專利名稱：：Ob-fold作為支架用于工程化新的特異性結(jié)合物的制作方法OB-FOLD作為支架用于工程化新的特異性結(jié)合物本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了用于獲得特異性結(jié)合選自大量配體家族的靶的穩(wěn)定分子的手段。大多數(shù)天然蛋白質(zhì)不適于治療或甚至生物技術(shù)應(yīng)用。蛋白質(zhì)工程的挑戰(zhàn)是限定有效和廣泛的設(shè)計(jì)新的或改良的具有所需特性的蛋白質(zhì)的方法。在耙定特性中，高特異性和親和性識別配體是非常重要的。對于許多應(yīng)用，抗體己被使用，這是由于它們特別適合于結(jié)合不同種類的配體如蛋白質(zhì)，肽，核酸，糖等。但是由于分子復(fù)雜性和/或穩(wěn)定性不足，通常抗體或它們的衍生物片段制備困難且昂貴。由于這些原因，最近己發(fā)展了使用經(jīng)組合突變/選擇方法工程化的支架蛋白質(zhì)替代抗體的方法。目的是當(dāng)去除抗體的缺陷時(shí)維持它們的有利特性。已報(bào)道該策略的成功應(yīng)用(Binzetal.,2005;MathonetandFastrez,2004)，其中絕大多數(shù)的耙是蛋白質(zhì)和特別地小有機(jī)化合物。本發(fā)明的目的是提供用于工程化能很好適用于醫(yī)學(xué)或生物技術(shù)應(yīng)用和能夠與多種靶特異性和高親和力結(jié)合的分子的工具，所述靶選自核酸，蛋白質(zhì)，碳水化合物或任何其他生物學(xué)分子。為此，本發(fā)明檢驗(yàn)假設(shè)，即命名為寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊區(qū)(OB-fold)的一個(gè)特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可通過其結(jié)合面的殘基的隨機(jī)化而修飾，同時(shí)至少部分保留親代蛋白質(zhì)的有利生物物理學(xué)特性(即高穩(wěn)定性和折疊效率)。由Murzin(Murzin,1993)首先描述的寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊區(qū)(OB-fold)在所有界中發(fā)現(xiàn)并在20個(gè)染色體調(diào)査中排名為第28個(gè)最具代表性的折疊(Qianeta1.，2001)。這個(gè)折疊，頂上帶有一個(gè)兩性分子a-螺旋的5鏈P-桶，似乎適于多種序列。OB-fold呈現(xiàn)一個(gè)(3-折疊結(jié)合面，其在可被識別的化合物類型上賦予顯著的多樣性，所述化合物是ssDNA、dsDNA、RNA、寡糖、蛋白質(zhì)、金屬離子和催化底物。來自不同蛋白質(zhì)的幾個(gè)OB-fold的研究顯示結(jié)合核心總是位于結(jié)合面的相同位置(Arcus，2002)。Sac7d具有OB-fold拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖la)(Agbacketa1.,1998;Gaoetal.，1998;Robinsonetal.,1998;Suetal.，2000)。它屬于來自超嗜熱古細(xì)菌嗜酸熱硫化葉菌(5W/o/o6ws的一類小染色體蛋白質(zhì)。當(dāng)在DNA中誘導(dǎo)尖銳扭結(jié)(sharpkink)時(shí)，Sac7d結(jié)合雙鏈DNA，不具有任何特定序列優(yōu)選性(Robinsonetal.,1998)。認(rèn)為在熱硫化葉菌高生長溫度時(shí)在DNA螺旋穩(wěn)定化上發(fā)揮作用。(最佳為85。C)。Sac7d非常穩(wěn)定。它耐熱并在Tm91°C解折疊，在PH0到IO之間保持天然折疊，當(dāng)變性劑中點(diǎn)濃度2.8M時(shí)，鹽酸胍誘導(dǎo)的變性可逆性發(fā)生(McCraryetal.,1996)。與抗體相反，它的分子組織非常簡單。Sac7d是66個(gè)氨基酸、只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域(即OB-fold)和不具有二硫鍵的小單體蛋白質(zhì)(McAfeeetal.，1995)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Sac7d的幾個(gè)截短形式(McAfeeetal.，1995)。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大腸桿菌可實(shí)現(xiàn)過度生產(chǎn)水平達(dá)到可溶性蛋白質(zhì)10-15mg/l(EdmondsonandShriver,2001)。Sac7d和其來自硫磺礦硫化葉菌(5W/o/o6ws^//"ton'cw)的相近同系物Sso7d的結(jié)構(gòu)研究顯示兩個(gè)蛋白質(zhì)核心是重疊的并主要經(jīng)由16個(gè)殘基形成的扭曲區(qū)域結(jié)合DNA小溝(Agbacketal.,1998;Gaoetal.，1998;Robinsonetal.,1998)。本發(fā)明人已嘗試了經(jīng)體外蛋白質(zhì)定向進(jìn)化改變Sac7d的結(jié)合特異性的可能性，其引入?yún)⑴c配體結(jié)合的大量殘基的隨機(jī)突變，之后選擇與給定靶結(jié)合的變體。更準(zhǔn)確地，本發(fā)明人己構(gòu)建了大約3><1012變體的大文庫，其相當(dāng)于隨機(jī)取代Sac7d結(jié)合面的11個(gè)殘基。這個(gè)文庫已被用于經(jīng)核糖體展示選擇能夠結(jié)合限定蛋白質(zhì)靶的變體。獲得3個(gè)蛋白質(zhì)靶的結(jié)合物池(pool),其親和力在幾百納摩爾范圍。在另一個(gè)方法中，本發(fā)明人擴(kuò)大了潛在的結(jié)合區(qū)域達(dá)到13和14個(gè)殘基。這些新文庫被用于選擇前述的靶之一(PulD-N)和獲得親和力在皮摩爾范圍的特異性結(jié)合物。因此令人驚奇地，本發(fā)明人證明普通DNA結(jié)合物(Sac7d)可進(jìn)化為具有高特異性和親和力的特異性蛋白質(zhì)結(jié)合物。這個(gè)證明提供了證據(jù)，即可以從Sac7d或其他OB-fold衍生出對于實(shí)質(zhì)上任何類型配基的結(jié)合物，例如通過使用以下更詳細(xì)描述的方法。因此，本發(fā)明的第一方面是OB-fold蛋白質(zhì)作為起始分子用于通過組合突變/選擇方法獲得特異性結(jié)合靶、特別是起始OB-fold蛋白質(zhì)不結(jié)合的耙即與用作起始分子的OB-fold蛋白質(zhì)的耙不同的耙的分子的應(yīng)用。在下文中，起始OB-fold蛋白質(zhì)的靶將被稱為"天然靶"，然而選擇步驟中使用的靶將被指定為"感興趣的靶"。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，感興趣的靶子有不同于天然靶的化學(xué)性質(zhì)(例如蛋白質(zhì)比/核酸，和金屬離子或糖比/蛋白質(zhì))。因此，本發(fā)明的一個(gè)特別方面是天然結(jié)合核酸的OB-fold蛋白質(zhì)作為起始分子用于通過組合突變/選擇方法獲得特異性結(jié)合不同于核酸的靶(例如蛋白質(zhì))的分子的應(yīng)用。天然結(jié)合蛋白質(zhì)的OB-fold蛋白質(zhì)作為起始分子用于通過組合突變/選擇方法獲得特異性結(jié)合非蛋白質(zhì)靶(例如核酸)的分子的應(yīng)用也是本發(fā)明的一部分。依據(jù)本發(fā)明，短語"OB-fold蛋白質(zhì)"被指定為任何多肽，其包含或由具有OB-fold拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域組成，如(Murzin,1993)和(Arcus,2002)所述。這個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相當(dāng)于在一個(gè)末端頂部有一個(gè)兩性分子a-螺旋的5鏈P桶的構(gòu)造。談到CATH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類(Pearletal.,2003)，OB-fold拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相當(dāng)于2.40.50折疊家族(CATH數(shù)據(jù)庫版本3.0.0:ReleasedMay2006)。這樣的OB-fold蛋白質(zhì)可以是天然蛋白質(zhì)(即具有與天然蛋白質(zhì)相同序列的分離純化或重組的蛋白質(zhì))或工程化的蛋白質(zhì)(例如天然蛋白質(zhì)的片段或包含來自第一個(gè)蛋白質(zhì)的OB-fold結(jié)構(gòu)域和來自另一個(gè)蛋白質(zhì)的另一部分的融合蛋白)。依據(jù)本發(fā)明可使用的OB-fold蛋白質(zhì)的非限定性實(shí)例是Sac7d，Sso7d，SEB的N末端結(jié)構(gòu)域(Papageorgiouetal.，1998)，志賀樣毒素lie(PDB2bosa)的鏈A，人嗜中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2，PDBltvxA)，棕色固氮菌G4zoto6a"wW"e/aw&7)的鉬結(jié)合蛋白質(zhì)(modg)(PDBlh9j)，SPE-C的N末端結(jié)構(gòu)域(Rousseletal.，1997)，大腸桿菌(Eco")志賀樣毒素的B5亞基，Cdcl3(Mitton-Fryetal.，2002)，人Y-box蛋白質(zhì)YB-1的冷休克DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Kloksetal.，2002)，大腸桿菌無機(jī)焦磷酸酶EPPase(Samyginaetal.，2001)，或任何列于(Arcus,2002)文章表3的蛋白質(zhì)例如lkrs(賴氨酰-tRNA合成酶LysS，大腸桿菌)、lcOaA(Asp-tRNA合成酶，大腸桿菌)、lb8aA(Asp-tRNA合成酶，Pybcb^araera&)、llylA(賴氨酰-tRNA合成酶LysU，大腸桿菌)、lquqA(復(fù)制蛋白質(zhì)A，32kDa亞基，人)、lquqB(復(fù)制蛋白質(zhì)A，14kDa亞基，人)、ljmcA(復(fù)制蛋白質(zhì)A，70kDa亞基(RPA70)片段，人)、lotc(端粒-末端-結(jié)合蛋白質(zhì)，O."ova),3ullA(線粒體ssDNA-結(jié)合蛋白質(zhì)，人)、lprtF(百日咳毒素S5亞基，百日咳桿菌(及pw加^))、lbcpD(百日咳毒素S5亞基(ATP結(jié)合)，百日咳桿菌)、3chbD(霍亂毒素，霍亂弧菌(KC77o/erae))、ltiiD(熱敏感毒素，大腸桿菌)、2bosA(志賀樣毒素-l/志賀毒素，B-五聚體，大腸桿菌)、lbr9(TIMP-2,人)、lan8(超抗原SPE-C，化膿性鏈球菌(5^yoge"es))、3seb(超抗原SPE，金黃色葡萄球菌(S.awmw))、law7A(中毒休克綜合征毒素，金黃色葡萄球菌)、ljmc(主要冷休克蛋白質(zhì)，大腸桿菌)、lbkb(起始轉(zhuǎn)錄因子5a,/!"era//^/"w)、lsro(PNPase的SlRNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，大腸桿菌)、ld7qA(起始轉(zhuǎn)錄因子l，elFla,人)、lah9(起始轉(zhuǎn)錄因子1,IF1，大腸桿菌)、lb9mA(Mo-依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控物ModE,大腸桿菌)、lckmA(RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶，小球藻病毒，PBCV-1)、la0i(ATP-依賴性DNA連接酶，噬菌體T7)、lsnc(葡萄球菌核酶，金黃色葡萄球菌)、lhjp(DNA解旋酶RuvA亞基，N末端結(jié)構(gòu)域，大腸桿菌)、lpfsA(基因V蛋白質(zhì)，假單胞菌噬菌體pf3)、lgvp(基因V蛋白質(zhì)，絲狀噬菌體(fl,M13))、lgpc(基因32蛋白質(zhì)(gp32)核心，噬菌體T4)、lwgjA(無機(jī)焦磷酸酶，釀酒酵母OS.cev&^))和2prd(無機(jī)焦磷酸酶，嗜熱棲熱菌(7^ermopMw))。注意的是毒素來源的OB-fold結(jié)構(gòu)域可被用作起始分子，甚至目的是去除毒性，因此在它們結(jié)合位點(diǎn)的突變和因此它們結(jié)合特異性的改變可完全去除它們的毒性。作為以下實(shí)驗(yàn)部分更詳細(xì)的例證，組合突變/選擇方法包括獲得相當(dāng)于起始OB-fold蛋白質(zhì)的大量選擇的殘基的隨機(jī)化(特別地，大量涉及蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的殘基的隨機(jī)化)的組合文庫，之后是在所述文庫選擇有所需特性的變體。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是組合文庫，其相當(dāng)于OB-fold蛋白質(zhì)與其天然配體的結(jié)合面的5到32、優(yōu)選8到20、和更優(yōu)選11到16個(gè)殘基的隨機(jī)化，可能與缺失1到4個(gè)殘基和/或插入1到50殘基組合。當(dāng)然，在此"OB-fold蛋白質(zhì)的結(jié)合面"甚至在有多個(gè)結(jié)合不同配體的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的情況中是指OB-fold結(jié)構(gòu)域和結(jié)合這個(gè)結(jié)構(gòu)域的配體之間的界面。