專利名稱：：一種重組人胰島素及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組人胰島素及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種重組人胰島素及其編碼基因與其在制備治療I型糖尿病的乳酸菌口服疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰島素(Insulin,INS)是一種重要的內(nèi)分泌激素，是引起自身免疫疾病I型糖尿病(T1DM)的主要自身抗原?，F(xiàn)階段T1DM并無有效的預(yù)防手段，且發(fā)病者只能通過一日三次注射胰島素來保持血糖穩(wěn)定。有研究表明通過給T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obesediabetic,NOD)小鼠口服胰島素能減輕或延緩其發(fā)病過程，其機(jī)制是抗原通過黏膜的Peyer's區(qū)吸收，從而激活免疫系統(tǒng)，之后與耐受性相關(guān)的效應(yīng)T細(xì)胞被激活，引發(fā)口服耐受性，從而保護(hù)胰島素不被損傷(WeinerHLOraltolerance:immunemechanismsandthegenerationofTh3-typeTGF-beta-secretingregulatorycells.MicrobesandInfection,2001,3:947-954)。但是如果直接口服抗原，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在胃腸道里的降解，會(huì)明顯影響抗原的生物利用率。而乳酸菌是一類被普遍認(rèn)為安全的生物體,在食品行業(yè)中已得到廣泛的應(yīng)用，可以作為一種合適的表達(dá)胰島素的基因工程載體。而現(xiàn)在胰島素的生產(chǎn)是通過基因工程大量表達(dá)，純化，溴化氰裂解，變性，復(fù)性等多個(gè)步驟，工藝繁瑣。因此有必要采用新方法進(jìn)行給藥。.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組人胰島素及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的重組人胰島素，名稱為R-INS，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有人胰島素功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列1由59個(gè)氨基酸殘基組成。為了使(a)中的R-INS分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號(hào)肽序列，為了(a)中的R-INS便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的R-INS可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的R-INS的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNa:2的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端連上信號(hào)肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述重組人胰島素的編碼基因(y-/7V50也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。鑒于密碼子的兼并性和乳酸菌對(duì)氨基酸密碼子的偏向性，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了含乳酸菌偏愛密碼子的重組人胰島素的編碼基因，可使重組人胰島素基因的在乳酸菌中表達(dá)。所述重組人胰島素的編碼基因，是優(yōu)化的重組人胰島素基因，具體可為如下l)、2)或3)的基因1)序列表中SEQIDN2:2的自5'端第卜177位核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDNa:l蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQIDNS:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件可為在O.1XSSPE(或0.IXSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。序列表中序列2是由180個(gè)脫氧核苷酸組成，自5'端第1-177位核苷酸序列為編碼序列，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列，自5'端第178-180位核苷酸序列為終止密碼子。含有上述重組人胰島素基因的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述重組人胰島素基因的工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述工程菌是將上述的重組人胰島素的編碼基因通過原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到乳酸菌中，篩選得到的可表達(dá)上述重組人胰島素工程菌。所述重組人胰島素的編碼基因的5'端還連接有方便編碼的蛋白在所述工程菌的細(xì)胞壁中表達(dá)的信號(hào)肽基因。所述乳酸菌為干酪乳桿菌(7acto&cj7J〃scase。