專(zhuān)利名稱(chēng)：：膽酸派生物作為fxr配基預(yù)防或治療fxr-介導(dǎo)的疾病或狀況的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于治療淤膽失調(diào)的法尼酯X受體(FXR)調(diào)節(jié)物，特別是膽酸派生物，其中C6包括乙烷基，而C24羧基轉(zhuǎn)換為硫酸基團(tuán)。
背景技術(shù)：
：法尼酯X受體(FXR)是一種最初從大鼠肺cDNA文庫(kù)中鑒定的孑瓜JL^亥受體(BM.Forman,etal.，Cell81:687—693(1995)),其與昆蟲(chóng)蛻皮激素受體密切相關(guān)。FXR是包括類(lèi)固醇，類(lèi)維生素A,和曱狀腺激素受體的配基-激活轉(zhuǎn)錄因子核受體家族的成員(DJ.Mangelsdorf,etal.,Cell83:841-850(1995))。Northern和原位分析顯示FXR在肺，腸，腎，和腎上腺中大量表達(dá)(BM.Fo畫(huà)netal.,Cell81:687-693(1995)和W。Seoletal.，Mol.Endocrinnol。9:72-85(1995))。FXR與9—順式維生素A酸受體(RXR)形成異源二聚體與DNA結(jié)合。FXR/RXR異源二聚體優(yōu)先與由共有AG(G/T)TCA的雙核受體半位點(diǎn)組成的成分結(jié)合，其形成反向重復(fù)并被單一核苷分離(IR-l模體)(BM.Forman，etal.,Cell81:687—693(1995))。然而，這些4匕合物無(wú)法激活小鼠和人類(lèi)FXR,使得內(nèi)源性FXR配基的自然性還不確定。一些自然發(fā)生的月旦酸在生理濃度下結(jié)合并'激活FXR(PCTWO00/37077,2000年6月29日出版))。如此所述，作為FXR配基的膽酸包括鵝脫氧膽酸(CDCA),脫氧膽酸(DCA),石膽酸(LCA)，和這些膽酸的?；撬峒鞍被宜峁草m物。膽酸是在肝臟中形成并分泌入十二指腸的膽固醇代謝產(chǎn)物，其在食物脂肪和維生素的溶解和吸收中具有重要作用。大多數(shù)膽酸(~95%)隨后在回腸中吸收并通過(guò)腸肝循環(huán)系統(tǒng)回到肝臟。肝臟中膽固醇至膽酸的轉(zhuǎn)變?yōu)榉?貴調(diào)控膽酸下調(diào)細(xì)胞色素P4507a(CYP7a)的轉(zhuǎn)錄，其編碼催化膽酸生物合成限速步驟的酶。數(shù)據(jù)顯示FXR與膽酸對(duì)CYP7a表達(dá)的抑制有關(guān)，雖然精確的機(jī)制仍未明確(DW.Russell，Cell97:539-542(1999))?；啬c中，膽酸"i秀導(dǎo)腸內(nèi)膽酸結(jié)合蛋白(IBABP)的表達(dá)，其是一種以高親和力與膽酸結(jié)合，并與其細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的胞內(nèi)蛋白。兩組已經(jīng)發(fā)5U旦酸通過(guò)激活FXR調(diào)節(jié)其對(duì)于IBABP表達(dá)的效應(yīng)，F(xiàn)XR結(jié)合人類(lèi)，大鼠，和小鼠IBABP基因啟動(dòng)子中^f呆守的IR-1型應(yīng)答元件。這些FXR與膽酸和膽固醇平衡中的目標(biāo)基因的激活(IBABP)牙口才中制(CYP7a)4目關(guān)。EP13927147>開(kāi)了3a，7a—又又羥基-6oc-乙基—5P—膽烷-24-羧酸(這里也指6-乙基-鵝脫氧膽酸，6-EDCA)，其溶劑化物和氨基酸結(jié)合物用作FXR拮抗劑，其可用于制備預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物。EP1568796公開(kāi)了作為FXR拮抗劑的6-乙基-熊脫氧膽酸(6-EUDCA)派生物，及其在預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)(I)的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R是氫基或a-羥基，位置7的羥基在a或(3位點(diǎn)；及其藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑化物或其氨基酸結(jié)合物。一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物為鵝脫氧膽酸派生物的形式。另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物為熊脫氧膽酸派生物的形式。而另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物為膽酸派生物的形式。另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物為三乙基銨鹽形式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物為鈉鹽形式:另一方面，本發(fā)明^是供了一種預(yù)防或治療FXR介導(dǎo)的疾病或狀況的方法。本方法包4舌施用治療有效量的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物。本發(fā)明也提供使用結(jié)構(gòu)式(I)的化合物以制備預(yù)防或治療FXR介導(dǎo)的疾病或^1犬況的藥物。在特定實(shí)施方案中，F(xiàn)XR-介導(dǎo)的疾病或狀況是心血管疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈硬化，高膽甾醇血，高血脂慢性肝炎疾病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，代j射疾病，癌癥(例々0,結(jié)直腸癌)，或神經(jīng)跡象如中風(fēng)。特定實(shí)施方案中，慢性肝病是原發(fā)性硬化(PBC),腦腱性黃瘤癥(CTX)，原發(fā)性硬化性膽嚢炎(PSC),藥物導(dǎo)致的膽汁郁積，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸外吸收相關(guān)膽汁郁積(PNAC),細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)或膿血癥月旦汁郁積，自身免疫肝炎，慢性病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH),肝移植相關(guān)移植物抗宿主病，活供體肝移植再生，先天性肝纖維化，膽總管結(jié)石，肉芽性肝病，肝內(nèi)-或外惡性腫瘤，Sjogren綜合征，結(jié)節(jié)病，Wilson's疾病，Gaucher，s疾病，血色病，或ocl-拍J夷蛋白酶缺乏癥。特定實(shí)施方案中，胃腸疾病是炎癥性腸病(IBD)(包括Crohn's疾病和潰瘍性腸炎)，腸易激綜合征(IBS)，細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)吸收不良，反射-后結(jié)腸炎，或微小性結(jié)腸炎。特定實(shí)施方案中，腎病是糖尿病腎病，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS),高血壓腎病，慢性腎小球炎，慢性移植性腎小球病，慢性間質(zhì)性腎炎，或多嚢腎病。特定實(shí)施方案中，心血管疾病是動(dòng)脈硬化癥，動(dòng)脈硬10化，血脂障礙，高膽固醇血癥，或高甘油三酯血癥。特定實(shí)施方案中，代ii射疾病是力夷島素抗性，I型和II型糖尿病，或肥胖。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括結(jié)構(gòu)式(I)化合物和藥學(xué)上可^妄受的載體或稀釋物的藥物組合物。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備結(jié)構(gòu)式(I)和其藥學(xué)上可4妄受的鹽，溶劑化物或氨基酸結(jié)合物的方法。圖1是以圖表形式表示的反式激活測(cè)定結(jié)果。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次測(cè)定的平均值。CTRL:對(duì)照；INT-747:6-EDCDA;UPF-987。圖2顯示反式^敫活測(cè)定中INT-747和UPF-987的劑量歲文應(yīng)。圖3顯示FXR目標(biāo)基因體外表達(dá)。結(jié)果為兩次定量實(shí)時(shí)PCR試一驗(yàn)的平均值。圖4顯示代表性FXR目標(biāo)基因在來(lái)源于小鼠肝臟的細(xì)胞中的體內(nèi)表達(dá)。數(shù)據(jù)為兩次定量實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)的平均值。圖5顯示UPF-987對(duì)由TNBS誘導(dǎo)的重量丟失的影響。圖6顯示UPF-987對(duì)糞便形態(tài)的影響。圖7顯示UPF-987對(duì)粘膜損害程度的影響。圖8顯示UPF-987對(duì)小鼠結(jié)腸基因表達(dá)的影響。結(jié)果為兩次定量實(shí)時(shí)PCRi式-3全的平均4直。ii圖9顯示UPF-987對(duì)ANIT-i秀導(dǎo)的膽汁郁積的血漿膽紅素的影響。圖10顯示UPF-987對(duì)ANIT-i秀導(dǎo)的膽汁郁積的血漿AST的影響。圖11顯示UPF-987對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積的血漿ALP的影響。圖12顯示UPF-987對(duì)ANIT-i秀導(dǎo)的膽汁郁積的血漿gammaGT的影響。圖13顯示UPF-987對(duì)ANIT-謙導(dǎo)的膽汁郁積的血漿膽固醇的影響。圖14顯示UPF-987對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積的體重的影響。圖15顯示UPF-987對(duì)ANIT-i秀導(dǎo)的膽汁郁積的肝臟重量的影響。圖16顯示UPF-987對(duì)ANIT-i秀導(dǎo)的膽汁郁積大鼠肝臟中FXR目標(biāo)基因表達(dá)的影響。結(jié)果為兩次定量實(shí)時(shí)PCR試4t的平均值。圖17顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿膽紅素的影響。圖18顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿AST的影響。圖19顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿ALT的影響。圖20顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿ALP的影響。圖21顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿gammaGT的影響。圖22顯示INT-1103對(duì)ANIT-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的體重的影響。圖23顯示最終肝臟比例(肝臟重量/體重x100)。圖24顯示INT-1103對(duì)BDL-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿月旦纟工素的影響。圖25顯示INT-1103對(duì)BDL-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿AST的影響。圖26顯示INT-1103對(duì)BDL-i秀導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿ALT的#》響。圖27顯示INT-1103對(duì)BDL-i秀導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿ALP的#》響。圖28顯示INT-1103對(duì)BDL-誘導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的血漿gammaGT的影響。圖29顯示INT-1103對(duì)BDL-裔導(dǎo)的膽汁郁積大鼠的體重的影響。13圖30顯示最終肝臟比例(肝臟重量/體重x100)。圖31顯示INT-1103和INT-747對(duì)自然大鼠膽汁流的影響。圖32顯示INT-1103和INT-747對(duì)estrogencolestatic大鼠膽汁流的影響。圖33顯示INT-1103和INT-747對(duì)estrogencolestatic大鼠肝臟比例的影響。圖34顯示INT—1103和INT—747對(duì)estrogencolestatic大鼠體重的影響。圖35顯示通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR確定的胰島素基因表達(dá)。圖36是水中膽鹽濃度(mM)對(duì)K相對(duì)于表面張力(dyne/cm)的示意圖。