在科學(xué)文獻(xiàn)中技術(shù)員將發(fā)現(xiàn)鑒定涉及OB-fold蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的殘基的必要信息，所述殘基通常位于OB-fold的(3鏈p3、134和P5和環(huán)1、3和4中(圖lb和2)。采用來自嗜酸熱硫化葉菌的Sac7d或其同系物(圖4)例如來自硫磺礦硫化葉菌的Sso7dSso7d可獲得本發(fā)明的特定組合文庫。當(dāng)然，獲得的文庫有Sac7d的截短形式，如(McAfeeetal.,1995)所述，也是本發(fā)明的一部分。使用網(wǎng)址衡-Blast2(http:〃www.ebi.ac.uk/blast2/index.html)(Lopezetal"2003)、T匿COFFEE(http:〃www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html)(Notredameetal.，2000)禾口DALIlite(http:〃www.ebi.ac.uk/DaliLite/)(HolmandPark,2000)將OB-fold結(jié)構(gòu)域的幾個(gè)序列和3D結(jié)構(gòu)疊加，本發(fā)明人己確定可被修飾以獲得本發(fā)明文庫的位置。作為參照，SEQIDNO:1的Sac7d的序列，可以隨機(jī)化的殘基如下V2,K3，K5，K7，Y8，K9,G10，E14，T17,K21,K22,W24,V26，G27,K28，M29，S31，T33，D36，N37，G38，K39，T40,R42,A44，S46,E47，K48,D49,A50和P51。仍以Sac7d作為參考，可被缺失的殘基是A59，R60,A61和E64。使用網(wǎng)址DALI(http:〃www.ebi.ac.uk/dali/Interactive.html)(HolmandSander,1998),10個(gè)蛋白質(zhì)或OB-fold結(jié)構(gòu)域(包括Sac7d)的3D結(jié)構(gòu)的疊加揭示這種蛋白質(zhì)帶有不同大小的環(huán)，其極可能涉及配體結(jié)合(見圖2)。這個(gè)觀察與先前發(fā)表的數(shù)據(jù)一致(Arcus,2002)。因?yàn)镾ac7d是帶有最短環(huán)的蛋白質(zhì)之一，在所述環(huán)中可方便的完成隨機(jī)插入以便獲得特別適宜某種配體家族結(jié)合的文庫。在環(huán)3可方便地進(jìn)行1到15個(gè)氨基酸殘基的插入(如圖lb和2確定)，例如在Sac7d的25到30位殘基區(qū)域、優(yōu)選在27到28位殘基之間插入，可在環(huán)4內(nèi)進(jìn)行1到15個(gè)氨基酸殘基的插入(如圖lb和2確定)，例如在Sac7d的35到40位殘基區(qū)域、優(yōu)選在37到38位殘基之間插入，及可在環(huán)1內(nèi)進(jìn)行1到20個(gè)氨基酸殘基的插入(如圖lb和2確定)，例如在Sac7d的7到12位殘基區(qū)域、優(yōu)選在9到10位殘基之間插入。為了避免任何不確定，本文確定圖la和2中確定的環(huán)3、4和1分別相當(dāng)于由ArcusCswpra)在綜述中確定的環(huán)1、2和4。依據(jù)本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案，組合文庫相當(dāng)于Sac7d選自K7，Y8，K9，K21，K22,W24，V26,K28,M29,S31，T33，K39，T40,R42,A44，S46，E47和K48之中的11，12，13,14，15,16,17或18個(gè)殘基、例如選自K7，Y8，K9,K21，K22，W24，V26,K28,M29,S31，T33，K39，T40，R42，A44和S46的11，12,13,14，15或16個(gè)殘基的隨機(jī)化。在以上實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選組合文庫中，隨機(jī)化的殘基包含至少Sac7d的殘基K7,Y8，K9，W24,V26,M29，S31，T33,R42,A44和S46。這個(gè)實(shí)施方案中以及以下實(shí)驗(yàn)部分稱為"文庫ll"的特異文庫相當(dāng)于Sac7d的殘基K7，Y8，K9，W24,V26，M29，S31，T33,R42,A44和S46的隨機(jī)化。在這個(gè)實(shí)施方案的其他組合文庫中，選自K21、K22和T40的Sac7d的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)額外的殘基也是隨機(jī)化的。也在實(shí)驗(yàn)部分描述的本發(fā)明的2個(gè)其他優(yōu)選文庫是"文庫13"和"文庫14"，文庫13相當(dāng)于Sac7d的K7，Y8，K9,K21，K22，W24,V26,M29,S31，T33，R42,A44和S46殘基的隨機(jī)化，文庫14相當(dāng)于Sac7d的K7,Y8,K9，K21，K22，W24,V26,M29，S31，T33,T40,R42，A44和S46殘基的隨機(jī)化。當(dāng)然，經(jīng)隨機(jī)化Sso7d的11，12,13,14，15或16殘基獲得的組合文庫也是本發(fā)明的一部分，所述殘基選自位于與如上所列位置等價(jià)位置上的殘基。使用RSCB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Bermanetal.,2000)中的Sso7d(鏈A)的文件(lbf4A)并與Sac7d比較3D結(jié)構(gòu)(圖3a)可確定所述等價(jià)位置Sac7d:78921222426282931333940424446lbf4A:78921222426282931334041434547也可使用Sac7d的其他蛋白質(zhì)同系物獲得上述組合文庫。在下表中揭示了這種蛋白質(zhì)的實(shí)例。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>列于表1中的Sac7d同系物的OB-fold結(jié)構(gòu)域的排列對比示于圖4。使用志賀樣毒素IIe(PDBlr4pB)獲得本發(fā)明的其他特定組合文庫，例如通過隨機(jī)化ll，12,13,14，15或16個(gè)殘基，所述殘基選自位于與Sac7d的上述位置等價(jià)位置的殘基，所述等價(jià)位置如下(圖3b):Sac7d:78921222426282931333940424446lr4pB:605958910121417182022XX272931通過隨機(jī)化人嗜中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2，PDBltvxA)的11，12,13,14,15或16個(gè)殘基獲得本發(fā)明的其他特定組合文庫的其他實(shí)例，其中所述殘基選自位于與Sac7d的上述位置等價(jià)位置的殘基。經(jīng)比較所述蛋白質(zhì)與Sac7d(圖3c)的3D結(jié)構(gòu)獲得的這些等價(jià)位置如下Sac7d:78921222426282931333940424446ltvxA:25262740414345545557596163656769使用棕色固氮菌的鉬結(jié)合蛋白質(zhì)(modg)(PDBlh9j)仍可獲得本發(fā)明的其他特定組合文庫，例如隨機(jī)化選自位于與Sac7d的上述位置等價(jià)位置上的殘基的11，12，13,14,15或16個(gè)殘基，其中所述等價(jià)位置(圖3d)如下Sac7d:78921222426282931333940424446lh9jA:6061628687899193949698105106108110112本發(fā)明也涉及上述組合文庫用于工程化特異性結(jié)合靶的分子的應(yīng)用。在本發(fā)明中，如果分子與靶的結(jié)合的信號與噪音比率高于10，則被認(rèn)為是耙的"特異"結(jié)合物。使用本發(fā)明組合文庫工程化的結(jié)合物分子優(yōu)選以高親和力結(jié)合其靶(也稱為"感興趣的靶")，即例如當(dāng)靶是肽或蛋白質(zhì)時(shí)，親和力超過10nM，且當(dāng)靶是碳水化合物分子時(shí)，親和力超過lpM。本發(fā)明的另一個(gè)目的是工程化特異性結(jié)合靶的分子的方法，包括在如上述的組合文庫中選擇特異性結(jié)合所述靶的所述OB-fold蛋白質(zhì)的變體的步驟。在此"變體"是指屬于文庫的蛋白質(zhì)，即來源于起始OB-fold蛋白質(zhì)通過在其結(jié)合位點(diǎn)突變而衍生的蛋白質(zhì)。正如上述所提及，本發(fā)明的興趣之一是其能夠工程化特異性結(jié)合感興趣的靶的分子，且關(guān)于這個(gè)靶無實(shí)質(zhì)性限制。例如，感興趣的靶可以是肽，蛋白質(zhì)，寡糖，脂質(zhì)，脂肽，碳水化合物(例如糖)，單鏈DNA，雙鏈DNA，RNA。有趣地是，感興趣的耙可以是限于一些原子或甚至僅僅一個(gè)原子的天然或合成的小分子。這種小分子實(shí)例包括任何類型的半抗原(即僅當(dāng)與大載體附著時(shí)可引發(fā)免疫應(yīng)答的小分子)，維生素，或金屬離子?？杀挥米靼械姆肿拥膹V泛多樣性是特別有趣的，因?yàn)榻Y(jié)合這些靶的OB-fold蛋白質(zhì)可被用于抗體己知的相同應(yīng)用，或不同應(yīng)用。例如，本發(fā)明獲得的并與金屬離子結(jié)合的OB-fold蛋白質(zhì)可被用于生物除污過程，例如從復(fù)雜材料如土壤或被污染的水中去除重金屬。技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域任何技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明方法的選擇步驟和/或進(jìn)行篩選步驟以獲得有所需特性的蛋白質(zhì)。選擇技術(shù)可以是例如噬菌體展示(Smith,1985)，mRNA展示(Wilsonetal.，2001)，細(xì)菌展示(Georgiouetal.，1997)，酵母展示(BoderandWittrup,1997)或核糖體展示(HanesandPluckthun,1997)。為進(jìn)行選擇步驟，核糖體展示是特別有利的，因?yàn)槠渫耆隗w外進(jìn)行并因此繞開許多體內(nèi)系統(tǒng)的局限性(特別是關(guān)于文庫大小)(HeandTaussig,2002;Schaffitzeletal.,1999)。在以下實(shí)驗(yàn)部分同時(shí)在He和Taussig(2002)以及Schaffitzel的(1999)的文章中或在其他文章和手冊中技術(shù)員將發(fā)現(xiàn)進(jìn)行核糖體展示的方案。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過核糖體展示進(jìn)行2，3,4或5輪選擇。如實(shí)驗(yàn)部分所描述，本發(fā)明方法也可包括進(jìn)一步的分離步驟和鑒定一個(gè)或幾個(gè)特異性結(jié)合感興趣靶的分子的步驟。例如，如下進(jìn)行分離和鑒定步驟(i)用核糖體展示選擇的池中的mRNA被逆轉(zhuǎn)錄并經(jīng)PCR擴(kuò)增，并且將所得的DNA克隆進(jìn)入表達(dá)載體；(ii)細(xì)菌(例如感受態(tài)DH5oc)被所述表達(dá)載體(包含所述DNA)轉(zhuǎn)化并且生長單克?。缓?iii)檢測從所述細(xì)菌克隆提取的蛋白質(zhì)與靶的結(jié)合和/或其他生物學(xué)特性(例如穩(wěn)定性等)。然后，生長表達(dá)最好特性蛋白質(zhì)的克隆以制備大量蛋白質(zhì)。通過測序表達(dá)載體的相關(guān)部分確定工程化蛋白質(zhì)的編碼序列，并且編碼這個(gè)蛋白質(zhì)的基因也可被用于進(jìn)一步工程化蛋白質(zhì)。確實(shí)，使用通過本發(fā)明方法獲得的結(jié)合物構(gòu)建多功能蛋白質(zhì)是有利的，該蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)靶向部分和另一個(gè)具有催化，熒光，酶促和任何其他活性的部分。例如這可以通過構(gòu)建融合蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)，所述融合蛋白質(zhì)包含作為第一部分的分離和鑒定的分子和至少第二部分。這第二部分可方便地選自酶，標(biāo)記物或報(bào)道蛋白(如PhoA,GFP等)，治療蛋白質(zhì)等。依據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)變化，幾個(gè)結(jié)合物連接到一起(或者在一個(gè)融合蛋白中或通過非共價(jià)連接)以構(gòu)建具有多結(jié)合特異性的融合體或復(fù)合物。本發(fā)明的其他目的是經(jīng)上述方法獲得的蛋白質(zhì)。特別地，特異性結(jié)合PulD并具有選自SEQIDNO:2-8的序列的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的一部分，SEQIDNO:47的GarA-結(jié)合物也是。隨后的圖例和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。圖1:a)圖示野生型Sac7d與雙鏈DNA(PDBcodelazp)復(fù)合。b)參與DNA結(jié)合的殘基。凹面區(qū)域以淺灰色殘基定義，平面區(qū)域用中等灰色和深灰色。結(jié)合區(qū)域間界限的殘基是中等灰色。圖2:多種OB-fold結(jié)構(gòu)域的環(huán)1、3和4的圖示。用于進(jìn)行這個(gè)疊加的RSCBPBD結(jié)構(gòu)文件如下_lazp(即Sac7d),ltvxA，ldokA,lbqq,lcsp,3seb，lbr9,2bosA,lbf4A和lquqB。