專利名稱：：分離和檢測小多核苷酸的方法和物質(zhì)的制作方法分離和檢測小多核苷酸的方法和物質(zhì)相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年8月30日4是交的題目為"MethodandSubstancesforIsolatingRNAs(分離RNAs的方法和物質(zhì))"的美國臨時(shí)專利申請60/824,068的權(quán)利；要求2006年9月15日提交的題目為"MethodandSubstancesforIsolatingRNAs(分離RNAs的方法和物質(zhì))"的美國臨時(shí)專利申請60/825,888的權(quán)利；要求2006年11月1日提交的題目為"MethodandSubstancesforIsolatingRNAs(分離RNAs的方法和物質(zhì))"的美國臨時(shí)專利申請60/863,886的權(quán)利；要求2006年11月16日提交的題目為"MethodandSubstancesforIsolatingRNAs(分離RNAs的方法和物質(zhì))"的美國臨時(shí)專利申請60/866,210的權(quán)利；以及要求2006年12月20曰提交的題目為"MethodandSubstancesforIsolatingRNAs(分離RNAs的方法和物質(zhì))"的美國臨時(shí)專利申請60/871,094的權(quán)利；上述申請的內(nèi)容以其整體通過引用的方式并入本文公開內(nèi)容。
背景技術(shù)：
：有種類繁多的天然存在的和合成的小多核苷酸，其具有科學(xué)和商業(yè)益處。示例性小多核苦酸包括微小RNAs、snoRNAs、短干擾RNAs(天然的或合成的)、指導(dǎo)RNAs、核仁RNAs、核糖體RNAs、tRNAs以及小反義DNAs或小多核苦酸降解產(chǎn)物。特別有益處的是微小RNA(miRNAs)，即天然存在的18至24個(gè)RNA殘基的單鏈多核糖核苷酸(polyRNAs)，其來源于更長的天然存在的非編碼真核前體RNA轉(zhuǎn)錄物(通常具有"發(fā)夾"構(gòu)型)，且miRNAs在細(xì)胞發(fā)育和分化通路中發(fā)揮重要作用。因此，已做了大量努力試圖理解和表征miRNAs的時(shí)間、空間和細(xì)胞表達(dá)水平以及表達(dá)沖莫式以確定它們在正常和疾病兩種狀態(tài)下的細(xì)胞發(fā)育和分化中的確切作用。目前對miRNAs的研究首先是通過/人樣品中獲取總RNA。接著通過凝膠電泳或通過層析分離和粒度選擇洗脫將總RNA分離到亞群。然后，切下凝膠的適當(dāng)段，從凝膠中洗脫出18-24RNAs，或收集包含大小為18-24核糖核芬酸的單鏈RNA's的洗脫組分，通常是長度小于500-200核苷酸的RNA組分。接著通過沉淀分離所述RNAs，并表征miRNAs。然而，當(dāng)樣品量小時(shí)，諸如來自肺瘤組織或活才企材料的樣品，這些方法的效果并不好，因此它們是有缺點(diǎn)的。此外，通過現(xiàn)行的方法分離出的miRNAs的表征通常包括幾步擴(kuò)增程序，隨后是檢測、定量、克隆和測序。因?yàn)檫@些過程中的眾多的步驟以及與miRNAs的反復(fù)純化、分離和鑒定相關(guān)的低劣效率，所以現(xiàn)行的方法是耗時(shí)的，相對昂貴的，需要相對大量的材料且并不能完全代表在諸如肺瘤的樣品內(nèi)表達(dá)的miRNAs群，或那些低豐度表達(dá)的miRNAs。另外，這些方法并不能特異地分離和鑒定miRNAs，而是經(jīng)常分離和鑒定siRNA、tRNA、5S/5.8SrRNA以及來自另外的細(xì)胞RNAs的降解RNA。因此，需要用于分離和鑒定miRNAs、其它的小調(diào)節(jié)RNAs和短干擾RNAs(siRNAs)的改良方法，其沒有上述的這些缺點(diǎn)。發(fā)明概述依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于分離和檢測小多核苷酸的捕獲探針(captureprobe)。所述捕獲探針是包括如下區(qū)段的多核苦酸具有間隔區(qū)段序列的間隔區(qū)段，該間隔區(qū)段有3'端和5，端；具有模板區(qū)段序列的模板區(qū)段，該模板區(qū)段有3'端和5'端；以及具有小多核香酸結(jié)合區(qū)段序列的小多核香酸結(jié)合區(qū)段。所述間隔區(qū)段的5'端與所述小RNA結(jié)合區(qū)段的3'端連接，且模板區(qū)段的3'端與所述小RNA結(jié)合區(qū)段的5'端連接。小多核苷酸結(jié)合區(qū)段通過沃森-克里克堿基配對與一個(gè)或多個(gè)目的小多核苷酸基本上互補(bǔ)并能夠與其雜交。在捕獲探針的優(yōu)選形式中，所述目的小多核苷酸選自miRNA、snoRNA、siRNA和短干擾RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針還包含能夠與固相結(jié)合的分子組合物的固相結(jié)合區(qū)段。在捕獲探針的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔區(qū)段包括RNA聚合酶終止位點(diǎn)。在捕獲探針的優(yōu)選實(shí)施方案中，小多核苷酸結(jié)合區(qū)段與目的miRNA基本上互補(bǔ)并能夠與其雜交。在捕獲探針的一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括包含多核苷酸聚合酶識別位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)序列或與多核芬酸聚合酶識別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。在捕獲探針的一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括一個(gè)或多個(gè)為限制酶識別基序的序列。在捕獲探針的一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括一個(gè)或多個(gè)與RNA切割催化核酸或DNAzyme互補(bǔ)的序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了包含兩種或更多種捕獲探針的組合物。該組合物包括(a)具有第一間隔區(qū)段、第一小多核香酸結(jié)合區(qū)段和第一模板區(qū)段的第一捕獲探針，以及(b)具有第二間隔區(qū)段、第二小多核苷酸結(jié)合區(qū)段和第二模板區(qū)段的第二捕獲探針，其中第二小多核香酸結(jié)合區(qū)段與第一小多核苦酸結(jié)合區(qū)段具有不同的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段序列，并且第二模板區(qū)段與第一模板區(qū)段具有不同的模板區(qū)段序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了分離目的小多核苷酸的方法。該方法包括下述步驟(a)提供上文所述的一種或多種捕獲探針；(b)提供包含目的小多核苷酸的樣品；(c)將所述捕獲探針與所述樣品合并；(d)使所述目的小多核苷酸與所述捕獲探針的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段雜交以形成小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物；(e)將小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物與多核苷酸聚合酶及一組三磷酸核苷合并，所述聚合酶優(yōu)選能夠用RNA作為引物的聚合酶；以及(f)延伸雜交的目的小多核苷酸以形成延伸產(chǎn)物，其中所述延伸產(chǎn)物包括在3，端與延伸的區(qū)段連接的目的小多核苷酸、含有與捕獲探針的模板區(qū)段互補(bǔ)的序列的延伸的序列，并且合物。在該方法的優(yōu)選形式中，目的小多核苷酸選自miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干擾RNAs。在特別優(yōu)選的形式中，目的小多核苷酸是miRNA。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針還包含固相結(jié)合區(qū)段，且通過將捕獲探針經(jīng)所述固相結(jié)合區(qū)段結(jié)合到固體載體，將小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物或延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物捕獲到固相。另一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測樣品中目的小多核香酸的方法，其包括如下步驟(a)如上所述分離目的小多核普酸，其中將捕獲延伸探針附著于熒光珠上，且延伸的區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的核苷酸殘基；以及(b)檢測所述熒光珠和與所述捕獲延伸探針雜交的標(biāo)記的延伸產(chǎn)物。另一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測目的小多核香酸的方法，所述方法包括如下步驟(a)如上所述分離目的小多核普酸，其中捕獲探針的模板區(qū)段包含RNA聚合酶識別序列的一條鏈，且所述延伸步驟形成雙鏈RNA聚合酶啟動子；(b)將所述延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與識別雙鏈RNA聚合酶啟動子的RNA聚合酶合并；以及(c)從啟動子下游轉(zhuǎn)錄所述序列以合成包含小RNA結(jié)合序列的單鏈RNA產(chǎn)物。在該檢測方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述捕獲探針的間隔區(qū)段包含RNA聚合酶終止位點(diǎn)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法還包括重復(fù)轉(zhuǎn)錄步驟一次或多次。一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測樣品中目的小RNA的另一種方法，所述方法包括如下步驟(a)如上所述分離目的小多核苷酸；(b)提供連接酶和接頭區(qū)段，該接頭區(qū)段包含具有3'端和5'端的多核芬酸，該接頭區(qū)段具有接頭區(qū)段序列，其中所述接頭區(qū)段序列通過沃森-克里克堿基配對與間隔區(qū)段序列基本上互補(bǔ)，且能夠與其雜交；(c)使所述接頭區(qū)段與所述間隔區(qū)段雜交；以及(d)將所述接頭區(qū)段的3'端連接到所述目的小RNA的5'端以形成連接的延伸產(chǎn)物，該延伸產(chǎn)物與所述捕獲探針序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交。該方法的一個(gè)優(yōu)選形式還包括通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所述連接的延伸產(chǎn)物和捕獲探針。另一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測目的小多核香酸的方法，其包括下述步驟(a)提供雙標(biāo)記的檢測探針，其具有附著于檢測探針分子的5，端的一種標(biāo)記、附著于檢測探針的3，端的另一種標(biāo)記以及檢測探針序列，所述序列與捕獲探針的模板區(qū)段內(nèi)的檢測探針結(jié)合序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交；(b)如上所述分離小目的多核苷酸，其中(l)合并所述捕獲探針和樣品還包括向合并物中加入雙標(biāo)記的4全測探針；(2)使所述檢測探針與捕獲探針或小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物的檢測探針結(jié)合序列雜交；(3)將具有5，到3，核酸外切酶活性的聚合酶和核苷酸混合物添加到所述雜交的檢測探針和小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物中，以使所述檢測探針被多核苷酸聚合酶的5，到3，核酸外切酶水解；以及(4)所述檢測探針?biāo)夂?，檢測一種或多種標(biāo)記的焚光特性的變化。一個(gè)實(shí)施方案提供了檢測目的小多核苷酸的另一種方法，其包括下述步驟(a)如上所述分離目的小多核苷酸，其中(l)所述模板區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)序列，所述序列是雙鏈限制酶識別基元基序(motif)的一條鏈；以及(2)所述延伸步驟將包含于捕獲探針的模板區(qū)段內(nèi)的單鏈限制酶識別序列轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈限制酶識別序列。該方法還包含(b)提供識別并作用于所述延伸的區(qū)段的限制酶識別序列的限制酶；(c)將限制酶與限制酶識別序列^t矣觸；(d)在延伸的區(qū)段的限制酶識別序列處或附近使延伸產(chǎn)物產(chǎn)生切口以產(chǎn)生包含所述目的小多核苷酸的3，端片段和5，末端帶切口的延伸片段；以及(e)移出并檢測所述帶切口的延伸片段。在該方法的一種形式中，所述限制酶識別基元基序?yàn)橛汕锌诤怂醿?nèi)切酶識別。另一種形式中，所述模板區(qū)段的限制酶識別基元基序包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物，其使所述模板區(qū)段的限制酶識別基元基序抵抗限制酶的核酸內(nèi)切酶活性。在優(yōu)選的形式中，該方法還包括用聚合酶延伸包含雜交的目的小多核苷酸的3'-端片段的循環(huán)，以復(fù)原所述限制酶識別基元基序并移出5，-末端帶切口的延伸片段。所述檢測方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，(a)所述捕獲探針的模板區(qū)段包含第一限制位點(diǎn)和第二限制位點(diǎn)，其中第一限制位點(diǎn)不同于第二限制位點(diǎn)，(b)所述延伸步驟將所述第一限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成雙鏈限制酶識別序列，其能夠在延伸的區(qū)段而不是在模板區(qū)段上被產(chǎn)生切口，且將所述第二限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成第二雙鏈限制識別序列；(c)產(chǎn)生切口的步驟包含將延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與切口劑(nickingagent)接觸，所述試劑識別并作用于所述第一限制位點(diǎn)，而不是所述第二限制位點(diǎn)，以使所述延伸產(chǎn)物在所述延伸區(qū)段的第一限制位點(diǎn)處或附近被選擇性地產(chǎn)生切口，以產(chǎn)生帶切口的延伸片段。檢測步驟隨后還包含(l)提供雙標(biāo)記的檢測探針，其與帶切口的延伸片段互補(bǔ)且能與其雜交；(2)將所述探針與所述帶切口的延伸片段雜交以形成雙鏈探針/帶切口的延伸片段復(fù)合物；(3)將所述雙鏈探針/帶切口的延伸片段復(fù)合物與切口劑接觸，所述試劑能夠識別所述檢測探針序列并使其產(chǎn)生切口；以及(4)檢測與使所述雙標(biāo)記的一企測纟笨針產(chǎn)生切口相關(guān)的熒光變化。在該方法的優(yōu)選形式中，第一限制酶識別基序由切口核酸內(nèi)切酶(nickingendonuclease)識別。在該方法的另一種形式中，所述模板區(qū)段的第二限制酶識別基序包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物，其使所述模板區(qū)段的限制酶識別基序抵抗所述限制酶的核酸內(nèi)切酶活性。在所述檢測方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，(a)所述模板區(qū)段還包含一個(gè)或多個(gè)與DNAzyme基序互補(bǔ)的DNAzyme互補(bǔ)序列、第一側(cè)翼區(qū)段和第二側(cè)翼區(qū)段，所述第一側(cè)翼區(qū)段位于DNAzyme互補(bǔ)序列的5，端的側(cè)面，且所述第二側(cè)翼區(qū)段位于DNAzyme互補(bǔ)序列的3，端的側(cè)面；以及(b)帶切口的延伸片段的移出提供了功能性的DNAzyme，其能夠在DNAzyme切割位點(diǎn)與合適的底物探針雜交并切割合適的底物探針。所述檢測步驟還包含(1)提供包含RNA多核苷酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸的合適的底物探針，該底物探針具有附著于底物探針分子的5，端的一種標(biāo)記以及附著于底物探針分子的3，端的另一種標(biāo)記，所述底物探針包含具有第一底物探針序列的第一底物探針區(qū)段、DNAzyme切割位點(diǎn)以及具有第二底物探針序列的第二底物探針區(qū)段，其中所述底物探針的第一底物探針序列與所述模板區(qū)段的第一側(cè)翼區(qū)段基本上相同，且所述第二底物探針序列與所述模板區(qū)段的第二側(cè)翼區(qū)段基本上相同；(2)將所述底物探針和帶切口的延伸片段接觸，以便通過第一底物探針序列和包含于帶切口的延伸片段內(nèi)的互補(bǔ)序列之間以及在所述第二底物探針和包含于帶切口的延伸片段內(nèi)的互補(bǔ)序列之間的沃森-克里克堿基配對，在帶切口的延伸片段上形成包含DNAzyme基序的環(huán)結(jié)構(gòu)；(3)在DNAzyme切割位點(diǎn)處切割所述底物探針；以及(4)檢測與切割所述底物探針相關(guān)的熒光變化。一個(gè)實(shí)施方案提供了分離和檢測小RNAs的試劑盒，其可以包括(l)捕獲探針的等摩爾混合物；(2)包含三磷酸脫氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；(3)聚合酶；(4)抗生蛋白鏈菌素包被的順磁珠；(5)—種或多種雙標(biāo)記的檢測探針，所述檢測探針具有與所述捕獲探針的模板區(qū)段內(nèi)的檢測探針結(jié)合序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交的檢測探針序列；(6)連接酶；(7)與所述捕獲探針的間隔區(qū)段基本上互補(bǔ)且能與其雜交的寡核苷酸接頭；和/或(8)—種或多種對包含于捕獲探針內(nèi)的限制酶識別序列具特異性的限制酶。