圖37是0.15MNaCl中中膽鹽濃度(mM)對(duì)數(shù)相對(duì)于表面張力(dyne/cm)的示意圖。圖38顯示?；撬峤Y(jié)合的INT-747的分泌速度。凄"居以月旦汁濃度才艮告并且以膽汁體積^修正。圖39顯示甘氨酸結(jié)合的INT-747的分泌速度。數(shù)據(jù)以膽汁濃度才艮告并且以膽汁體積修正。圖40顯示INT-747的分泌速度。凄t據(jù)以膽汁濃度才艮告并且以月旦汁體積j奮正。圖41顯示INT-747異構(gòu)體的分泌速度。婆t據(jù)以膽汁濃度才艮告并且以膽汁體積^f多正。圖42顯示?；撬峤Y(jié)合的INT-747異構(gòu)體的分泌速度。數(shù)據(jù)以膽汁濃度^艮告并且以膽汁體積修正。圖43顯示INT-1103的分泌速度。數(shù)據(jù)以膽汁濃度才艮告并且以月旦汁體積J奮正。圖44顯示INT-1103和其主要代謝物3-葡萄糖苷酸的分泌速度。相關(guān)數(shù)量以分析的信號(hào)表示。數(shù)據(jù)以膽汁濃度4艮告并且以膽汁體積修正。圖45顯示使用質(zhì)譜分析的膽汁中INT-IIO主要代謝物的分泌速度。數(shù)據(jù)以膽汁濃度報(bào)告并且以膽汁體積修正。圖46顯示4吏用質(zhì)i普變焦顯示分一斤的膽汁中INT-110主要代謝物的分泌速度。數(shù)據(jù)以膽汁濃度才艮告并且以膽汁體積修正。圖47顯示人類(lèi)糞^f更培養(yǎng)物中INT-747和INT-1103的代謝穩(wěn)定性。鵝去氧膽酸作為天然類(lèi)似物參考品使用。圖48顯示INT-1103在模擬胰腺流中的代謝穩(wěn)定性。根據(jù)USP方案使用橄欖油作為參照。化合物非常穩(wěn)定并且其酯鍵(硫酸鹽)不纟皮胰酶水解，顯示在人類(lèi)十二指腸和上腸部位中的高度穩(wěn)定性。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物其中R是氫基或a-羥基，位置7的羥基在a或P位點(diǎn)；和藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑化物或其氨基酸結(jié)合物。合適的本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽可以由本領(lǐng)域中的技術(shù)人員容易J也確定，并可包4舌，例如，堿式鹽如由鋁，釣，鋰，4美，鉀，鈉，和鋅制備的堿或堿-脂金屬鹽，或由N,N，-二千基亞乙基二胺，氯普魯卡因，膽堿，二乙醇胺，乙二胺，葡甲胺(N-曱基葡糖胺)，和普魯卡因等制備的有機(jī)鹽。帶有如賴(lài)氨酸，精氨酸，氨基丁三醇，三乙胺和類(lèi)似物等胺類(lèi)的藥學(xué)上可接受的鹽也可以被使用。這些結(jié)構(gòu)式(I)化合物的鹽可以使用常規(guī)技術(shù)制備，例如將結(jié)構(gòu)式(I)化合物與合適的堿基反應(yīng)，由結(jié)構(gòu)式(I)化合物制備。藥物應(yīng)用中，結(jié)構(gòu)式(I)化合物鹽應(yīng)當(dāng)為藥學(xué)上可4妄受的，但是非藥學(xué)上可接受的鹽也可以便利地用于制備對(duì)應(yīng)的游離堿或者其藥學(xué)上可接受的鹽。這里使用的術(shù)語(yǔ)"溶劑化物"是一種包括結(jié)構(gòu)式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的晶體形態(tài)，可以為化學(xué)劑量或非-化學(xué)劑量的溶劑。溶劑，作為例子，包括水，曱醇，乙醇，或乙酸。以下，結(jié)構(gòu)式(I)化合物指任何其化合物的物理形式，除非指明其特定的形式，鹽或溶劑。這里使用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸結(jié)合物"指帶有任何合適的氨基酸的結(jié)構(gòu)式(I)化合物的結(jié)合物。合適地，這些結(jié)構(gòu)式(I)化合物的氨-基酸結(jié)合物將具有增強(qiáng)在膽汁或腸流液中完整性的優(yōu)勢(shì)。合適的氨基酸包括但不局限于甘氨酸和?；撬?。這樣，本發(fā)明包括^壬4可結(jié)構(gòu)式(I)4b合物的甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合物。一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式I化合物是一種鵝去氧膽酸派生物，其中7位的羥基在a位置，而R是氫。另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式I化合物是一種熊去氧膽酸派生物，其中7位的羥基在P位置，而R是氫。另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式I化合物是一種膽酸派生物，其中74立的羥基在oc位置，而R是羥基。在此之后，所有"結(jié)構(gòu)式I化合物"指上述所有描述的結(jié)構(gòu)式I化合物和藥學(xué)上可4妄受的鹽，溶劑化物或其氨基酸結(jié)合物。結(jié)構(gòu)式I化合物可以由6-乙基-7-酮基-膽酸制備，如EP1392714和EP1568796中描述所制備，合適地，通過(guò)包括在C24羥基中轉(zhuǎn)入碟原子的反應(yīng)序列，對(duì)3-羥基基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，將碘原子轉(zhuǎn)化進(jìn)入羥基，減少了7-酮基基團(tuán)，以獲得相應(yīng)的3-a或3-P羥基，C24羥基選擇性的磺?；?-羥基的去保護(hù)。在每一步中使用的反應(yīng)方法和試劑在下列的方法中報(bào)導(dǎo)，其顯示了三乙基胺鹽形式的3a，7a,23-三羥基-6a-乙基-24_去曱基—5(3-月旦烷—23—石克酸鹽(UPF—987或以下^f匕合凈勿9)的制備。相同的方法可以^皮釆用，通過(guò)合適地替換藥劑和/或17起始材料并且隨意地改變反應(yīng)序列和保護(hù)基團(tuán)，制備其他結(jié)構(gòu)式I化合物。a)3,4-二氫-27/-吡喃,p-TsOH，二氧六環(huán)，r丄;b)I2，Pb(AcO)4，hv，CCU;c)HClconTHF;d)TBDMSiCl，咪唑，CH2C12，r.t.;e)Ag2C03，丙酮，H20，回流；f)NaBH4THF，H20r.t.;g)C1S03H，(Et)3N，THF;h)CH3COCH3,PdCl2(CH3CN)2在每一步中^f吏用的反應(yīng)方法和試劑在下列的方法中才艮導(dǎo)，其顯示了鈉鹽形式的3a，7a,23-三羥基-6a-乙基一24-去曱基—5P-月旦》克-23-石克酸鹽(INT-1103或以下化合物10)的制備。相同的方法可以被采用，通過(guò)合適地替換藥劑和/或起始材料并且隨意地改變反應(yīng)序列和保護(hù)基團(tuán)，制備其他結(jié)構(gòu)式I藥學(xué)上可接受的鹽的形式。10a)3，4二氫-2if-吡喃，p-TsOH,二氧六環(huán)，t.a.;b)I2，Pb(AcO)4，hv，CCU;c)HClgas，DME;d)TBDMSCl,咪唑，CH2C12，t.a.;e)Ag2C03,丙酮，1120，回流；f)NaBH4，THF，H20，r.t.;g)C1S03H，(Et)3N，THF;h)H20,丙西同；PdCl2(CH3CN)2，i)NaOH，MeOH正如在試驗(yàn)階段詳細(xì)描述，化合物9在人類(lèi)肝細(xì)胞系和施用alfa-nafthylsiotiocyanate(ANIT)引發(fā)膽汁阻塞的未處理小鼠和大鼠體內(nèi)進(jìn)行無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和反式激活實(shí)驗(yàn)。FRET方法中，化合物激活FXR的潛力比鵝去氧膽酸(CDCA)強(qiáng)將近1000倍。在反式激活實(shí)驗(yàn)中，化合物9導(dǎo)致膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)物，BSEP(膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)泵)和微小異源二聚體伙伴(SHP,—種缺失DNA-結(jié)合區(qū)域的非典型的核酸受體)，的2倍誘導(dǎo)。19其進(jìn)一步有效地抑制Cyp7Al,SREPB-lc和脂肪酸合酶(FAS),這樣表明本發(fā)明的化合物對(duì)FXR的激活準(zhǔn)許基因的選擇性《務(wù)飾，包4舌膽酸合成和脂，膽固醇和葡萄糖的代謝。因此，結(jié)構(gòu)式(I)的化合物作為月旦酸轉(zhuǎn)運(yùn)物的選擇性z修飾物和肝臟中膽酸流量的增強(qiáng)劑；進(jìn)一步，其有效調(diào)整脂和膽固醇代謝中包括r的基因，因此其可以用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況，其包括慢性肝病(包括一種或多種膽汁郁積，脂肪變性，炎癥，纖維化，和硬化)，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，和代謝疾病。使用結(jié)構(gòu)式(I)化合物預(yù)防或治療的慢性肝病包括但不局限于原發(fā)性硬化(PBC)，原發(fā)性硬化性膽嚢炎(PSC),腦腱性黃瘤癥(CTX)，藥物介導(dǎo)的膽汁郁積，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸夕卜吸收相關(guān)膽汁郁積(PNAC)，細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)或膿血癥膽汁郁積，自身免疫肝炎，慢性病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD),非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝移植相關(guān)移植物抗宿主病，活供體肝移植再生，先天性肝纖維化，膽總管結(jié)石，肉芽性肝病，肝內(nèi)-或外惡性腫瘤，Sjogren綜合征，結(jié)節(jié)病，Wilson's疾病，Gaucher，s疾病，血色病，或a1—4元月夷蛋白酶缺乏癥。使用結(jié)構(gòu)式(I)化合物預(yù)防或治療的胃腸疾病包括4旦不局限于炎癥性腸病(IBD)(包括Crohn's疾病和潰瘍性腸炎)，腸易激綜合征(IBS),細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)吸收不良，反射-后結(jié)腸炎，或微小性結(jié)腸炎。使用結(jié)構(gòu)式(I)化合物預(yù)防或治療的腎病包括但不局限于糖尿病腎病，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS),高血壓腎病，慢性腎小球炎，慢性移植性腎小球病，慢性間質(zhì)性腎炎，或多嚢腎病。使用結(jié)構(gòu)式(I)化合物預(yù)防或治療的心血管疾病包括^旦不局限于動(dòng)脈硬化癥，動(dòng)脈硬化，血脂障礙，高膽固醇血癥，或高甘油三酯血癥。使用結(jié)構(gòu)式(I)化合物預(yù)防或治療的代i射疾病包括但不局限于胰島素抗性，I型和II型4唐尿病，或月巴胖。本發(fā)明的方法包括施用有效劑量的結(jié)構(gòu)式(I)化合物的方法。這里〗吏用的術(shù)語(yǔ)"治療有效劑量，，指有效獲得^見(jiàn)定效果的結(jié)構(gòu)式(I)化合物的lt量。相應(yīng)的，在預(yù)防或治療FXR介導(dǎo)的疾病或狀況的方法中4吏用的結(jié)構(gòu)式(I)化合物的治療有效劑量將是有歲文預(yù)防或治療FXR介導(dǎo)的疾病或狀況的凄t量。相似的，在治療或預(yù)防淤膽肝病或增加膽汁流的方法中^f吏用的結(jié)構(gòu)式(I)4匕合物的治療有效劑量將是有效增加腸內(nèi)膽汁流的有效量。需要獲得期望生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(I)化合物的劑量將依賴(lài)于多種因素，如使用的目的，給藥的方法，和受體，并將最終由醫(yī)生或獸醫(yī)決定。通常，治療FXR介導(dǎo)的疾病和一大況的典型日劑量，例如，將位于0.01mg/kg至100mg/kg范圍內(nèi)。該劑量可以通過(guò)單一劑量或通過(guò)^L次單獨(dú)劑量或連續(xù)灌注纟會(huì)藥。類(lèi)似的劑量將應(yīng)用于其他疾病，狀況的治療，包括預(yù)防和治療膽汁淤積性肝病。這樣，進(jìn)一步，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括作為活性成分的一種結(jié)構(gòu)式(I)化合物，和與之共同的和/或混合的至少一種藥物載體或稀釋物。這些藥物組合物可以用于預(yù)防和治療前述的疾病或狀況。載體必須是藥學(xué)上可接受的，并且必須相容于組合物中的其他成分，例如，不具有有害效應(yīng)。