為圖像清晰，僅顯示Sac7d結(jié)構(gòu)。圖3:圖示和疊加Sac7d和a)Sso7d(結(jié)構(gòu)文件lbf4);b)志賀樣毒素lie(結(jié)構(gòu)文件:2bosa);c)人嗜中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2,結(jié)構(gòu)文件ltvxA);d)棕色固氮菌的鉬結(jié)合蛋白質(zhì)(modg)(結(jié)構(gòu)文件lh9j)。注意對于包含不同于OB-fold結(jié)構(gòu)域的額外結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，僅OB-fold結(jié)構(gòu)域在圖中顯示。使用DALI和DALILite服務(wù)器獲得結(jié)構(gòu)疊加。在下表2中顯示蛋白質(zhì)序列，它們的編號在NCBI文件中。名稱文件ref.來源序列Sac7dlazpNCBI:AAA80315iEJOC(SEQIDNo:1)Sso7dlbf4NCBI:P39476JO:(SEQIDNo:28)毒素IIelr4pbNCBI:CAA90631MKKMFMAVLFALVSVNAMAADCAiCGKXBFSK(SEQIDNo:29)NAP-2ltvxANCBI:CAG33086MSIiRLjDTTPSCNSARPUiALQVKLIjIjSIiljLTALASSTKGQTKRNLAKGKEESLiDSDIjYAEIJESAD(SEQIDNo:30)modglh9jNCBI:CAA，38MKISARNVFKGTVSALKEGAVNAEVDILLGGGDKLAAWTLESARSLQLAAGKEWAVVKAPASASAVTXASNVXI/GVPA(SEQIDNo:31)表2:已被用于獲得圖3顯示的疊加的蛋白質(zhì)序列。斜1本的序列片段相當(dāng)于結(jié)構(gòu)文件中有效使用的序列以確定可方便地被隨機(jī)突變的位置。所述突變位置是粗體。圖4:幾個(gè)Sac7d同系物的OB-fold結(jié)構(gòu)域排列。圖5:編碼Sac7d的突變序列的基因合成。文庫11的隨機(jī)化的位置以黑色標(biāo)記。文庫14的額外的隨機(jī)化的位置以灰色標(biāo)記。使用的寡核苷酸由細(xì)箭頭指示(它們的序列見文章)。大箭頭指示Sac7d編碼序列(無C-terTolA接頭)。圖6:a)文庫11經(jīng)4輪篩選后，檢測抗DnaK，PulD-N和GarA的RIA(放射性免疫測定)。當(dāng)甲硫氨酸35S存在時(shí)體外翻譯選擇池并檢測與固定于ELISA板的DnaK，PulD-N或GarA的結(jié)合。沖洗并使用0.1M三乙醇胺洗脫之后，使用(3計(jì)數(shù)器評估結(jié)合物的量。使用濃度為lpM和10pM的游離蛋白質(zhì)預(yù)保溫翻譯池平行進(jìn)行競爭。b)第4輪后篩選抗-PlulD-N結(jié)合物。c)ELISA檢測6個(gè)抗PulD-N結(jié)合物的結(jié)合特異性。比較結(jié)合物和固化的DnaK,PulD-N，GarA和BSA之間的相互作用。圖7:文庫ll、13和14經(jīng)5輪篩選之后檢測抗PulD-N的RIA。當(dāng)甲硫氨酸35S存在時(shí)體外翻譯選擇池并檢測與固定于ELISA板的DnaK,PulD-N，GarA或BSA結(jié)合。沖洗并使用0.1M三乙醇胺洗脫之后，使用(3計(jì)數(shù)器評估結(jié)合物的量。使用濃度為lnM，10nM,100nM，1000nM的游離PuiD-N預(yù)保溫翻譯池平行進(jìn)行競爭。使用BSA作為結(jié)合池的陰性對照(無競爭完成)。圖8:8個(gè)選擇的抗PulD-N的結(jié)合物的序列。野生型Sac7d的序列示于圖頂端。野生型Sac7d和結(jié)合物共同的殘基由點(diǎn)標(biāo)記。計(jì)劃取代的位置為高亮的灰色。圖9:表達(dá)和純化分析8個(gè)選擇的結(jié)合物。蛋白質(zhì)上樣于15%SDS-PAGE并用考馬氏亮藍(lán)染色。a)30°C表達(dá)后大腸桿菌粗提物。使用0.5mMIPTG誘導(dǎo)19小時(shí)后收集細(xì)胞并在上樣緩沖液中裂解。b)粗提物的可溶性級分之后純化結(jié)合物。c)一步IMAC(固定化金屬離子親和層析)純化大腸桿菌粗提物可溶性級分之后純化的結(jié)合物。所有上樣的樣品相當(dāng)于13^1液體培養(yǎng)物。圖10:使用SPR(表面等離子體共振)分析確定克隆6的親和力。a)使用BIAcore之后的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。生物素化PulD-N被固定于(250RU)鏈霉抗生物素芯片上并注入50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM和1.56nM的克隆6。無固化PulD-N的流動(dòng)池(cell)被用于控制非特異性結(jié)合的出現(xiàn)并將來自池的信號減去以獲得檢測池的信號。采用整體適宜程序使用BIAevaluation軟件分析數(shù)據(jù)。b)使用競爭BIAcore也檢測平衡時(shí)的親和力。兩種方法測定的參數(shù)在表3中報(bào)道。Ul^經(jīng)差示掃描量熱法確定Sac7d的野生型和變體重組蛋白的熱穩(wěn)定性。在rC/min，蛋白質(zhì)濃度200ng/ml于含有300mMNaCl的50mMMES緩沖液pH5.6中報(bào)道野生型Sac7d，克隆40，克隆33和克隆6的過剩熱吸收。對于每一個(gè)蛋白質(zhì)樣品，實(shí)驗(yàn)的額外熱容量曲線(粗線)經(jīng)非線性回歸最佳擬合為非雙態(tài)模型(細(xì)線)。在表4中給出生成的熱力學(xué)參數(shù)。圖12:a)使用克隆6-堿性磷酸酶融合物，用大腸桿菌粗提取物混合的PulD-N的檢測的Western印跡。b)使用固定于柱上的克隆6—步純化PulD-N。含PulD-N的大腸桿菌提取物的可溶性級分注入用HBS緩沖液pH7.0平衡的柱上。洗滌后，使用甘氨酸-鹽酸緩沖液將pH降到2.5。級分在15。/。SDS-PAGE上分析并用考馬氏亮藍(lán)染色。CE:細(xì)胞提取物；PulD-N:純化蛋白質(zhì)作為標(biāo)記物；級分酸性pH變化后從柱子洗脫的級分；FT:流經(jīng)。圖13:Sac7*40,Sac7*33和Sac7*6與分離的細(xì)胞包膜和PulD十二聚體(PulDD)和PulD單體(PulDM)的結(jié)合。(A)生成PulD和PulS或PulD-CS和PulS的PAP105菌株的遞增量的細(xì)胞包膜與Sac7*40-GFP保溫，然后使用SDS和GFP抗體免疫印跡分析膜級分。(B)使用3個(gè)Sac7*-PhoA嵌合體和抗PhoA抗體，同一菌株指示量的細(xì)胞包膜蛋白質(zhì)的Far-Western印跡。圖14:未經(jīng)或經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的Sac7-PhoA嵌合體的制備和它們對于帶有pCHAP231的細(xì)胞包膜蛋白酶缺陷株P(guān)AP5198的分泌和PulD多聚化的作用。(A)(采用PhoA抗體)免疫印跡測定相同量細(xì)胞提取物的Sac7-PhoA水平。(B)使用PulD抗體，對苯酚處理和未處理的細(xì)胞提取物免疫印跡檢測的分泌水平(°/。)和PulD十二聚體(PulDD)和單體(PulDM)的存在。箭頭指示無苯酚處理檢測的PulDM。S表示Sac7d-PhoA。(C)和(B)—樣，但是無IPTG誘導(dǎo)。圖15顯示:對得自ARNms的ADNc進(jìn)行的PCR，在第4個(gè)循環(huán)中洗脫(見圖19，RT-PCR階段)。圖16:5個(gè)抗PKnG和抗溶菌酶選擇循環(huán)之后進(jìn)行競爭性放射性免疫圖17:5個(gè)選擇循環(huán)之后獲得的抗溶菌酶(A)，抗PknG(B)和抗GarA(C)克隆的ELISA篩選。圖18:5個(gè)選擇循環(huán)之后獲得的抗溶菌酶克隆序列。圖19:GarA結(jié)合物和Sac7d的排列對比。圖20:抗Fc片段的第4輪選擇之后的競爭性ELISA。Mli^圖示一輪核糖體展示選擇。實(shí)施例采用下述材料和方法獲得以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。材料和方法普通分子生物學(xué)選擇的突變體的克隆和表達(dá)載體是pQE30，購自Qiagen(Germany)。編碼野生型Sac7d的DNA的合成使用以下6個(gè)寡核苷酸采用裝配PCR產(chǎn)生野生型Sac7d的DNA序列SCI(SEQIDNo:9:GAAACTCCTAGGTATTGTGCTGACGACCCCGATCGCGATCTCTAGCTTTGCGGTGAAAGTGAAATT),SC2(SEQIDNo:10:GATCTTGCTGGTGTCCACTTCTTTTTCTTCGCCTTTATATTTAAATTTCACTTTCACCGCAAAGCTAG)，SC3(SEQIDNo:11:GAAGTGGACACCAGCAAGATCAAGAAAGTTTGGCGTGTGGGCAAAATGGTGAGCTTTACCTACGACGACAACGGCAAG)，SC4(SEQIDNo:12:CTCTTTCGGGGCATSC5(SEQIDNo:13:GAGAAAGATGCCCCGAAAGAGTTATTAGATATGTTAGCGCGTGCGGAAAGCTTCAACCA)，SC6(SEQIDNo:14:TGGTGGTTGAAGCTTTCCGCACG)。純化的PCR產(chǎn)物作為第二次PCR擴(kuò)增的模板并使用以下兩個(gè)引物SC07(SEQIDNo:15:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAAGTGAAATTTAAATATAAAG)和SC08(SEQIDNo:16:ATAABamHI和Hindlll限制性位點(diǎn)將PCR產(chǎn)物克隆入pQe30表達(dá)載體。帶有所需序列的克隆被用于隨后表達(dá)。組合文庫的制備與以與核糖體展示相容的形式制備3個(gè)文庫11、13、14的方案是相同的。主要經(jīng)基因合成和PCR裝配步驟構(gòu)建文庫。用聯(lián)合使用編碼NNS三聯(lián)體(其中N=A,C，T或G和S=C或G)的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和3個(gè)簡并寡核苷酸的一步PCR獲得DNA產(chǎn)物，其包括核糖體展示必須的5'-側(cè)翼區(qū)并獲得Sac7d的隨機(jī)化基因。對于文庫14，使用以下寡核苷酸:T7C(SEQIDNo:17:ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC)，SDA—MRGS(SEQIDNo:18:AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAACACCATCACGGATCCGTCAAGGTGAAATTC)，SClib2(SEQIDNo:20:GGATCCGTCAAGGTGAAATTC麗SNNS麗SGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC),SClib3(SEQIDNo:21:CTTGCCGTTGTCGTCGTAS麗AAASNNCACS麗TTTGCCSNNACGS麗AACS麗S麗GATCTTACTAGTGTCCACTTC)，SClib4(SEQIDNo:22:TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCSNNCACSNNGCCS麗GCCS麗CTTGCCGTTGTCGTCGTA)，SClib5(SEQIDNo:23:CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTTTCGGGGCATC)。位置相當(dāng)于Sac7d中的殘基21、22和40或殘基40的編碼野生型三聯(lián)體而不是NNS三聯(lián)體的引物被分別用于構(gòu)建文庫11和13。為了將展示在核糖體上的蛋白質(zhì)能更接近潛在配體，蛋白質(zhì)需要與接頭融合。這個(gè)接頭的序列相當(dāng)于大腸桿菌蛋白質(zhì)TolA的一部分，在質(zhì)粒pRDV載體內(nèi)編碼(Binzetal.，2004a)，使用引物SClink(SEQIDNo:24:(SEGIDNo:25:CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT)(后者編碼核糖體展示必須的3，-側(cè)翼區(qū))PCR擴(kuò)增。最終使用tolAk和T7B(SEQIDNo:25:ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG)引物通過PCR裝配將文庫與tolA接頭組裝。最終裝配的產(chǎn)物相當(dāng)于Sac7d文庫，后者帶有如上所述的用于核糖體展示選擇必須的所有5，-禾卩3'-區(qū)域(Hanesetal.，1998;Schaffitzeletal.,1999)。核糖體展示選擇循環(huán)對于選擇實(shí)驗(yàn)，使用生物素化靶蛋白質(zhì)。通過將10pMDnaK、GarA或PulD-N溶液與超過20倍摩爾濃度的于PBS中的磺基琥珀酰亞胺基-6-(生物素氨基)-己酸酯(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin,Pierce)冰上保溫1小時(shí)進(jìn)行生物素化。生物素化蛋白質(zhì)使用Pierce的平衡于TBS中的蛋白質(zhì)脫鹽離心柱進(jìn)行緩沖液交換。使用HABA化驗(yàn)(Sigma)確定生物素化的程度為每個(gè)蛋白質(zhì)分子2到3個(gè)生物素分子。生物素化的靶蛋白質(zhì)結(jié)合到固定于Maxisorp板(Nunc)內(nèi)的neutmvidin上，并在4°C按有一些修改的(Binzetal.,2004b)描述經(jīng)核糖體展示進(jìn)行選擇。