通過下面的描述，對本發(fā)明做了更為詳細(xì)的說明。通過下面的描述、附帶的權(quán)利要求書以及附圖，可更好地理解本發(fā)明的這些和其它的特征、方面和優(yōu)勢，其中圖1是在依照本發(fā)明利用捕獲探針分離和檢測miRNAs和其它小多核苷酸的方法的某些實(shí)施方案中，一些步驟的示意圖2是在依照本發(fā)明分離和檢測miRNAs和其它小多核苷酸的方法的某些實(shí)施方案中，一些步驟的另一張示意圖，所述方法是利用具有RNA聚合酶識別位點(diǎn)的捕獲探針的一種形式；圖3顯示了在依照本發(fā)明分離和;險(xiǎn)測miRNAs或其它小多核苷酸的方法的某些其它實(shí)施方案中，一些步驟的圖解，所述方法利用捕獲探針指導(dǎo)接頭連接。圖4顯示了在依照本發(fā)明使用捕獲探針和檢測探針檢測miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它實(shí)施方案中，一些步驟的圖解。圖5顯示了在依照本發(fā)明分離和檢測miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它實(shí)施方案中，一些步驟的圖解，所述方法使用產(chǎn)生切口位點(diǎn)的另一種形式的捕獲探針圖6顯示了在依照本發(fā)明使用另一種形式的捕獲探針和檢測探針檢測miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它實(shí)施方案中，一些步驟的圖解。圖7顯示了在依照本發(fā)明分離和檢測miRNAs或其它小多核苷酸的方法的其它實(shí)施方案中，一些步驟的圖解，所述方法使用能產(chǎn)生DNAzyme的另一種形式的捕獲探針圖8是使用10um掃描分辨率和70%激光增益的雜交的GenoExplorerTMmiRNA芯片的掃描圖像；以及圖9是利用依照本發(fā)明的方法檢測的12種不同miRNAs樣品的熒光強(qiáng)度圖表。發(fā)明詳述依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了分離例如諸如miRNAs(小RNAs)、短干擾RNAs以及其它小調(diào)節(jié)RNAs和DNAs的小多核苷酸的方法。依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了鑒定目的小多核苷酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定目的小多核苷酸的方法包括依照本發(fā)明首先分離所述目的小多核苷酸。依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供了適用于分離小多核芬酸的方法的一種或多種捕獲探針以及一組或多組捕獲探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離小多核苷酸的方法是依照本發(fā)明的方法?，F(xiàn)在具體地公開所述方法和捕獲探針。如在本文公開內(nèi)容中所使用的，除了上下文另有規(guī)定，術(shù)語"包含(comprise)"和該術(shù)語的變異，諸如"包含(comprising)"、"包含(comprises)"和"包含(comprised)"并非意圖排除其它添加物、組分、整體或步驟。如在本文公開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"小RNAs"指天然存在的、18至24個(gè)RNA殘基的單鏈RNA，通常在5'末端帶有磷酸基團(tuán)，通常稱為"成熟微小RNAs",其來源于通常具有"發(fā)夾"構(gòu)型的更長的天然存在的前體RNA。如在本文7>開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"小多核苷酸(smallpolynucleotide)"和"小多核香酸(smallpolynucleotides)"指長度為17至200個(gè)殘基的多核普酸，通常是單鏈RNA或DNA,其包括非編碼調(diào)節(jié)RNAs組，包括例如miRNAs、snoRNAs、snRNAs、siRNAs、反義DNAs和岡崎區(qū),爻(Okazakifragments)。如在本文公開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"一個(gè)或多個(gè)小多核苷酸"、"小多核苷酸(asmallpolynucleotide)"和"小多核苷酸(thesmallpolynucleotide)"被規(guī)定為是同義的，其指一個(gè)目的小多核苷酸或多個(gè)目的小多核苷酸，除非上下文另有規(guī)定。如在本文公開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"一種或多種捕獲探針"、"捕獲探針(acaptureprobe)"、"捕獲探針(thecaptureprobe)"、"捕獲延伸探針(capture-extensionprobe)"、"捕獲延伸探針(capture-extensionprobes)"、"捕獲和延伸模板探針(captureandextensiontemplateprobe)"以及"捕獲和延伸才罙4十(captureandextensiontemplateprobes)，，凈皮頭見定為是同義的，且可指單數(shù)或復(fù)數(shù)，除非上下文另有規(guī)定。如在本文公開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"基本上互補(bǔ)的(substantiallycomplementary)"以及該術(shù)語的變異，諸如"基本互補(bǔ)(substantialcomplement)"意指第一條鏈上所有連續(xù)殘基的至少卯％與第二條鏈相同長度的一串連續(xù)殘基互補(bǔ)。結(jié)合本文公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，一條鏈可以短于另一條鏈但仍然基本上互補(bǔ)。例如，就本文公開內(nèi)容公開的本發(fā)明而言，小RNA或小RNA結(jié)合區(qū)段可以短于或長于互補(bǔ)的目的小RNA，然而，優(yōu)選的是所述小RNA結(jié)合區(qū)段與其對應(yīng)的小RNA長度相同且基本上互補(bǔ)。如本文公開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"雜交(hybridize)"及諸如"雜交(hybridizes)"和"雜交(hybridized)"的該術(shù)語的變異，是指互補(bǔ)的核酸單鏈或鏈的區(qū)段的沃森-克里克堿基配對以產(chǎn)生反向平行的雙鏈核酸，且如本文公開內(nèi)容中所使用的，除非另有詳細(xì)說明或除非上下文另有所指，雜交應(yīng)該被理解為發(fā)生在基本上互補(bǔ)的鏈之間。例如，在含5ug酵母tRNA、總體積為50pi的水性緩沖液存在時(shí)，通過將等摩爾濃度如100皮摩爾的成對單鏈的每一條合并，然后在于25。C輕搖下孵育混合物1小時(shí)，可完成雜交，所述酵母tRNA溶于水性緩沖液包含400mMMOPS、80mMDTT和40mMMgCl2,且pH為7.3。的總體積為50pi的水性緩沖液中。如本文/>開內(nèi)容中所使用的，術(shù)語"近端(neartheend)"和該術(shù)語的變異指在確定的末端殘基的20%殘基范圍內(nèi)。例如，20個(gè)殘基鏈的近端指該鏈確定的5，或3'端或末端的頭4個(gè)殘基。如本文公開內(nèi)容所使用的，術(shù)語"延伸"或"延伸反應(yīng)"指通過聚合酶與用于反應(yīng)發(fā)生的所有附加試劑和條件的聯(lián)合作用，延伸多核苦酸的3'端。捕獲探針依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了捕獲探針I(yè)O,其適用于分離小RNAs或DNAs的方法。參照圖1A，所述#:針/人其3'端到其5，端包含下述共價(jià)結(jié)合或連接的區(qū)段a)固相結(jié)合區(qū)段20，b)間隔區(qū)段30，和c)具有小多核苷酸結(jié)合區(qū)段序列的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40,其中所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段通過沃森-克里克堿基配對與一個(gè)或多個(gè)目的小多核苷酸基本上互補(bǔ)并能與其雜交，以及d)模板區(qū)段50。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕獲探針10包含選自一種或多種多核苷酸、一種或多種核苷酸類似物以及一種或多種多核芬酸和多核苷酸類似物的組合的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕獲探針包含能結(jié)合于固相的分子組合物的固相結(jié)合區(qū)段20，所述分子組合物例如諸如偶聯(lián)到所述捕獲探針3'端的生物素，其能夠結(jié)合固定到固相的抗生物素或抗生蛋白鏈菌素，所述固相例如諸如抗生蛋白鏈菌素包被的順磁顆?；蚩股鞍祖溇匕坏奈⒘康味ò宓目?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相結(jié)合區(qū)段20是能夠共價(jià)結(jié)合到固相的物質(zhì)，例如，諸如利用在該固相結(jié)合區(qū)段的伯胺和固相上的羧酸基團(tuán)之間的碳二亞胺活化和酰胺鍵形成，偶聯(lián)到固相上羧酸基團(tuán)的伯胺。將多核香酸共價(jià)偶聯(lián)到固相的其它合適的方法是本領(lǐng)域熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固相結(jié)合區(qū)段20是捕獲探針10的3，端、5，端或兩端，它們也可以在捕獲探針10的間隔區(qū)段30或模板區(qū)段50或該兩個(gè)區(qū)段的內(nèi)部。此外，可以在合成捕獲延伸探針10的過程中加入固相結(jié)合區(qū)段20,例如在多核香酸合成過程中加入生物素亞磷酰胺，這一點(diǎn)會被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解。另外，可以在包含間隔區(qū)段30、小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40和模板區(qū)段50的連續(xù)捕獲探針合成后，引入固相結(jié)合區(qū)段20，例如通過使用生物素化的dUTP作為生物素的來源經(jīng)由末端轉(zhuǎn)移酶的作用將生物素標(biāo)記的dUTP摻入捕獲探針的3'末端。捕獲探針的間隔區(qū)段30包含多核苷酸序列，其具有預(yù)定序列或預(yù)定大小，且經(jīng)設(shè)計(jì)，能提供一種或多種功能特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段具有足以使與多核苷酸結(jié)合區(qū)段形成的雜交復(fù)合物的位阻最小化的長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段包括用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。在如圖3所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段包括用于連接反應(yīng)中的接頭的停泊位點(diǎn)(dockingsite)。仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)包括一個(gè)或多個(gè)理想的限制酶識別位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)包括RNA聚合酶識別位點(diǎn)。在如圖2A所示的一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)36。間隔區(qū)段30的多核香酸可以是天然存在的、合成的或核苷酸類似物，包含5-50個(gè)核普酸或5-40個(gè)核普酸，優(yōu)選5-30個(gè)核苦酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段30由RNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段30由DNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段30由多核苷酸類似物組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔區(qū)段30由多個(gè)選自RNA、DNA、RNA的多核苷酸類似物和DNA的多核苷酸類似物的多核芬酸或多核苷酸類似物的嵌合體組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針10的間隔區(qū)段30包含具有6-100個(gè)碳原子的碳骨架或其它骨架構(gòu)型的有機(jī)物質(zhì)，例如具有3-33個(gè)重復(fù)單位的聚乙二醇，或諸如包含1-17個(gè)單元的氨基己酸重復(fù)單位的酰胺類。小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40經(jīng)設(shè)計(jì)，與目的多核苷酸形成雜交復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小多核苷酸是小RNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小多核香酸是小DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40由18至24個(gè)DNA殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該小多核香酸結(jié)合區(qū)段40由18個(gè)或19個(gè)或20個(gè)或21個(gè)或22個(gè)或23個(gè)或24個(gè)DNA殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40包含17-100個(gè)多核苷酸的DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40包含17至60個(gè)多核苷酸的DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40包含17至40個(gè)多核香酸。小多核香酸結(jié)合區(qū)段40通過沃森-克里克堿基配對與一個(gè)或多個(gè)目的小多核苷酸基本上互補(bǔ)并能夠與其雜交，所述目的小多核苷酸包括具有預(yù)定序列或具有預(yù)定大小的目的小多核苷酸，其來自包含化學(xué)相關(guān)的物質(zhì)的樣品，例如諸如信使RNAs、轉(zhuǎn)運(yùn)RNAs、核糖體RNAs和基因組DNA的混合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，目的小多核苷酸60可以從任何合適來源的任何已知的小RNA中選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小多核苦酸60選自公共數(shù)據(jù)庫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的小多核苷酸60是miRNA，且所述公共數(shù)據(jù)庫是由桑格研究所(SangerInstitute)提供的中心信息庫http:〃miRNA.Sanger.ac.uk/sequences/，新發(fā)J見的以及先前已知的miRNA序列可以提交到該庫來命名和分配術(shù)語，以及將序列放在數(shù)據(jù)庫內(nèi)存檔和用于通過萬維網(wǎng)的在線檢索。通常，由桑格研究所收集的關(guān)于miRNAs序列的數(shù)據(jù)包括種類、來源、對應(yīng)的基因組序列和基因組位置(通常是染色體的坐標(biāo))，以及用于成熟的完全加工的miRNA的全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和序列。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，為了選擇小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40的序列，當(dāng)靶小RNAs包含miRNA時(shí)，從例如諸如桑格研究所數(shù)據(jù)庫或其它合適的數(shù)據(jù)庫的合適來源中選擇目的miRNA或一組目的miRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果一組目的miRNAs選自包含一種或多種miRNAs的重復(fù)條目的來源時(shí)，首先去除重復(fù)的條目以使該組目的miRNAs的序列只包含每種目的miRNA的一個(gè)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組目的miRNAs由來自單一來源或數(shù)據(jù)庫的每種miRNA的一個(gè)組成，諸如桑格研究所提供的中心信息庫中列出的每種miRNA的一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的小多核苷酸60是真核生物的小RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小RNA是靈長類的小RNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小RNA是病毒小RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的小RNA是人類小RNA。在另一實(shí)施方案中，所述一組目的小RNA都是真核miRNA。在另一實(shí)施方案中，該組目的小RNA都是靈長類miRNAs。在另一實(shí)施方案中，該組目的小RNA都是人類miRNAs。在另一實(shí)施方案中，目的小多核苷酸60是真核小DNA。在另一實(shí)施方案中，所述目的小DNA是靈長類小DNA。在另一實(shí)施方案中，所述目的小DNA是病毒小DNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目的小DNA是人類小DNA。在另一實(shí)施方案中，所述的一組目的小DNA都是真核生物DNA。在另一實(shí)施方案中，該組目的小DNA都是靈長類DNAs。