載體可以是一種固體或液體并且合適;也制備沉單位劑量形式，例如，一種包括0.05至95%重量活性成分的藥片。如有期望，其他生理學(xué)活性成分也可以包括入本發(fā)明的藥物組合物?？赡艿男问桨切┻m用于口月艮，舌下，口腔，注射(例如，皮下，月幾肉內(nèi)，或靜月永內(nèi))，直腸，局部，包4舌透皮，鼻月空內(nèi)和吸入給藥。對(duì)于特定病人的許多合適的給藥方法將依賴(lài)于所治療的疾病或狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重性，或所采用的治療的性質(zhì)，和活性化合物的性質(zhì)，但如有可能，口服給藥適用于預(yù)防和治療FXR介導(dǎo)的疾病和4犬況。適用于口服給藥的形式可以以分離的單位提供，如藥片，膠嚢，藥包，錠劑，每一種包括預(yù)先確定數(shù)量的活性成分；如粉末或顆并立；如水或非水液體的卩容液或懸液；或如水包油或油包水乳劑。適用于舌下或口腔給藥的形式包括錠劑，其包括活性化合物，和調(diào)味劑，如糖和阿拉伯樹(shù)膠或黃芙膠，和藥錠，其包括位于明膠和甘油或蔗糖阿拉伯樹(shù)膠等惰性物質(zhì)中的活性化合物。適用于注射給藥的形式典型地包括無(wú)菌液體溶液，其包括一種預(yù)定濃度的活性化合物；溶液與受體的血液等滲。適用于注射給藥的額外形式包括含有生理適配的復(fù)合-溶劑和/或藥物復(fù)合物，如表面活性劑或環(huán)糊精。水包油乳劑也適用于注射形式。雖然這些溶液適宜通過(guò)靜脈內(nèi)給藥，其也可以通過(guò)皮下或肌肉內(nèi)注射給藥。適用于直腸給藥的形式以單位-劑量栓劑形式提供，其中活性成分包埋于一種或多種形成4全劑基礎(chǔ)的固體中，例如，可可酯。適用于局部或鼻腔內(nèi)使用的形式包括藥膏，乳膏，洗液，膏劑，凝膠劑，噴霧劑，氣霧劑和油。這些形式的合適的載體包括凡士才木，羊毛脂，聚乙二醇，乙醇，和其耳關(guān)合物。本發(fā)明的制劑可以由任何合適的方法制備，典型地通過(guò)均一地和緊密地將活性化合物與液體或良好劃分的固體載體或其兩者根據(jù)需要的比例混合，如需要，將最后的混合物制備成期望的形狀。例力o,可以通過(guò)^夸一種包^舌活性成分并分末或顆粒和一種或多種合適的成分，如結(jié)合物，潤(rùn)滑劑，惰性稀釋劑，或表面活性分散劑的混合物壓縮制備藥片，或通過(guò)將粉末狀活性成分和惰性液體稀釋劑混合物進(jìn)行塑形。合適的吸入給藥制劑包括顆粒粉劑或噴霧，其可以通過(guò)多種類(lèi)型劑量的眼里壓力氣溶"交，噴霧劑，或吸入器產(chǎn)生。對(duì)于經(jīng)口的肺部纟合藥，4分末或顆粒的大小典型地在0.5-10jum之間，合適i也為1-5|um,以確保進(jìn)入支氣管4對(duì)。對(duì)于鼻腔給藥，10-500jum大小的顆粒適合于確保在鼻腔中停留。定量吸入器是一種壓力氣溶膠分配器，典型地含有在液化推進(jìn)物中的活性物質(zhì)的懸液或溶液形式。當(dāng)使用時(shí)，這些裝置通過(guò)閥釋放訴訟定量體積的藥劑，典型地為10至150jLi1,以產(chǎn)生含有活性成分的良好的顆粒噴霧。合適的推進(jìn)物包括特定的氯氟石友化合物，例如，二氯二氟曱烷，三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷和其混合物。藥劑可以額外含有一種或多種復(fù)合溶劑，例如，乙醇表面活性劑，如油酸或山梨聚糖，抗氧化劑和合適的調(diào)味劑。噴霧劑是一種商業(yè)提供的裝置，通過(guò)空氣或氧氣等壓力氣體的加速作用，經(jīng)狹小的文氏管孔，或通過(guò)超聲振動(dòng)方法，其使活性物質(zhì)溶液或懸液轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熜詺馊苣z噴霧。噴霧劑中使用的合適的制劑包括水相載體中的活性成分，其最高占制劑的40%w/w,合適地小于20。/。w/w。載體典型地為水或一種稀釋的水和酒津奇溶液，合適地通過(guò)添加，例如，氯化鈉制備成與體液等;參。23如果制劑是非無(wú)菌的，可選的添加物包括防腐劑，例如，甲基羥基苯曱酸，抗氧化劑，調(diào)味劑，揮發(fā)油，緩沖劑和表面活性劑。通過(guò)噴射給藥的合適的制劑包括粉末，其可以通過(guò)一種吹藥器豐lr送或通過(guò)鼻吸進(jìn)入鼻腔。在吹藥器中，4分末包^舌在膠嚢或藥丸中，典型地由凝膠或塑料制成，其可以在原位刺破或打開(kāi)使得粉末通過(guò)吹藥器裝置的空氣流，或通過(guò)手動(dòng)泵輸送。吹藥器中使用的4分末可以包括單一的活性成分，或包括活性成分和合適的粉末稀釋物，如乳糖，和一種可選的表面活性劑的混合并分末。活性成分在制劑中的比例典型地為0.1至100w/w。上述的特異配方之外，已經(jīng)注意到不確定的制劑類(lèi)型，本發(fā)明的制劑也可以包括藥物領(lǐng)域中的技術(shù)人員知道的其他成分。例如，適用于口力良給藥的制劑可以包括調(diào)味劑，適用于鼻內(nèi)給藥的才幾制可以包4舌芳香物。因此，根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了使用結(jié)構(gòu)式(I)的4匕合物制備藥物以預(yù)防或治療FXR介導(dǎo)的疾病或狀況。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)i兌明。實(shí)施例1化學(xué)。熔點(diǎn)通過(guò)Buchi535電熱裝置測(cè)定，并為校正。通過(guò)BrukerAC200MHz分光計(jì)獲得NMR光譜，化學(xué)位移以百萬(wàn)分之一(ppm)表示。這里l吏用的縮寫(xiě)為s,單一；bs，寬單態(tài)；d,二重態(tài)；dd,乂又二重態(tài)；m,多態(tài)；q，四重態(tài)；t，三重態(tài)。使用Merck硅膠60(0.040-0.063mm)進(jìn)行快速層析色i普。在帶有石圭月交60F-254(Merck)預(yù)包一皮的TLC板上進(jìn)行TLC。通過(guò)磷鉬酸鹽試劑(5%的EtOH溶液)使斑點(diǎn)可見(jiàn)。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行此反應(yīng)。3a-四氣p比喊基氧一7—酉同_5|3—膽火克一24—叛酸(2)二氧雜玉不乙烷(12ml)中的3,4-二氫-2H—p比喃(1.74ml,19mmol)緩慢滴入含有p-曱苯石黃酸(115mg,0.6ml)和6a-乙坑一7-酉同基膽石酉吏(5.0g，12mmol)的二氧雜玉不乙》克(55ml)溶液。反應(yīng)混合物室溫?cái)噭?dòng)2小時(shí)。力。入(40ml)7jc，混合物通過(guò)真空部分濃縮并用EtOAc(4x25ml)抽提。有才幾部分用鹽水(lx50ml)洗滌，無(wú)水Na2S04干燥，真空蒸發(fā)以獲得6g化合物2。未經(jīng)加工的》派生物不經(jīng)進(jìn)一步純4匕可用于下一步反應(yīng)。HNMR:(200MHz,CDC13)5:0.68(3H，s，C-18Me);0.8(3H,t,J=4Hz，C-26);0,98(3H,d，J=6,5，C-21Me);1,17(3H,s,C-19Me);3.4-3,7(4H,m，C-23CH2,C-6);3.8-3.9(1H，m,c-3);2,6-2,8(1H，m,C-6)。13CNMR(50,3MHz,CDC13)5:212,41,179,42，54,75，52,10,21,79，18,30,12,04。3cx—四氫p比喃基氧-7—酉同-24—去甲—5P—膽烷—23-I(3)300w鴒燈照射下，CCU(75ml)中的》典(5g,20mmol)滴力口入溶液2(5.5g，llmmol)并引導(dǎo)入CC"(200ml)中由々四乙酸鹽4.9g，llmmol)。反應(yīng)混合物經(jīng)冷卻并以硅藻土過(guò)濾。有機(jī)相以5%Na2S203溶液，5%NaOH，鹽水(15ml)洗滌，無(wú)水Na2S04干燥，真空蒸發(fā)。殘留物以珪月交快速層析純化，使用石油醚/EtOAc95/5作為流動(dòng)相以獲得4.6g化合物3(40%產(chǎn)量)。25H麗R:(200MHz，CDC13)5:0,54(3H,s，C-18Me);0。68(3H，t,J=7.36MHz,C-25);0,79(3H,d，J=5,2MHz,C-21);1,09(3H,s，C-19);2,55(1H,m，C-26);2,96(1H,m,c-23);3,16(1H,m,C-23);3,20(1H,m,C-6，)；3,76(1H，m，C-6，)；4,59(1H,m，C-2，)。13CNMR(50，3MHz，CDC13)5:212.50,96.56,95.99,74.90,74.60,62.63,54.63，54.08,50.78，50.58,49.84,48.91,43.38,42.70，40.11,38.90,36.92,35.81，34.34,34.10,31.07,30.06,29.61，28.26，27.85，25.97，25.42，24.54,23.49,21.75，19.76,19.59，18.88,17.84,12.05,11.98,5.26。3a-#5基—6oc-乙基—7—酮-24—去甲—5P—膽火克-23-I(4)化合物3(2.2g,3.8mmo1)在HC137%THF(50ml)溶液中室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)混合物以飽和NaHC03(20ml),H20(20ml),鹽水(20ml)洗滌，Na2S04干燥，真空蒸發(fā)以獲得1.4g化合物4(80%產(chǎn)量)。未經(jīng)加工的派生物不經(jīng)進(jìn)一步純化可用于下一步反應(yīng)o力NMR:(200MHz，CDC13)5:0,68(3H,s，C—18Me);0.82(3H,t,J=7,36MHz,C-21);0，93(3H，t,J=5，2MHz,C-21Me);1,26(3H,s,C-19Me);3,08(1H,m，C-23);3，37(1H,m,c-23);3.61(1H,m,C-3)。l3CNMR(50,3MHz,CDC13〉&212.81,71.09,54.63,51,93,50.60,49.84,48.93,43.64,42.70，40.11,38.92，36.92，35.63,34.19,31.71,31.06,29.78,28.25,27.89,25.96,25.42，24.51,23.48，21.79，19.56,18.77,18.22,17.85，12.02,11.95,5.22.3a—^又-丁基二曱基石圭氧一6a_乙火克—7—酉同—24—去曱-5P-膽烷-23-I(5)4匕合4勿4(1.4g，2.8mmol)的CH2C12(30ml)溶液，力口入^又_丁基二甲基曱桂烷基氯(496mg，3.22mmol)和咪峻(230mg，3.36mmol)，混合物于室溫4覺(jué)4半過(guò)乂艾。，良應(yīng)混合物以《包和NaHC03(30ml),鹽7jc(20ml)洗;奈，無(wú)KNa2S04干;t喿。有才幾相經(jīng)真空蒸發(fā)以獲得1.5g化合物5(87%產(chǎn)量)。未經(jīng)加工的派生物不經(jīng)進(jìn)一步純4匕可用于下一步反應(yīng)。NMR:(200MHz,CDC13)5:0.02(6H,s,(CH3)2Si);0,65(3H，s,C-18Me);0.85(9H,s，(CH3)3CSi);1,19(3H,s,C-19);3,16(1H,m，C-23);3.30(1H,m,C-23);3.48(1Hm,C-3)."CNMR(50,3MHz,CDC13)<5:212.56，71.93,54.63，51.89，50.62，49.81，48.90，43.34，42.72,40.11，38.89，36.92,35.62,34.37，31.97，30,34，28.26,25.83，25.61,24.57,23.48,21.77,18.81'17.84,12-02，11.92,5.27,4.70.3a-#又-丁基二甲基石圭氧—6a—乙)t克—7-酮—24-去曱-5P-膽烷-23-ole(6)4匕合物5(l,2g,1.96mmol)的丙酮(12ml)溶液中，力口入Ag2C。3(l.lg,3.9mmol)。反應(yīng)混合物回流過(guò)夜并冷卻至室溫，珪藻土過(guò)濾，丙酮洗滌，聯(lián)合的有機(jī)相經(jīng)濃縮獲得lg化合物6.未經(jīng)加工的派生物不經(jīng)進(jìn)一步純化可用于下一步反應(yīng)。■HNMR:(200MHz,CDClj)J:0.02(6H,s,(CH，hSi);0,65(3H,s,C-18Me);0.88(9H，s,(CH3)3CSi);3,16(1H,m,C-23);3.37(1Hm,C-3);3.69(2H,m,C-23).I3CNMR(50,3MHz,CDClj)&212.64,71.96，60.84,55.27,50.66，49.87,48.94，43.37,42.69,38.94，35.64,34.39，32.70，32.00,30-36,29.68,28.53,25.85,24.64,23.50,21.80,18.84,12.01,11.94,-4.68.273oc—*又—丁基二甲基石圭氧—7a—，至基—6a—乙》克—24—去曱-5|3-膽烷-23-油(7)化合物6(lg,1.96mmol)在THF(50ml)和H20(12.5ml)的混合5容液中，力口入NaBH4(740mg,19.6mmo1),于室溫?cái)嚢?