簡要地，每輪選擇后，洗脫的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并使用引物SDA一MRGS和SClib5擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在NuclespinExtractII柱(Macherey-Nagel)脫鹽并用于與TolAlinkerDNA片段的PCR裝配(見上)。這個(gè)生成的全長核糖體展示構(gòu)建體具有新加入的5'-和3'-側(cè)翼區(qū)以最小化在處理過程中由于mRNA末端降解而導(dǎo)致的克隆丟失。RT-PCR循環(huán)數(shù)是35個(gè)循環(huán)(第1輪)，30個(gè)循環(huán)(第2輪)，30個(gè)循環(huán)(第3輪)，25個(gè)循環(huán)(第4輪)。在第5輪，如上描述使用解離速率選擇法增加選擇壓力(Jermutusetal.,2001)。為了這個(gè)選擇，加入10nM生物素化PulD-N至第4輪池的停止的翻譯物中。混合物在4°C平衡lh并加入非生物素化PulD-N至終濃度達(dá)到10pM(超過生物素化PulD-N1000倍過量)。4。C振蕩保溫2h后，與生物素化PulD-N結(jié)合的三元復(fù)合物(mRNA-核糖體-結(jié)合物)在4。C被3(^1鏈霉抗生物素包被的磁珠(Roche)捕獲15min。洗珠并且分離mRNA用于第一次4輪循環(huán)。在第5輪這種選擇時(shí)，RT-PCR循環(huán)數(shù)是35。經(jīng)監(jiān)測每輪RT-PCR產(chǎn)物的量檢査選擇進(jìn)程。分析選擇的池和分離的克隆4輪或5輪之后，如(Hanesetal.,1998)等描述使用Maxisorp板內(nèi)直接包被的靶蛋白質(zhì)和從lnM到10pM無靶蛋白質(zhì)作為競爭物采用RIA(放射免疫分析)測試選擇的池。使用BamHI和HindIII限制性位點(diǎn)將來自選擇的池的RT-PCR產(chǎn)物克隆入pQE30載體并將產(chǎn)生的連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc菌株。從培養(yǎng)皿挑選出克隆接種每孔含1.5mlLB培養(yǎng)基(100pg/ml氨芐青霉素，1%葡萄糖)的深孔板。250rpm搖動(dòng)、37°C過夜培養(yǎng)，從這個(gè)主平板每孔內(nèi)取出0.2ml接種另一個(gè)每孔含有1.3ml2YT培養(yǎng)基(100pg/ml氨芐青霉素)的深孔板。然后平板在37°C保溫lh，250rpm搖動(dòng)。加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在30°C保溫4h，搖動(dòng)(250rpm)。離心(2250g)沉淀細(xì)胞并去除上清。每孔使用50plBugBuster(Novagen)提取蛋白質(zhì)，250rpm搖動(dòng)30min，然后加入250^1TBSpH7.4(20mMTris-HCl，150mMNaCl)。離心(2500g)沉淀細(xì)胞碎片。對于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))篩選，使用lOOpl每種上清液檢測與包被在Maxisorp板內(nèi)的靶蛋白質(zhì)的結(jié)合。使用只從結(jié)合物中檢測RGS-(His)6-tag而不從靶蛋白質(zhì)中檢測(His)6-tag的RGSHis抗體HRP綴合物(Qiagen)和Roche的BM-Blue底物進(jìn)行檢測。所有保溫步驟在TBSpH7.4，含0.1%Tween20的緩沖液中進(jìn)行。陽性克隆用標(biāo)準(zhǔn)測序技術(shù)測序。采用SPR(表面等離子體共振)制備用于篩選的蛋白質(zhì)基于結(jié)合物從PulD-N解離的時(shí)間進(jìn)行篩選，在5ml規(guī)模培養(yǎng)中表達(dá)克隆(大腸桿菌DH5oc菌株)。500^1深孔內(nèi)過夜預(yù)培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，lOOpg/ml氨芐青霉素，1%葡萄糖，37。C)接種在深孔板中的4.5ml培養(yǎng)基(2YT，100pg/ml氨節(jié)青霉素，37°C)。當(dāng)OD6(K)=1.0時(shí)加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在30。C(250rpm)保溫培養(yǎng)物19h。離心(2500g)收集細(xì)胞，在含有25mM咪唑，BugBuster和Benzonase(Novagen)的0.5mlTBSpH7.4中重懸細(xì)胞而在深孔中提取蛋白質(zhì)。4。C振蕩lh后，離心深孔板沉淀細(xì)胞碎片。上清液在含有l(wèi)OOnlNi-FastFlowChelatingSepharose(GeneralElectric)的微離心柱上純化，柱用含有20mM咪唑的TBSpH7.4平衡。使用上樣緩沖液洗Resin4次并用400plTBSpH7.4和250mM咪唑洗脫純化的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)制備以及結(jié)合物和野生型Sac7d的純化對于Biacore和微量熱實(shí)驗(yàn)，結(jié)合物在1L規(guī)模的DH5a大腸桿菌菌株中表達(dá)并如下述純化。使用50ml過夜預(yù)培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，100^ig/ml氨芐青霉氣1%葡萄糖,37。C)接種1L培養(yǎng)基(2YT,100ng/ml氨芐青霉氣37°C)。當(dāng)OD6oQ=1.0時(shí)加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在30°C保溫19h(250rpm)。離心收集細(xì)胞并在30ml含有25mM咪唑的TBSpH7.4中在30°C重懸細(xì)胞。使用AvestinEmulsiflex勻漿器裂解細(xì)胞并經(jīng)離心去除細(xì)胞碎片。使用含有25mM咪唑的TBSpH7.4平衡的5mlHiTrap螯合柱純化蛋白質(zhì)。使用TBSpH7.4和250mM咪唑洗脫。經(jīng)大小排阻層析在已用HBSpH7.0(20mMHEPES,150mMNaCl)平衡的Superdex7526/60凝膠過濾柱(GEHealthcare)上進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。在SMART系統(tǒng)(GEHealthcare)中使用HBSpH7.0平衡的Superdex753.2/20柱分析凝膠過濾(60pl/min，50^1樣品注入)。BPTI(6.5kDa)，核糖核酸酶A(14.6kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(20.3kDa)，卵白蛋白(46.7kDa)和白蛋白(62.9kDa)用作凝膠過濾的標(biāo)準(zhǔn)分子量。表面等離子體共振在25°C使用BIAcore2000設(shè)備測量SPR。如用于核糖體展示選擇制備生物素化PulD并固定在SA-chip的流動(dòng)池上。用于動(dòng)力學(xué)檢測和抑制檢測的固定的生物素化PulD-N的密度分別是200RU和800RU(飽和芯片)。NaCl，0.05%Tween20)。使用以運(yùn)行緩沖液稀釋到1/20的微IMAC純化的蛋白質(zhì)(見上)、之后注入以60pl/min流動(dòng)速率進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測而根據(jù)解離速率進(jìn)行結(jié)合物的篩選和分類。使用以lnM到50nM濃度范圍注入的大小排阻層析純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行確定親和力的動(dòng)力學(xué)檢測。在5nM結(jié)合物濃度和以濃度范圍從0.2nM到20nM的不同濃度PulD-N作為競爭物以流速25^il/min按如上述(Ostermeieretal.，1995)完成抑制檢測。確定結(jié)合相的傳感器圖的斜率并對PulD-N的濃度作圖。使用BIAeval軟件(BIAcore)完成數(shù)據(jù)評估。微量熱實(shí)驗(yàn)如前所述使用MicroCalVP-DSC熱量計(jì)進(jìn)行差示掃描量熱法(Hibleetal.,2005)。Sac7d重組野生型和變體的原液在50mMMES緩沖液中(pH5.6300mMNaCl)中4°C透析過夜。然后蛋白質(zhì)樣品在同樣的緩沖液中稀釋到200pg/ml，在真空中脫氣10min，輕柔振蕩，加入熱量計(jì)池(0.5ml)。參考池加入同樣的緩沖液。在恒定外部壓力25psi下，樣品原地保留以避免泡沫形成并達(dá)到130°C的蒸發(fā)作用，25°C平衡25min，以恒定加熱速率1deg./min加熱，并且使用16秒濾波器收集數(shù)據(jù)。由生產(chǎn)廠商提供的Origin7TM軟件(Plotnikovetal.，1997)分析數(shù)據(jù)。從熱容函數(shù)減去兩個(gè)基線，緩沖液參照溫度記錄圖和標(biāo)準(zhǔn)化至解折疊轉(zhuǎn)換進(jìn)程的濃度之后計(jì)算出的化學(xué)基線之后獲得過剩熱容函數(shù)(Cp，過剩)。每個(gè)蛋白質(zhì)樣品的解折疊轉(zhuǎn)換的熱力學(xué)參數(shù)是假定非雙狀態(tài)模型的過剩熱容曲線的非線性3參數(shù)(7^，A//eal，A/7vH)回歸的結(jié)果。堿性磷酸酶融合體的構(gòu)建編碼結(jié)合物的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，使用引物SCPhoAF(SEQIDNo:26:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAGGTGAAATTC)和SCPhoAR(SEQIDNo:27:ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGCTCCGCAC)和Phusion聚合酶在5'-和3'-末端分別導(dǎo)入Kpnl和Sacl。PCR產(chǎn)物用Kpnl和Sacl消化并克隆進(jìn)入pQUANTagen載體(Qbiogene)。因此堿性磷酸酶融合到結(jié)合物C末端。使用大腸桿菌DH5oc菌株和廠商說明書進(jìn)行堿性磷酸酶活性克隆篩選和周質(zhì)提取。簡要地，在LB板上篩選堿性磷酸酶活性的陽性克隆(100pg/ml氨芐青霉素，4ng/ml5-溴-4-氯-3』引哚基-磷酸鹽)。使用8ml過夜預(yù)培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，100ng/ml氨芐青霉素，37。C)接種400ml培養(yǎng)基(2YT培養(yǎng)基，100pg/ml氨芐青霉素，lg磷酸氫二鉀pH7.5，37°C)。當(dāng)0D6。。大約0.7時(shí)加入0.5mMIPTG完成tac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)并在30°C連續(xù)生長4h。離心沉淀細(xì)胞并重懸于40mlTSE緩沖液(30mMTris-HClpH8.0,蔗糖20%，0.5mMEDTA，0.1mg/ml溶菌酶)。4。C懸浮保溫20min，溫和攪動(dòng)完成溶菌酶休克。4°C在20000g離心30min去除細(xì)胞碎片并且上清液經(jīng)存于-20。C前用0.45pm膜過濾。使用堿性磷酸酶融合體的Western印跡離心不含任何表達(dá)載體的10ml大腸桿菌菌株DH5ot過夜培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，37。C)沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀重懸在lmlTBS(1XBugBuster和1^1Benzonase)。室溫裂解細(xì)胞30min并且懸液在20000g離心5min去除細(xì)胞碎片。然后上清液用于純化PulD-N的連續(xù)稀釋。用恒定體積的上清液和相當(dāng)于0.4ng到400ng可變量的純化PulD-N制備樣品，5^1樣品加載到SDS凝膠上。電泳后，蛋白質(zhì)從SDS凝膠轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上(Hybond-Cextra,0.45pm,GeneralElectric)。使用于TBST(20mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5，0.1%Tween20)的5%奶粉封閉。然后膜與用TBST奶稀釋1到15倍的融合體的可溶性周質(zhì)提取液保溫lh，輕柔攪動(dòng)。洗膜后，使用在反應(yīng)緩沖液(100mMTris-HClpH9.5，lOOmMNaCl,5mMMgCl2)中稀釋的沉淀底物NBT/BCIP(AP綴合物底物試劑盒,Biorad)完成檢測。GFP(綠色熒光蛋白)融合體的構(gòu)建和表達(dá)編碼結(jié)合物的基因經(jīng)BamHI和HindIII位點(diǎn)克隆入含有eGFP基因和編碼柔性肽接頭KLGSAGSAAGSGEF(SEQIDNo:32)的區(qū)域的pQE30衍生質(zhì)粒(pFP3000)。這導(dǎo)致與在N末端的MRGS(His)6tag的N-ter-結(jié)合物-接頭-eGFP-C-ter融合體。通過DNA測序檢測各個(gè)克隆的序列。在與僅有結(jié)合物的同樣條件下完成結(jié)合物-GFP融合體的表達(dá)和純化(即用IMAC和大小排阻層析步驟)。