在另一實(shí)施方案中，該組目的小DNA都是人類DNAs。其次，選擇的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40與目的小多核芬酸序列60基本互補(bǔ)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40在長度和序列上與目的小多核苦酸序列60恰好互補(bǔ)。在另一實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段與目的小多核苷酸區(qū)段的互補(bǔ)超過90%，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段的長度與目的小多核苷酸序列的長度相同。在另一實(shí)施方案中，小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40與的目的小多核苦酸60區(qū)段的互補(bǔ)超過80%，所述小多核芬酸結(jié)合區(qū)段具有與目的小多核苷酸序列60相同的長度。在一個(gè)實(shí)施方案中，小多核香酸結(jié)合區(qū)段40由RNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40由DNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40由多核苷酸類似物組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40由多個(gè)選自RNA、DNA、RNA的多核苷酸類似物和DNA的多核苷酸類似物的多核苷酸或多核苷酸類似物的嵌合體組成。此外，小多核香酸結(jié)合區(qū)段40可以與miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干擾RNAs互補(bǔ)，由此促進(jìn)它們的測定。表I提供了一列小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40樣本，其由DNA以及與小RNA結(jié)合區(qū)段40恰好互補(bǔ)的miRNAs組成。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，其它小RNA結(jié)合區(qū)段40也是有用的，包括例如是表I所列的小RNA結(jié)合區(qū)段40的cDNA的小RNA結(jié)合區(qū)#史40。表I人類MiRNAs的8種小RNA結(jié)合區(qū)段的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>捕獲探針的模板區(qū)段50包含具有預(yù)定序列或預(yù)定大小的多核苷酸序列，其經(jīng)設(shè)計(jì)，提供一種或多種功能特征。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包舍捕獲探針的模板區(qū)段50的多核苷酸可以作為通過多核苷酸聚合酶的作用合成互補(bǔ)多核苷酸鏈的模板。在如圖4所示的一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括檢測探針52的結(jié)合位點(diǎn)。在如圖2所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括多核苷酸聚合酶識別位點(diǎn)54或與多核香酸聚合酶識別位點(diǎn)互補(bǔ)的位點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸聚合酶識別位點(diǎn)54是選自T7、SP6、T3DNA依賴的RNA聚合酶、大腸桿菌的2型RNA聚合酶和單鏈DNA依賴的N4RNA聚合酶的多核苷酸合成啟動子的基序。然而，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容會理解的，所述多核苷酸合成啟動子基序可以是任何其它合適的多核苷酸合成啟動子的基序。在一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。在如圖5所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)為限制酶識別基序56的序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)特異性限制酶識別基序56存在時(shí)，其不存在于通過本發(fā)明的方法分離和鑒定的miRNA或其它目的小多核苷酸的DNA類似物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述限制酶識別基序56存在時(shí)，被切口核酸內(nèi)切酶識別。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，模板區(qū)段的限制位點(diǎn)基序56并不被切口核酸內(nèi)切酶切割。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述限制位點(diǎn)56由諸如>^人紐英生物技術(shù)公司(NewEnglandBiolabs)(Ipswich,MA)得到的N.BbvCI、N.AlwI、N.BstNBI、N.BpulOI等切口核酸內(nèi)切酶識別。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述限制酶識別基序56由選自BamHI、HindIII和EcoRI的限制酶識別。因?yàn)锽amHI、HindIII和EcoRI還作用于一些miRNA序列的DNA等同物，所以在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述限制位點(diǎn)基序56由選自NotI、XhoI、XmaI和NheI的限制酶識別。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述限制酶識別基序56包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸或核苷酸類似物，其保護(hù)模板區(qū)段免受限制酶的核酸內(nèi)切酶活性的影響。例如，模板區(qū)段50的限制酶識別基序56可以包含一個(gè)或多個(gè)抵抗水解的核苷酸間鍵(internucleosidebond),諸如硫代磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯(boran叩hosphate)鍵、曱基磷酸酯鍵或肽鍵。核苷酸類似物的可選實(shí)例是在限制酶識別基序56中由脫氧尿苷代替脫氧胸苷。然而，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容會理解的，也可以使用其它合適的限制位點(diǎn)基序。在如圖7所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50包含與DNAzyme互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)序列130。RNA切割DNA酶(DNAzyme)的實(shí)例包括"10-23"和"8-17"通用RNA切割DNA酶，兩者都包含保守的催化序列(分別是GGCTAGCTACAACGA和TCCGAGCCGGACGA)。該保守的催化結(jié)構(gòu)域側(cè)面是能夠通過沃森-克里克堿基配對與靶RNA雜交的可變結(jié)合結(jié)構(gòu)域。側(cè)翼結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶RNA的雜交形成了包含催化結(jié)構(gòu)域的環(huán)結(jié)構(gòu)。由示例的"10-23"DNAzyme的切割發(fā)生在靶RNA的噪呤-嘧咬二核苦酸處，而由示例的"8-17"DNAzyme的切割發(fā)生在耙RNA的AG二核香酸處。因此，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，依照本實(shí)施方案，與DNAzyme基序互補(bǔ)的序列130包含與保守的催化序列互補(bǔ)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針的模板區(qū)段50包含多核苷酸，所述多核苷酸包含的核苷酸為天然存在的、合成的核苷酸或核苷酸類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50包含1-50個(gè)核苷酸，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該模板區(qū)段包含1-40個(gè)核苷酸，且仍在另一實(shí)施方案中，該模板區(qū)段包含1-30個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，才莫板區(qū)段50由RNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50由DNA組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50由多核苷酸類似物組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述模板區(qū)段由多個(gè)選自RNA、DNA、RNA的多核苷酸類似物和DNA的多核香酸類似物的多核苦酸或多核苦酸類似物的嵌合體組成。在一組捕獲探針10中，模板區(qū)段50可以包含相同的序列、不同的序列或序列和長度均不同的序列。例如，在一組捕獲探針10中包含不同長度的多核苷酸的模板區(qū)段50可以用于產(chǎn)生它們各自的靶標(biāo)小多核苷酸諸如miRNAs的不同延伸產(chǎn)物。此外，不同長度的延伸產(chǎn)物可以隨后用于使用標(biāo)準(zhǔn)的方法例如諸如使用毛細(xì)管電泳來區(qū)分不同的輩巴標(biāo)小RNAs。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，捕獲探針10的合成使用已知的方法。例如，所述方法可以包括，首先選擇固相結(jié)合區(qū)段20、間隔區(qū)段30、小多核普酸結(jié)合區(qū)段40和模板區(qū)段50的序列，然后合成它們。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，3'固相結(jié)合區(qū)段20包含生物素；間隔區(qū)段30包含諸如AGCTC的5個(gè)核苷酸的短DNA多核苷酸區(qū)段、或者諸如T7DNA依賴性RNA啟動子的多核苷酸、多核芬酸TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:9)或其互補(bǔ)序列CCCTATAGTGAGTCGTATTA(SEQIDNO:10)或不與目的小多核苷酸60互補(bǔ)的其它多核苷酸；小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40包含目的小RNA60的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)DNA序列,諸如表I中所列的那些；以及模板區(qū)段50包含諸如例如SP6DNA依賴性RNA聚合酶啟動子54,例如DNA多核苷酸ATTTAGGTGACACTATAG(SEQIDNO:ll)或不與目的小多核苷酸互補(bǔ)的其它多核苷酸。此外，捕獲探針的間隔區(qū)段30和模板區(qū)段50兩者之一或兩者可以包括限制位點(diǎn)56。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲探針10的3'端倒數(shù)第二位(penultimate)由例如磷酸酯、石克代磷酸酯、生物素、雙脫氧核苷酸、3，胺(amine)等封閉，以使其不能延伸。這樣封閉3，端以阻止延伸為本領(lǐng)域所熟知。這樣封閉末端的目的是通過幾種聚合酶固有的擬末端轉(zhuǎn)移酶活性或潛在末端轉(zhuǎn)移酶活性阻止捕獲探針10的延伸。捕獲探針10的合成可以通過亞磷酸酰胺化學(xué)容易地實(shí)現(xiàn)，且可以從本領(lǐng)域熟知的眾多來源獲取，本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容應(yīng)理解這一點(diǎn)?，F(xiàn)參照表II,其顯示了左側(cè)欄中所列的用于檢測的目的小RNAs60(如同表1所列，所有目的小RNAs60都是人類miRNAs)的8種樣本捕獲探針10。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>使用方法分離/捕獲依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了從包含目的小多核苷酸的樣品中分離miRNA(微小RNA)或其它目的小多核苷酸的方法。依照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了鑒定miRNAs或其它小多核苷酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于鑒定miRNAs或其它小多核苷酸的方法首先包括依照本發(fā)明分離小多核香酸。參照圖1，顯示了該方法的某些實(shí)施方案中的一些步驟。所顯示的步驟并非意圖限制，也不是意指描述的每一步對該方法是必需的，而僅是示例性步驟。從圖1A中可以看出，該方法包括首先提供包含miRNA或其它目的小多核苷酸60的樣品。適于通過本發(fā)明的方法分析的樣品包含或潛在地包含小RNAs和小DNAs。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品還包含一種或多種與目的miRNA化學(xué)上相關(guān)的物質(zhì)，例如諸如選自信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核并唐體RNA、siRNA、5S/5.8SrRNA、基因組DNA以及前述的組合的物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品還包含一種或多種除了miRNA以外的RNA,例如諸如選自信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、siRNA、5S/5.8SrRNA以及前述的組合的物質(zhì)。樣品中RNA的全部，不管RNA的類型，構(gòu)成了樣品中的"總RNA"。在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的樣品從全血、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、諸如肝、肺、腦的完整組織或甚至諸如線蟲(Ce/egaw)或果蠅CDraso;/7z7a)的完整有機(jī)體的真核細(xì)胞中獲取。也可以從受一些病毒侵襲的組織中分離小多核香酸，因?yàn)檫@些微生物產(chǎn)生miRNAs,這些miRNAs能夠抑制免疫反應(yīng)或修飾其它宿主因素以通過損害宿主因素使所述微生物持續(xù)存在和感染，否則所述微生物就轉(zhuǎn)向?qū)λ鼈冇欣乃拗髻Y源。同樣，小多核苷酸可在細(xì)菌或原核生物中存在，調(diào)節(jié)它們諸如生物膜形成的過程以及諸如致病性的細(xì)菌的其它活性。這些樣品來源在本領(lǐng)域中是熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品來自真核生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品來自靈長類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品來自人類。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包含選自血液、腦、心臟、腸、肝、肺、胰腺、肌肉、葉、花、植物的根和植物的莖的組織或組織液。細(xì)胞裂解產(chǎn)物適合用于捕獲探針10，特別是當(dāng)中和了能降解樣品中待檢測的miRNAs或小多核苷酸或降解與所述樣品接觸的捕獲探針I(yè)O的核酸酶時(shí)，然而，在合成過程中，通過用核酸酶抗性骨架如諸如肽核酸的酰胺或更為常見的硫代磷酸修飾的骨架合成捕獲探針，可以使抵抗捕獲探針對核酸酶的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是包埋固定的組織切片，其中樣品中固定的小多核芬酸，例如miRNAs，作為捕獲-延伸探針10的固相結(jié)合區(qū)段或元件20。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括提供樣品后從所述樣品中分離總RNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法或使用可從諸如QIAgen、Invitrogen、Protnega等供應(yīng)商廣泛獲得的商品化試齊'j盒乂人所述樣品中分離總RNA。如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容所理解的，當(dāng)該方法包括提供樣品后從所述樣品中分離總RNA時(shí)，術(shù)語"樣品"指用于該方法其余步驟的分離的總RNA。目的小多核苷酸60具有目的小多核苷酸序列，且包含3'端和5，端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述目的小多核香酸是miRNA,其由18至24個(gè)殘基組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目的miRNA由18或19或20或21或22或23或24個(gè)RNA殘基組成。目的小多核苷酸60通過沃森-克里克堿基配對與依照本發(fā)明的捕獲探針10的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40基本上互補(bǔ)且能與其雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小多核香酸是公開數(shù)據(jù)庫中所列的目的miRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述公共數(shù)據(jù)庫是由桑格研究所提供的中心信息、庫http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/，miRNA序歹ll才是交》Ji亥庫來命名和分配術(shù)語，并將序列放在數(shù)據(jù)庫內(nèi)存檔和用于通過萬維網(wǎng)的在線檢索。