ATCC27092或乳酸乳球菌(73c"cocciA7ac"50MG1363，優(yōu)選為干酷乳桿菌(Ja"o/A3"7JiAScasei)ATCC27092。所述信號(hào)肽基因?yàn)镾Pu^信號(hào)肽基因；所述表達(dá)的權(quán)利要求1所述重組人胰島素以權(quán)利要求l所述重組人胰島素和SPu一信號(hào)肽的融合蛋白的形式在所述工程菌的細(xì)胞壁中表達(dá)；所述SPu一信號(hào)肽基因的核苷酸序列是GENBANK號(hào)為M60178的自5'端第101—214位核苷酸序列；所述信號(hào)肽基因的5'端還連接有組成型表達(dá)啟動(dòng)子。所述原核表達(dá)載體優(yōu)選為pSW501。含有上述工程菌的藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述藥物可為預(yù)防和\或治療糖尿病，特別是預(yù)防和\或治療I型糖尿病的菌劑。所述藥物可作為治療I型糖尿病的口服疫苗，服用劑量可為KT-lO^cfu/次/60kg，每周一次。本發(fā)明的重組人胰島素基因，通過密碼子優(yōu)化，可在乳酸菌中表，終重組人胰島素。本發(fā)明的重組人胰島素在天然人胰島素的A，B鏈序列之間引入連接肽(RRSPNGKR)利于形成(5轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，重組蛋白模擬的空間結(jié)構(gòu)與天然胰島素結(jié)構(gòu)非常相似，實(shí)驗(yàn)證明該蛋白具有胰島素活性，可以與胰島素多克隆抗體特異性結(jié)合。.實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的含有重組人胰島素基因的工程菌能在腸道內(nèi)存活48小時(shí)以上，刺激NOD小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重組人胰島素特異性抗體，使與免疫耐受相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4水平明顯升高，誘導(dǎo)免疫耐受產(chǎn)生。表明，本發(fā)明的含有重組人胰島素基因的工程菌，對(duì)于非肥胖糖尿病的治療具有很好的效果。本發(fā)明的工程菌制成菌劑作為治療非肥胖糖尿病的口服疫苗，沒有繁瑣的后加工過程，只需經(jīng)過簡(jiǎn)單的離心或其它常規(guī)加工即可得到，具有良好的應(yīng)用前景。圖1為人胰島素基因和改造的重組人胰島素基因序列分析圖2為重組人胰島素基因乳酸菌表達(dá)載體pSW501和對(duì)照載體pSW509的構(gòu)建示意3為工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501表達(dá)胰島素的Western-blot圖圖4為工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501表達(dá)胰島素濃度篩選的Western-blot5為NOD小鼠血清中SPUsp45-R-INS特異性抗體的分析結(jié)果圖6為NOD小鼠血清中IL-4水平檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，所述百分含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、重組人胰島素基因及表達(dá)其的工程菌的獲得1、重組人胰島素基因的合成根據(jù)乳酸菌偏愛密碼子在人胰島素基因序列中替換37個(gè)堿基對(duì)，并在其A，B鏈序列之間加入連接肽(RRSPNGKR)的編碼序列5'-CGTAGATCTCCTAATGGAAAACGT-3，，RR和KR為胰島素原C肽兩端的氨基酸，SPNG利于形成p轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，重組蛋白模擬的空間結(jié)構(gòu)與天然胰島素結(jié)構(gòu)非常相似。根據(jù)其正負(fù)鏈序列設(shè)計(jì)八條拼接引物(表2所示，表2中l(wèi)-4為正鏈的拼接引物，5-8為負(fù)鏈的拼接引物)，用T4磷酸激酶加上5，-Pi，再加熱至95t:，緩慢退火至室溫，連接過夜，以退火產(chǎn)物為模板，用引物P1和P2(P1:CAGTCGACTTTGTCAACCAACATTTATGTG;P2:GCGATATCTTAGTTACAGTAGTTCTCA"AGTTG)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為lOOyl;反應(yīng)程序?yàn)橄?4°C5min;在94"Clrain，57°Clmin，72°C45s,30次循環(huán)；最后72°C5min。擴(kuò)增得到180bp目的片段，將PCR產(chǎn)物用100%乙醇沉淀，70%洗滌后，室溫晾干使乙醇揮發(fā)干凈，溶于重蒸水中，經(jīng)過DNA純化試劑盒純化后，取4ul在16X:及連接酶作用下連接16hr至pMD18-T(Takara公司)上，進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序表明，上述擴(kuò)增的片段具有序列表中序列2的核苷酸片段，自序列表中序列2的5'的第1-177位脫氧核苷酸序列為編碼序列，第178-180位為終止密碼子序列，該片段即為重組人胰島素基因，將其命名為v-/^，其編碼的蛋白為R-INS。