膜級分的分離和與40-eGFP嵌合體的相互作用研究帶有質(zhì)粒pCHAP3671(pulD)禾卩pCHAP580(pulS)(Guilvoutetal.,1999)或質(zhì)粒pCHAP3711(pulD-CS)(Guilvoutetal.，2006)和pCHAP580的大腸桿菌K-12菌株P(guān)AP105(Guilvoutetal.,1999)被用于膜囊泡的分離。培養(yǎng)物在含有適當(dāng)抗生素(100^g/ml氨芐青霉素，25pg/ml氯霉素)的LB培養(yǎng)基(Miller，1992)中30°C強(qiáng)通風(fēng)生長到對數(shù)生長期(0060():0.9-1.1)。細(xì)胞高壓破碎并再溶于Tris50mMpH7.5，NaCl150mM達(dá)到終濃度450pg/ml之后離心(180000xg，30min)分離膜級分。不同數(shù)量的膜囊泡與70pmo1純化的40-eGFP融合蛋白質(zhì)室溫保溫lh。離心(80000xg，20min)后使用同樣的緩沖液洗沉淀，再次離心并在相同體積中重懸。每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用GFP—抗采用免疫印跡方法進(jìn)行40-eGFP融合蛋白質(zhì)的檢測。使用固化的克隆6結(jié)合物進(jìn)行親和層析使用0.2M碳酸鹽緩沖液pH8.3(0.5MNaCl)透析17毫克IMAC純化的克隆6并注入已預(yù)先使用6mllmMHCl沖洗的lmlHiTrapNHS-活化的HP柱(GeneralElectric)。室溫固定30分鐘。洗柱并用0.5M乙醇胺(0.5MNaCl,pH8.3)和0.1M醋酸鹽(0.5MNaCl，pH8.3)室溫去活化任何殘留的活性基團(tuán)30min后，柱用TBSpH8.0(20mMTris,500mMNaCl)平衡并準(zhǔn)備用于純化。使用用質(zhì)粒pCHAP3702(Chamietal.，2005)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)表達(dá)PulD-N蛋白質(zhì)。50ml過夜預(yù)培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，100|ig/ml氨芐青霉素，1%葡萄糖,37。C)用于接種1L培養(yǎng)基(2YT,100Mg/ml氨芐青霉素，37°C)。當(dāng)OD600=1.0時(shí)添加l.OmMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在30°C(250rpm)保溫培養(yǎng)物4h。離心收集細(xì)胞并重懸于30mlTBSpH8.0。使用AvestinEmulsiflex勻漿器裂解細(xì)胞并經(jīng)離心去除細(xì)胞碎片。1.5ml這種可溶級分以0.5ml/min流速注入NHS-克隆6固化柱。使用40ml運(yùn)行緩沖液洗掉非特異性蛋白質(zhì)，使用lOOmM甘氨酸緩沖液(pH2.5，250mMNaCl)洗脫具有酸性pH改變的PulD-N。將級分上樣于SDS凝膠來檢測洗脫的蛋白質(zhì)的純度。Far-Western印跡如前制備大腸桿菌PAP105+/-PulD(pCHAP3671;(Guilvoutetal.,1999))或PulD-CS(pCHAP3711;(Guilvoutetal.，2006))以及PulS(pCHAP580;(Daefleretal.，1997))的外膜。重懸膜并貯存于含有10%蔗糖和O.lmg/ml蛋白酶抑制劑Pefabloc(Interchim，Montl叫on,France)的50mMTris-HCl，pH7.5中，并進(jìn)行SDS/PAGE和轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素片上，然后封閉并與菌株生產(chǎn)的Sac7-PhoA嵌合體的周質(zhì)(滲透壓休克)提取物保溫。洗后，通過抗PhoA抗體，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗和化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)合的PhoA。分泌使用空載體或編碼Sac7-PhoA嵌合體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株P(guān)AP7232(Hardieetal.,1996)。轉(zhuǎn)化株在含有0.4%麥芽糖(誘導(dǎo)產(chǎn)生支鏈淀粉酶和其分泌系統(tǒng)，包括PulD)和lmMIPTG的培養(yǎng)基中生長以誘導(dǎo)Sac7-PhoA產(chǎn)生。如(d'Enfertetal.，1989)所述檢測分泌水平并表示為與裂解細(xì)胞內(nèi)檢測到的酶活性(100%)相比在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)檢測的酶活性的量。使用PulD和PhoA抗體免疫印跡檢測細(xì)胞提取物。為分析Sac7-PhoA嵌合體對于高水平制備PulD的作用，使用側(cè)翼Pstl位點(diǎn)擴(kuò)增zeocin抗性基因并插入到相應(yīng)質(zhì)粒的W"M基因中獨(dú)特的Pstl位點(diǎn)。重組質(zhì)粒和pCHAP231(d'Enfertetal.，1987)—起轉(zhuǎn)化進(jìn)入包膜蛋白酶缺陷菌株P(guān)AP5198(&g尺ompr，/^)。如上用或不用IPTG誘導(dǎo)來分析支鏈淀粉酶分泌和PulD(預(yù)先使用或不使用苯酚處理)水平。結(jié)果實(shí)施例1:第一代文庫的設(shè)計(jì)(文庫11)研究使用Sac7d作為支架以獲得不同配體的結(jié)合物的可能性的首要關(guān)鍵一步是通過隨機(jī)化可能的結(jié)合區(qū)域同時(shí)保持親代Sac7d蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和可溶性來設(shè)計(jì)文庫。Sac7d-DNA復(fù)合物的幾個(gè)三維結(jié)構(gòu)已知(Agbacketal.,1998;EdmondsonandShriver,2001;Gaoetal.,1998;McAfeeetal"1995;McCraryetal"1996;Robinsonetal"1998;Suetal"2000)(圖la)。依據(jù)這些結(jié)構(gòu)，Sac7d與DNA小溝的結(jié)合包括與DNA非常匹配(形狀和電荷)的結(jié)合表面區(qū)域。這個(gè)結(jié)合區(qū)域由16個(gè)殘基組成(K7，Y8，K9,K21，K22，W24，V26，K28，M29，S31,T33，K39,T40,R42，A44,S46)(圖lb)。這個(gè)結(jié)合區(qū)域的目測顯示它是扭曲的并包含2種幾何形狀一個(gè)輕緩的凹面(K7,Y8,K9，W24,V26,K28,M29,S31,T33，R42,A44，S46)和另一個(gè)基本上平的面(K21,K22,W24,T33，K39，T40,R42)。這兩個(gè)面共用殘基W24,T33和R42。大約Sac7d序列的四分之一參與DNA結(jié)合。雖然所有這些殘基暴露于表面，25%的Sac7d序列的大量隨機(jī)誘變對于獲得的突變體的折疊和穩(wěn)定性可能是引人注目的。第一步，本發(fā)明者決定從誘變計(jì)劃中排除K28和K39，因?yàn)檫@兩個(gè)殘基不完全朝向結(jié)合面。排除他們的第二個(gè)原因是由于用于引物退火重疊部分的減少(見下)，將不能如下描述經(jīng)一步PCR產(chǎn)生文庫。我們也假定結(jié)合區(qū)域的凹面?zhèn)鹊膸缀螌W(xué)可與球狀蛋白質(zhì)的球形匹配良好，或至少其能容納它們暴露環(huán)的結(jié)合。因此，取代策略集中在Sac7d的這個(gè)區(qū)域的ll個(gè)殘基上(K7，Y8，K9,W24,V26,M29，S31，T33,R42，A44,S46)。編碼Sac7d的基因非常短(大約200堿基對)。因此，經(jīng)一步PCR可獲得相當(dāng)于隨機(jī)取代所述11個(gè)殘基的文庫。使用三個(gè)簡并寡核苷酸(NNS方案)和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸的混合物完成這個(gè)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)化位置的密碼子經(jīng)代表所有氨基酸的NNS三聯(lián)體編碼。對于這種誘變策略，理論的多樣性是大約3.2x1016(3211)，其超出實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)的我們文庫多樣性的大約4個(gè)數(shù)量級。當(dāng)然，依據(jù)用于產(chǎn)生核糖體展示構(gòu)建的PCR裝配產(chǎn)物的量，文庫估計(jì)的上限大約是3.0"012變體。40個(gè)隨機(jī)克隆測序確定觀測的殘基頻率與所預(yù)測的類似(數(shù)據(jù)未顯示)。無任何移碼或缺失的正確克隆的百分率大約是50%。因此，"功能性"多樣性被認(rèn)為滿意并且文庫被用于選擇。實(shí)施例2:使用文庫11進(jìn)行核糖體展示選擇3個(gè)蛋白質(zhì)被選作靶DnaK，GarA(都來自結(jié)核桿菌(Myco6acfen'wm^^wcm/o^)和PulD的N末端結(jié)構(gòu)域(來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌(尺/&15&/&Ox_yto0)。PulD是外膜蛋白質(zhì)，其不能保持在無離子去垢劑的溶液中。因此使用可溶性單體片段。這個(gè)片段命名為PulD-N，相當(dāng)于PulD的N末端區(qū)域。選擇這些靶是因?yàn)樘禺愋院蚢vid結(jié)合物是研究DnaK,GarA和PulD的有用工具。此外這些蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)研究的結(jié)晶是困難的。如用抗體片段相同的方法將識別這些蛋白質(zhì)的結(jié)合物用于共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)(Ostermeieretal.，1995)。包被neutmvidin的ELISA板用于固定生物素化蛋白質(zhì)并進(jìn)行選擇。4輪選擇后，發(fā)現(xiàn)所有3個(gè)靶的特異性結(jié)合物的富集(圖6a)。在所有情況中，依據(jù)RIA，超過50%的結(jié)合池被10pM游離靶所抑制。經(jīng)ELISA進(jìn)一步評估結(jié)合池以用PulD-N選擇，使用BamHI和HindIII限制性位點(diǎn)將來自選擇的池的RT-PCR產(chǎn)物克隆入pQE30載體(Qiagen)。產(chǎn)生的連接產(chǎn)物被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a。從培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選96個(gè)克隆并接種于每孔含有1.5mlLB培養(yǎng)基(10(^g/ml氨芐青霉素，1%葡萄糖)的深孔板中。37°C，250rpm過夜培養(yǎng)后，從這個(gè)主板的每孔取0.2ml接種另一每孔含有1.3ml2YT培養(yǎng)基(100pg/ml氨芐青霉素)的深孔板。然后板在37°C，250rpm保溫lh。加入0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)并在30°C，250rpm保溫4h。離心(2250g)沉淀細(xì)胞并去除上清液。每孔使用5(^1BugBuster(Novagen)在250rpm搖動(dòng)30min提取蛋白質(zhì)，然后加入250WTBSpH7.4(20mMTris-HCl，150mMNaCl)。離心(2500g)沉淀細(xì)胞碎片。對于ELISA篩選，使用lOOpl每種上清液測試包被在Maxisorp板上的PulD-N或BSA的結(jié)合。使用只從結(jié)合物中檢測RGS-(HiS)6-tag而不從靶蛋白質(zhì)中檢測(His)6-tag的RGSHis抗體HRP綴合物(Qiagen)和Roche的BM-Blue底物進(jìn)行檢測。所有保溫步驟在TBSpH7.4含0.1%Tween20中進(jìn)行。在OD340nm檢測所有克隆的PulD-N和BSA結(jié)合。計(jì)算每個(gè)克隆的BSA結(jié)合值與PulD-N值的比率。第4輪大約92%的克隆觀察到超過10的信噪比(圖6b)。通過ELISA檢測來自PulD-N選擇(第4輪)的6個(gè)純化克隆對DnaK,GarA，PulD-N和BSA的結(jié)合。如圖6c所示，結(jié)合特異于PulD-N。來自第4輪的28個(gè)克隆測序顯示序列的高多樣性；確實(shí)未發(fā)現(xiàn)一條序列指示可使用更高選擇壓力。而且，在任意所有l(wèi)l個(gè)隨機(jī)位置(數(shù)據(jù)未顯示)未發(fā)現(xiàn)野生型殘基。IMAC(固定金屬離子親和性層析)純化9個(gè)克隆后評估的平均表達(dá)產(chǎn)量大約是70mg/L培養(yǎng)物(30。C保溫4h)。結(jié)合物可被濃縮至少達(dá)到45mg/ml?？傊@些結(jié)果建議Sac7d的結(jié)合區(qū)域?qū)θ〈歉叨饶褪艿牟⑶疫x擇的變體保持滿意的生物物理學(xué)特性。但是，RIA的更詳細(xì)分析顯示來自第4輪的池中與結(jié)合物的平均親和力為大約100nM并且經(jīng)溫和(2h)或更強(qiáng)烈(17h)的解離速率選擇進(jìn)行第5輪不能增加抗PulD-N池的平均親和力(圖7)。這種低親和力在應(yīng)用上是局限的，所述應(yīng)用需要低納摩爾解離常數(shù)。因此，本發(fā)明人決定嘗試其他方法以獲得更高的親和力。