小時(shí)30分4中。反應(yīng)溶液真空部分濃縮并以CHCl3抽^是(3x20ml)。聯(lián)合的有才幾層以鹽水(1x50ml)洗滌，無(wú)水Na2S04干燥并真空蒸發(fā)。未經(jīng)加工的殘留物4吏用CH2C12:MeOH99:1混合物作為流動(dòng)相通過(guò)硅膠快速層析純化，獲得0.8g化合物7(81%產(chǎn)量)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>3a-*又—丁基二曱基石圭氧一7a—,》基—6a—乙》克-24-去曱-5P-膽烷-23-碌u酸三乙基銨鹽(8)4匕合4勿7(0.5g,0.99mmo1)的THF(7ml)溶液冷3卩至-3。C,加入E^N(0.3ml,2.1mmol),混合物4覺(jué)拌10分4中。加入C1S03H(0.1ml，1.5mmol),混合物室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。加入水(10ml)，混合物以CH2Cl2(3x15ml)抽提，無(wú)水Na2S04干燥并真空蒸發(fā)。未經(jīng)力口工的辟^酸鹽>派生物不經(jīng)進(jìn)一步純^:可用于下一步反應(yīng)。3oc，7a,23-三夾至基-6oc-乙烷—24—去甲—5p—膽烷—23-硫酸三乙基銨鹽(9)4匕合#勿8(0.5g,0.77mmo1)6々丙酉同(8ml)溶液中，力口入PdCl2(CH3CN)2(10mg，0.05eq)，混合物于室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)濾，真空濃縮，使用MeOH/H208/2混合物作為流動(dòng)相通過(guò)中壓LichroprepRP-8純化，以獲得0.115g化合物9，mp118—121°C。'HNMR(200MHz,CD3OD)&0.70(3H,s,C-18Me);0.91(3H，m,C-21Me,3H,C-25);0.98(3H,d,/=6.4Hz，C-19Me);1.32(9H，t,/=7.3Hz,(CH3-CH2)3N);3.20(6H，q,/=7.31Hz,(CH3-CH2-)3N;3.31(1H,m,C-3);3.65(1H,bs，C-7);4.03(2H,m,CH2-23).I3CNMR(CD3OD)5:9.23,12.05,12.19,19.14,21.97,23.52,23.76,24.57,34.23,34.51,36.56,36.65,36.79,41.06,41.55,43.13,47.73,50.28,51.68，57.80，67.19,71.16,73.23.3a,7ot，23-三#5基-6a—乙烷—24_去曱—5(3—月旦*克-23-硫酸鈉鹽(9)〉VS合凈勿8(0.4g,0.72mmol)在丙酉同(4ml)禾口H20(0.08ml)的混合溶液中加入PdCl2(CH3CN)2(10mg，0.05eq),室溫4覺(jué)拌3小時(shí)。反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土過(guò)濾并真空濃縮。最后的產(chǎn)物以10%NaOH甲醇溶液處理2小時(shí)。最后的混合物以真空濃縮，使用CH3OH/H20(7:3)作為流動(dòng)相以液相中壓純4匕，制備0.09g化合物10(25%產(chǎn)量)。實(shí)施例2生物活性首次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以—險(xiǎn)證與鵝去氧膽酸(CDCA)相比，UPF-987是否能調(diào)節(jié)FXR-相關(guān)基因。CDCA是一種主要的膽酸，其29具有法尼酯衍生物-x-受體(FXR;NR1H4)內(nèi)源性配基的作用。通過(guò)4吏用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)細(xì)胞自由測(cè)定的體外實(shí)驗(yàn)首)欠測(cè)定UPF-987對(duì)于FXR活i生的生4勿活'性，如PellicciariR,etal.，JMedChem.200215;45:3569-72描述。簡(jiǎn)要的，反應(yīng)包括了銪-標(biāo)記的抗-GST抗體和抗生物生活蛋白-連接的別藻藍(lán)蛋白，F(xiàn)XRGST-LBD融合蛋白和生物素化的SRC1傳感器多肽。在FRET緩沖液(lOmMHepes,pH7.9,150mMNaCl，2mMMgCl2，1mMEDTA,O.lmg/mlBSA)中于室溫反應(yīng)1小時(shí)。以Victor1420多標(biāo)計(jì)凄t器測(cè)定FRET。FRET無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Scr-1，一種FXR的共-激活因子，其產(chǎn)生的濃度幾乎比自然FXR-配基CDCA需要的低300倍(表1)。表1FRET中UPF-987對(duì)人類(lèi)FXR的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>1CDCA=100%時(shí)SRC1多肽對(duì)于FXR的相對(duì)補(bǔ)充。所有凄史4居為平均±SE，n=4。j吏用人類(lèi)肝細(xì)月包系(HepG2)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估UPF-987是否調(diào)節(jié)FXR-相關(guān)的基因。使用HepG2細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，UPF-987提供了潛在的FXR配基。HepG2細(xì)胞暴露于UPF-987反式;敫活FXR。以帶有FXR基因的病毒載體或克隆在熒光素酶基因下游的其他核酸受體轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞的其他實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)FPF-987作為小鼠，大鼠，和人類(lèi)肝細(xì)胞中的選擇性FXR配基。本方法的詳細(xì)描述見(jiàn)一下參考FirucciS,etal.，Gastroenterology2004。簡(jiǎn)要的，熒光素酶方法中，HepG2細(xì)胞以補(bǔ)充1%青霉素/鏈霉素，1。/。L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(高葡萄糖)(CELBIO)的E-MEM中培養(yǎng)。細(xì)胞于37。C,50/。032生長(zhǎng)。所有轉(zhuǎn)染1吏用鈣石粦酸共沉淀方法進(jìn)《亍，以25juM氯奎作為DNA降解的抑制劑。使用500ng受體載體phsp27-TKLUC進(jìn)4亍瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，200ngPcmv-Bgal作為轉(zhuǎn)染效果的內(nèi)控，各50ng受體表達(dá)質(zhì)粒pSG5-FXR,pSG5-RXR。加入pGEM載體以規(guī)范每個(gè)實(shí)驗(yàn)中DNA轉(zhuǎn)染的tt量(2.5jag)。以pCMV-|3-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)月包，才艮據(jù)P-gal表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，H印G2細(xì)月包以1juMUPF-987刺激18小時(shí)。對(duì)照培養(yǎng)基只以i某介(0.1%DMSO)處理。以lOOial稀釋的受體裂解緩沖液(Promega)裂解細(xì)胞，用焚光素酶分析系統(tǒng)(Promega)分析0.2jul細(xì)月包裂解物中焚光素酶的活性J吏用自動(dòng)光度計(jì)測(cè)定發(fā)光。通過(guò)區(qū)分p-半乳糖肝酶活性的相對(duì)光單位，對(duì)轉(zhuǎn)染效果熒光素酶活性進(jìn)4于標(biāo)化。HepG2細(xì)胞中UPF-987對(duì)FXR目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)為研究UPF-987是否為FXR的調(diào)節(jié)物并表現(xiàn)不同的活性，人類(lèi)HepG2細(xì)胞暴露于UPF-987，CDCA(自然FXR配基)和其6-乙烷-》泉生物，6-ECDCA,其為一種潛在的FXR配基。通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)研究這些配基對(duì)于FXR應(yīng)答基因的效應(yīng)。簡(jiǎn)要的，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)，使用PRIMER3-OUTPUT4欠件設(shè)計(jì)所有PCR引物。從肝臟中提取全部RNA(TRIzol試劑，Invitrogensrl，Milan,Italy)。1樣么克純化的RNA以DNAseI室溫處理10分鐘，隨后加入2.5mmol/LEDTA于95°C孵育3分鐘。使用隨機(jī)引物在20ju1反應(yīng)體積中以SuperscriptIII(Invitrogen，Carsbad,CA)7十RNA反轉(zhuǎn)錄。lOOng才莫牙反溶解于25jul反應(yīng)液中，其含有0.3/nL每種引物和12.5jul2xSYBRGreenPCRMasterMix(Fynnzimes-DyNAmoSYBRRGreenqPCRmix)。所有反應(yīng)進(jìn)4亍三次重復(fù)，在iCycleriQi殳備(Bio-Rad,Hercules,CA)上進(jìn)行，循環(huán)條件如下2分鐘95。C,隨后進(jìn)4亍95。C20秒，55°C20秒和72°C30秒循環(huán)50次。計(jì)算每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，以循環(huán)限度表示(CT;每個(gè)PCR反應(yīng)達(dá)到子貞定的熒光限度時(shí)的循環(huán)It,對(duì)于所有反應(yīng)都i殳置一個(gè)線性范圍)。通過(guò)目標(biāo)基因樣本的CT值和內(nèi)源性對(duì)照(GAPDH)的平均CT值的差值(ACT)計(jì)算基因表達(dá)的數(shù)量。以測(cè)定的對(duì)照樣本和每個(gè)目標(biāo)基因間ACT的差異(△ACT)計(jì)算相對(duì)表達(dá)。相對(duì)mRNA表達(dá)以2-△ACT顯示(表3)。實(shí)時(shí)PCR中使用的引物為hGAPDH:gaaggtgaaggtcggagtandcatgggtggaatcatattggaa;hCYP7Al:caccttgaggacggttcctaandcgatccaaagggcatgtagt;hSHP:gctgtetggagtccttctggandccaatgatagggcgaaagaagag;hBSEP:gggccattgtacgagatcctaaandtgcaccgtettttcactttctg;hSREBPlc:gcaaggccatcgactacattandggtcagtgtgtcctccacct.相對(duì)于表3，使用定量反轉(zhuǎn)錄PCR體外實(shí)驗(yàn)的差異，顯示暴露于任《可這些配基沒(méi)有直4妄的細(xì)力包毒性，HepG2細(xì)月包暴露于CDCA和其6-ECDCA派生物，導(dǎo)致2-3倍的SHP,—種FXR調(diào)節(jié)基因的應(yīng)答。通過(guò)比較，盡管UPF-987是一種FXR配基(見(jiàn)上述)，其刺激SHP的表達(dá)。所有測(cè)試的FXR配基，CDCA,6-ECDCA和UPF-987發(fā)揮相同的對(duì)于CYP7a1的效果(所有32試劑導(dǎo)致CYP7a1mRNA表達(dá)減少60-70%)。此夕卜，暴露于UPF-987引導(dǎo)了BSEP和SHPmRNA表達(dá)(大約2-3倍)。UPF-987相比其他FXR酉己基的效應(yīng)更明顯。進(jìn)一步，相似于其他配基，暴露于UPF-987造成潛在的抑制SREPB-lc和FASmRNA表達(dá)的結(jié)果。綜述，這些lt據(jù)顯示UPF-987是一種作為潛在的FXR配基的FXR調(diào)節(jié)物，并意外地改變FXR調(diào)節(jié)基因，導(dǎo)致膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)(例如BSEP)的顯著減少和脂質(zhì)相關(guān)基因的抑制。此外，UPF-987抑制CYP7al的表達(dá)，其為一種由膽固醇合成膽酸過(guò)程中涉及的基因。這些FXR目標(biāo)基因的調(diào)節(jié)顯示UPF-987是一種基因-選擇性FXR配基，其通過(guò)經(jīng)典途徑增加肝臟中膽酸的分泌抑制膽酸的生物合成，而不影響SHP表達(dá)。