通常，由桑格研究所所收集的關(guān)于miRNAs序列的數(shù)據(jù)，包括種類、來源、對應(yīng)的基因組序列和基因組位置(通常是染色體的坐標(biāo))，以及用于成熟的完全加工的miRNA(帶有5，末端磷酸基團(tuán)的miRNA)的全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的樣品包含多個(gè)目的miRNAs60，其中所述多個(gè)miRNAs的每一個(gè)或其它目的小多核苷酸60具有彼此相同的目的小多核香酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的樣品包含多個(gè)目的miRNAs60，其中所述多個(gè)目的miRNAs60的至少兩個(gè)具有彼此不同的目的miRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的樣品包含多個(gè)目的miRNAs60,其包含具有第一目的miRNA序列的第一目的miRNA以及具有第二目的miRNA序列的第二目的miRNA，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第二目的miRNA序列。在另一實(shí)施方案中，提供的樣品包含多個(gè)目的miRNAs60，其包含具有第一目的miRNA序列的第一目的miRNA、具有第二目的miRNA序列的第二目的miRNA以及具有第三目的miRNA序列的第三目的miRNA，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第二目的miRNA序列，其中所述第一目的miRNA序列不同于所述第三目的miRNA序列，且其中所述第二目的miRNA序列不同于所述第三目的miRNA序列。其次，該方法還包含提供捕獲探針10。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的捕獲探針I(yè)O是依照本發(fā)明的捕獲探針10。當(dāng)所述捕獲探針10是依照本發(fā)明的捕獲探針時(shí)，所提供的捕獲探針I(yè)O在所有方面都具有依照本發(fā)明所公開的捕獲探針10的特征和屬性，出于清楚的目的，其中一些會在下文重復(fù)。如在圖1中所觀察到的，捕獲探針10從左到右，從該捕獲探針10的3'端到該捕獲探針的5'端包含圖1中所描述的如下三個(gè)區(qū)段a)具有間隔區(qū)段序列的間隔區(qū)段30;b)具有多核普酸結(jié)合區(qū)段序列的小多核苦酸結(jié)合區(qū)段40;以及c)具有模板區(qū)段序列的模板區(qū)段50，其包括3'端和5'端，其中所述間隔區(qū)段50的5'端與所述多核苷酸結(jié)合區(qū)段40的3'端連接，且其中多核苷酸結(jié)合區(qū)段40的5'端與所述模板區(qū)段50的3'端連接。該多核苷酸結(jié)合區(qū)段40對目的miRNA或其它小多核苷酸60的特異性允許該方法直接用于包含與miRNA相關(guān)的物質(zhì)的樣品或用于分離的總RNA,而不需要目前的技術(shù)方法中所必需的/人所述樣本或總RNA中特異性分離miRNAs，例如諸如通過凝膠電泳或?qū)游黾兓?。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲探針10的3，端倒數(shù)第二位由例如磷酸酯、^;乾代磷酸酯、生物素、雙脫氧核苷酸、3'胺等封閉，以使其不能延伸。這樣封閉3'端以阻止延伸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所述熟知。這樣封閉末端的目的是通過幾種聚合酶固有的擬末端轉(zhuǎn)移酶活性或潛在末端轉(zhuǎn)移酶活性阻止捕獲探針10的延伸。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了多種捕獲探針I(yè)O作為包含兩種或多種捕獲探針的組合物或混合物。所述混合物包括(a)具有第一間隔區(qū)段30、第一小多核普酸結(jié)合區(qū)段40以及第一模板區(qū)段50的第一捕獲探針10;以及(b)具有第二間隔區(qū)段20、第二小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40以及第二模板區(qū)段50的第二捕獲探針10，其中所述第二小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40與第一多核苷酸結(jié)合區(qū)段40具有不同的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段序列，且第二模板區(qū)段50與第一模板區(qū)段50具有不同的模板區(qū)段序列。因此，結(jié)合于捕獲探針10的不同的小多核苷酸的存在與相關(guān)的模板區(qū)段50中的可檢測的差異相互關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一模板區(qū)段50與第二模板區(qū)段50在長度上不同。參照圖1A,該方法接著包括將捕獲探針10與樣品合并，所述樣品在圖1A中由目的小多核苷酸60代表。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括將所述樣品與所述捕獲探針I(yè)O在溶液中合并。在一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針10和樣品包括合并約等摩爾量的每種捕獲探針10。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針10與樣品包括將約等摩爾量的每種捕荻探針10與一定量的樣品合并，所述樣品被期望含有捕獲探針10的約1/10摩爾量的目的小多核苷酸60。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針10與樣品包括將約等摩爾量的每種捕獲探針10與一定量的樣品合并，所述樣品被期望含有捕獲探針10的約1/2和1/10摩爾量的目的小多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針10與樣品包括將樣品與O.lpmol/^1至100pmo11的每種捕獲探針10在合適的緩沖液中合并以產(chǎn)生包含捕獲探針10和所述樣品的溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品中總RNA的量從約10pg到約10pg之間變動，更優(yōu)選/人約10ng到約1pg之間變動。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液選自TRIS、MOPS和SSC;包括諸如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉的堿性鹽；且還可以包括核酸酶抑制劑以及促進(jìn)劑，諸如葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇或聚丙烯酰胺。示例性的緩沖液包括(a)溶于0.1-2.0M氯化鈉的lXTE緩沖液；(b)溶于1mMEDTA和100mM氯化鈉的0.1MMOPS，以及(c)20mMMOPS、1.8M氯化鋰、lmMEDTA、100金4青三羧酸(aurintricarboxylicacid)pH6.8。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合本文公開內(nèi)容會理解的，選擇的緩沖液pH應(yīng)是使目的反應(yīng)最優(yōu)化的一個(gè)。通常，所選的pH是6至8，優(yōu)選6.4至7.4且更優(yōu)選接近7.0。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括將一種或多種核糖核酸酶抑制劑添加到樣品和捕獲探針10的合并物中，所述酶抑制劑例如諸如選自十二烷基硫酸鋰(LiDS)、十二烷基硫酸鈉、金精三羧酸的銨鹽和金精三羧酸的銨鹽的鈉鹽、卩巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三(2-曱酰乙基)膦鹽酸鹽(Tris(2-Carboxyethyl)-PhosphineHydrochloride)(TCEP)或人胎盤核糖核酸酶抑制劑的核糖核酸酶或核酸酶抑制劑。這些抑制劑被包括以抑制核酸酶而不降低探針與其靶多核苷酸相互雜交的能力，這一點(diǎn)會被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。參照圖IB,將捕獲探針10和樣品合并后，該方法包括使目的小多核苷酸60與小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交以形成小多核芬酸/捕獲探針復(fù)合物(圖1B)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使目的小多核苷酸60與小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交包括在25。C至60°C下，孵育包含捕獲探針10和樣品的溶液1至60分鐘，直至幾乎所有的目的miRNA60與捕獲探針10雜交，由此將目的小多核苷酸10從樣品中其它的物質(zhì)中隔離出。除了小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40以外，捕獲探針10還包含固相結(jié)合區(qū)段20、間隔區(qū)段30和能作為多核苦酸聚合酶模板的模板區(qū)段50。隨后例如通過將生物素化的捕獲探針10結(jié)合到抗生蛋白鏈菌素包被的順磁顆粒及隨后通過磁珠的作用臨時(shí)性固定順磁顆粒和移除剩余的生物樣品，將該組捕獲探針10和雜交的靶RNAs60捕獲到固相。與沖企測諸如miRNAs的小多核苦酸的其它方法不同，-使用本文7>開內(nèi)容的方法允許回收和進(jìn)一步處理移除的生物樣品以用于諸如mRNAs或基因組DNA的其它分子種類的分析。隨后，在所述顆粒釋放入洗滌緩沖液后，將所述顆粒洗滌幾輪以從順磁珠和捕獲延伸探針雜交復(fù)合物中移除未雜交的多核香酸和其它物質(zhì)。固定的捕獲探針10方法的一個(gè)優(yōu)勢是不需要用于諸如小核仁RNAs、siRNAs、微小RNA和反義RNAs的非編碼蛋白RNAs的總RNA樣品的初始富集。優(yōu)選地，所述捕獲探針10會在溶液中與特異性靶標(biāo)雜交。其次，當(dāng)捕獲探針10固定于固體載體上時(shí)，可移除未結(jié)合的材料并由此完成特異性靶標(biāo)的富集。另一個(gè)優(yōu)勢是便于緩沖液的交換。仍另一個(gè)優(yōu)勢是小多核苷酸可以從結(jié)合的捕獲探針中洗脫。所述洗脫的小多核香酸是高度濃縮和富集的，適用于多種下游分析方法，所述洗脫方法為本領(lǐng)域所熟知，例如使用80。C的水或曱酰胺，所述下游應(yīng)用如凝月交電泳、連4妻和測序、標(biāo)記和雜交等。延伸接著，如圖IB所示，該方法包含延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)的第一步包含將小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物與多核苷酸聚合酶和一組三磷酸核苷酸合并。該延伸反應(yīng)還包括延伸雜交的目的小多核芬酸60以形成延伸產(chǎn)物80，其中所述延伸產(chǎn)物80與捕獲探針10雜交以形成延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物(圖1C)。所述延伸產(chǎn)物包含在3'端與延伸的區(qū)段連接的目的小多核苷酸60,所述延伸的區(qū)段包含與捕獲探針10的模板區(qū)段50互補(bǔ)的序列(圖1D)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述延伸的區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的或修飾的核苷酸殘基。通常，所述核苷酸聚合包含DNA的聚合以獲得組成延伸產(chǎn)物80的RNA-DNA嵌合體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合到捕獲探針10的雜交的小多核苷酸60通過聚合酶的作用進(jìn)行延伸，該聚合酶利用雜交的小RNA作為引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果捕獲-延伸探針10的延伸模板區(qū)段50是DNA，則聚合酶是DNA依賴性DNA聚合酶，能夠利用所述雜交的小多核苷酸60的3'端作為引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶是多核苷酸聚合酶，其可以利用RNA作為引物，諸如T4、T7、大腸桿菌PolI、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst聚合酶、Phi-29聚合酶等或這些酶的一種或多種的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸聚合酶缺乏所有的核酶活性，且能夠容易地利用標(biāo)記的三磷酸核苷酸作為雜交的小多核苷酸延伸的底物，所述小多核苷酸諸如作為延伸反應(yīng)引物的miRNA。用于延伸反應(yīng)的核苷酸混合物通常是一組三磷酸核苷，通常是NTPs，侈寸^(口ATP、CTP、GTP禾口UTP，或是dNTPs,，J^口dATP、dCTP、dGTP和TTP(或dUTP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，三石粦酸核苷的至少一種包含諸如熒光素、花青3、花青5、生物素、氨丙烯基、地高辛、四曱基若丹明等的可檢測標(biāo)記。廣泛多樣的可檢測三磷酸核苷可以從Roche(Indianapolis,IN)、Invitrogen(Carlsbad,CA)和其它商家購買。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記的三磷酸核苷的濃度低于其它三種三磷酸核苷的濃度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，未標(biāo)記的三磷酸核苷在延伸反應(yīng)中的濃度為5至300微摩爾，標(biāo)記的三磷酸核苷的濃度則為5至30微摩爾。然而，如本領(lǐng)域所理解的，不同的聚合酶在鏈合成中具有不同的利用此類修飾的核苷酸的能力。因此，在某些情況下，使用的標(biāo)記的三磷酸核苷的濃度可以與延伸反應(yīng)中所使用的未標(biāo)記的三磷酸核苷的濃度相當(dāng)。三磷酸核芬濃度的此類調(diào)整本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。此外，本領(lǐng)域已知，可調(diào)整延伸反應(yīng)中使用的緩沖液和或溫度以適應(yīng)修飾的三磷酸核苷在延伸反應(yīng)中的摻入。選擇用于延伸反應(yīng)的緩沖液不應(yīng)該妨礙小多核苷酸60與其捕獲探針10的雜交，且適合由聚合酶引發(fā)的延伸反應(yīng)。緩沖液的優(yōu)選形式允許或促進(jìn)修飾的核苷酸在延伸產(chǎn)物中的摻入。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合酶是來自大腸桿菌的Klenow酶的無核酸酶形式；三磷酸核苷酸是dATP、dCTP、dGTP,每種100微摩爾，標(biāo)記的dNTP是用花青3標(biāo)記的dUTP，濃度為IO微摩爾；延伸緩沖液包含0.05MTris國HCL、0.01MMgC12、1.0mMDTT、0.05mg/mlBSA以及20單位的核糖核酸酶抑制劑，如能夠抑制真核核糖核酸酶的重組哺乳動物蛋白。檢測/鑒定延伸產(chǎn)物80的分析可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來進(jìn)行，所述技術(shù)包括，但不限于，通過利用對待評i^介的miRNAs或其它小多核苷酸特異的微陣列的雜交和檢測、基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的分析、序列分析、流式細(xì)力包術(shù)和電;:永分析。也會被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的是，一組捕獲探針10可以首先結(jié)合到諸如熒光編碼珠的固相，所述編碼珠被指定根據(jù)探針對給定小多核香酸的特異性或與給定小多核香酸的互補(bǔ)來鑒定每種捕獲探針。在一個(gè)實(shí)施方案中，一組編碼珠中的每種獨(dú)特唯一的編碼珠對應(yīng)于待評價(jià)的一組miRNAs內(nèi)的一種獨(dú)特唯一的miRNA。通過流量法(flowmethod)用于測定的所述這類編碼珠可從諸如Luminex(Austin,TX)的眾多供應(yīng)商獲得。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，隨后適于雜交的條件下，將所述組的編碼珠與包含待評價(jià)或待測量的miRNAs的生物樣品接觸。此外，然后洗滌所述雜交珠以移除樣品中未雜交的材料和其它組分。然后在標(biāo)記的dNTP(s)存在下，通過上文所述的DAN聚合酶作用，延伸所述i朱。然后直接測定這些編碼珠來確定生物樣品中miRNAs或其它小多核香酸的存在和數(shù)量是可能的。為了降低背景和干擾，理想的是，通過洗滌所述珠，然后通過流量檢測進(jìn)行分析，從所述^K中移除延伸反應(yīng)中未結(jié)合的組分，此類方法在本領(lǐng)域內(nèi)已^皮充分了解。逆轉(zhuǎn)錄在許多實(shí)施方案中，目的多核苷酸60的隨后擴(kuò)增、檢測和/或鑒定還可以包含所得的延伸產(chǎn)物80的逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法并結(jié)合本文公開內(nèi)容，可以完成合適的逆轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì)以及^f吏用逆轉(zhuǎn)錄酶以產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的cDNA拷貝。擴(kuò)增術(shù)語"PCR反應(yīng)"、"PCR擴(kuò)增"、"PCR"、"預(yù)PCR"和"實(shí)時(shí)定量PCR"是用于表明應(yīng)用核酸擴(kuò)增系統(tǒng)的可互換的術(shù)語，所述系統(tǒng)增加了待檢測的靶核酸。這種系統(tǒng)的實(shí)例包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)系統(tǒng)。