實(shí)施例3:第二代文庫文庫13和14)的設(shè)計(jì)提高親和力的一個(gè)直觀方法是延伸結(jié)合區(qū)域并因此增加結(jié)合物和其配體之間相互作用的潛在數(shù)量。相應(yīng)于11個(gè)殘基的隨機(jī)化的潛在的結(jié)合區(qū)域具有890人2溶劑可及表面。Sac7d對于ll個(gè)取代非常耐受，因此決定隨機(jī)化2個(gè)或3個(gè)額外位置K21和K22(文庫13)或K21,K^2和T40(文庫l4)，它們分別相當(dāng)于1130A2和1200A2。另一個(gè)說明可以是凹的結(jié)合區(qū)域不適于結(jié)合蛋白質(zhì)和因此使用一個(gè)更平坦的表面可提高最終的親和力。這2個(gè)新文庫(每個(gè)3.0X1012變體)采用與文庫11同樣方法構(gòu)建。文庫14的70個(gè)隨機(jī)克隆的測序確定觀察到的殘基頻率與預(yù)測的相似，表示S、L和R氨基酸殘基略低，P、N、Q和H氨基酸殘基略高(數(shù)據(jù)未顯示)。無任何移碼突變或缺失的正確克隆的百分率大約是65%。因此，"功能性"多樣性被認(rèn)為是滿意的并且文庫被用于選擇。實(shí)施例4:使用文庫13和14用PulD-N作為靶蛋白進(jìn)行核糖體展示選擇使用這些文庫和PulD-N作為靶蛋白質(zhì)完成4輪選擇。文庫11，13，14經(jīng)溫和解離速率選擇2小時(shí)以富集池中具有更低解離速率的結(jié)合物而平行完成第5輪選擇。第5輪后池的放射免疫分析指示2個(gè)新文庫的特異性PulD-N結(jié)合物的富集。在固化的BSA或neutravidin上不能檢測結(jié)合。而且RIA顯示10nM游離PulD-N足以抑制大約50%與文庫13的結(jié)合信號，lOOnMPulD-N可同樣水平抑制與文庫11的結(jié)合信號。文庫14甚至更好，lnM競爭物足以實(shí)現(xiàn)大約20%結(jié)合信號的明顯抑制。因此，用文庫14的設(shè)計(jì)對于平均親和力至少增加了一個(gè)數(shù)量級。實(shí)施例5:文庫14的抗-PulD-N的特性5丄遂獰游結(jié)合欽游分析表達(dá)浙錄眾因?yàn)榭梢栽诘米晕膸?4的池中發(fā)現(xiàn)最有希望的親和力(第5輪)，分析這個(gè)文庫的結(jié)合物池。富集的池被克隆進(jìn)入表達(dá)質(zhì)粒pQE30，使用大腸桿菌菌株DH5cc制備蛋白質(zhì)。使用固化的PulD-N或BSA和大腸桿菌粗提物經(jīng)ELISA方法分析48個(gè)單個(gè)克隆。對于所有克隆，檢測相對于背景的顯著特異性結(jié)合。因此，測序所有結(jié)合物以進(jìn)一步分析。對于文庫11觀察到甚至在5輪選擇后仍保持結(jié)合物的大量多樣性(圖8)。但是，依據(jù)它們的同源性大多數(shù)的克隆可被分為6個(gè)家族(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，在2個(gè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)同樣的克隆，所有其他克隆是唯一的，提示選擇收斂性(convergences發(fā)現(xiàn)在隨機(jī)位置的殘基具有非常不同的特性，帶有脂肪族和芳香族側(cè)鏈以及電荷或疏水側(cè)鏈。在一些位置可觀察到對于一些特殊殘基的明顯優(yōu)先。例如，可大約半數(shù)的克隆中位置R42被酪氨酸占據(jù)，可能反映了它對于結(jié)合PulD-N的重要性。在所有可控的突變中，觀察到天然殘基非嚴(yán)格的保守性，包括3個(gè)與文庫11比較被靶向的新位置(K21,K22和T40)。最后，在40個(gè)測序的克隆中在560(40x14)個(gè)殘基中僅保留7個(gè)天然殘基。因此，這些觀察提示所述14個(gè)位置耙向了所有耐受的隨機(jī)取代。結(jié)合物在30°C過夜生長的大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中大量積累并經(jīng)僅一步IMAC從1升搖瓶培養(yǎng)物中純化為均質(zhì)，產(chǎn)量直至達(dá)到200mg(圖9)。蛋白質(zhì)采用15%丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠電泳跑到它們預(yù)期分子量的位置。在標(biāo)準(zhǔn)的TBS緩沖液中純化的結(jié)合物可被濃縮達(dá)到60mg/ml，其在4°C數(shù)月無沉淀并保持可溶。大小排阻層析顯示研究的克隆6,39，40和41結(jié)合物是單體。如Sac7d，在這個(gè)化驗(yàn)中所有結(jié)合物比預(yù)期的更大(確定為11.5kDa而不是計(jì)算的9.1kDa)，可能是由于一個(gè)9個(gè)殘基N末端標(biāo)簽的存在而導(dǎo)致球形的偏差。5.2.尸"/D-iV辦激條浙力為了確定最高親和力克隆，使用48個(gè)克隆進(jìn)行微表達(dá)和IMAC純化。然后采用固化于鏈霉抗生物素包被的芯片上生物素化PulD-N通過SPR篩選這些純化的蛋白質(zhì)。在所有結(jié)合物化驗(yàn)中，在僅包被鏈霉抗生物素的空白面上未觀察到明顯結(jié)合，支持結(jié)合對于PulD-N是特異性的觀點(diǎn)。依據(jù)解離階段的分析，選擇具有最慢解離速率的5個(gè)克隆用于通過SPR確定單價(jià)蛋白質(zhì)的詳細(xì)親和力確定。經(jīng)凝膠過濾進(jìn)一步純化這5個(gè)克隆，6，33，39，40和41。在不同濃度進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析和使用整體動(dòng)力學(xué)擬合(globalkineticfit)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)所有PulD-N結(jié)合物的解離常數(shù)在皮摩爾或低納摩爾范圍內(nèi)(圖10a和表3)?？寺?和33具有最高的親和力(分別是KD=130pM和190pM)。在高離子強(qiáng)度條件下(300mMNaCl)，締合動(dòng)力學(xué)稍稍減少(1.3倍)，指示這些締合不是靜電輔助的(數(shù)據(jù)未顯示)。由競爭SPR分析確定這5個(gè)結(jié)合物的Kd值(圖10b和表3)(Niebaeta1.，1996)。對照實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)檢測野生型Sac7d與固化的PulD-N的結(jié)合時(shí)未發(fā)生結(jié)合，指示觀察到的選擇克隆的結(jié)合特性是新導(dǎo)入的功能所導(dǎo)致而不是預(yù)先存在的Sac7d與PulD-N親和力的結(jié)果。克隆kon〖M-V']KD[nM〗aKD[nM]b%活性c61.91072.510-30.130.14±0.0390-100331.71073.21030.190.17±0.0390-100391.71078.61030.521.1±0.290-100402.31071.41020.600.9±0.290-100412.01071.21020.611.1±0.190-100表3:由表面等離子共振確定的解離常數(shù)總結(jié)。a:動(dòng)力學(xué)分析獲得的kd值.b:srp競爭實(shí)驗(yàn)獲得的kd值.°:來自srp競爭實(shí)驗(yàn)分析。這些結(jié)合物的序列分析揭示不同情況(圖8)?？寺?和33中的隨機(jī)化位置是不同的，盡管事實(shí)是它們各自的Ko值在同一范歐130-M0pM)。相反，與克隆41一樣，克隆40具有11/14隨機(jī)化的殘基，并具有相似的Kd值(-lnM)。克隆39與克隆6分享10/14隨機(jī)化的殘基，但具有低于7倍的親和力。有趣地，發(fā)現(xiàn)在克隆39的C末端被截短4個(gè)殘基但保留了與PulD-N結(jié)合的能力。這并不意外，正如Sac7d的幾個(gè)截短形式也是存在的(McAfeeetal.，1995)。5.丄尸w/Z)-7V翁合激游穩(wěn)定絲Sac7d是一個(gè)超熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，其在pH7.、7^91。C時(shí)解折疊，在更低的pH(McCraryetal.,1996)時(shí)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性降低。經(jīng)差示掃描量熱法比較克隆6，33以及40和野生型Sac7d的熱穩(wěn)定性。為了確保蛋白質(zhì)在低于DSC(125。C)極限高溫下蛋白質(zhì)完全展開，所有掃描使用pH5.6。發(fā)現(xiàn)克隆在變性溫度68°C和83°C之間(圖11和表4)是熱穩(wěn)定的?？寺?0非常穩(wěn)定，其rm值低于野生型(89.7。C)僅5.8°C，其后是克隆33(Arm=-10.5°C)，最不穩(wěn)定的是克隆6(A7^-22.0。C)。但是克隆6的7^仍高于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)平均rm值8。C(Freire，2001)。DSC掃描是協(xié)同解折疊(cooperativeunfolding)的特征，指示雖然具有高突變負(fù)載(直至14個(gè)殘基被突變，即21%的Sac7d突變)，Sac7d變體能夠采用與野生型一樣的折疊結(jié)構(gòu)。克隆40和33的量熱焓(每摩爾熱改變，A//eal，)分別低于野生型(42.5kcal.mol")僅5.8和4.8kcal.mol-l(表4)。而且對于克隆40和克隆33，yff，van，tHoff焓與量熱焓的比值(每協(xié)同解折疊單位的熱改變)接近，并與野生型Sac7d的^l接近。這個(gè)觀察強(qiáng)烈指示克隆40和克隆33的解折疊相當(dāng)于折疊蛋白質(zhì)單體的解折疊(表4)?？寺?呈現(xiàn)比野生型更低的量熱焓(低18.10kcal,mor1)和更高的/比值(表4)。這些觀察可能涉及在蛋白質(zhì)較不穩(wěn)定的酸性pH時(shí)克隆6蛋白部分解折疊(在pH7克隆6的rm是8°C以上；數(shù)據(jù)未顯示)?？傊@些現(xiàn)象顯示克隆6，33和40最大限度保留野生型蛋白質(zhì)的有利的熱穩(wěn)定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表4:Sac7d的wt和變體的熱解折疊參數(shù)a:rm是土0,rC;b:Ai/cai是±0.3kcal.mor1，A//vH是±0.5kcal.mol";c:^=A//vH/A//cai5乂尸"/D-iV翁合激游特，絲這些PulD-N結(jié)合物特異性如何，和他們可被用于生物技術(shù)應(yīng)用的哪個(gè)特異性是關(guān)鍵的？為回答這些問題，結(jié)合物6，33和40融合到大腸桿菌堿性磷酸酶的N末端(PhoA)。使用編碼PhoA信號肽的pQUANTagen載體在菌株DH5a內(nèi)將嵌合體(Sac7、PhoA)生產(chǎn)為周質(zhì)蛋白。然后經(jīng)滲透壓休克從周質(zhì)提取嵌合體并且采用PulD-N-或BSA-包被的小孔經(jīng)ELISA分析它們的功能性。采用對硝基苯磷酸鹽顯色底物和分光光度法定量結(jié)合的融合體(數(shù)據(jù)未顯示)。所有三個(gè)嵌合體都觀察到高于背景的信號(信號/背景比例>10)。這顯示嵌合體是1)在周質(zhì)內(nèi)輸出，2)仍能特異性識別PulD-N和3)催化活性。因此這些融合體可用作一步法ELISA檢測試劑。為了評價(jià)是否這些融合體能夠在復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中區(qū)別PulD-N蛋白，例如在大腸桿菌粗提物中，我們將它們作為免疫印跡檢測試劑。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，收集和裂解過夜培養(yǎng)的無質(zhì)粒的DH5oc。在每個(gè)試管中加入等分的粗提物和數(shù)量遞減的純化的PulD-N。SDS-PAGE和轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，在沉淀顯色底物(NBT/BCIP)以低至1.5-3ng(圖12a)的量無交叉反應(yīng)性存在時(shí)使用結(jié)合物-PhoA嵌合體檢測PulD-N。這支持了ELISA觀察到的融合體的雙重功能性(圖12a)。當(dāng)更大量的內(nèi)源性蛋白質(zhì)存在時(shí)完成低量PulD-N的檢測，證明結(jié)合物6，33和40能夠在幾千種蛋白質(zhì)中區(qū)別PulD-N并因此是高特異性的。為了進(jìn)一步評價(jià)特異性，在lmlNHS-瓊脂糖活化柱上經(jīng)胺偶聯(lián)反應(yīng)將結(jié)合物6共價(jià)固定。相當(dāng)于40ml的產(chǎn)生PulD-N的培養(yǎng)物的大腸桿菌粗提物可溶性級分注入柱。在加載，沖洗和洗脫(酸性pH改變)步驟時(shí)收集級分。SDS-PAGE分析這些級分顯示柱能夠捕獲存在于粗提物中的PulD-N并且以高特異性完成這個(gè)捕獲，因?yàn)樵谌旧腟DS-PAGE膠上僅有一條可見的相當(dāng)于PulD-N的條帶(圖12b)。因此，再次確認(rèn)結(jié)合物從幾千種蛋白質(zhì)中區(qū)別PulD-N的能力。實(shí)施例6:PulD-N結(jié)合物與十二聚體PulD的結(jié)合下一步，本發(fā)明人研究是否對于PulD-N具有最高親和力的3個(gè)選擇的Sac7d衍生物(結(jié)合物6，33和40)能夠識別與整合進(jìn)大腸桿菌外膜的全長PulD蛋白。全長PulD在膜內(nèi)形成十二聚體(PulD-N是單體)(Chamietal.，2005)并且不能排除PulD多聚化影響每一個(gè)結(jié)合物識別的表位，因此阻止它們與天然PulD的結(jié)合。