該效應(yīng)是所期望的，因其減小了這些FXR配基的藥物學(xué)活性，并可以預(yù)防SHP相關(guān)的代謝活性。表2顯示了對(duì)于UPF-987的體外藥物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表2UPF-987的體外藥物學(xué)結(jié)果細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料劑量物種終點(diǎn)結(jié)果簡(jiǎn)述無(wú)細(xì)胞^實(shí)驗(yàn)UPF-987CDCA濃度范圍由lnM至100MMn/aUPF-987作為FXR配基在無(wú)細(xì)力包實(shí)驗(yàn)FRET方法中的效果這些實(shí)—驗(yàn)結(jié)果顯示UPF-987是一種潛在的FXR配基(EC5。~14nM)肝細(xì)胞UPF-濃度對(duì)FXR和UPF-987導(dǎo)致系987范圍人類(lèi)FXR相關(guān)基FXR的反式激活。(HepCDCA由1因(SHP，UPF-987是一種33<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>素，Alc。碌酸酉旨酶和月s固醇)，施用UPF-987減少了ANIT引發(fā)的膽汁郁積并調(diào)節(jié)肝臟NTCP,BSEP和CYP7A1mRNA表達(dá)實(shí)施例3UPF-987對(duì)FXR目標(biāo)基因的體內(nèi)調(diào)節(jié)背景化合物9也指UPF-987。FXR在膽酸代謝和脂/膽固醇和葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡中涉及的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。這些交互作用的調(diào)節(jié)是高度復(fù)雜的并包括多重反饋回路以自身-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄循環(huán)。竟?fàn)幮院娃卓古浠约癋XR與其他包括PPARs和LXR的代i射核酸受體共享的目標(biāo)基因的重疊范圍，可以作為多余的保護(hù)才幾制以引起保護(hù)反應(yīng)，從而當(dāng)一種途徑折衷時(shí)，補(bǔ)救的途徑可以替代。假設(shè)的代謝核酸受體收斂和發(fā)散功能復(fù)雜性的關(guān)鍵是其轉(zhuǎn)錄共刺激物和共抑制物，其在多種FXR調(diào)節(jié)方式中被引發(fā)。FXR調(diào)節(jié)物可以用于治療-瞼證，淤膽，纖維性肝失調(diào)，和代謝失調(diào)，包括高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥，以及，擴(kuò)展的，動(dòng)月永》更^:癥和其并發(fā)癥。綜述，F(xiàn)XR不僅僅由于其與調(diào)節(jié)相關(guān)的應(yīng)用，也由于其配基識(shí)別和基因激活中的特定機(jī)制，可以作為特別期望的治療藥物。材灃牛和方法動(dòng)物6—8周齡雌性Balb/c小鼠由CharlesRiver(CharlesRiver實(shí)l全室，Inc，Wilmington,MA)獲4孚。動(dòng)物以才示準(zhǔn)chowpelletdiet喂食，有々大水自由通道，12小時(shí)的黑暗/光亮循環(huán)。本研究中的所有方法4艮據(jù)政府動(dòng)物1呆護(hù)指導(dǎo)由Perugia大學(xué)(意大利)動(dòng)物研究委員會(huì)提供。動(dòng)物5天內(nèi)通過(guò)腹腔內(nèi)注射6-ECDCA,5mg/Kg/天，對(duì)照動(dòng)物僅以々某介處理(曱基-纖維素)。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谔幩佬∈?，分離肝臟進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析FXR目標(biāo)基因。35定量實(shí)時(shí)PCR如上述進(jìn)行(見(jiàn)1.1材料和方法)。使用的引物為mGAPDH:ctgagtatgtcgtggagtctacandgttggtggtgcaggatgcattgmBSEP:aaatcggatggtttgactgeandtgacagcgagaatcaccaagmSHP:tctcttcttccgccctatcaandaagggcttgctggacagttamCYP7Al:aagccatgatgcaaaaccteandgccggaaatacttggtcaaamSREBPlc:gatcaaagaggagccagtgcandtagatggtggctgctgagtg結(jié)果完整小鼠中以5mg/kg劑量體內(nèi)施用UPF-9874天后，肝臟中產(chǎn)生潛在的BSEP和SHP誘導(dǎo)。盡管通過(guò)上述體外實(shí)驗(yàn)初步討^侖獲得了激發(fā)性的，然而是矛盾的目標(biāo)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示Cyp7al潛在的下調(diào)(60-70%)作用。UPF-987也導(dǎo)致肝臟中SREBP-lc和FASmRNA表達(dá)的90%水卩制。(圖5)實(shí)施例4大腸炎TNBS小鼠模型中評(píng)估UPF-987抗-炎癥活性材料和方法大腸炎模型半抗原TNBS的結(jié)腸內(nèi)應(yīng)用引起嚙齒類(lèi)動(dòng)物急性和慢性大腸炎。TNBS-大腸炎粘膜炎癥具有顯著的嗜中性滲透作用，但也包4舌CCRl+和CCR5+巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的滲透和顯著的IL-12和IFN-依賴(lài)的T淋巴細(xì)胞(Thl)激活。組治病理學(xué)特征類(lèi)似于人類(lèi)節(jié)^殳性回腸炎，透壁的炎癥，肉芽腫病，裂隙潰瘍和"跳;夭性病變"(潰瘍范圍被正常粘膜范圍分離)。TNBS-大腸炎可作為有用的測(cè)i式建立和創(chuàng)達(dá)斤節(jié),殳性回腸炎治療方法的臨床前模型。動(dòng)物動(dòng)物每天監(jiān)控腹瀉，體重減輕，和存活情況。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，處死存活的小鼠，心臟刺石皮采集血液樣本，切離7cm結(jié)腸片斷，稱(chēng)重，i平估宏觀損傷。大腸炎誘導(dǎo)和研究設(shè)計(jì)在BALB/c小鼠(8周齡)中通過(guò)直腸內(nèi)施用TNBS(0.5mg/小鼠)-誘導(dǎo)大腸炎。開(kāi)始3小時(shí)之后連續(xù)以24小時(shí)為間隔，5天內(nèi)，小鼠腹月空內(nèi)施用UPF—987(0.3—1-3mg/kg)或J某介(曱基纖維素1%)。每組包括5至7只小鼠。最后施用測(cè)試藥物或媒介18小時(shí)后處死小鼠。通過(guò)評(píng)估宏觀損傷對(duì)大腸炎嚴(yán)重程度分級(jí)。后者是組織中粒細(xì)月包浸潤(rùn)的指標(biāo)。大腸炎的宏^L分級(jí)的詳細(xì)描述見(jiàn)Fiomcci等，包括O盲分(正常)至4(嚴(yán)重?fù)p害)級(jí)別。體重和糞便密度在研究的開(kāi)始和最后進(jìn)行紀(jì)錄。收集每個(gè)小鼠末端纟*.腸纟且織才羊-本并^口前戶斤Hii4亍實(shí)一驗(yàn)。大腸炎的宏觀分級(jí)結(jié)腸在解剖鏡(5x)下觀察并根據(jù)宏觀損害分級(jí)，基于反應(yīng)炎癥的標(biāo)準(zhǔn)，如充血，腸增厚，和潰瘍程度分為10級(jí)。定量實(shí)時(shí)PCR^口前所述通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評(píng)估小鼠大腸基因表達(dá)。從結(jié)腸末端組織提取全部RNA。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的序列數(shù)據(jù)，以PRIMER3-OUTPUT軟件設(shè)計(jì)引物37mGAPDH:ctgagtatgtogtggagtctac油dgttggtggtgcaggatgcattgmTNFa:acggcatggatctcaaagacandgtgggtgagcacgtagtmILip:tcacagcagcacatcaacaaandtgtcctcatcctcgaaggtcmlL6:ccggagaggagacttcacagandtccacgatttcccagagaacmINPy:gctttgcagctcttcctcatandgtcaccatccttttgccagtmiNOS:acgagacggataggcagagaandcacatgcaaggaagggaactmTGFpi:ttgcttcagctccacagagaandtggttgtagagggcaaggacmFXR:tgtgagggctgcaaaggtttandacatccccatctctctgcac實(shí)施例5"i平4古UPF-987在大鼠淤膽才莫型(ANIT)中的效應(yīng)背景肝臟內(nèi)堆積細(xì)胞毒性膽酸造成膽汁郁積，其引發(fā)肝臟損害最后導(dǎo)致膽汁纖維化和硬化。淤膽肝損害可被多種內(nèi)在的肝保護(hù)機(jī)制抑制。這些防衛(wèi)機(jī)制包括抑制肝膽酸的表達(dá)和新膽酸的合成。此外，I相和II相膽酸解毒被引發(fā)使得膽酸親水性增強(qiáng)。除了通過(guò)微管4t出系統(tǒng)的"直立行走"輸出，這些化合物也可以通過(guò)基底外側(cè)的"選擇性"輸出系統(tǒng)輸出至系統(tǒng)循環(huán)并通過(guò)腎排除。親水性膽酸的被動(dòng)性腎小球過(guò)濾，活性腎管分泌，和管膽酸再吸收的抑制促進(jìn)了膽汁郁積時(shí)腎膽酸的排除。根本的分子機(jī)制主要為通過(guò)包括核酸受體和其他轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。法尼酯X受體FXR，孕烷X受體PXR，和維生素D受體VDR已經(jīng)^皮鑒定為膽酸的核酸受體。然而，對(duì)于膽酸的纟艮本的對(duì)應(yīng)應(yīng)答不能完全防止膽汁郁積肝臟損害。因此，需要額外的治療策略如核酸受體的定位激活，以增強(qiáng)肝臟對(duì)毒性膽酸的防御。材料和方法動(dòng)物才艮據(jù)Pemgia大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行wistar大鼠研究。從CharlesRiverBreeding實(shí)-g全室(Portage,MI)獲4尋名,寸生wistar大鼠(200-250g),以標(biāo)準(zhǔn)實(shí)-驗(yàn)室大鼠^泉飼養(yǎng)，12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)。淤膽模型方法a-萘基-異硫氰酸鹽(ANIT)第一組大鼠(N-6)以100mg/kg,每天，通過(guò)強(qiáng)飼法以ANIT處理(引發(fā)淤膽)，第二組和第三組(N=6)以ANIT100mg/kg強(qiáng)飼法加上每天腹腔內(nèi)施用5和3mg/kgUPF-987。對(duì)照大鼠(N=4)施用4某介(生理溶液I.P.)。研究末期，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉處死(50mg/kgi.p.)并通過(guò)心臟穿刺采血；分離肝臟并稱(chēng)重測(cè)^式，收集血液纟羊本。定量實(shí)時(shí)PCR如前所述通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評(píng)估大鼠基因表達(dá)。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的序列數(shù)據(jù)，以PRIMER3-OUTPUT軟件設(shè)計(jì)引物39rGAPDH:atgactctacccacggcaagandatgactctacccacggcaagrSHPcctggagcagccctcgtctcagandaacactgtatgcaaaccgaggarBSEP:aaggcaagaactcgagataccagandtttcactttcaatgtccaccaacrCYP7Al:ctgcagcgagctttatccacandcctgggttgctaagggactorCYP8Bl:cccctatctctcagtacacatggandgaccataaggaggacaaaggtctrNTCP:gcatgatgccactcctcttatacandtacatagtgtggccttttggactrMdrl:cgttgcctacatccaggtttandgccattgcctgaaagaacatrMdr2:gttctcgctggtcttcttggandcgtctgtggcgagtcttgtarMMP2:gatggatacccgtttgatggandtgaacaggaaggggaacttg結(jié)果測(cè)定UPF-987對(duì)oc-萘基異硫氰酸鹽(ANIT)誘導(dǎo)的大鼠膽汁郁積的體內(nèi)保護(hù)作用。