最近描述的和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法是基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBATM，Cangene，Mississauga,Ontario)和Q卩復(fù)制酶系統(tǒng)?？蓪?shí)時(shí)監(jiān)測或不實(shí)時(shí)監(jiān)測所述擴(kuò)增反應(yīng)形成的產(chǎn)物，或僅在反應(yīng)后監(jiān)測作為終點(diǎn)測量結(jié)果。RNA擴(kuò)增在如圖2所示的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括將包含在捕獲探針的間隔區(qū)段30或模板區(qū)段50內(nèi)的部分RNA聚合酶識別序列54轉(zhuǎn)變成完整的RNA聚合酶識別序列54和72且最終轉(zhuǎn)變成雙鏈RNA聚合酶啟動子54和72。隨后利用識別雙鏈RNA聚合酶啟動子54和72的RNA聚合酶，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了擴(kuò)增的單鏈RNA分子。這種單鏈RNA分子90可用于多種下游應(yīng)用，包括涉及核酸微陣列的基因表達(dá)研究以及通過細(xì)胞內(nèi)的反義或RNAi活性敲除與轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的對應(yīng)miRNA或其它RNA。術(shù)語"RNA聚合酶識別序列"意在包括單鏈和雙鏈核苷酸序列54和72。當(dāng)以單鏈形式時(shí)，所述核苷酸序列對應(yīng)于雙鏈RNA聚合酶啟動子的模板鏈或非模板鏈。"模板鏈"指一條核酸鏈，在其上通過模板依賴性核酸聚合酶活性用核苷酸或核苷酸類似物合成一條互補(bǔ)鏈。"非模板鏈"指與模板鏈互補(bǔ)的核酸鏈。當(dāng)以雙鏈形式時(shí)，所述核苷酸序列對應(yīng)于雙鏈RNA聚合酶啟動子的模板鏈和非模板鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針的模板區(qū)段包含RNA聚合酶識別位點(diǎn)70的非模板鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，間隔區(qū)段包含RNA聚合酶識別位點(diǎn)的模板鏈。任何RAN聚合酶識別序列54都可以用于本文所述的方法中，只要它被RNA聚合酶特異性識別。優(yōu)選地，所用的RNA聚合酶識別序列被諸如T7、T3或SP6RNA聚合酶的噬菌體RNA聚合酶識別。示例性的T7RNA聚合酶識別序列是TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:20)。示例性的T3RNA聚合酶識別序列是AATTAACCCTCACTAAAGGG(SEQIDNO:21)。示例性的SP6RNA聚合酶識別序列是AATTTAAGGTGACACTATAGAA(SEQIDNO:22)。例如，參照圖2B，目的小多核苷酸60(例如mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、非編碼RNAs，反義DNAs等)與捕獲探針10的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交，其中模板區(qū)段50包含必需的RNA聚合酶識別位點(diǎn)54(在圖2B的情況下，是RNA聚合酶啟動子的非模板鏈)。隨后的延伸產(chǎn)物80包含目的多核苷酸60和與該目的小多核苷酸的3'端相鄰的延伸的區(qū)段70，所述延伸區(qū)段70包含與模板區(qū)段50的RNA聚合酶識別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列(圖2C)。包含RNA聚合酶識別位點(diǎn)54和其互補(bǔ)序列72的雙鏈區(qū)產(chǎn)生了RNA聚合酶啟動子。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了檢測目的多核苷酸60，使用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄如上文所述而形成的延伸產(chǎn)物80,這樣就形成了包含與目的多核苷酸互補(bǔ)的序列40的RNA產(chǎn)物卯，所述RNA聚合酶識別位于延伸產(chǎn)物80相對端的RNA聚合酶啟動子54和72。將雙鏈延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與識別RNA聚合酶啟動子54和72的RNA聚合酶合并，產(chǎn)生了包含與所述目的小多核苷酸互補(bǔ)的序列即cRNA40(圖2D)的單鏈RNA產(chǎn)物。在卯的一個(gè)方面，捕獲探針的間隔區(qū)段30可以包括RNA聚合酶終止位點(diǎn)36，例如T7終止序列GCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQIDNO:23)。在此情形下，cRNA轉(zhuǎn)錄物卯會包含與RNA聚合酶識別位點(diǎn)54直接相鄰且在所述位點(diǎn)54下游的殘基，其在終止位點(diǎn)36前的殘基的3'端終止。如果省略了終止位點(diǎn)36，則所述酶會聚合在啟動子基序中的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游的整個(gè)序列，包括目的多核苷酸的互補(bǔ)鏈40以及通過例如接頭區(qū)段的連接作用追加在目的多核苷酸60的5'端的任何其它序列。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在核糖核普酸包括標(biāo)記的核糖核苷酸存在時(shí)發(fā)生。在一個(gè)方面，標(biāo)記核苦酸。如果需要制備包含cRNA的標(biāo)記的多核芬酸，則可以略去未標(biāo)記的UTP，并用標(biāo)記的UTP取代，或與標(biāo)記的UTP混合。標(biāo)記可以包4舌，例如熒光標(biāo)記或方文射性標(biāo)記。RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物卯的檢測指示樣品中存在待檢目的多核苷酸60，可以進(jìn)一步用于目的多核苦酸60的定量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物卯的檢測。優(yōu)選地，使用摻入轉(zhuǎn)錄物90的標(biāo)記的檢測實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物卯的檢測。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按大小分離后或與其同時(shí)進(jìn)行所述檢測。連接促進(jìn)目的小多核普酸擴(kuò)增和/或檢測的另一種方式包括連接反應(yīng)，以便進(jìn)一步延長小多核香酸延伸產(chǎn)物80。"連接"或"共價(jià)偶聯(lián)"指兩個(gè)鄰近核苷酸序列的共價(jià)偶聯(lián)，如與捕獲探針的間隔區(qū)段30基本上互補(bǔ)且與其雜交的接頭序列100，其與鄰近的miRNA或其他的小多核苷酸延伸產(chǎn)物80共價(jià)偶聯(lián)。所述反應(yīng)受連接酶的催化，在一個(gè)核芬酸序列的5'端和鄰近核苷酸序列的3'端之間，如捕獲探針的兩個(gè)鄰近區(qū)段之間或該兩條鄰近區(qū)段的互補(bǔ)物之間，形成磷酸二酯鍵。適宜的酶包括下列酶EC6.5.1.1(DNA連接酶(ATP))和EC6.5.1.3(RNA連接酶(ATP))。目的小多核苷酸60與捕獲纟果針10雜交后，才艮據(jù)本發(fā)明這一方面的方法還包括提供接頭區(qū)段IOO(圖3A)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭區(qū)段100包含選自下述的物質(zhì)包括核糖核苷酸以及脫氧核糖核香酸的一種或多種的多核苷酸，一種或多種的核苷酸類似物，以及一種或多種多核苷酸和多核苷酸類似物的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭100可抵抗核酸酶的降解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭100包含核酸酶抗性核香酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭100包含具有硫代磷酸酯骨架的核普酸，該骨架使所述接頭能抵抗核酸酶降解。接頭100具有接頭序列，并包含3，端和5，端。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭序列通過沃森-克里克堿基配對與本發(fā)明的捕獲探針10的間隔區(qū)段30基本上互補(bǔ)并能與其雜交。接頭100包含6至50個(gè)殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接頭100包含至少10個(gè)殘基，且所述接頭100的3，端的至少10個(gè)殘基與間隔區(qū)段30的5'端處或其附近的相應(yīng)殘基恰好互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，允許接頭100與間隔區(qū)段30雜交，隨后連接于延伸產(chǎn)物80，形成與捕獲探針序列IO(圖3B)基本上互補(bǔ)并能與其雜交的連接的延伸產(chǎn)物110。通過提供具有對捕獲探針10的間隔區(qū)段序列30具特異性的接頭序列的接頭100，可協(xié)助此類連接反應(yīng)，以便在序列特異性雜交時(shí)，小多核苷酸靶標(biāo)60和所述接頭100可彼此緊密靠近。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭100的3'端通過適宜的連接酶如T4多核普酸連接酶或通過另一個(gè)適宜的化學(xué)反應(yīng)能連接于目的miRNA60的5'端。參照圖3A,如圖3A通過與捕獲探針10雜交的目的小多核苷酸60和延伸的區(qū)段70所示，該方法接著包括將接頭100與樣品和捕獲探針10合并。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括將接頭100和雜交的捕獲探針/延伸產(chǎn)物10/80在溶液中合并?？蛇x地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容會理解的，捕獲探針I(yè)O、接頭100以及樣品可同時(shí)合并或以任何順序依次合并。例如，首先將捕獲探針10與樣品合并，接著將捕獲探針和樣品與接頭100合并；或可選地，例如，首先將捕獲探針10和接頭100合并，接著將捕獲探針10和接頭IOO與樣品合并；或可選地，例如，首先將接頭100與樣品合并，接著將捕獲探針10與接頭100和樣品合并。在一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲#:針10、接頭ioo以及樣品包括將約等摩爾量的捕獲探針10和接頭IOO合并。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針io、接頭ioo和樣品包括將約等摩爾量的捕獲採:針io和接頭ioo與一定量的樣本合并，所述樣本被期望含有捕獲探針I(yè)O或接頭100的約1/10摩爾量的目的小多核苷酸60。在一個(gè)實(shí)施方案中，合并捕獲探針I(yè)O、接頭100和樣品包括將樣品與0.1pmol/jxl至100pmol4d的每種捕獲探針10和接頭100在適當(dāng)?shù)木彌_液中合并，以產(chǎn)生包含捕獲探針10、接頭100和樣品的溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液選自TRIS、MOPS以及SSC;并包括諸如氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鈉的堿性鹽；以及還可以包括核酸酶抑制劑和促進(jìn)劑，諸如葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇、聚丙烯酰胺。示例性的緩沖液包括(a)溶于0.1-2.0M氯化鈉的lxTE緩沖液；(b)溶于1mMEDTA和100mM氯化鈉的0.1MMOPS,以及(c)20mMMOPS、1.8M氯化鋰、1mMEDTA、100jliM金精三羧酸(pH6.8)。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容會理解的，選擇的緩沖液pH將是最優(yōu)化目的反應(yīng)的pH。通常，所選的pH是6至8，優(yōu)選6.4至7.4,且更優(yōu)選接近7.0。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括將一種或多種核糖核酸酶抑制劑加入到樣品和捕獲探針10的合并物中，所述酶抑制劑例如諸如選自十二烷基硫酸鋰(LiDS)、十二烷基硫酸鈉、金精三羧酸的銨鹽以及金精三羧酸的鈉鹽、p-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三(2-曱酰乙基)-膦鹽酸鹽(TCEP)或人胎盤核糖核酸酶抑制劑的核糖核酸酶或核酸酶抑制劑。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，此類抑制劑可抑制核酸酶，而不降低探針和它們的耙多核苷酸彼此雜交的能力。參照圖3B，接頭IOO、捕獲探針10以及樣品合并后，該方法包括使接頭100與間隔區(qū)段30雜交，由此將接頭100、目的小多核苷酸60以及任選地延伸的區(qū)段70與捕獲探針10結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，使接頭100與間隔區(qū)段30雜交以及使目的小多核芬酸60與小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交，包括在足以使接頭100與捕獲探針10的間隔區(qū)段30雜交的條件下、在25°C至60°C下將包含接頭100、捕獲探針10和樣品的溶液孵育1至60分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭100與間隔區(qū)段30在接頭100的3'端的最后一個(gè)殘基與間隔區(qū)段30上的殘基雜交的位置處雜交，距離目的小多核苷酸60的5'端的1至5個(gè)殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭100與間隔區(qū)段30在接頭100的3'端的最后一個(gè)殘基與間隔區(qū)段30上的殘基雜交的位置處雜交，與目的小多核苷酸60的5'端直接相鄰。接下來，如圖3B所示，該方法包括將和間隔區(qū)段30雜交的接頭100的3'端與和小多核苦酸結(jié)合區(qū)段40雜交的目的小核苦酸60的5，端共價(jià)連接。接頭100的3，端與目的小多核苷酸60的5'端的連接以及目的小多核香酸3，端向延伸的區(qū)段70的3，端的延伸，可以以包括同時(shí)、依次的任何順序?qū)崿F(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域^支術(shù)人員結(jié)合本文/>開的內(nèi)容會理解的，所述連接可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接包括在存在適宜的緩沖液和必要輔助因素的情況下用適宜的連接酶如T4多核苷酸連接酶處理帶有雜交的接頭100的捕獲探針10以及含有目的小多核芬酸60的延伸產(chǎn)物80足夠的時(shí)間以使連接接近全部完成。如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容會理解的，捕獲探針10中存在的間隔區(qū)段30通過使接頭100的3'端與目的小多核苷酸60的5'端匹配的方式促進(jìn)接頭100與目的小多核苷酸60的連接。連接和延伸步驟的結(jié)合，產(chǎn)生了由已共價(jià)連接在一起的接頭100、目的小多核苷酸60和延伸的區(qū)段70的鏈所限定的"連接的延伸產(chǎn)物"110(連接的接頭-目的小多核苷酸-延伸的區(qū)段)，且其中連接的延伸產(chǎn)物110與捕獲探針10雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容會理解的，接頭100的5'端包含諸如焚光染料的標(biāo)記以便于檢測。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文公開的內(nèi)容所理解的，只要標(biāo)記的存在不干擾本發(fā)明的方法的其他步驟，接頭100可包含諸如熒光染料的標(biāo)記，以便于除接頭100的5，端以外的位置處的檢測。在其他的實(shí)施方案中，通過連接作用與目的小多核苷酸60結(jié)合的接頭序列100，可單獨(dú)或與相鄰的小多核苷酸60的核酸序列聯(lián)合，部分地順應(yīng)PCR擴(kuò)增的引物或標(biāo)記的檢測探針的引物。檢測探針在某些實(shí)施方案中，目的多核苷酸的檢測和鑒定可使用檢測探針。"檢測探針"指能識別特定的靶核芬酸序列的核酸結(jié)合分子，通常用于包括定量或?qū)崟r(shí)PCR分析以及終點(diǎn)分析的擴(kuò)增反應(yīng)中。此類探針同樣可用于監(jiān)控靶標(biāo)小多核苷酸序列、其附加的區(qū)段和/或互補(bǔ)物的延伸、反轉(zhuǎn)錄和/或擴(kuò)增。檢測探針通常包括熒光分子或熒光團(tuán)，包括但不限于帶S03而非羧基的熒光素染料的磺酸衍生物、熒光素的亞磷酰胺形式、CY3或CY5的亞磷酰胺形式(可從例如Amersham購買獲得)、氨基烯丙基、地高辛、四曱基若丹明等。多種可4企測的三磷酸核苷可從Roche(Indianapolis,IN)、Invitrogen(Carlsbad,CA)以及其他的生產(chǎn)商購買。術(shù)語"雙標(biāo)記纟笨4十"指帶有兩種附著標(biāo)記的寡核苷酸。一方面，一種標(biāo)記附著于探針分子的5，端，而另一種標(biāo)記則附著于該分子的3，端。特定類型的雙標(biāo)記探針含有附著于一端的熒光分子以及附著于另一端可通過焚光共才展能力轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)^f吏該熒光團(tuán)淬滅的分子。因此，雙標(biāo)記4企測4笨針也可以包含淬滅劑，包括但不限于BlackHole淬滅劑(Biosearch,Novato,CA)、IowaBlack(IDT,Coralville,Iowa)、QSY;豐滅劑(MolecularProbes,Invitrogen,Carlsbad,CA)以及Dabsyl和Dabcyl磺酸鹽/碳酸鹽淬滅劑(Epoch,Bothell,WA)。"