當(dāng)遞增量的含有PulD的大腸桿菌PAP105(pCHAP3671pCHAP580)膜與飽和量的GFP-標(biāo)記結(jié)合物40或33混合時(shí)，離心后沉淀物中殘留的結(jié)合物量相應(yīng)增加(圖13A)。GFP-標(biāo)記結(jié)合物不與含有缺失N-結(jié)構(gòu)域的PulD變體的PAP105(pCHAP3711pCHAP580)的膜一起沉積(Guilvoutetal.，2006)(圖.13A)。因此，這些GFP-結(jié)合物嵌合體與膜的結(jié)合是PulD-N特異性的，并且盡管存在GFP標(biāo)簽，它們與天然十二聚體分泌素復(fù)合物結(jié)合。結(jié)合物6僅與含有PulD的膜微弱結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。far-Western免疫印跡用于驗(yàn)證Sac7d衍生物與PulD十二聚體的結(jié)合。所有3個(gè)Sac7*-PhoA嵌合體與單體和十二聚體PulD特異性結(jié)合，但不與PulD-CS結(jié)合(圖13B)。雖然這3個(gè)嵌合體與苯酚解離(單體；見(Hardieetal.，1996)的PulD均等結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，對于十二聚體PulD它們始終呈現(xiàn)不同的表觀親和力，范圍從高(結(jié)合物40)到低(結(jié)合物6)。實(shí)施例7:PulD-N結(jié)合物抑制支鏈淀粉酶分泌和防止PulD多聚化Sac7d或其衍生物位于PhoA信號肽和PhoA的催化部分之間的31Sac7*-PhoA嵌合體有效地輸出到周質(zhì)，如通過高PhoA活性和周質(zhì)休克時(shí)釋放所監(jiān)測到的。編碼Sac7、PhoA嵌合體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌菌株P(guān)AP7232，其中/"/基因整合到染色體。IPTG誘導(dǎo)后所有3個(gè)嵌合體以相似量產(chǎn)生并被完全抑制支鏈淀粉酶分泌，但是輸出的Sac7d-PhoA沒有影響。而且，在制備任何Sac7、PhoA嵌合體的菌株中未檢測到PulD十二聚體或單體(數(shù)據(jù)未顯示)。為獲得這些現(xiàn)象的更準(zhǔn)確的信息并研究在制備嵌合體菌株中PulD的命運(yùn)，在帶有pCHAP231(以增加T2SS制備；見GuilvoutW"/.，2006)的包膜蛋白酶缺陷菌株P(guān)AP5198中制備它們。IPTG-誘導(dǎo)的Sac7*-PhoA生產(chǎn)水平抑制支鏈淀粉酶分泌>90%(圖14A)。十二聚體PulD很不豐富，并且PulD單體比無嵌合體或帶有Sac7d-PhoA的對照相應(yīng)地更豐富(圖14B箭頭)，證明嵌合體防止PulD多聚化和經(jīng)包膜蛋白酶導(dǎo)致PulD單體降解。用未誘導(dǎo)水平的Sac7*33-PhoA和Sac7*40-PhoA獲得類似結(jié)果，但是當(dāng)Sac7*6-PhoA以未誘導(dǎo)水平存在時(shí)，大量支鏈淀粉酶分泌(>50%)和PulD多聚化發(fā)生(圖14C)。實(shí)施例8:與其他靶結(jié)合的Sac7d變體的篩選采用如上述同樣技術(shù)使用最佳文庫(文庫14)獲得特異于其他靶的結(jié)合物。通過集中于以下蛋白質(zhì)的抗蛋白質(zhì)核糖體展示進(jìn)行選擇PulDN1(26.8kDa)，NGF(13kDa),PknG(81.6kDa)，GarA(12kDa)和溶菌酶(14.3kDa)直至第5次循環(huán)。在第4次循環(huán)過程中，使用或不使用靶平行進(jìn)行選擇過程。圖15顯示4次選擇循環(huán)之后，僅當(dāng)靶存在時(shí)可獲得PCR產(chǎn)物(泳道標(biāo)記為"+")。這建議選擇池富集對于每個(gè)檢測的靶特異的克隆。為了進(jìn)一步評估選擇過程的成功，使用不同抑制濃度的靶蛋白質(zhì)進(jìn)行競爭性放射免疫分析(RIA)。這些RIA清晰顯示明顯富集抗PknG、抗溶菌酶和抗PulDNl選擇，但是在NGF和GarA中未見富集，結(jié)果提示選擇未足夠收斂。圖16顯示對于抗PknG和抗溶菌酶變體的平均預(yù)期親和力是1至U10nM。用于循環(huán)5的抗溶菌酶、抗PknG和抗GarA選擇池依據(jù)ELISA方法經(jīng)預(yù)備96孔微培養(yǎng)物和在30°CIPTG誘導(dǎo)克隆表達(dá)4h后使用細(xì)菌裂解上清液進(jìn)行篩選。圖17的結(jié)果清晰顯示存在對于每個(gè)靶特異性的克隆。雖然不鼓勵(lì)RIA檢測GarA，使用ELISA方法仍可檢測到顯著比例的陽性克隆。分離和測序結(jié)合GarA的特定克隆。圖19顯示這個(gè)結(jié)合物序列REKDAPKELLDMLARAEREKKL，SEQIDNo:47)和Sac7d的排列對比。關(guān)于PknG，似乎明顯比例的克隆結(jié)合BSA，其提示需要額外的選擇循環(huán)以便于清除它們。進(jìn)行抗PulDNl和抗NGF篩選。通過制備96孔微培養(yǎng)物采用Biacore對陽性抗溶菌酶克隆的檢測最佳預(yù)期親和力(長化合物解離時(shí)間(koff))進(jìn)行選擇和分類。然后測序選擇的24個(gè)最佳克隆(圖18)。優(yōu)先序列如Lys—Bll克隆的序列是很明顯的，因?yàn)槠浔伙@示了多次(盡管用相同氨基酸的不同密碼子編碼某些位置)。第4次循環(huán)的篩選揭示了更大的多樣性(未示出)。在大腸桿菌中制備3個(gè)不同序列的克隆(Lys—B3，Lys一H4和Lys—H8)，經(jīng)IMAC和流經(jīng)分子篩大規(guī)模純化。獲得的制備水平大約分別是120，40和25mg/L培養(yǎng)物。獲得和處理經(jīng)Biacore確定的親和力?，F(xiàn)有(初步)數(shù)據(jù)指示親和力數(shù)量級為15nM、3nM和25nM(分別是Lys—B3、Lys—H4禾口Lys—H8)。經(jīng)微量熱方法描述3個(gè)抗溶菌酶克隆(Lys一B3，Lys一H4和Lys—H8)特性以便于確定它們在溶液中的熱穩(wěn)定性和親和力。其他選擇獲得的克隆也將被Biacore篩選和測序，并且經(jīng)Biacore將更準(zhǔn)確地確定某些克隆的親和力。實(shí)施例9:結(jié)合人IgGFc片段的Sac7d變體的選擇5U.&翁合激游透摔Bio-Rad使用磺基琥珀酰亞胺基-6-(生物素氨基)己酸酯(sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate)化學(xué)生物素化Bio畫Rad提供的人IgGFc片段(MW:50kDa)。由HABA化驗(yàn)確定的生物素化程度大約是每個(gè)蛋白質(zhì)分子2到3分子生物素。生物素化Fc結(jié)合Maxisorp板中(Nunc)固化的neutravidin或鏈霉抗生物素并經(jīng)核糖體展示在4°C使用Sac7d衍生的文庫進(jìn)行選擇(如上述)。進(jìn)行4輪選擇分離結(jié)合物。每輪交替使用33neutravidin和鏈霉抗生物素以避免非特異性結(jié)合物。9.2.選捧游^^泡游伊仿在一輪選擇后，獲得帶有RGS-His6-tag的序列池(推測的結(jié)合物)。在體外使用大腸桿菌S30提取物翻譯這個(gè)池并使用抗RGS-His6-tag-HRP綴合物檢測其結(jié)合活性。檢測選擇池內(nèi)針對被動(dòng)固化Fc片段的結(jié)合活性，未觀察到針對BSA，Neutmvidin和鏈霉抗生物素的結(jié)合信號(未顯示)。這個(gè)結(jié)果提示結(jié)合物池可能是Fc片段特異性并且Neutravidin和鏈霉抗生物素對于結(jié)合活性可能無顯著作用。也進(jìn)行用這個(gè)翻譯池的競爭ELISA以初步評估選擇的結(jié)合物的平均親和力。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，翻譯是與幾個(gè)濃度的Fc片段預(yù)保溫之后在Fc片段固化的ELISA板中保溫。圖20顯示，20%和70%信號可分別被10nM和100nMFc抑制。這提示預(yù)期平均親和力大約是幾十nM。這個(gè)親和力范圍與觀察到的PulD-N選擇的相似。實(shí)施例10:技術(shù)自動(dòng)化為了增加上述技術(shù)的潛力，核糖體展示選擇方案(圖21)轉(zhuǎn)化為連續(xù)、同時(shí)和快速檢測多種靶的自動(dòng)化平臺(仍使用文庫14或任何其他文庫，例如從不同于Sac7d的OB-fold蛋白質(zhì)開始)。為此目的已完全裝備TecanGemini150機(jī)器人。這個(gè)工作站包括幾個(gè)加熱/冷卻/攪拌模塊，MJ研究熱循環(huán)儀用于帶有電動(dòng)蓋的自動(dòng)化工作站，進(jìn)行反應(yīng)設(shè)置、RNA和DNA清除和用整體微板閱讀器檢測核酸濃度的所有必須附件。目的是根本不需手工干涉進(jìn)行一輪選擇。僅在每輪選擇之間需要手工干涉如在每輪循環(huán)末更換許多塑料物品。經(jīng)核糖體展示(圖21)進(jìn)行的手動(dòng)選擇是反復(fù)的(需要5輪以富集結(jié)合物)、挑剔的(許多轉(zhuǎn)錄、翻譯、PCR、RT-PCR步驟)和因此僅幾個(gè)靶就很耗時(shí)和甚至一個(gè)試驗(yàn)者對于超過4個(gè)靶時(shí)難于管理。因此，使用機(jī)器人進(jìn)行選擇具有很大的實(shí)際優(yōu)勢。機(jī)器人工作站(對PulD靶)選擇方案確認(rèn)之后，有可能在1或2周的時(shí)間內(nèi)針對直至48個(gè)靶選擇結(jié)合物。討論本發(fā)明人研究了百萬年來OB-fold折疊適于與廣泛多樣配體結(jié)合的進(jìn)化過程的潛在益處，所述配體包括金屬離子，糖，核酸(RNA、單鏈和雙鏈DNA)和蛋白質(zhì)。它們能夠顯示OB-fold家族成員經(jīng)體外進(jìn)化確實(shí)能夠從DNA識別轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)識別。這導(dǎo)致成功產(chǎn)生給定靶的高親和力、高特異性結(jié)合物。觀察到OB-fold結(jié)構(gòu)是極化的，意味著在所有OB-fold蛋白質(zhì)中結(jié)合面總是相同的(Arcus，2002)，使得能夠設(shè)計(jì)保留野生型蛋白質(zhì)的有利的生物物理特性的Sac7d變體文庫。在經(jīng)常參與配體結(jié)合的環(huán)l、3和4長度內(nèi)不同OB-fold蛋白質(zhì)可呈現(xiàn)大量變化(圖lb和2)。雖然目前使用的大多數(shù)支架基于與抗體相似的柔性環(huán)的隨機(jī)化(Binzetal.，2005)，本發(fā)明人決定保持天然Sac7d蛋白質(zhì)的最初環(huán)的長度。首先他們假定結(jié)合區(qū)域的稍凹陷部分將最佳適于用作耙的蛋白質(zhì)的球形。但是如上所報(bào)道，這個(gè)區(qū)域的殘基的隨機(jī)化不能獲得好于納摩爾的結(jié)合物。這個(gè)潛在的結(jié)合面相當(dāng)于大約890A2的溶劑可及表面并在抗體-蛋白質(zhì)締合的典型的范圍內(nèi)(777±135A2)(JonesandThornton,1996)。因此，這個(gè)表面足以提供足夠的相互作用能量以獲得具有高親和力的單體結(jié)合物。然后檢測具有3個(gè)以上取代的潛在結(jié)合區(qū)域的擴(kuò)展。使用核糖體展示成功完成幾個(gè)不同靶的結(jié)合物的選擇。與富集需要5到6輪的用完全合成的天然scFv文庫的選擇不同(Hanesetal.，2000)，用Sac7d文庫在第3輪后已經(jīng)觀察到顯著富集。這可以解釋為與抗體比較Sac7d更有效的折疊，它既不需要二硫鍵形成以達(dá)到其天然狀態(tài)也不需要兩個(gè)連接的結(jié)構(gòu)域具有功能性的正確締合(如scFv片段)。高比率富集與描述的DARPin支架(Binzetal.，2004a)相似。最終，針對PulD-N的選擇結(jié)果證明文庫含足夠的功能多樣性提供能夠識別同樣靶蛋白質(zhì)的不同結(jié)合物。這確認(rèn)了本發(fā)明Sac7d文庫的設(shè)計(jì)。透鄉(xiāng)齢激游歸針對PulD-N選擇的單體結(jié)合物的特性顯示使用Sac7d文庫可獲得皮摩爾親和力。這些親和力是使用不需要親和力成熟步驟的支架蛋白獲得的最高親和力(綜述，見(Hosseetal.，2006)和其中的參考文獻(xiàn))。結(jié)合動(dòng)力學(xué)也是顯著的，締合率大約是21(^M".s"，使得PulD-N結(jié)合物屬于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的擴(kuò)散限制締合率上限范圍(GabdoullineandWade,1997)。締合率似乎不是靜電輔助的。因此，無需構(gòu)象改變，高締合率可解釋為結(jié)合物"預(yù)先形成的(preformed)"形狀與靶幾何學(xué)匹配。獲得的高親和力與非常高的特異性相關(guān)。本發(fā)明人已顯示無論環(huán)境(context)(大腸桿菌粗提物或膜)和方法(免疫印跡或親和層析)如何，所有檢測的結(jié)合物能夠在幾千種其他蛋白質(zhì)中區(qū)別靶。這個(gè)嚴(yán)格的特異性可能與防止對不同靶的微小適應(yīng)性的支架剛性有關(guān)。而且在ELISA化驗(yàn)中所有幾十種篩選的結(jié)合物顯示均是靶特異性的，指示應(yīng)用的選擇壓力足以去除粘性分子。變體重組蛋白的產(chǎn)量(達(dá)到200mg/l大腸桿菌培養(yǎng)物)比報(bào)道的Sac7d的(大約10-15mg/l)高很多。誘導(dǎo)野生型^^基因表達(dá)后數(shù)小時(shí)發(fā)生的裂解可解釋這個(gè)不同。