施用ANIT導(dǎo)致嚴(yán)重膽汁淤積，F(xiàn)iomcci等先前的研究(未出版)已經(jīng)顯示6-ECDCA在本模型中不能有效減少肝臟損害。通過(guò)評(píng)估三種膽汁淤積和血漿膽固醇標(biāo)志物，血清水平的AST,yGT和堿性磷酸酯酶，施用UPF-987減弱了ANIT處理大鼠的肝臟損害。此外，UPF-987,調(diào)節(jié)NTCP，CYP7A1和BSEP表達(dá)。實(shí)施例6評(píng)估INT-1103在大鼠淤膽才莫型(ANIT)中的效應(yīng)背景INT-1103是6-乙烷-鵝去氧膽酸(6E-CDCA或INT-747)的石jUt》泉生物，其描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7138390，通過(guò)引述在此合并于本文。材泮十和方法淤膽模型根據(jù)Perugia大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行a-萘基-異石危氰酸鹽(ANIT)wistar大鼠研究。從CharlesRiverBreeding實(shí)-驗(yàn)室(Portage,MI)獲4尋i禽性wistar大鼠(200—250g),以才示準(zhǔn)實(shí)馬全室大鼠4泉飼養(yǎng)，12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)。第一《且大鼠(N=8)以100mg/kg,每天，通過(guò)強(qiáng)飼法以ANIT處理(引發(fā)淤膽)，第二組和第三組(N=8)以ANIT100mg/kg強(qiáng)飼法加上每天腹腔內(nèi)施用5mg/kgINT-1103。對(duì)照大鼠(N=8)施用々某介(生理溶液I.P.)。研究末期，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉處死(50mg/kgi.p.)并通過(guò)心臟穿刺采血；分離肝臟并稱(chēng)重測(cè)試，收集血液樣本。定量實(shí)時(shí)PCR如前所述通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)評(píng)估大鼠FXR目標(biāo)基因表達(dá)。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的序列數(shù)據(jù)，以PRIMER3-OUTPUT軟件設(shè)計(jì)引物rGAPDH:3tgactctacccacggc幼gandatgactctacccacggcaagrSHPcctggagcagccctcgtctcagandaacactgtatgcaaaccgaggarBSEP:aaggcaagaactcgagataccagandtttcactttcaatgtccaccaacrCYP7Al:ctgcagcgagctttatccacandcctgggttgctaagggacterCYP犯l:cccctatctctcagtacacatggandgaccataaggaggacaaaggtctrNTCP:gcatgatgccactcctcttatacandtacatagtgtggccttttggactrMdrl:cgttgcctacatccaggtttandgccattgcctgaaagaacatrMdr2:gttctcgctggtcttcttggandcgtctgtggcgagtcttgtarMMP2:gatggatacccgtttgatggandtgaacaggaaggggaacttg41實(shí)施例7評(píng)估INT-1103在大鼠淤膽才莫型(BTL)中的效應(yīng)才才料禾。方法(BTL)肝淤膽模型通過(guò)225-250g老年雄性Wistar大鼠膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)。對(duì)Sham-operated大鼠(N=8)進(jìn)行相同的腹腔鏡手術(shù)，除了所操作膽管沒(méi)有被結(jié)扎和分段。共處理24只大鼠。手術(shù)3天后，存活的大鼠隨機(jī)通過(guò)腹腔內(nèi)給予安慰劑，(fisioogic溶液)(N=6)或5mg/kgINT-1103(N=8)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7天。研究末期，大鼠以戊巴比妥鈉麻醉處死(50mg/kgi.p.)并通過(guò)心臟穿刺采血；分離肝臟并稱(chēng)重測(cè)試，收集血液4羊本。實(shí)施例8評(píng)估未處J里大鼠中INT-1103和INT-747對(duì)膽汁流的作用才才料禾口方法200至250g成年^M生Wistar大鼠用于本研究。實(shí)-瞼前，動(dòng)物給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和隨意飲水，房間溫度(21-23°C)，濕度(45-50%),12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)。所有研究根據(jù)Perugia大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)^亍。動(dòng)物以單劑量戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg體重，腹腔內(nèi))并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持該條件，測(cè)定膽汁流。使用PE—50聚乙丈希管(Intramedic;ClayAdams,Parsippany,NJ)頸靜脈導(dǎo)管插入后，腹部開(kāi)中等切口，膽總管導(dǎo)管插入(PE-10,ntramedic;ClayAdams)。以熱燈使體溫維持在37.0至38.5°C以防止膽汁流受體溫過(guò)低影響。通過(guò)膽外瘺在195min內(nèi)每15min收集膽汁樣本并且稱(chēng)重以測(cè)定膽汁流量。假設(shè)l.Og/ml的膽汁濃度，通過(guò)重量測(cè)量法測(cè)定膽汁流。在9:00-11:OOAM之間收42集膽汁，使節(jié)律的影響最小。通過(guò)頸靜脈插管施用3jumoli/kg/min藥物，對(duì)照組Y又4妻受々某介(2%BSAfisilogic溶液)。實(shí)施例9評(píng)估J難激素瘀膽大鼠中INT-1103和INT-747對(duì)膽汁流的作用材料和方法300至350g成年孟,性Wistar大鼠用于本研究。實(shí)-驗(yàn)前，動(dòng)物給予標(biāo)準(zhǔn)々大食和隨意々大水，房間溫度(21-23°C)，濕度(45-50%),12小時(shí)光亮/黑暗循環(huán)。所有研究根據(jù)Perugia大學(xué)動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。動(dòng)物被隨機(jī)分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組1.未處理，(N=5)2.以5mg/kg腹月空內(nèi)5天施用17—乙炔基站,二酉事，(N=8)3.腹腔內(nèi)5天施用5mg/kg17-乙炔基雌二醇+5mg/kgINT-747,(N=7)4.腹腔內(nèi)5天施用5mg/kg17-乙炔基雌二醇+5mg/kgINT-1103,(N-7)在第6天(施用最后劑量的E217后1天)進(jìn)行手術(shù)，收集膽汁。動(dòng)物以單劑量戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg體重，腹腔內(nèi))并在整個(gè)實(shí)—驗(yàn)中維持該條件，測(cè)定膽汁流。腹部開(kāi)中等切口，膽總、管導(dǎo)管4悉入(PE—10，ntramedic;ClayAdams)。以熱燈l吏體溫維持在37.0至38.5。C以防止膽汁流受體溫過(guò)低影響。在9:00-11:OOAM之間收集膽汁，使節(jié)律的影響最小。在120min內(nèi)每15min收集膽汁樣本，膽汁流通過(guò)重量測(cè)定法測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)的最后，稱(chēng)量大鼠的體重和肝重。實(shí)施例10INT-747相對(duì)INT-1103對(duì)胰島素基因調(diào)節(jié)的體外研究材料和方法RT-PCR分析，在1%青霉素/鏈霉素，1%L-谷氨酰胺和10%胎牛血清(高葡萄糖)(CELBIO)的D-MEM中培養(yǎng)B-TC6胰細(xì)胞。細(xì)胞于37。C，5。/。C02生長(zhǎng)并用最終濃度1nM的INT-1103和INT-747處理18小時(shí)。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谑占?xì)胞以提取RNA。實(shí)時(shí)PCR通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)小鼠基因表達(dá)進(jìn)行定量。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的序列數(shù)據(jù)，以PRIMER3-OUTPUT軟件設(shè)計(jì)所有引物。從肝臟中4是取全部RNA(TRIzol^式劑，Invitrogensrl,Milan,Italy)。1孩t克纟屯4b的RNA以DNAseI室溫處理10分鐘，隨后加入2.5mmol/LEDTA于95。C孵育3分4f。4吏用隨機(jī)引物在20ju1反應(yīng)體積中以SuperscriptIII(Invitrogen,Carsbad，CA)對(duì)RNA反轉(zhuǎn)錄。100ng模板溶解于25jul反應(yīng)液中，其含有0.3nL每種引物和12.5jul2xSYBRGreenPCRMasterMix(Fynnzimes-DyNAmoSYBRRGreenqPCRmix)。所有反應(yīng)進(jìn)4亍三次重復(fù)，在iCycleriQ設(shè)備(Bio-Rad,Hercules,CA)上進(jìn)行，循環(huán)條件如下2分鐘95。C，隨后進(jìn)行95。C20秒，55°C20秒和72°C30秒循環(huán)50次。計(jì)算每個(gè)才羊本重復(fù)實(shí)-險(xiǎn)的平均值，以循環(huán)限度表示(CT;每個(gè)PCR反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的熒光限度時(shí)的循環(huán)數(shù)，對(duì)于所有反應(yīng)都設(shè)置一個(gè)線性范圍)。通過(guò)目標(biāo)基因樣本的CT值和內(nèi)源性對(duì)照(GAPDH)的平均CT值的差值(ACT)計(jì)算基因表達(dá)的數(shù)量。以測(cè)定的對(duì)照樣本和每個(gè)目標(biāo)基因間ACT的差異(AACT)計(jì)算相對(duì)表達(dá)。相對(duì)mRNA表達(dá)以2-△ACT表示。實(shí)時(shí)PCR中使用的引物為m<5APDH:gaaggtgaaggtcggagtandcatgggtggaatcatattggaa;mSHP:gctgtctggagtccttctggandccaatgatagggcgaaagaagag;mSREBPlc:gcaaggccatcgactacattandggtcagtgtgtcctccacct.mINS:tgttggtgcacttcctacccandttgttccacttgtgggtcctmSHP:aagggcttgctggacagttaandtctcttcttcctccctatcamGLUT2:ccctgggtactcttcaccaaandgccaagtaggatgtgccaat實(shí)施例11INT-747和INT-1103的物理化學(xué)特性背景兩種膽酸類(lèi)似物，INT-747和INT-1103,才艮據(jù)先前發(fā)現(xiàn)并經(jīng)我們實(shí)-瞼室優(yōu)化的方法，具有完全的物理-化學(xué)特征，并先前經(jīng)R.Pellicciari實(shí)-瞼室研究應(yīng)用于完全掃描大量系列的膽酸類(lèi)A乂物(UDCA類(lèi)似物)。選擇物理-化學(xué)特征以精確定義緩沖溶液和生理體液的特性，并建立其對(duì)生理成分的潛在毒性，其在不同生物體液和器官中的藥^動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)及生物分布。與自然類(lèi)似物的比較數(shù)據(jù)也一皮提供并討論。水溶解性454義<又研究旁鏈羧基BAINT-747,CDCA和UDCA。固體BA懸浮于5mlO.IMHC1。孵育1周后，飽和溶液經(jīng)Millipore過(guò);慮(0.22nm),<吏用C18讒主子(150mmx2mmi.d.4jam)以HPLC-ESI-MS/MS測(cè)定BA的濃度，水流動(dòng)相包括15mMpH5乙酸和乙腈。