將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含有氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行重組子的篩選，挑取具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，通過堿裂解法制備質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過酶切和PCR鑒定，將鑒定結(jié)果表明含有上述重組人胰島素基因的重組載體命名為pSW101,重組人胰島素與胰島素基因中有37個(gè)堿基不同(圖l，圖1中1為人胰島素基因序列r2為替換乳酸菌偏愛密碼子的重組人胰島素基因)，與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列完全相符。表2.拼接引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建(載體構(gòu)建示意圖如圖2所示)1)胰島素基因的中間載體pSW201的構(gòu)建以pSW101為模板，以合成的胰島素基因序列設(shè)計(jì)引物(P1和P2)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物序列PI:CAGTCGACTTTGTCAACCAACATTTATGTG(WI);P2:GCGATATCTTAGTTACAGTAGTTCTCAAGTTG(fc。RV)反應(yīng)體系為100ul;反應(yīng)程序?yàn)橄?4°C5min;在94t:lmin，57°Clmin，72°C45s，30次循環(huán)；最后72。C5min。，反應(yīng)結(jié)束后取2y1PCR產(chǎn)物迸行瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測(cè)在l'80bp處有一條明顯的條帶，其分子量大小與預(yù)測(cè)重組人胰島素基因的大小一致，經(jīng)測(cè)序表明該片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。將PCR產(chǎn)物用100%乙醇沉淀，70%洗滌后，室溫晾干使乙醇揮發(fā)干凈，溶于重蒸水中，將PCR片段用6^7I和V雙酶切后得到的片段，與5"s7I和fcoA"V雙酶切后并經(jīng)過純化的含有組成型P59啟動(dòng)子(具有類似自GENBANK號(hào)為M24806的5'端第1—180位的核苷酸序列，實(shí)際序列為序列表中序列3所示的核苷酸序列)、觀s一信號(hào)肽基因(具有自GENBANK號(hào)為M60178的5'端第101—214位的核苷酸序列)的大腸桿菌乳酸菌穿梭載體pVE5523(按照文獻(xiàn)DieyeY,UsaiS，ClierFetal.Designofaprotein-targetingsystemforlacticacidbacteria.J"Bacteriol,2001，183(14):4157-4166所述的方法構(gòu)建)連接，在16。C在連接酶作用下連接16hr。連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，用氨芐青霉素篩選得到轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過酶切、PCR以及DNA測(cè)序驗(yàn)證，將經(jīng)驗(yàn)證表明含有P59啟動(dòng)子、5A一信號(hào)肽和上述重組人胰島素基因的重組載體命名為pSW201。核苷酸序列分析也表明pSW201含有包括組成型P59啟動(dòng)子、s;^45信號(hào)肽基因和胰島素基因的正確基因序列及閱讀框架。2)胰島素基因乳酸菌表達(dá)載體pSW501的構(gòu)建以pSW201為模板，設(shè)計(jì)使用P3，P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增包含組成型P59啟動(dòng)子、^L一信號(hào)肽基因和重組人胰島素基因P3:CAGAATTCCGGTATCGATAGCCCGCCTAAT(fc。RI)P4:GCTCTAGATTAGTTACAGTAGTTCTCAAGTTG(J/baI)反應(yīng)體系為100nl;反應(yīng)程序?yàn)橄?4°C8min;在94°Clmin，57°Clmin，72°C45s，30次循環(huán)；最后72。C5min。將PCR產(chǎn)物，用JteI酶切，純化后與先用I酶切，平端化后再用WsI酶切并純4七的pMG36e(按照文獻(xiàn)vandeGuchteM，vanderVossenJM，KokJetal.Constructionofalactococcalexpressionvector:expressionofheneggwhitelysozymeinLactococcuslactissubsp.lactis.ApplEnvironMicrobiol.1989，55(1):224-228所述的方法構(gòu)建)在16'C連接16hr，連接物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(購自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)，用紅霉素篩選得到轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過酶切、PCR以及DNA測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證表明正確的含有組成型P59啟動(dòng)子、5^-信號(hào)肽基因和重組人胰島素基因的pMG36e重組表達(dá)載體pSW501。用Ss7I和JteI酶切pSW501，平端化后在16'C連接16hr，連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用紅霉素篩選得到轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過酶切和PCR驗(yàn)證，得到不含有人胰島素基因的對(duì)照載體pSW509。