5，核酸酶測定探針"指可通過DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性而水解的雙標(biāo)記探針。探針的降解可使熒光團(tuán)和淬滅劑分離，從而增強(qiáng)熒光發(fā)射。"5，核酸酶測定纟笨針"經(jīng)常稱為"TaqMan測定探針"，且"5，核酸酶測定，，稱為"TaqMan測定"。在本申請中，這些名稱可交換使用。"分子指示標(biāo)(MolecularBeacon)"指單標(biāo)記或雙標(biāo)記揮:針，其可能不受DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性的影響。已對探針、聚合酶或測定條件進(jìn)行了專門修飾，以避免標(biāo)記或組成型核苷酸通過DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性而分離。例如，分子指示標(biāo)的特定方面可含有許多核酸酶抗性殘基，以抑制DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性的水解。檢測的原理因此依賴于分子指示標(biāo)與其靶序列結(jié)合后標(biāo)記產(chǎn)生的信號中的可檢測差異。在本發(fā)明的一方面中，寡核苷酸探針在經(jīng)選擇的測定溫度下形成受寡核苷酸5，和3，端處的互補(bǔ)序列介導(dǎo)的分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該寡核苷酸具有附著于一端的熒光分子和附著于另一端的分子，當(dāng)兩者在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中彼此緊密接近時(shí)，該分子可將該熒光團(tuán)淬滅。結(jié)合的檢測可通過測量與靶標(biāo)結(jié)合后一種或多種標(biāo)記的特性的變化直接進(jìn)行(如具有或不具有莖結(jié)構(gòu)的分子指示標(biāo)類型測定)，或通過結(jié)合后的隨后反應(yīng)間接進(jìn)行，所述隨后反應(yīng)如5'核酸酶測定中通過DNA聚合酶的5，核酸酶活性的切割。在某些實(shí)施方案中，具有分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記探針如莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針和雙Scorpion探針，在擴(kuò)增過程中既可作為引物，又可作為4笨4十。檢測探針也可以包含兩種探針，其中，例如，焚光團(tuán)位于1種探針上，而淬滅劑位于另一種探針上，其中所述兩種探針一起在靶標(biāo)上雜交可淬滅信號，或者其中靶標(biāo)上的雜交可經(jīng)由焚光的變化改變信號特征。在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合染料可用于檢測在擴(kuò)增過程中積累的雙鏈DNA產(chǎn)物，所述DNA結(jié)合染料當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)射焚光。使用非共價(jià)結(jié)合的小溝結(jié)合物(minorgroovebinders,MGB)和/或嵌入標(biāo)記，如不對稱花青染料、DAPI、SYBRGreenI、SYBRGreenII、SYBRGold、PicoGreen、噻唑橙、Hoechst33342、溴化乙錠、l-O-(l-芘基曱基)丙三醇以及Hoechst33258，并由此在缺少檢測探針時(shí)，使擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)時(shí)或終點(diǎn)可視化。在某些實(shí)施方案中，實(shí)時(shí)可視化包括可使用嵌入的檢測探針和基于序列的檢測探針兩者。在如圖4所示的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(a)提供包含目的小多核苷酸60的樣品、捕獲探針10和雙標(biāo)記4企測探針120，所述雙標(biāo)記才企測探針120具有附著于檢測探針分子的5，端的一個(gè)標(biāo)記、附著于檢測探針120的3'端的另一個(gè)標(biāo)記以及檢測探針序列，所述序列與捕獲探針10的模板區(qū)段50內(nèi)的檢測探針結(jié)合序列52基本上互補(bǔ)并能與其雜交。如圖4A所示，將樣品、捕獲探針10以及檢測探針120合并后，使目的小多核苦酸60與多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交，并使檢測探針120與捕獲探針10的檢測探針結(jié)合序列52雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸聚合酶優(yōu)選具有能在延伸過程中切割雜交的小多核苷酸60的下游多核苷酸的5'核酸外切酶活性。如圖4B所示，通過向反應(yīng)混合物中加入聚合酶和核苷酸混合物，雜交的目的小多核苷酸60得以延伸，形成延伸產(chǎn)物80，而4會測探針120可通過多核苷酸聚合酶的5，至3'核酸外切酶水解?？蛇x地，在檢測:探針120切割以及隨后兩種標(biāo)記分離后，通過測量一種或多種標(biāo)記的熒光特性的變化，檢測目的小多核苷酸60的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，延伸產(chǎn)物80的延伸的區(qū)段70以及檢測探針，含有限制酶識別的互補(bǔ)序列。當(dāng)檢測探針和延伸的區(qū)段結(jié)合形成雙鏈雜交復(fù)合物時(shí)，檢測探針序列可被限制酶識別和切割。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，限制酶是切口核酸內(nèi)切酶，其使所述復(fù)合物的單鏈產(chǎn)生切口?？蛇x地，延伸反應(yīng)物可以包括反應(yīng)混合物中的一種或多種核苷酸類似物，所述核苷酸類似物使延伸的區(qū)段可抵抗核酸內(nèi)切酶的作用。隨后使所述探針產(chǎn)生切口提供了可檢測的萸光變化。帶切口的延伸產(chǎn)物在圖5所示的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供捕獲探針10,其中模板區(qū)段50包含一個(gè)或多個(gè)序列，其是雙鏈限制酶識別基序的一條鏈56,在本文被稱為限制位點(diǎn)基序。接下來，如上文所公開的，該方法包括使捕獲探針10和含有目的小多核芬酸60的沖羊品合并，以及^^所述目的小多核香酸60與小多核芬酸結(jié)合區(qū)段40雜交，形成小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物。接下來如圖5A和5B所示，該方法包含延伸反應(yīng)，其中將小多核苷^/捕獲探針復(fù)合體與多核苷酸聚合酶和一組三磷酸核苷合并。所述延伸反應(yīng)還包括延伸雜交的目的小多核苷酸以形成延伸產(chǎn)物80，其中將所述延伸產(chǎn)物80與捕獲探針I(yè)O雜交，形成延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物。一方面，延伸步驟將包含于捕獲探針10的模板區(qū)段50內(nèi)的單鏈限制酶識別序列56轉(zhuǎn)變成雙鏈限制酶識別序列56和74。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈限制位點(diǎn)56、74可受到切口劑的識別和作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，延伸的區(qū)段70的限制位點(diǎn)基序74可被切口核酸內(nèi)切酶切割。在另一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50的限制酶識別基序56含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物，其保護(hù)模板區(qū)段50免受切口劑的核酸內(nèi)切酶活性的作用。例如，可通過使限制位點(diǎn)的某些核苷酸間^:對水解產(chǎn)生抗性，如通過將它們轉(zhuǎn)變成硫代磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵或肽鍵，或通過代入特異性的限制核酸內(nèi)切酶不能識別的核普酸變體，促進(jìn)該限制位點(diǎn)內(nèi)的精確切割。在一個(gè)具體方面中，限制酶的特異性可排除含有取代dT的dU或類似地取代dG的dl(脫氧次黃噤呤核苷(deoxyinosine))的序列的識別和切割，但仍然能識別和作用于相反鏈(oppositestrand)的互才卜序歹寸。下一步，如圖5C所示，包括使延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與切口劑接觸，以使延伸產(chǎn)物80在雙鏈限制位點(diǎn)的一條鏈74上被選擇性地產(chǎn)生切口，以產(chǎn)生帶切口的延伸產(chǎn)物82。使延伸產(chǎn)物80產(chǎn)生切口得到了含有目的小多核苷酸60的3，端片段以及含有延伸的片段70部分的5，端片段，后者在本文被稱為帶切口的延伸片段82。如圖5D所示，該方法還包括用聚合酶延伸含有雜交的目的小多核苷酸60的、帶切口的延伸產(chǎn)物的3'端片段，以便復(fù)原切口位點(diǎn)，并移出帶切口的延伸片段82。通過帶切口的延伸片段82的熱變性以及移動，可促進(jìn)帶切口的延伸片段82的移出。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶和限制酶是熱穩(wěn)定酶，其能在為適應(yīng)帶切口的延伸片段的變性和移動而增加的溫度下，保持酶活性。具有應(yīng)用潛力的DNA聚合酶包括Vent(外切)、DeepVent(外切)、Pfu(外切)、Bst(大片段)、Bca(外切)、phi29，T7(外切)以及Klenow(外切)。耐熱聚合酶和/或高持續(xù)性聚合酶(processivepolymerases),特別是具有鏈替代活性的聚合酶，可能是有優(yōu)勢的。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步的延伸、切割以及取代步驟的循環(huán)可導(dǎo)致帶切口的延伸片段82的線性擴(kuò)增，從而反映最初與捕獲探針10雜交的靶標(biāo)小多核苷酸60的初始濃度。檢測帶切口的延伸產(chǎn)物帶切口的延伸產(chǎn)物82的檢測，指示樣品中存在待檢目的多核苷酸60，并可進(jìn)一步用于目的多核香酸60的定量。上文所述的帶切口的延伸片段82的檢測可通過利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式來實(shí)現(xiàn)，所述技術(shù)包括但不限于，與帶切口的延伸片段82結(jié)合的標(biāo)記的檢測、針對微陣列的一種或多種帶切口的延伸片段82的雜交和檢測、克隆和測序或定量實(shí)時(shí)PCR。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過與信號產(chǎn)生探針(signalgeneratingprobe)接觸，可便于帶切口的延伸片段82的檢測，所述信號產(chǎn)生探針具有與被移開的帶切口的延伸片段82互補(bǔ)并能雜交的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號產(chǎn)生探針的長度為約15-25個(gè)核苷酸殘基。信號產(chǎn)生探針與帶切口的延伸片段82形成雙鏈復(fù)合物的雜交隨后可用諸如SYBRGreen或溴化乙錠等嵌入染料(intercalatingdye)來檢測，所述嵌入染料一旦選擇性地與雙鏈核酸結(jié)合，便能產(chǎn)生焚光信號。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶切口的延伸片段82具有與特異性的目的小多核苷酸60相關(guān)的帶切口的延伸片,殳序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一信號產(chǎn)生探針具有第一信號產(chǎn)生探針序列，第二信號產(chǎn)生探針具有第二信號產(chǎn)生探針序列，每種都具有預(yù)定的序列或預(yù)定的大小，其中所述第一信號產(chǎn)生探針序列和所述第二信號產(chǎn)生探針序列的序列或大小或者序列和大小兩者彼此不同。檢測和區(qū)分兩個(gè)或多個(gè)信號產(chǎn)生探針的序列和/或大小允許每次測定檢測幾個(gè)靶標(biāo)。在另外的實(shí)施方案中，信號產(chǎn)生探針具有能夠從嵌入染料中轉(zhuǎn)移能量的熒光團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一信號產(chǎn)生探針具有第一熒光團(tuán)，而第二信號產(chǎn)生:^罙針具有第二熒光團(tuán)，其中所述第一熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光語不同于所述第二熒光團(tuán)的熒光發(fā)射光語。；險(xiǎn)測和區(qū)分兩個(gè)或更多個(gè)熒光團(tuán)的不同的熒光發(fā)射光譜允許每次測定復(fù)用幾個(gè)靶標(biāo)。同理，在另外的實(shí)施方案中，與被移開的帶切口的延伸片段雜交的信號產(chǎn)生探針可以是分子指示標(biāo)，以便其在未雜交狀態(tài)時(shí)，其淬滅劑和熒光團(tuán)經(jīng)其發(fā)夾結(jié)構(gòu)彼此鄰近，但當(dāng)與被移開的帶切口的延伸片段雜交時(shí)，因?yàn)闊晒鈭F(tuán)和淬滅劑彼此分離而允許產(chǎn)生熒光，故觀察到可檢測的熒光。因此，熒光與樣品中存在的最初的小多核苷酸成比例?？稍O(shè)計(jì)分子指示標(biāo)，其與唯一的帶切口的延伸片段雜交，該片段通過上文所述的每個(gè)唯一靶向的捕獲^1針，與靶向的小多核香酸相關(guān)聯(lián)。在如圖6所示的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供捕獲探針，其中模板區(qū)段包含第一限制位點(diǎn)56以及第二限制位點(diǎn)58,其中所述第一限制位點(diǎn)56作為在延伸產(chǎn)物80或頂鏈(topstrand)中產(chǎn)生切口位點(diǎn)的模板，而所述第二限制位點(diǎn)58經(jīng)修飾，可抵抗模板區(qū)段50或底鏈(bottomstand)的切割。本發(fā)明此方面的捕獲探針的實(shí)例顯示于表III中。接下來，如上文所公開的，該方法包括將捕獲探針10和含有目的小多核芬酸的樣品合并，并使目的小多核芬酸60與小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交，形成小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物。接著，該方法包含延伸反應(yīng)，其中將小多核苷酸/探針復(fù)合物與多核苷酸聚合酶和一組三磷酸核苷合并。所述延伸反應(yīng)還包括延伸雜交的目的小多核芬酸60,形成延伸產(chǎn)物80,其中將所述延伸產(chǎn)物80與捕獲探針10雜交，形成延伸產(chǎn)物/捕獲4罙針復(fù)合物。一方面，延伸步驟將捕獲探針的第一限制位點(diǎn)56轉(zhuǎn)變成能在頂鏈74即延伸的區(qū)段70而不是底鏈56即模板區(qū)段50上產(chǎn)生切口的雙鏈限制酶識別序列，相反，捕獲探針的第二限制位點(diǎn)58則轉(zhuǎn)變成第二個(gè)雙鏈限制序列58、76，其在相應(yīng)的^t板區(qū)段50上不^皮選擇性地產(chǎn)生切口。如圖6A所示的下一步驟包括將延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與識別并作用于第一限制位點(diǎn)56、74的切口劑接觸，以便使延伸產(chǎn)物80在雙鏈限制位點(diǎn)56、74的一條鏈即頂鏈74上選擇性地產(chǎn)生切口，產(chǎn)生帶切口的延伸片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，切口劑是切口核酸內(nèi)切酶，且延伸的區(qū)段70的限制位點(diǎn)基序74切口劑切割。在另一個(gè)實(shí)施方案中，模板區(qū)段50的限制酶識別基序含有一個(gè)或更多個(gè)核苷酸類似物，所述核苷酸類似物保護(hù)模板區(qū)段50免受切口劑的核酸內(nèi)切酶活性的作用。例如，通過使限制位點(diǎn)的某些核苷酸間鍵對水解產(chǎn)生抗性，如通過將它們轉(zhuǎn)變成硫代磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵、曱基磷酸酯鍵或肽鍵，或通過代入不能被特異性限制核酸內(nèi)切酶識別的核苷酸變體，促進(jìn)在限制位點(diǎn)內(nèi)精確地產(chǎn)生切口。在一個(gè)具體方面，限制酶的特異性可排除含有取代dT的dU的序列的識別和切割，但仍然能識別和作用于相反鏈的互補(bǔ)序列。含有第一NtAlwI限制位點(diǎn)和第二Nb.BbvCI限制位點(diǎn)的捕獲探針10的實(shí)例顯示于下文的表V中，其中所述第二位點(diǎn)含有用于取代脫氧T的脫氧U。含有第一Nt.AlwI限制位點(diǎn)和第二Nb.BbvCI限制位點(diǎn)的捕獲探針10的其他實(shí)例也顯示于下文的表V中，其中所述第二位點(diǎn)含有硫醇化的骨架(thiolatedbackbone)。如圖6B所示，使延伸產(chǎn)物80產(chǎn)生切口，產(chǎn)生了含有目的小多核苷酸60的3'端片段和含有延伸的區(qū)段70部分的5'端片段，后者在本文中稱為帶切口的延伸片段82。該方法還包含通過聚合酶的作用移出帶切口的延伸區(qū)段82，其含有第二限制位點(diǎn)76的未修"飾的頂鏈。在如圖6C所示的一個(gè)實(shí)施方案中，通過接觸與帶切口的延伸片段82互補(bǔ)并能與其雜交的檢測探針120,可易化帶切口的延伸片段82的檢測。雙鏈探針/帶切口的延伸片段復(fù)合物的形成更新了第二雙鏈限制識別序列，所述序列現(xiàn)在能夠在底鏈即探針序列120上被產(chǎn)生切口。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測探針的長度為約15-25個(gè)核普酸殘基。