流速為150jal/分鐘。使用陰離子ESI源多重反應(yīng)監(jiān)控模型進(jìn)ff質(zhì)譜采集。緩沖溶液以inmoi/升表示表3:膽酸研究的緩沖溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*水溶性指BA作為質(zhì)子化物質(zhì)因此不對(duì)INT-1103評(píng)估測(cè)定pH值為1時(shí)羧酸鹽膽酸的不溶性質(zhì)子化物質(zhì)的水溶性。碗酸鹽化合物，UPF1103在低pH時(shí)仍是電離的并且在所有生理體液的生理環(huán)境下是始終可溶的。INT-747的水溶性是9"M，其比CDCA低，與UDCA相當(dāng)。因?yàn)镮NT-747的CMC相對(duì)較低(見(jiàn)下一章節(jié))，INT-747的低水溶性并不折衷膠束相化合物的特性；對(duì)于UDCA，高CMC相關(guān)的低水溶性折衷于使溶液中質(zhì)子化酸形成膠束的pH。事實(shí)上，UDCA的CMpH是8.4,如果不在十二指腸中顯現(xiàn)餐后堿化作用，其是過(guò)高的。臨界孩i團(tuán)濃度(CMC)<吏用最大泡壓法通過(guò)測(cè)定表面張力測(cè)定該值。張力計(jì)是Sensadyne6000(Chem-DyneResearchCorp.,Milwaukee,WI),配備與氮?dú)庠催B接的0.5和4.0mm直徑的玻璃探針。氣泡頻率為26。C去離子水中1氣泡/秒(P=2.7atm),以雙去離子水和曱醇標(biāo)化。BA鈉鹽溶液的表面張力在水和0.15MNaCl中以不同濃度范圍進(jìn)4亍測(cè)定，分另'J為0.2—75mM禾口0.3—100mM。4夸表面張力對(duì)于膽酸濃度的對(duì)數(shù)值作用；4吏用最小平方計(jì)算對(duì)應(yīng)于曲線兩個(gè)部分(單節(jié)顯性和膠束相)的回歸線，線的交點(diǎn)作為CMC值。表4:研究的膽酸的臨界微團(tuán)濃度膽酸CMC(mM)STcmcST50H20NaCl0,15MDyne/cmDy加/cmINT-7474.52.948.843.2INT-11033.91.347.943.3CDCA7.53.055.648.5UDCA266.063.050.4TUDCA8.0*2.2*TCDCA7.0*3.0*_-STCMC:水中CMC的表面張力，ST50:50mM緩沖溶液中的表面張力；*:文獻(xiàn)值在非平衡條件，例如，雜質(zhì)不影響結(jié)果的條件下通過(guò)表面張力測(cè)定的INT-747和INT-1103的CMC值是相當(dāng)?shù)偷?，相似于CDCA自然類(lèi)似物。INT-1103在7jc中和存在150mM反相Na+離子時(shí)都具有更低的CMC值。INT-747的低CMC值與乙烷基和羥基的局部解剖學(xué)分布相關(guān)第6位的乙烷基定向于I3方位，類(lèi)固醇的后位，其有助于增加親脂性范圍和該配基的表面積，因此趨向于形成樣i團(tuán)。INT-1103由于側(cè)鏈上第6位的乙烷基和第23位的硫酸鹽，具有更低的CMC值。由于帶有表面親脂性基47團(tuán)的陰離子頭部和脂質(zhì)尾，硫酸鹽基團(tuán)的特殊性質(zhì)給予INT-1103陰離子表面活性劑相似特性(類(lèi)似于十二烷基磺酸鈉)。CMC和膠束相(50mM)的表面張力活性值與已有的CMC數(shù)據(jù)一致，兩種化合物都具有表面活性，并且在^艮大程度上可以降低UDCA和TUDCA的表面張力。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持該化合物是類(lèi)似于并且甚于CDCA類(lèi)似物的去污劑。相對(duì)高濃度>60mM的INT-747及存在0.15MNa+時(shí)形成月交束相，i兌明了該條件下發(fā)現(xiàn)的相關(guān)非#青確ST數(shù)據(jù)(圖1)。這些結(jié)果是不驚奇的，因?yàn)槠渌ノ蹌┳匀籅A,4。去氧膽酸類(lèi)似;也形成該凌是"交(通常為黏彈性的)，特別是在反相離子如Na+和Ca—的作用下。該相位發(fā)展出相對(duì)低動(dòng)力學(xué)的膠束相。此外該現(xiàn)象發(fā)生在非常高的非生理濃度下。辛醇/水劃分凌文應(yīng)使用常規(guī)^罷弁瓦方法;平估1-辛醇/水劃分效應(yīng)(logP)。實(shí)驗(yàn)在pH8O.lmM月旦鹽溶液和0.1M磷酸緩沖液中進(jìn)行以確保BA的完全電離；logP值指電離形式的BA,非質(zhì)子化物質(zhì)，每種BA的最初;農(nóng)度在其CMC值之下。緩沖溶液預(yù)先以1-辛醇預(yù)-々包和，加入5ml水預(yù)-飽和的1-辛醇，樣本于室溫連續(xù)攪拌平衡2周。離心后分離兩相。4吏用C184主子(150mmx2mmi.d.,4jum)HPLC-ESI—MS/MS測(cè)定水相中BA濃度，流動(dòng)相A:15mM乙酸水溶液pH5，B:乙腈。流速為150jul/分鐘，柱子維持在45°C。使用陰離子ESI源在多種反應(yīng)監(jiān)控模型中進(jìn)行質(zhì)鐠分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>計(jì)算電離物質(zhì)的1-辛醇-水分離系數(shù)以促進(jìn)羧基和石危酸鹽膽酸的比4交，而后者在非常低的pH時(shí)不被質(zhì)子化。INT-747相對(duì)于其他二羥基膽酸如UDCA和CDCA,具有略高的親脂性。增加的親脂性是位點(diǎn)6引入乙烷基團(tuán)的結(jié)果。在脂質(zhì)范圍中的分布趨勢(shì)因而更高。由于石危酸基團(tuán)和側(cè)《連長(zhǎng)度，UPF1103顯示lpgP為2.0，略低于INT-747和自然CDCA和UDCA類(lèi)似物。此夕卜，INT-1103的親脂性類(lèi)似于非結(jié)合的BA并高于?；撬徇B4妻的TCDCA，其logP為0.9。相反的，7jc相中的牛碌酸連才妄物，INT-1103類(lèi)似于INT-747具有在脂質(zhì)區(qū)i或聚集的趨勢(shì)。白蛋白結(jié)合通過(guò)固定BA-白蛋白比例平衡透析評(píng)估白蛋白結(jié)合。BA溶解于100juM5。/。牛血清白蛋白-鹽溶液并放置于25°C24小時(shí)。2ml該溶液置于分子量截留值為12-14000的纖維素嚢中，以25ml鹽溶液透析。系統(tǒng)通過(guò)機(jī)械振動(dòng)在25。C平《軒72小時(shí)。用HPLC-EIS-MS/MS以前述相同的條件測(cè)定透析溶液和起始溶液的BA濃度。表6:研究的月旦酸的白蛋白結(jié)合*:文獻(xiàn)值<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>INT-747和UPF1103都表現(xiàn)了類(lèi)似于自然雙羥基膽酸，如CDCA和UDCA的與白蛋白的強(qiáng)交互作用，顯示肝臟吸收的類(lèi)似動(dòng)力學(xué)。三羥基膽酸如膽酸或牛石黃酸連接的膽酸顯示較低的白蛋白交互作用，-說(shuō)明了顯示的腸吸收中更低的血清濃度，造成更高的第一4侖清除結(jié)果。未結(jié)合的片斷(與許多藥物類(lèi)似)調(diào)節(jié)肝臟吸收片斷增力口吸收。INT-747和INT-1103具有更低的非結(jié)合片斷因此作為相對(duì)較低的第一輪清除，其血清濃度更高，其特性相似于自然類(lèi)似物。臨界膠束pH該一f直可以通過(guò)評(píng)估給定BA開(kāi)始由月交束、溶液沉淀的pH{直測(cè)定?？梢杂蒀MC計(jì)算。質(zhì)子4匕物質(zhì)水〉容液和pKa為以下形式CMpH=pKa+logCMC/WS。表1描述了研究的化合物與自然類(lèi)合乂物比4交的CMpH。表7:研究的膽酸臨界膠束pH<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>INT747的CMpH值相似于CDCA而低于UDCA。根據(jù)該值INT747沒(méi)有腸內(nèi)可〉容性的問(wèn)題，并且需要pH7.6的溶解生理?xiàng)l件。例如UDCA的CMpH值為8.4,需要十二指腸中的更高堿性，并且只在々大食后階—敬以月交束相溶解。UP1103具有錄b酸基團(tuán)，不具有該問(wèn)題，其在2至9的生理pH下都為可溶，因此pKa非常^f氐，化合物并不質(zhì)子化形成非可溶性分子。其性質(zhì)類(lèi)似于?；撬徇B接的膽酸。實(shí)施例12大鼠iv灌$#3jumol/Kg/分鐘INT-747和INT-1103—'J、時(shí)后的肝臟^i射和分泌背景大鼠膽管灌輸BA,7小時(shí)內(nèi)每15分鐘收集膽汁。測(cè)定膽汁流，HPLC-ES-MS-MS分析膽汁以鑒定膽汁分泌速度并評(píng)估主要肝臟代i射。HPLC-ES-MS/MS方法通過(guò)液相色譜-串寫(xiě)關(guān)質(zhì)譜(HPLC-ES-MS/MS)方法使用陰離子才莫型電噴射(ESI)源測(cè)定膽酸和其代i射物。大鼠膽汁樣本置于室溫并以15mM醋酸銨緩沖液(pH5)1:100v/v-1:1000v/v稀釋。10juL注射入色讀-柱。4吏用WatersAlliance2695分離單元及自動(dòng)近樣裝置進(jìn)4亍液相色i普。4吏用SynergiHydro-RPC18柱子(150x2.0mmi.d.，4/am粒徑)分析膽酸，SecurityGuardODS4x2.0mmi.d。寸呆護(hù)^主寸呆護(hù)，由Phenomenex才是供。4吏用15mM醋酸銨《爰沖液(pH=5.00)作為流動(dòng)相A及乙腈作為流動(dòng)相B以洗脫梯度分離膽酸。流動(dòng)相B在12分鐘內(nèi)由30%增加至64%，隨后在8分鐘內(nèi)增加至70%,最后在IO分鐘內(nèi)達(dá)到100%并維持1分4f。流速為150juL/分鐘，柱子維持45。C。多重反應(yīng)監(jiān)控(MRM)獲得沖莫型操作，用Quattro-LC"鼓小質(zhì)量)三四質(zhì)譜以ESI-MS/MS分析柱子流出物。MassLynx軟件4.0版用于獲得和才喿作^:據(jù)。結(jié)果INT-747主要以牛石黃酸結(jié)合物分泌入膽汁中并且其回^li:是幾乎完全的給藥劑量時(shí)超過(guò)99%的灌輸分子分泌入膽汁中，如圖3顯示。膽汁收集的最后點(diǎn)在膽汁中仍分泌相當(dāng)高數(shù)量的牛磺酸結(jié)合化合物。在輸送末120分鐘后達(dá)到最大分泌速度。隨后30分鐘維持穩(wěn)定的濃度階段。?；撬峤Y(jié)合方法開(kāi)始于非常早期，并且在給藥劑量上顯示效果。痕量的化合物也與甘氨酸結(jié)合，其少于0.2%并且顯示的數(shù)量分泌入膽汁中。INT-747的特性與自然乂又羥基類(lèi)似物如CDCA活UDCA類(lèi)似，其^f又以?；?酸和甘氨酸結(jié)合物形式分泌入月旦汁中。不同的，商羥基BA如CA，也可以部分以非結(jié)合形式分泌。非修飾BA的分泌范圍依賴(lài)于其親脂性和劑量及物種。該分子的肝臟吸收和分泌特性與自然類(lèi)似物如CDCA非常52顯示，并且肝臟分泌的速度與CoA活性介導(dǎo)的牛》黃酸結(jié)合和?；撬岣闻K利用率相關(guān)。與牛石黃酸的結(jié)合是大鼠和其他物種(狗，小鼠，...)特有的，人類(lèi)中該化合物主要與甘氨酸結(jié)合給藥。根據(jù)這些凄t據(jù)顯示INT-747可以有效的被肝臟吸收和分泌。INT-747的肝臟代謝過(guò)程主要為牛石黃酸結(jié)合形式。痕量的甘氨酸結(jié)合物在膽汁中分泌，并且分泌量非常少(圖37和38)。膽汁中存在非結(jié)合的和牛磺酸結(jié)合的小差向異構(gòu)體(圖39和40)。^口圖41顯示INT-1103在月旦汁中部分以非^修飾形式分泌。膽汁中INT-1103的分泌量約為《會(huì)藥劑量的30-40%，其分泌速度相對(duì)4交{氐，收集末期相當(dāng)高婆史量的分子仍分泌入膽汁中。大鼠中給藥劑量的INT-1103的主要肝臟代謝物為3-葡萄糖甘酸，如圖42所示。由于沒(méi)有純〗匕的參考標(biāo)準(zhǔn)物，沒(méi)有對(duì)該化合物定量。其他分泌入月旦汁的代i射產(chǎn)物描述于圖43，更詳細(xì)見(jiàn)圖43和圖44。奠定的主要代謝產(chǎn)物是3-硫酸鹽結(jié)合物，一種羥基類(lèi)似物(超過(guò)一個(gè)羥基)，酮派生物和INT-1103差向異構(gòu)體。由于沒(méi)有純化的參考標(biāo)準(zhǔn)物，沒(méi)有對(duì)這些化合物定量。這些凄《據(jù)顯示INT-1103可以以該方式分泌入膽汁，并且其特性與需要與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合分泌入膽汁的自然雙羥基類(lèi)似物如CDCA和INT-747不同。這是這些分子親脂性所需的主要方面。相反，可以分泌入膽汁的三羥基BA如CA或UCA也部分如此。INT1103中的硫酸基團(tuán)促進(jìn)分泌過(guò)程，即使該分子仍是親脂性的，并且其特性在非連接和?；撬徇B接膽酸之間。