3、可表達(dá)胰島素的工程菌的獲得及其表達(dá)培養(yǎng)1)可表達(dá)胰島素的工程菌的獲得將2uLpSW501加到50uL冰預(yù)冷的乳酸乳球菌(7ac&cocci^7acfMG1363(購自NIZ0foodresearchBV，Netherland)感受態(tài)細(xì)胞中混勻，將混合物加入到2mm的無菌電擊杯中進(jìn)行電擊。電擊條件為2500V1800VU/b.c^e/ATCC27092)，400Q，25uF。之后迅速加入lmLSGM17復(fù)蘇液混勻，3CTC復(fù)蘇2-3h，用含有紅霉素的GM17平板進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過PCR驗(yàn)證，證明pSW501已轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG1363中，將鑒定表明含有pSW501的乳酸乳球菌MG1363工程菌命名為MG1363-pSW501。將pSW501轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌(hcfoZ^ci"〃5"casei)ATCC27092(美國(guó)菌種保藏中心，保藏編號(hào)ATCC27092)，轉(zhuǎn)化方法與乳酸乳球菌MG1363轉(zhuǎn)化方法除下述條件，其它步驟均相同電擊條件為1800V，400Q，25uF。復(fù)蘇液使用lmLMRS+0.5MSucrose,用含有紅霉素的MRS平板進(jìn)行篩選鑒定，將鑒定表明含有pSW501的干酪乳桿菌ATCC27092工程菌命名為ATCC27092-pSW501。對(duì)照質(zhì)粒pSW509的轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化子鑒定同上，將鑒定表明含有pSW509的乳酸乳球菌MG1363工程菌命名為MG1363-pSW509，將鑒定表明含有pSW509的干酪乳桿菌ATCC27092工程菌命名為ATCC27092-pSW509。2)可表達(dá)胰島素的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)將工程菌MG1363-pSW501或MG1363-pSW509分別接種至裝有3mlGM17液體培養(yǎng)基(每升中含有蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母提取物2.5g，葡萄糖5g,e-磷酸甘油二鈉，19g，維生素C0.5g，lMMgS04lral，加適量水溶解，定容至1000ml，固體培養(yǎng)基加1.2%瓊脂。MRS培養(yǎng)基酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸氫二銨2g，MgS(V7H200.58g，K2HP042g，MnS(V4H200.25g，NaAc5g，Tween-801ml)試管中3(TC靜置過夜后，按體積百分含量為1%接種量(107cfu/ml)接種于裝有20mlGM17液體培養(yǎng)基試管中，30。C靜置培養(yǎng)至ODe。。至0.4-0.7之間。將ATCC27092-pSW501或ATCC27092-pSW509分別用MRS培養(yǎng)基(每升中含有酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸氫二銨2g，MgS(V7H200.58g，K2HP042g，MnS(V4H200.25g,NaAc5g，Tween-801ml)，按照上述工程菌MG1363-pSW501或MG1363-pSW509的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)至OD6oo至0.4-0.7之間。分別離心收集菌體和培養(yǎng)基上清。分別取培養(yǎng)基上清1.6ml，加入0.4ml濃度為0.8g/ml的三氯乙酸溶液，冰上靜置20min，離心后沉淀用40uL50n|M'NaOH溶液溶解，制得上清濃縮物。分別將收集的菌體超聲破碎后，在4'C下21000g離心45min，沉淀用TES溶液(含有10ramol/LTris-HC1、1mmol/LEDTA和0.005g/mlSDS的溶液)溶醉，得到細(xì)胞壁組分，上清為細(xì)胞質(zhì)組分。分別將得到的工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501、MG1363-pSW509或ATCC27092-pSW509的三個(gè)組分(培養(yǎng)液上清液、細(xì)胞壁組分、細(xì)胞質(zhì)組分)進(jìn)行抗原鑒定。具體方法如下所示表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定SDS-PAGE采用Tricine電泳系統(tǒng)，16.5%濃度的分離膠。分別取上述工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501、MG1363-pSW509(工程菌MG1363-pSW501的陰性對(duì)照)或ATCC27092-pSW509(工程菌ATCC27092-pSW501的陰性對(duì)照)的三個(gè)組分(培養(yǎng)液上清液、細(xì)胞壁組分、細(xì)胞質(zhì)組分)樣品各lOiil，加入樣品緩沖液IOul(100,1/LTris-HCl，pH6.8，200mmol/lDTT，4%SDS，0,2%溴酚藍(lán)，20%甘油)，水浴煮沸3min，20ul全部點(diǎn)到上樣孔中。