接下來該方法還包括使雙鏈探針/帶切口的延伸區(qū)段復(fù)合物與能識別檢測探針序列120并使其產(chǎn)生切口的切口劑接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針是雙標(biāo)記的檢測探針120，以便產(chǎn)生切口的反應(yīng)提供可檢測的熒光變化。本具體實(shí)施方案的雙標(biāo)記檢測探針序列的實(shí)例，顯示于表IV中。表III<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>名稱中"HSA"對應(yīng)于由給定捕獲探針?biāo)Y(jié)合的各自人類miRNA"ideoxyU"對應(yīng)于取代T的dU"*"對應(yīng)于骨架中的硫代磷酸鍵表IV雙標(biāo)i淡測探針<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>"5IAbFQ，，對應(yīng)于5'IowaBlackFQ(IDT)"IFluorT"對應(yīng)于熒光標(biāo)記的T"36-FAM"對應(yīng)于3'末端熒光DNAzyme基序的并入在如圖7所示的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供捕獲^:針i0，其中模板區(qū)段50包含一個(gè)或多個(gè)與RNA切割催化的核酸互補(bǔ)的序列，本文將其稱為"DNAzyme基序"130。RNA切割DNA酶(DNAzyme)的實(shí)例包括"10-23，，和"8-17"通用RNA切割DNA酶，其分別含有保守的催化序列GGCTAGCTACAACGA(SEQIDNO:32)和TCCGAGCCGGACGA(SEQIDNO:33)。保守的催化結(jié)構(gòu)域的側(cè)面為能通過沃森-克里克^威基配對與靶RNA雜交的可變結(jié)合結(jié)構(gòu)域。側(cè)翼結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶RNA的雜交產(chǎn)生含有催化結(jié)構(gòu)域的環(huán)結(jié)構(gòu)。經(jīng)示例性的"10-23"DNAzyme的切割發(fā)生于耙RNA的噤P令-嘧咬二核芬酸上，而經(jīng)示例性"8-17"DNAzyme的切割發(fā)生于靶RNA的AG二核苷酸上。因此，本實(shí)施方案的DNAzyme互補(bǔ)物130含有與保守的催化序列互補(bǔ)的序列，這點(diǎn)會被本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本/>開的內(nèi)容所理解。除了DNAzyme互補(bǔ)基序130外，本實(shí)施方案的模板區(qū)段50包含分別位于DNAzyme互補(bǔ)物的5'端和3'端的側(cè)面的第一側(cè)翼區(qū)段132和第二側(cè)翼區(qū)段134。優(yōu)選地，第一側(cè)翼區(qū)段和第二側(cè)翼區(qū)段每個(gè)的長度均為約5-20個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選約7-10個(gè)，最優(yōu)選約8-9個(gè)核苷酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所迷，模板區(qū)段50還包含限制位點(diǎn)56。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述限制位點(diǎn)56位于3，方向的下游，并可與第二探針區(qū)段重疊。表V提供了含有與"10-23"保守的催化序列互補(bǔ)的DNAzyme互補(bǔ)物的捕獲探針的實(shí)例，其中DNAzyme互補(bǔ)物的側(cè)翼在5'端為包含第一側(cè)翼區(qū)段的9個(gè)殘基，在3，端為包含第二側(cè)翼區(qū)段的9個(gè)殘基。此外，表V的捕獲4笨針都含有可以被切口核酸內(nèi)切酶N.BbvCI(NewEnglandBiolabs,IpswichMA)識別的限制酶識別基序。接下來，如上文所述，該方法包含將捕獲探針和含有目的小多核苷酸60的樣品合并，使目的小多核苷酸60與小多核苷酸結(jié)合區(qū)段40雜交以形成小多核苷Slt/捕獲探針復(fù)合物。接著，該方法包括延伸反應(yīng)，其中將小多核苦酸/捕獲探針復(fù)合物與多核苷酸聚合酶和一組三磷酸核苷合并。所述延伸反應(yīng)還包含延伸雜交的目的小多核苷酸60以形成延伸產(chǎn)物80，其中所述延伸產(chǎn)物80與捕獲探針10雜交，形成延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物。在如圖7A所示的優(yōu)選實(shí)施方案中，下一步驟包含將延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合體與識別并作用于限制位點(diǎn)74的切口劑接觸，以便使在雙鏈限制位點(diǎn)的一條鏈即頂鏈74上的延伸產(chǎn)物80被選擇性產(chǎn)生切口，以產(chǎn)生帶切口的延伸片段82。在如圖7B和7C所示的一個(gè)實(shí)施方案中，延伸產(chǎn)物或優(yōu)選帶切口的延伸片段82的移出，提供了能與適宜底物雜交并將其切割的功能DNAzyme。適宜的底物神果針140可以是RNA多核苦酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸。底物探針130包含具有第一探針序列的第一探針區(qū)段132、切割位點(diǎn)以及具有第二探針序列的第二探針區(qū)段134。底物探針140的第一探針序列與模板區(qū)段50的第一側(cè)翼序列132基本上相同。同樣，底物探針140的第二探針序列134與模板區(qū)段50的第二側(cè)翼序列134基本上相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNAzyme互補(bǔ)物基序78含有與"10-23"保守催化結(jié)構(gòu)域互補(bǔ)的序列。底物探針140可以是RNA多核苷酸或嵌合的DNA/RNA多核苷酸，其具有含有一個(gè)或多個(gè)核糖核苦酸殘基的DNAzyme敏感切割位點(diǎn)142。所述底物探針140包含具有第一探針序列的第一探針區(qū)段132、切割位點(diǎn)142以及具有第二探針序列的第二探針區(qū)段134。底物探針140的第一探針序列132與模板區(qū)段50的第一側(cè)翼序列132基本上相同。同樣，所述底物探針140的第二探針序列134與模板區(qū)段50的第二側(cè)翼序列134基本上相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述切割位點(diǎn)142包含與嘧啶殘基相鄰的噪呤殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過探針序列132、134與包含在延伸產(chǎn)物80內(nèi)或帶切口的延伸片段82內(nèi)的互補(bǔ)序列136、138之間的沃森-克里克堿基配對，在帶切口的延伸片段82中形成環(huán)結(jié)構(gòu)。接著，該方法還包括在切割位點(diǎn)142切割底物探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，底物探針140是雙標(biāo)記的檢測探針，以便產(chǎn)生切口的步驟提供可檢測的熒光變化。本具體實(shí)施方案的雙標(biāo)記底物探針的實(shí)例顯示于表VI中。表v含有DNAZYME基序的捕獲探針<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>試劑盒在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有一種或多種用于分離、標(biāo)記和檢測小RNAs如人類miRNA的試劑的試劑盒。試劑盒的優(yōu)選形式包括(a)捕獲探針的等摩爾混合物；(b)含有三磷酸脫氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；(c)聚合酶；(d)抗生蛋白鏈菌素包被的順磁珠；(e)—種或多種雙標(biāo)記檢測探針；(f)連接酶；(g)與捕獲探針的間隔區(qū)段基本上互補(bǔ)并能與其雜交的寡核苷酸接頭；或(h)—種或多種對包含于捕獲探針中的限制酶識別序列特異的限制酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含本發(fā)明的的捕獲延伸探針，例如諸如表II所列的那些與小RNA結(jié)合區(qū)段的等摩爾混合物，所述小RNA結(jié)合區(qū)段包含已知的人類成熟miRNA群的互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含選自下述一種或多種物質(zhì)標(biāo)記緩沖液，包含0.5MTris-HCL、0.1MMgCl2、10mMDTT、0.5mg/mlBSA以及諸如能抑制真核RNases的重組哺乳動物蛋白的RNase抑制劑；核苦酸混合物，含有例如10微摩爾的花青3-dUTP或花青5-dUTP，以及每種100微摩爾的未標(biāo)記的dATP、dCTP以及dGTP;諸如多核酸酶聚合酶的標(biāo)記酶，例如無核酸外切酶的Klenow(USBCorp.;Cleveland,OHUS);諸如1(im抗生蛋白鏈菌素包被的順》茲J朱的捕獲珠；包含例如0.5MTris-HCL、0.1MMgCl2以及10mMDTT的珠洗滌緩沖液；包含例如甲酰胺的標(biāo)記的miRNA洗脫緩沖液；諸如MicroconYM10裝置的緩沖液交換裝置以及O.lxTE洗滌緩沖液。包括摘要和附圖的說明書中公開的所有特征，以及公開的任何方法或過程中的所有步驟，可以任何組合的方式進(jìn)行組合，一些此類特征和/或步驟相互排斥的組合除外。除非另有明確說明，包括摘要和附圖的說明書中公開的每個(gè)特征，可被滿足相同、等同或相似目的的可選特征來替代。因此，除非另有明確說明，所公開的每個(gè)特征僅是一系列總的等同或相似特征的一個(gè)實(shí)例。前述討論決不是進(jìn)行限制，且檢測由本發(fā)明的方法標(biāo)記和測量的miRNAs的其他方式是4艮容易想到的，諸如通過電泳檢測miRNA的延伸群，或例如通過miRNAs的延伸，其中樣品自身作為諸如組織切片的固相。下文的描述的對本發(fā)明進(jìn)行了更詳細(xì)的說明。實(shí)施例1如下進(jìn)行本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。首先用本文^^開內(nèi)容中公開的標(biāo)記方法，標(biāo)記來自外周血單核細(xì)胞的人類總RNA樣品，隨后與商購的miRNA微陣列玻片雜交，測量通過本文公開的方法制備的分離的雜交探針的熒光，并分析結(jié)果。小RNA捕獲-^4伸探針包含對應(yīng)于210個(gè)單一的人類miRNAs和2份重復(fù)的3個(gè)其他的人類miRNAs的miRNA結(jié)合區(qū)段的一組捕獲-延伸探針，總計(jì)為216個(gè)捕獲延伸-探針被設(shè)計(jì)為與它們的對應(yīng)人類miRNAs完全且特異性地互補(bǔ)，其中的8個(gè)實(shí)例顯示于表III中，它們具有不同miRNA結(jié)合區(qū)段，具有相關(guān)的相同的固相結(jié)合區(qū)段、相同的延伸區(qū)段以及相同的間隔區(qū)段，所述固相結(jié)合區(qū)段由加入附著于每個(gè)捕獲-延伸探針5，端的生物素來促進(jìn)。從集成DNA技術(shù)7i^司(IntegratedDNATechnologies,Coralville，IAUS)獲得小RNA捕獲-延伸探針。將單個(gè)小RNA捕獲探針重懸浮于含2%乙腈(SigmaAldrich;St.Louis,MOUS)的0.1xTE緩沖液中，使每個(gè)探針復(fù)合物的終濃度為100pmol/ul。表VII5，生物素化的捕獲探針以及它們的互補(bǔ)MIRNA的代表性實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>"/5BIO/"表示在合成中加入的5'生物素。向每個(gè)1.5ml的螺口試管(screwcaptube,Starstedt;Newton,NCUS)中加入7ul每種探針，制備來自桑格中心(SangerCenter)的216個(gè)捕獲探針的集合?；旌衔镏械奶结樖堑饶柕?，在捕獲-延伸探針混合物中，其終濃度為約0.5pmol/每種捕獲探針/ul。小RNA與混合的捕^l探針的雜交將0.5ug分離自外周血單核細(xì)胞(BioChain;Hayward，CAUS)的總RNA加入到濃度為0.5pmol/探針/ul的1.0ul混合的捕獲探針和10個(gè)單位的RNasin(Promega;Madison,WIUS)中。在Bio-Rad96孑LMultiplate(Bio-RadLaboratories,Inc.;Hercules,CAUS)中集合上述組分，并在離心機(jī)中短暫律動，進(jìn)行混合。通過在熱循環(huán)儀(Bio-RadLaboratories,Inc.)中于42°C孵育所述組分30分鐘，隨后5分鐘每秒降低1°C至25°C，進(jìn)行雜交。通過延伸進(jìn)行標(biāo)記使用捕獲探針作為模板以及使用雜交的miRNA作為引物，利用Klenow無核酸外切酶活性的DNA聚合酶(USB;Cleveland,OHUS)，實(shí)現(xiàn)通過延伸的標(biāo)記。將含有1XKlenow反應(yīng)緩沖液(USB)，0.1mMdATP、dGTP、dCPT(PromegaCorp.;Madison,WIUS)與0.0065mM花青3-dUTP(EnzoLifeSciences,Inc.;Farmingdale,NYUS)以及5個(gè)單J立的Klenow無核酸外切酶活性的DNA聚合酶(USB)的反應(yīng)組分混合，隨后加入到含有雜交的miRNA和捕獲探針的孔中，至10ul的總反應(yīng)體積。然后將平板在離心機(jī)中短暫律動，進(jìn)行混合。將該平板用箔覆蓋避光，并在室溫下孵育1小時(shí)。加入10ul0.5MEDTA(SigmaAldrichCorp.;St.Louis,MOUS)，終止反應(yīng)。利用在含有溴化乙錠的預(yù)制的Nuseive/GTG(3:1)瓊脂糖凝膠(BMACORP.;Rockland,MEUS)上運(yùn)行1.0ul標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行電泳。通過觀察到延伸產(chǎn)物族的一簇適當(dāng)大小的條帶來證實(shí)所述標(biāo)記。>^珠捕獲和來自捕獲^:針的標(biāo)記的小RNA將剩余的9ul標(biāo)記反應(yīng)混合物和5.0ul抗生蛋白鏈菌素A畫&a^TM(Aureon;Vienna,Austria)轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的螺口試管(Starstedt;Newton，NCUS)。輕彈試管以便混合，并用箔避光，在室溫下孵育20分鐘以捕獲探針-miRNA延伸產(chǎn)物。20分鐘后，通過將該1.5ml試管放置于磁性架(magnetstand,GraceBiolabs;Bend,ORUS)上洗滌所述珠-探針雜交復(fù)合物并允許在試管的一側(cè)收集磁珠。吸出多余液體并棄掉，隨后加入100ulIXKlenow無核酸外切酶活性的反應(yīng)緩沖液(USB)。輕彈試管以混合內(nèi)容物，隨后放回磁性架，取走多余液體并棄掉，并加入IOOulIXKlenow無核酸外切酶活性的反應(yīng)緩沖液(USB)。將所述試管混合后放回磁性架上，吸走多余液體并棄掉，加入20ul100%去離子化的曱酰胺(BioVentures,Inc.;Murfreesboro,TNUS)，以從捕獲4笨針-珠復(fù)合物中洗脫標(biāo)記的小RNA延伸產(chǎn)物。加入甲酰胺2分鐘后，輕彈試管以便混合，并放回磁性架上。將含有洗脫的標(biāo)記的小RNA延伸產(chǎn)物的20ul曱酰胺轉(zhuǎn)移至新的1.5mL螺口試管。隨后，使用MicroconYM10超過濾裝置(MimporeCorp.;Billerica，MAUS)，進(jìn)行緩沖液交換，以便用O.IXTE替換曱酰胺。將180ul0.1XTE加入含有洗脫的標(biāo)記的小RNA延伸產(chǎn)物的20ul體積中，并將全部體積即200ul轉(zhuǎn)移至放置于1.5ml收集管中的柱上。隨后，10。C下，將所述管在離心機(jī)中于14,000xg離心30分鐘。棄掉液體，將超過濾裝置^t回收集管內(nèi)，并向該超過濾裝置加入100ul0.1XTE。隨后將所述超過濾裝置10。C下于14,000xg再次離心10分鐘，棄掉液體。隨后將該超過濾裝置反轉(zhuǎn)并放入新的收集管中，10。C下3,000xg倒旋5分鐘。20ul回收液中含有在適宜的緩沖液中用于雜交的標(biāo)記的小RNA。標(biāo)記的小RNA雜交于小RNA生物芯片上將25ul2X雜交緩沖液(Genosensor;Tempe，AZUS)加入到20ul標(biāo)記的miRNA和5ul無菌DI水中，短暫律動以便混合，隨后吸至GenoExplorerTM+RNA生物芯片(Genosensor)的活性區(qū)域上，并用20x20塑料蓋玻片(TedPella,Inc.;Redding,CAUS)覆蓋。隨后將玻片置于濕潤的小室中，密封，并在室溫下將其置于黑暗處雜交過夜約18小時(shí)。孵育過夜后，將玻片在25ml3XSSC緩沖液和0.2%SDS中洗滌一次5分鐘，隨后在IXSSC緩沖液和0.1%SDS洗滌一次5分鐘。用0.1XSSC緩沖液進(jìn)行第三和第四次洗滌，每次2分鐘。洗滌包括將玻片浸入緩沖液中并輕輕攪動規(guī)定的時(shí)間。洗滌后，將玻片用壓縮的空氣進(jìn)行空氣干燥，隨后進(jìn)行玻片的掃描。玻片的掃描和分析使用PerkinElmer(Wellesley,MAUS)的ScanArrayExpressHT微陣列掃描儀，掃描玻片。在70。/。的增益(gain)以及20um的分辨率下，對全部蓋玻片的輕松掃描(easyscan),對通過儀器軟件進(jìn)行定量來說，是足夠的。通過輸入由miRNA微陣列制造商提供的.gal文件，完善樣點(diǎn)結(jié)果和玻片信息。所述.gal文件包括鑒定的所有樣點(diǎn)，以及蓋玻片樣點(diǎn)的位置、直徑和間3巨。