此外肝臟主要將該化合物代謝形成更具親水性的化合物，如3-葡萄糖甘酸，3-辟b酸鹽和羥基化類(lèi)似物。^呆留化合物的廣泛代i射作用與動(dòng)物種類(lèi)和給藥劑量相關(guān)，并且根據(jù)這些數(shù)據(jù)我們可以推測(cè)該化合物的代謝相似于"酸甾體"，稍不同于通常的膽酸，但可能具有相同的特性。我們不知道人體中的代i射，但如果其特性更53類(lèi)似于一種甾體，其在人類(lèi)體中可能轉(zhuǎn)化為3-葡醛酸。化合物通過(guò)ivi合藥并且需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)以評(píng)估其腸吸收的程度，例如類(lèi)似牛磺酸結(jié)合物的去活性或激活性。實(shí)施例13人類(lèi)糞便培養(yǎng)的體外代謝穩(wěn)定性對(duì)于腸道細(xì)菌的穩(wěn)定性；7a-脫羥基均質(zhì)新鮮人類(lèi)糞便(500mg)轉(zhuǎn)移至無(wú)菌小并瓦中，加入5mL無(wú)菌碎肉-葡萄4唐i咅養(yǎng)基(ScottLab,Fiskville,RI)。力口入BA至纟冬;農(nóng)度0.05mM。小弁瓦于37。Ci咅養(yǎng)；加入BA0,4，8,16,20,24和72消失后，加入150L30%KOH終止反應(yīng).樣本經(jīng)3500rpm離心10分鐘；以C-18固相分離上清液中的BA并用TLC和HPLC-ES-MS/MS分才斤。4吏用0.25m厚度石圭月交4反(Merck，Darmstat，德國(guó))薄層色譜(TLC)，進(jìn)行第一次篩選實(shí)驗(yàn)。用于分離結(jié)合BA的溶劑系統(tǒng)包括丙酸/乙酸異戊酉旨/水/N-丙醇(3:4:1:2,v/v/v/v;溶劑I)，非結(jié)合BA的溶劑為乙酸/四氯化碳/異丙醚/乙酸異戊酯/水/N-丙醇/苯(1:4:6:8:2:2,v/v/v/v/v/v;;容劑II)。分離的BA以5%石粦鉬酸乙醇-容液顯色。INT-747和INT-1103經(jīng)人類(lèi)糞侵J備養(yǎng)都非常穩(wěn)定，如圖45顯示甚至24小時(shí)后可以回收超過(guò)85%的非修飾化合物。相反，參考自然類(lèi)似物CDCA的半衰期為1小時(shí)，孵育8小時(shí)后幾乎完全代謝(雙羥基化)形成石膽酸。結(jié)果圖46的數(shù)據(jù)顯示，第6位乙烷基團(tuán)的存在通過(guò)空間位阻保護(hù)了7鞋基基團(tuán)的氧化或去除。此外，兩種類(lèi)似物，特別是INT-1103非常穩(wěn)定。側(cè)鏈酯鍵在人類(lèi)糞便培養(yǎng)物中非常穩(wěn)定。通過(guò)HPLC-ES-MS/MS沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微小代謝物。實(shí)施例14十二指腸/胰液刺激的體外穩(wěn)定性(USP規(guī)范)材料和方法本研究?jī)H針對(duì)INT1103,由于側(cè)鏈其含有酯鍵，目的是-瞼證存在胰酶時(shí)的穩(wěn)定性，如在十二指腸和胰液中。以0.05M磷酸緩沖液溶解胰酶(SigmaP8096:來(lái)源于豬胰腺的胰酶，1xUSP規(guī)范的活性)制備10g/L胰液，pH-7.2±0.1.4mL胰液中加入50luMINT-1103并于37。C孵育不同時(shí)間(0，30，60，90，120,180，和240分鐘)。孵育后，2mL每種溶液加入2mL0.1MNaOH,通過(guò)SPE提取膽酸，以前述薄層色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析。權(quán)利要求1.結(jié)構(gòu)式(I)的化合物其中R是氫或α-羥基位置7上的羥基基團(tuán)是α或β位的和藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑化物或其氨基酸結(jié)合物。2.一種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，并且R為氫。3.一種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物,并且R為氫。4.一種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，并且R為oc-羥基。其中位置7的羥基基團(tuán)在ot位其中位置7的羥基基團(tuán)在p位其中位置7的羥基基團(tuán)在a位5.—種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中藥學(xué)上可接受的鹽為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>6.—種結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，其中藥學(xué)上可接受的鹽為7.—種在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的方法，包4舌對(duì)患有FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的哺乳動(dòng)物施用治療有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物。8.4艮才居4又利要求5的方法，其中FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況選自由十曼'l"生肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，和代j射疾病所-纟且成的《且中。9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中慢性肝病選自由以下疾病所組成的組中，原發(fā)性石更化(PBC),腦腱性黃瘤癥(CTX),原發(fā)性硬化性膽嚢炎(PSC),藥物導(dǎo)致的膽汁郁積，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸外吸收相關(guān)膽汁郁積(PNAC)，細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)或膿血癥膽汁郁積，自身免疫肝炎，慢性病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD),非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝移植相關(guān)移植物抗宿主病，活供體肝移植再生，先天性肝纖維化，膽總管結(jié)石，肉芽性肝病，肝內(nèi)-或外惡性腫瘤，Sjogren綜合征，結(jié)節(jié)病，Wilson's疾病，Gaucher，s疾病，血色病，或a1—抗月夷蛋白酶缺乏癥。10.才艮據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中胃腸疾病是選自由以下疾病所組成的組中炎癥性腸病(IBD),包括Crohn，s疾病，潰瘍性腸炎，腸易激綜合征(IBS),細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)吸收不良，反射-后結(jié)腸炎，和孩i小性結(jié)腸炎。11.才艮據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中腎疾病是選自由以下疾病所組成的組中糖尿病腎病，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS),高血壓腎病，慢性腎小球炎，慢性移植性腎小球病，慢性間質(zhì)性腎炎，和多嚢腎病。12.才艮據(jù)4又利要求6的方法，其中心血管疾病是選自由以下疾病所組成的組中動(dòng)脈石更化癥，動(dòng)脈石更化，血脂障礙，高膽固醇血癥，禾口高甘油三酯血癥。13.才艮據(jù)4又利要求6的方法，其中代謝疾病是選自由以下疾病所組成的組中胰島素抗性，I型和II型糖尿病，或月巴胖。14.一種藥物組合物，包^"4艮據(jù)4又利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。15.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義的結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于預(yù)防或者治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物中的應(yīng)用。16.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于子貞防或治療FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況的藥物中的應(yīng)用，所述FXR-介導(dǎo)的疾病或狀況選自由慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，,n^i射疾病，心臟血管疾病，動(dòng)月永》更<匕癥，動(dòng)月永》更化，高膽甾醇血，和高脂血所組成的組。17.才艮據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于預(yù)防或治療淤膽肝疾病'漫性肝疾病的藥物中的應(yīng)用，所述淤膽肝疾病慢性肝疾病選自由原發(fā)性硬化(PBC),腦腱性黃瘤癥(CTX),原發(fā)性硬化性膽嚢炎(PSC)，藥物導(dǎo)致的月旦汁郁積，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸外吸收相關(guān)膽汁郁積(PNAC),細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)或膿血癥膽汁郁積，自身免疫肝炎，慢性病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD),非酒精性脂肪性肝炎(NASH),肝移植相關(guān)移植物抗宿主病，活供體肝移植再生，先天性肝纖維化，膽總管結(jié)石，肉芽性肝病，肝內(nèi)-或外惡性腫瘤，Sjogren綜合征，結(jié)節(jié)病，Wilson's疾病，Gaucher，s疾病，血色病，或a1-抗胰蛋白酶缺乏癥所組成的組。18.才艮才居權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于預(yù)防或治療胃腸疾病的藥物中的應(yīng)用，所述胃腸疾病選自炎癥性腸病(IBD),Crohn's疾病，潰瘍性腸炎，腸易激綜合征(IBS),細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)吸收不良，反射-后結(jié)腸炎，和樣史小性結(jié)腸炎所組成的組中。19.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于預(yù)防或治療腎病的藥物中的應(yīng)用，所述腎病選自由糖尿病腎病，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS),高血壓腎病，慢性腎小球炎，慢性移植性腎小球病，慢性間質(zhì)性腎炎，和多嚢腎病所組成的組中。20.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于"頁(yè)防或治療心血管疾病的藥物中的應(yīng)用，所述心血管疾病選自由動(dòng)月永石更化癥，動(dòng)廚"更4匕，血脂障^礙，高膽固醇血癥，和高甘油三酯血癥。動(dòng)力永石更^f匕癥，動(dòng)&;M更化，高月旦固商事血癥，和高血脂所組成的《且中。21.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義結(jié)構(gòu)式(I)化合物在制備用于預(yù)防或治療代i射疾病的藥物中的應(yīng)用，所述代i射疾病選自由fl夷島素抗性，I型和II型糖尿病，或月巴胖所組成的組中。22.藥物組合物，包括混合有藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所定義的結(jié)構(gòu)式(I)化合物。全文摘要本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)(I)的化合物其中R是氫或α-羥基；位置7上的羥基基團(tuán)是α或β位；和藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑化物或其氨基酸結(jié)合物。文檔編號(hào)C07J9/00GK101522703SQ200780032111公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2007年6月27日優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日發(fā)明者M(jìn)·普魯澤斯基,R·佩里恰里,S·菲奧魯西申請(qǐng)人:英特塞普特醫(yī)藥品公司