以人胰島素(購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，貨號(hào)140633)為陽性對(duì)照，人胰島素與小分子量標(biāo)準(zhǔn)用同樣的方法處理點(diǎn)樣。用7mA穩(wěn)流電泳約2hr后，調(diào)電流至15mA，約6hr后停止電泳。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，凝膠不進(jìn)行染色，用于Western-blot。將膠用蒸餾水沖洗凝膠，再將凝膠在電轉(zhuǎn)移液(10mMCAPS，pHll,20%甲醇)中浸潤(rùn)，用電轉(zhuǎn)移的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移在冰浴中進(jìn)行，電流100niA過夜。轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜在封閉液(質(zhì)量百分含量為5%的脫脂奶粉溶液，用PBS(NaCl137mmol/L，KC12.7mmol/L，Na2HP044.3mmol/L，KH2P041.4腦1/L，pH7.4)配制)中室溫封閉lhr，用PBS洗膜三次，每次8min;然后在室溫下與一抗(胰島素多克隆抗體，購自中國(guó)原子能科學(xué)研究院)溶液保溫lhr，用PBS洗膜三次，每次8min;與二抗溶液(抗豚鼠抗抗體，購自北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心，貨號(hào)E18))37'C保溫lhr;用PBST(PBS+0.0001g/ml的Tween20)洗膜三次，每次8rain;將膜與化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑室溫孵育3min后封入保鮮膜，壓入膠片曝光顯影。Western-blot結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，只有工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的細(xì)胞壁樣品，在10800Da大小處出現(xiàn)一特異的雜交條帶，為胰島素與信號(hào)肽SP一45的融合蛋白，而且其抗原特異性較好，表明重組工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的胰島素表達(dá)產(chǎn)物存在于細(xì)胞壁上。而工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的培養(yǎng)液上清液和細(xì)胞質(zhì)組分，以及對(duì)照工程菌MG1363-pSW509和ATCC27092-pSW509的三種組分均沒有特異的雜交條帶。圖3中A為乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501;B.干酪乳桿菌ATCC27092-pSW501;A和B中，R-INS為胰島素對(duì)照，P為細(xì)胞質(zhì)組分，SN為培養(yǎng)液上清濃縮物，Cwi/細(xì)胞壁組分，P'，SN，，CW':分別為P，SN，CW的陰性對(duì)照的細(xì)胞質(zhì)組分、培養(yǎng)液上清濃縮物，和細(xì)胞壁組分。3)可表達(dá)胰島素的工程菌的表達(dá)濃度的篩選工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的培養(yǎng)方法同步驟2)，其中用MRS液體培養(yǎng)基替代GM17液體培養(yǎng)基，具體方法如下將工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501分別接種至裝有3mlMRS液體培養(yǎng)基(每升中含有酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，檸檬酸氫二銨2g，MgSO7H200.58g，K2HP042g，MnS04*4H200.25g，NaAc5g，Tween-801ml)或GM17液體培養(yǎng)基(工程菌MG1363-pSW501用GM17液體培養(yǎng)基，ATCC27092-pSW501用MRS液體培養(yǎng)基)試管中3(TC靜置過夜后，按體積百分含量為1%接種量(107cfu/ml)接種于裝有20mlMRS液體培養(yǎng)基或GM17液體培養(yǎng)基(工程菌MG1363-pSW501用GM17液體培養(yǎng)基，ATCC27092-pSW501用MRS液體培養(yǎng)基)試管中，3(TC靜置培養(yǎng)。按照上述培養(yǎng)方法分別培養(yǎng)工程菌MG1363-pSW501，得到OD,為0.126，0.225,0.452，0.887，1.115和1.326的工程菌MG1363-pSW501培養(yǎng)液，培養(yǎng)工程菌ATCC27092-pSW501得到0D,為0.316，0.413，0.433，0.613,0.833和1.158工程菌ATCC27092-pSW501培養(yǎng)液；在上述不同濃度工程菌MG1363-pSW501培養(yǎng)液中分別取5><109個(gè)工程菌MG1363-pSW501細(xì)胞，在上述不同濃度工程菌ATCC27092-pSW501培養(yǎng)液中分別取109個(gè)工程菌ATCC27092-pSW501細(xì)胞；按照步驟2的方法，分別提取細(xì)胞壁組分，分別進(jìn)行Western-blot檢測(cè)；結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明工程菌MG1363-pSW501和ATCC27092-pSW501都是在0D6。。