這個(gè)毒性可能是由于Sac7d結(jié)合到大腸桿菌染色體誘導(dǎo)的調(diào)控途徑的干擾，因?yàn)镾ac7d是一個(gè)通用DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。變體未見這個(gè)局限性，提示變體確實(shí)丟失了它們的DNA結(jié)合特性。比較3個(gè)變體與嗜熱生物的幾個(gè)其他蛋白質(zhì)(Kahsaietal.，2005)的熱力學(xué)穩(wěn)定性以及結(jié)合物的熱穩(wěn)定性與野生型Sac7d的相近?？寺?，分析的最不穩(wěn)定的克隆，仍保留在pH5.6時(shí)rm大約68°C、Tm低于pH7.0時(shí)的8°C的熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)。因此，看來盡管從克隆到克隆觀察到可變的Tm值，上述整體文庫設(shè)計(jì)組合應(yīng)用極端生物來源的蛋白質(zhì)導(dǎo)致生成具有所需識別特性的非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。支縦微分鵬沐鵬合微謝鄉(xiāng)檢測的所有3個(gè)Sac7*-PhoA嵌合體結(jié)合單體全長PulD。Sac7*40-PhoA和Sac7*33-Ph0A很好地結(jié)合十二聚體PulD，指示它們的表位保持著可接近性。相反，Sac7+6-PhoA僅微弱結(jié)合PulD十二聚體，但在體外對PulD匪N具有最高的親和力，指示其表位部分掩蔽多聚化和不同于Sac7*40和Sac7*33識別的。ITC競爭實(shí)驗(yàn)指示Sac7*6和Sac7*40識別的表位是相同的或重疊的(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)與PhoA融合時(shí)，這兩個(gè)結(jié)合物體內(nèi)作用的不同提示它們的表位重疊。所有3個(gè)Sac7*-PhoA變體防止PulD多聚化和靶定的PulD單體被包膜蛋白酶降解，因此阻斷支鏈淀粉酶分泌。早期證據(jù)指示N結(jié)構(gòu)域不影響PulD多聚化(Guilvoutetal.,2006)。Sac7*-PhoA中的PhoA二聚化可產(chǎn)生空間位阻和隨后的PulD單體錯(cuò)誤定位。當(dāng)生成的PulD水平增加和包膜蛋白酶失活時(shí)，制備Sac7*-Ph0A的菌株的分泌水平非常低(圖14B)。低分泌可能是因?yàn)閮H存在一些PulD十二聚體、通道閉塞或被結(jié)合的嵌合體掩蔽底物或另一個(gè)分泌組分(Possotetal.,2000)的必須相互作用位點(diǎn)(Shevchiketal.，1997)。減少Sac7*33或Sac7*40的水平(去除IPTG誘導(dǎo))不能減少它們對于分泌或PulD多聚化的作用，但是在這樣條件下Sac7g6-PhoA幾乎沒有作用(圖14C)，即使它與其他嵌合體一樣豐富時(shí)(圖14A)。兩個(gè)不同的情況可解釋這個(gè)現(xiàn)象。首先，高度豐富的8^7*6-11(^幾乎結(jié)合所有？1110單體并防止它們多聚化。但是，當(dāng)Sac7+6-PhoA水平較低時(shí)，它不能與PulD單體-單體相互作用有效競爭，足夠的多聚體裝配允許有效的分泌。SaC7*6-PhoA對于十二聚體PulD明顯更低的親和力不足以防止分泌。第二，伴侶PulS與PulD單體的結(jié)合，它們正確耙定到外膜的一個(gè)先決條件(Guilvoutetal.，2006;Hardieetal.,1996)，防止Sac7*6-PhoA結(jié)合和允許正確多聚化。在這個(gè)情況下，產(chǎn)量依賴于哪個(gè)蛋白質(zhì)首先結(jié)合PulD，PulS或Sac7*6-PhoA。兩種情況支持事實(shí)即Sac7*6識別的表位強(qiáng)烈掩蔽PulD多聚化，提示它位于兩個(gè)單體之間的界面。疆鵬激默鄉(xiāng)這些結(jié)合物保留了對抗體可選擇支架所需的大部分非常有利的生物物理特性。它們的特性與先前建議的抗體的可選擇物如affibodies(Nordetal.,1997)、纖連蛋白(Xuetal.,2002)或錨蛋白(Binzeta1.，2004a)比較。當(dāng)然，它們在大腸桿菌(在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì))中表達(dá)良好，穩(wěn)定，可溶，能夠高親和力和高特異性識別蛋白質(zhì)靶，它們可與不同報(bào)道蛋白質(zhì)(PhoA和GFP)功能性融合。換言之，它們制備便宜，容易純化和操作。這為大量生物技術(shù)應(yīng)用大開方便之門。而且它們體積很小，比scFv或IgG分別小3倍或19倍，使它們在設(shè)計(jì)嵌合蛋白時(shí)成為理想的候選物，嵌合蛋白中需要結(jié)合模塊同時(shí)維持合理37大小。連接幾個(gè)不同特異性的結(jié)合物并因此構(gòu)建具有多特異性的融合體也是可能的。小結(jié)合物如Sac7d的另一個(gè)優(yōu)勢是它們結(jié)合天然抗體或其片段空間上不可接近的隱藏的表位的潛在能力。需要注意的是結(jié)合物結(jié)合靶蛋白質(zhì)的能力不限于高分子量靶。的確，除了那些關(guān)于PulD的，已獲得的結(jié)果顯示Sac7d發(fā)展的庫允許分離特異性結(jié)合3個(gè)新靶的克隆，所述庫覆蓋大范圍分子量(溶菌酶44.3kDa，GarA=17.3kDa，PknG=81.6kDa)。這些結(jié)合物在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于觀察到的重組抗體片段的水平。由于缺少時(shí)間，沒有基于長koff值(解離速率選擇)選擇獲得的親和力是nM數(shù)量級。這個(gè)選擇步驟是必須的以便于獲得亞納摩爾親和力，并已經(jīng)完成。為說明PulD結(jié)合物的特異性如何，本發(fā)明人已證明它們可被用于開發(fā)檢測試劑。例如，結(jié)合物與堿性磷酸酶的融合體可以完成一步法ELISA或Western印跡。另一個(gè)實(shí)例是使用GFP融合體體外檢測，為體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)定位鋪平道路。也證明采用這些結(jié)合物可完成親和層析和經(jīng)一步純化可將蛋白質(zhì)純化為均質(zhì)。其他應(yīng)用可以使用這些結(jié)合物，例如蛋白質(zhì)芯片陣列、生物傳感器或可開關(guān)的體內(nèi)敲除。錄論使用OB-fold蛋白質(zhì)獲得能夠高親和力和非常好的特異性識別靶蛋白質(zhì)的結(jié)合物的策略經(jīng)上述結(jié)果已成功確認(rèn)。出發(fā)點(diǎn)是Sac7d，一個(gè)普通DNA結(jié)合蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在Sac7d和其衍生物能夠識別2個(gè)結(jié)構(gòu)上無關(guān)的配體家族DNA和蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明人已體外再現(xiàn)OB-fold與給定靶的結(jié)合適應(yīng)性，如自然界已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的那樣。因此可以想象Sac7d也可適于其他已知OB-fold蛋白質(zhì)配體例如單鏈DNA、RNA或糖。除了它們在功能性敲除實(shí)驗(yàn)中潛在的用途之外，這些結(jié)合物可被用于親和層析，檢測，體內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)等。的確，這些結(jié)合物有利的生物物理特性連同它們易于與不同報(bào)道蛋白質(zhì)融合以及它們的小尺寸(分別比scFv和IgG小3和19倍)可促進(jìn)這些應(yīng)用。參考文獻(xiàn)Agback,P"Baumann，H.，Knapp，S.，Ladenstein,R.,andHard,T.(1998).Architectureofnonspecificprotein-DNAinteractionsintheSso7d-DNAcomplex.NatStructBiol5，579-584.Arcus,V.(2002).OB-folddomains:asnapshotoftheevolutionofsequence,structureandfunction.CurrOpinStructBiol794-801.Be廳n，H.M.，Westbrook，J"Feng,Z.,Gilliland,G"Bhat,T.N.，Weissig，H.，Shindyalov,I,N.，andBourne,P.E.(2000).TheProteinDataBank.NucleicAcidsRes跟235-242.Binz，H.K.，Amstutz，P.,Kohl,A.,Stumpp，M.T.,Briand，C,,Forrer，R，Grutter,M.G.，andPluckthun,A.(2004a).High-affinitybindersselectedfromdesignedankyrinrepeatproteinlibraries.NatBiotechnol",575-582.Binz，H.K.，Amstutz，P"Kohl，A.,Stumpp，M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grutter,M.G.，andPluckthun,A.(2004b).High-affinitybindersselectedfromdesignedankyrinrepeatproteinlibraries.NatBiotechnol22，575-582.Epub2004Apr2018.Binz,H.K.,Amstutz,P.,andPluckthun,A.(2005).Engineeringnovelbindingproteinsfromnonimmunoglobulindomains.NatBiotechnol23，1257-1268.Boder，E.T.,andWittrup,K.D.(1997).Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries.NatBiotechnol75，553-557.Chami，M.,Guilvout,I.，Gregorini,M.，Remigy,H.W"Mu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10之間。16.權(quán)利要求6-14任一項(xiàng)的組合文庫，其中選自A59,R60,A61和E64的1到4個(gè)氨基酸殘基被缺失。17.權(quán)利要求4-16任一項(xiàng)的組合文庫用于工程化特異性結(jié)合靶的分子的應(yīng)用。18.工程化特異性結(jié)合靶的分子的方法，包括在權(quán)利要求4-16任一項(xiàng)的組合文庫內(nèi)選擇結(jié)合所述靶的所述OB-fold蛋白質(zhì)的變體的步驟。19.權(quán)利要求1、2、3或17任一項(xiàng)的應(yīng)用，或權(quán)利要求18的方法，其中所述靶是肽，蛋白質(zhì)，寡糖，單鏈DNA，雙鏈DNA，RNA，金屬離子，或碳水化合物。20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述選擇步驟由核糖體展示完成。21.權(quán)利要求20的方法，其中由核糖體展示完成2，3，4或5輪選擇。22.權(quán)利要求20或21任一項(xiàng)的方法，還包括分離和鑒定特異性結(jié)合所述耙的分子的步驟。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述分離和鑒定步驟包含如下步驟-(i)對來自通過核糖體展示選擇的池的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，并將產(chǎn)生的DNA克隆進(jìn)表達(dá)載體；(ii)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌和使單個(gè)克隆生長；和(iii)檢測所述細(xì)菌克隆提取的蛋白質(zhì)與靶的結(jié)合。24.權(quán)利要求22或23的方法，還包括制備融合蛋白的步驟，所述融合蛋白質(zhì)包含作為第一部分的分離的、鑒定的分子和至少第二部分。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述至少第二部分選自與所述第一部分相比有不同特異性的酶，標(biāo)記蛋白質(zhì)，治療蛋白質(zhì)和結(jié)合物。26.通過權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的方法獲得的蛋白質(zhì)，其特征在于其特異性結(jié)合PulD以及其序列篩選自SEQIDNos:2到8。27.通過權(quán)利要求16-25任一項(xiàng)的方法獲得的蛋白質(zhì)，其特征在于其特異性結(jié)合GarA以及其序列是SEQIDNo:47。全文摘要本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，提供了獲得特異性結(jié)合選自大量配體家族的靶的穩(wěn)定分子的手段。特別地，本發(fā)明提供了通過用OB-fold蛋白質(zhì)作為起始分子的組合突變/選擇方法獲得特異性結(jié)合感興趣的靶的分子的方法。特別地，所述感興趣的靶可以是用作起始分子的OB-fold蛋白質(zhì)的天然靶的不同的化學(xué)性質(zhì)形式。文檔編號C07K14/195GK101652386SQ200780050902公開日2010年2月17日申請日期2007年12月4日優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日發(fā)明者F·佩科拉里,P·阿扎瑞申請人:巴斯德研究院;國立科學(xué)研究中心