表VIII用于定量的輸入數(shù)據(jù)的表示起始陣列模式信息單位,陣列4亍(ArrayRows)4陣列列(ArrayColumns)1樣點(diǎn)行(SpotRows)21才羊點(diǎn)歹'J(SpotColumns)24陣列行的間隔5000陣列列的間隔5000樣點(diǎn)行的間隔200樣點(diǎn)列的間隔200樣點(diǎn)直徑120空隙0樣點(diǎn)/陣列504總樣點(diǎn)2016末端陣列模式信息起始圖像信息圖像ID通道圖像熒光團(tuán)-1CHIAlexa546-1CH2Alexa546末端圖像信息起始標(biāo)準(zhǔn)化信息標(biāo)準(zhǔn)化方法LOWESS末端標(biāo)準(zhǔn)化信息參照圖8，其顯示了使用10um掃描分辨率和70。/。激光增益的雜交的GenoExplorerTMmiRNA芯片的掃描圖像。才艮據(jù)miRNA微陣列玻片布局，每個(gè)樣點(diǎn)重復(fù)印三次，在每個(gè)樣點(diǎn)以及整個(gè)玻片內(nèi)中允許點(diǎn)到點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化。除miRNA樣點(diǎn)外，還有由僅緩沖液或加入樣品時(shí)不發(fā)出焚光的其他的未知序列組成的陰性對照樣點(diǎn)。GenoExplorerTMmiRNA芯片含有總計(jì)632個(gè)樣點(diǎn)，代表三份重復(fù)的成熟miRNAs和前體miRNAs。將所有陰性對照樣點(diǎn)的平均強(qiáng)度和中值強(qiáng)度進(jìn)行平均，獲得背景水平的代表值。將背景的每個(gè)平均強(qiáng)度值和中值強(qiáng)度值從樣品樣點(diǎn)的平均強(qiáng)度值和中值強(qiáng)度值中減去，獲得扣除干擾的信號值。一旦獲得上述值后，則在三個(gè)重復(fù)的值中，對單個(gè)樣品的值進(jìn)行平均，獲得每個(gè)代表的樣品樣點(diǎn)的平均信號強(qiáng)度值。三個(gè)重復(fù)樣點(diǎn)之間具有高標(biāo)準(zhǔn)偏差的那些樣品樣點(diǎn)不用于最后的分析，因?yàn)樗鼈儧]有準(zhǔn)確地代表樣品強(qiáng)度。一旦標(biāo)準(zhǔn)化，加入到總RNA樣品內(nèi)用于小RNA延伸標(biāo)記的216個(gè)捕獲探針中，總共有198個(gè)被認(rèn)為是陽性的。標(biāo)準(zhǔn)化后，底數(shù)為2的對數(shù)(log2)或信號強(qiáng)度從4.64的低陽性到13.28的高陽性變動。hsa-mir-198miRNA對應(yīng)于log213.28的最高信號強(qiáng)度，點(diǎn)到點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為log20.099。其他樣點(diǎn)也存在，但被去掉，因?yàn)槿齻€(gè)重復(fù)樣點(diǎn)中的一個(gè)與其他重復(fù)點(diǎn)相比，位于可接受的強(qiáng)度范圍外。參照圖9，其顯示了使用花青3在0.5ug分離自外周血單核細(xì)胞的人類總RNA中檢測到的12種不同miRNAs樣品的熒光強(qiáng)度的圖表，其中所檢測到的12種不同miRNAs從1到12為:135a、369、024、453、154、7e、154*、138、325、106a、126和7a。在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)前，外周血單核細(xì)胞中miRNAs的特異性是未知的。大多數(shù)miRNA微陣列的研究是在諸如腫瘤或非腫瘤的特異性組織上進(jìn)行的。該微陣列的結(jié)果顯示，使用本發(fā)明的方法，捕獲-延伸探針能特異性地捕獲存在于總RNA樣品中的miRNAs并促進(jìn)其標(biāo)記，且標(biāo)記的產(chǎn)物可用于諸如微陣列分析的下游應(yīng)用。在本實(shí)施例中，當(dāng)雜交至微陣列上時(shí)，使用了0.5ug總RNA的相對小的樣品體積，并產(chǎn)生了可接受的信號強(qiáng)度。為了玻片雜交后收到可接受的信號強(qiáng)度，大多數(shù)現(xiàn)行的標(biāo)記方法需要多達(dá)50ug的起始總RNA原料。結(jié)合某些優(yōu)選的實(shí)施方案，對本發(fā)明進(jìn)行了相當(dāng)詳細(xì)的說明，其他的實(shí)施方案也是可行的。因此，不應(yīng)當(dāng)將所附的權(quán)利要求書的范圍限定于本文公開內(nèi)容包含的優(yōu)選實(shí)施方案的描述。本文引用的所有參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。權(quán)利要求1.包含多核苷酸的捕獲探針，所述多核苷酸包含具有間隔區(qū)段序列的間隔區(qū)段，該間隔區(qū)段具有3’端和5’端；具有模板區(qū)段序列的模板區(qū)段，該模板區(qū)段具有3’端和5’端；以及具有小多核苷酸結(jié)合區(qū)段序列的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段；其中所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段通過沃森-克里克堿基配對與一個(gè)或多個(gè)目的小多核苷酸基本上互補(bǔ)并能與其雜交，其中所述目的小多核苷酸選自RNA多核苷酸、DNA多核苷酸和其組合；其中所述間隔區(qū)段的5’端與所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段的3’端連接；且其中所述模板區(qū)段的3’端與所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段的5’端連接。2.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其還包含能結(jié)合于固相的分子組合物的固相結(jié)合區(qū)段。3.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其中所述間隔區(qū)段包括RNA聚合酶終止位點(diǎn)。4.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其中所述小多核苷酸結(jié)合區(qū)段與目的miRNA基本上互補(bǔ)且能與其雜交。5.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其中所述模板區(qū)段包括選自下述的一個(gè)或多個(gè)序列(a)多核苷酸聚合酶識別位點(diǎn)或與多核苷酸聚合酶識別位點(diǎn)互補(bǔ)的序列；(b)為限制酶識別基序的一個(gè)或多個(gè)序列；以及(c)與RNA切割催化核酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)序列。6.包含權(quán)利要求1所述的兩種或多種捕獲探針的組合物，所述組合物包含(a)具有第一間隔區(qū)段、第一小多核苷酸結(jié)合區(qū)段和第一模板區(qū)段的第一捕獲探針；以及(b)具有第二間隔區(qū)段、第二小多核苷酸結(jié)合區(qū)段和第二模板區(qū)段的第二捕獲探針，其中所述第二小多核苷酸區(qū)段與所述第一多核苦酸結(jié)合區(qū)段具有不同的多核苦酸結(jié)合區(qū)段序列，并且所述第二模板區(qū)段與所述第一模板區(qū)段具有不同的模板區(qū)段序列。7.分離目的小多核苷酸的方法，其包括(a)提供權(quán)利要求1所述的一種或多種捕獲探針；(b)提供包含目的小多核苦酸的樣品，其中所述目的小多核苦酸選自miRNAs、snoRNAs、siRNAs或短干擾RNAs。(c)將所述捕獲探針與所述樣品合并；(d)將所述目的小多核苷酸與所述捕獲探針的小多核苷酸結(jié)合區(qū)段雜交以形成小多核菩^/捕獲探針復(fù)合物；(e)將所述小多核苦酸/捕獲探針復(fù)合物與能夠用RNA作為引物的多核苷酸聚合酶和一組三磷酸核苷酸合并；以及(f)延伸所述雜交的目的小多核香酸以形成延伸產(chǎn)物，所述延伸產(chǎn)物包括在3'端與延伸的區(qū)段連接的所述目的小多核苷酸、含有與所述捕獲探針的模板區(qū)段互補(bǔ)的序列的延伸的序列，其中所述延伸產(chǎn)物與所述捕獲探針雜交以形成延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述目的小多核苦酸是miRNA。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述捕獲探針還包含固相結(jié)合區(qū)段，并且通過將捕獲探針經(jīng)由所述固相結(jié)合區(qū)段結(jié)合到固體載體上，將所述小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物或所述延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物捕獲到固相。10.從樣品中檢測目的小多核苷酸的方法，所述方法包括(a)依照權(quán)利要求7所述的方法分離目的小多核苦酸，其中所述捕獲探針附著于熒光珠上，且所述延伸的區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的核苷酸殘基；以及(b)檢測所述熒光珠和與捕獲延伸探針雜交的標(biāo)記的延伸產(chǎn)物。11.檢測目的小多核苷酸的方法，其包括(a)依照權(quán)利要求7所述的方法分離目的小多核苦酸，其中所述捕獲探針的模板區(qū)段包含RNA聚合酶識別序列的一條鏈，且延伸步驟形成雙鏈RNA聚合酶啟動子；(b)將所述延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與識別雙鏈RNA聚合酶啟動子的RNA聚合酶合并；(c)轉(zhuǎn)錄啟動子下游的序列以合成包含小多核苷酸結(jié)合序列的單鏈RNA產(chǎn)物。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述捕獲探針的間隔區(qū)段包含RNA聚合酶終止位點(diǎn)。13.如權(quán)利要求11所述的方法，其還包括重復(fù)所述轉(zhuǎn)錄步驟一次或多次。14.用于4企測樣品中目的小多核苷酸的方法，包括(a)依照權(quán)利要求7分離所述目的小多核苷酸；(b)提供連接酶和接頭區(qū)段，所述接頭區(qū)段包含具有3'端和5'端的多核普酸，所述接頭區(qū)段具有接頭區(qū)段序列，其中所述接頭區(qū)段序列通過沃森-克里克堿基配對與間隔區(qū)段序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交；(c)使接頭區(qū)段與間隔區(qū)段雜交；(d)將接頭區(qū)段的3'端與所述目的小多核苷酸的5'端連接以形成與所述捕獲探針序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交的連接的延伸產(chǎn)物。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其還包括通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所述連接的延伸產(chǎn)物和所述捕獲探針。16.;險(xiǎn)測目的小多核苷酸的方法，其包括(a)提供雙標(biāo)記的檢測探針，其具有附著在檢測探針分子5'端的一種標(biāo)記、附著在一全測探針分子3'端的另一種標(biāo)記以及才全測探針序列，所述檢測探針序列與捕獲探針模板區(qū)段內(nèi)的檢測探針結(jié)合區(qū)段基本上互補(bǔ)且能與其雜交；(b)依照權(quán)利要求38分離目的小多核苷酸，其中(1)合并所述捕獲探針和樣品還包括將雙標(biāo)記的檢測探針添加到該合并物；(2)使所述檢測探針與所述捕獲探針或小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物的檢測探針結(jié)合序列雜交；(3)將具有5'至3'核酸外切酶活性的聚合酶和核苷酸混合物添加到雜交的檢測探針和小多核苷酸/捕獲探針復(fù)合物，以使所述檢測探針被所述多核苷酸聚合酶的5'至3'核酸外切酶水解；以及(4)檢測探針?biāo)夂?，檢測一種或多種標(biāo)記的熒光特性的變化。17.檢測目的小多核苷酸的方法，其包括(a)依照權(quán)利要求7分離目的小多核苷酸，其中(1)所述模板區(qū)段包含一個(gè)或多個(gè)序列，所述序列是雙鏈限制酶識別基序的一條鏈；以及(2)延伸步驟將包含于所述捕獲探針的模板區(qū)段內(nèi)的單鏈限制酶識別序列轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈限制酶識別序列；(b)提供識別并作用于延伸的區(qū)段的限制酶識別序列的限制酶；(c)將所述限制酶與所述限制酶識別序列接觸；(d)在所述延伸的區(qū)段的限制酶識別序列處或其附近使所述延伸產(chǎn)物產(chǎn)生切口，以產(chǎn)生包含目的小多核苷酸的3'端片段和5'端帶切口的延伸片段；以及(e)移出和沖企測所述帶切口的延伸片段。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述限制酶識別基序由切口核酸內(nèi)切酶識別。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述模板區(qū)段的限制酶識別基序包含一個(gè)或多個(gè)核苦酸類似物，所述類似物使所述^^莫板區(qū)段的限制酶識別基序抵抗所述限制酶的核酸內(nèi)切酶活性。20.如權(quán)利要求17所述的方法，其還包括用聚合酶延伸所述包含雜交的目的小多核苷酸的3'端片段，以復(fù)原所述限制酶識別基序并移出5'端帶切口的延伸片段。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中(a)所述捕獲探針的模板區(qū)段包含第一限制位點(diǎn)和第二限制位點(diǎn)，其中所述第一限制位點(diǎn)不同于所述第二限制位點(diǎn)；(b)所述延伸步驟將所述第一限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槟茉谘由斓膮^(qū)段而不是模板區(qū)段上被產(chǎn)生切口的雙鏈限制酶識別序列，并且將所述第二限制位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槟茉谘由斓膮^(qū)段而不是模板區(qū)段上被產(chǎn)生切口的第二雙鏈限制識別序列；(c)產(chǎn)生切口的步驟包含將所述延伸產(chǎn)物/捕獲探針復(fù)合物與識別并作用于所述第一限制位點(diǎn)的切口劑接觸，以使所述延伸產(chǎn)物在所述延伸區(qū)段的第一限制位點(diǎn)處或其附近被選擇性地產(chǎn)生切口，以產(chǎn)生帶切口的延伸片段；以及(d)所述檢測步驟包含(1)提供雙標(biāo)記的檢測探針，其與帶切口的延伸片段互補(bǔ)并能與其雜交；(2)將所述探針與所述帶切口的延伸片段雜交以形成雙鏈探針/帶切口的延伸片段復(fù)合物；(3)將所述雙鏈探針/帶切口的延伸片段復(fù)合物與能識別所述檢測探針序列并使其產(chǎn)生切口的的切口劑接觸；以及(4)檢測與使所述雙標(biāo)記的檢測探針產(chǎn)生切口相關(guān)的熒光變化。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一限制酶識別基序由切口核酸內(nèi)切酶識別。23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述模板區(qū)段的第二限制酶識別基序包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物，其使所述模板區(qū)段的限制酶識別基序抵抗限制酶的核酸內(nèi)切酶活性。24.如權(quán)利要求17所述的方法，其中(a)所述模斧反區(qū)l殳還包含一個(gè)或多個(gè)與DNAzyme基序互補(bǔ)的DNAzyme互補(bǔ)序列、第一側(cè)翼區(qū)段和第二側(cè)翼區(qū)段，所述第一側(cè)翼區(qū)段位于所述DNAzyme互補(bǔ)序列的5'端側(cè)面，且所述第二側(cè)翼區(qū)段位于所述DNAzyme互4卜序列的3，端側(cè)面；(b)帶切口的延伸區(qū)段的移出提供了功能性DNAzyme，其能夠在DNAzyme切割位點(diǎn)與合適的底物探針雜交并將其切割；(c)所述檢測步驟還包括(1)提供包含RNA多核苷酸或嵌合的RNA/DNA多核苷酸的合適的底物探針，所述底物探針具有結(jié)合到所述底物探針分子的5'端的一種標(biāo)記以及結(jié)合到所述底物探針的3'端的另一種標(biāo)記，所述底物探針包含具有第一底物探針序列的第一底物探針區(qū)段、DNAzyme切割位點(diǎn)和具有第二底物探針序列的第二底物探針區(qū)段，其中所述底物探針的第一底物探針序列與所述^t板區(qū)段的第一側(cè)翼區(qū)段基本上相同，并且所述第二底物探針序列與所述才莫板區(qū)段的第二側(cè)翼區(qū)段基本上相同；(2)將所述底物探針和所述帶切口的延伸片段接觸，以便在帶切口的延伸區(qū)段上，通過所述第一底物探針序列和包含在所述帶切口的延伸片段內(nèi)的互補(bǔ)序列之間以及所述第二底物探針和包含在所述帶切口的延伸片段內(nèi)的互補(bǔ)序列之間的沃森-克里克堿基配對，形成包含DNAzyme基序的環(huán)結(jié)構(gòu)；(3)在DNAzyme切割位點(diǎn)切割所述底物探針；以及(4);險(xiǎn)測與切割底物探針相關(guān)的熒光變化。25.分離和檢測小多核苷酸的試劑盒，所述試劑盒包含(a)權(quán)利要求1的捕獲探針的等摩爾混合物；(b)選自下述的一種或多種物質(zhì)(2)包含三磷酸脫氧核糖核苷或三磷酸核糖核苷的核苷酸混合物；(3)聚合酶；(4)抗生蛋白鏈菌素包被的順磁珠；(5)—種或多種雙標(biāo)記的檢測探針，所述檢測探針具有與所述捕獲探針的模板區(qū)段內(nèi)的檢測探針結(jié)合序列基本上互補(bǔ)且能與其雜交的檢測探針序列；(6)連接酶；(7)寡核香酸接頭，其與所述捕獲探針的間隔區(qū)段基本上互補(bǔ)且能與其雜交；以及全文摘要適用于分離、標(biāo)記或檢測小多核苷酸的方法的捕獲探針。用于從樣品中分離目的小多核苷酸的方法，其包括將所述小多核苷酸與所述捕獲探針雜交并通過引物延伸或連接作用延長所述小多核苷酸。分離后，通過引物延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增和/或雜交以及隨后的雙標(biāo)記檢測探針切割來檢測目的小多核苷酸的方法。文檔編號C07H21/04GK101528763SQ200780031976公開日2009年9月9日申請日期2007年8月30日優(yōu)先權(quán)日2006年8月30日發(fā)明者克里斯蒂·E·旺布爾,艾利爾特·P·道森申請人:生物風(fēng)險(xiǎn)公司