為0.4左右時(shí)表達(dá)量最高，之后逐漸下降，說明它們均在生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期表達(dá)量較高。而且表達(dá)產(chǎn)物在干酪乳桿菌工程菌ATCC27092-pSW501中不僅表達(dá)時(shí)間要長(zhǎng)于乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501，而且表達(dá)量也明顯高于乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501。圖4中A為工程菌MG1363-pSW501，5xl()9個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁組分;其中泳道1-6分別為ODs。。為0.126，0.225，0.452，0.887,1.115和1.326的工程菌MG1363-pSW501培養(yǎng)液中取的細(xì)胞壁組分的結(jié)果；圖4中B為工程菌ATCC27092-pSW501，109個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁組分；其中泳道1-6分別為OD,為0.316，0.413,0.433，0.613,0.833和1.158工程菌ATCC27092-pSW501培養(yǎng)液中取的細(xì)胞壁組分的結(jié)果。—實(shí)施例2、工程菌ATCC27092-pSW501作為口服疫苗的動(dòng)物效果實(shí)驗(yàn)1、工程菌ATCC27092-pSW501活菌的培養(yǎng)收集將工程菌ATCC27092-pSW501接種至按體積百分比1%(107cfu/ml)接種量接種于MRS培養(yǎng)基，3(TC靜置培養(yǎng)至OD,0.3-0.4。收集菌體作為非肥胖糖尿病(NOD)小鼠口服治療疫苗，以干酪乳桿菌ATCC27092按照同樣的方法培養(yǎng)至OD咖0.3-0.4，收集菌體做為對(duì)照。2、工程菌ATCC27092-pSW501對(duì)非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的口服效果實(shí)驗(yàn)4周齡非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)18只，將其隨機(jī)分為PBS組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各6只。PBS組用0.4mLPBS灌胃，對(duì)照組用步驟1收集的干酪乳桿菌ATCC27092菌體按1(T個(gè)細(xì)胞/只小鼠的量(用0.4mlPBS懸浮)灌胃，實(shí)驗(yàn)組用步驟l收集的含有胰島素基因的干酪乳桿菌工程菌ATCC27092-pSW501菌體按照1(T細(xì)胞/只小鼠的量(用0.4mlPBS懸浮)灌胃，第一周每天灌胃一次，此后每周一次。1)在NOD小鼠腸道內(nèi)的存活時(shí)間檢測(cè)從灌胃后第二天連續(xù)6天取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠糞便1顆，加lmL無菌水充分混勻，稀釋10倍后涂布于MRS平板培養(yǎng)基上，PCR鑒定是否有工程菌ATCC27092-pSW501或工程菌ATCC27092-pSW509存在。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組給小鼠口服工程菌后第一天，所有鼠的腸道內(nèi)均能檢測(cè)到工程菌的存在。口服后第二天，仍有大部分鼠腸道能檢測(cè)到工程菌，但第三天所有小鼠均檢測(cè)不到其的存在。該結(jié)果表明工程菌ATCC27092-pSW501和對(duì)照工程菌ATCC27092-pSW509均可在NOD小鼠腸道內(nèi)存活48h以上，和直接口服胰島素相比，工程菌能延長(zhǎng)胰島素在小鼠體內(nèi)的作用時(shí)間。具體結(jié)果如表2所示表2.工程菌ATCC27092-pSW501在NOD小鼠腸道內(nèi)的存活時(shí)間時(shí)間組別第l天第2天第3天實(shí)驗(yàn)組6/65/60/6對(duì)照組6/64/60/62)NOD小鼠血清中重組人胰島素(R-INS)特異性抗體的分析將步驟1收集的工程菌ATCC27092-pSW501菌體按照實(shí)施例1中步驟3中的方法提取細(xì)胞壁組分，將提取的細(xì)胞壁組分用TricineSDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。j將12周齡的對(duì)照組、PBS組、實(shí)驗(yàn)組小鼠各取3只小鼠的血清，以1:20稀釋(用封閉液稀釋，封閉液為質(zhì)量百分含量為5。^的脫脂奶粉溶液，用PBS配制)作為一抗，l:500稀釋的抗小鼠IgG-服P(購自北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心，貨號(hào)E18)作為二抗，分別與一張按上述方法制備的PVDF膜進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，具體方法按照實(shí)施例1步驟3中的步驟2)的方法進(jìn)行。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了帶有信號(hào)肽SP一,5的R-INS特異性的抗體，而其他兩組并未發(fā)現(xiàn)特異性抗體的存在。這表明，工程菌ATCC27092-pSW501可成功刺激N0D小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體。3)N0D小鼠血清中IL-4水平分析取喂養(yǎng)至12周齡的對(duì)照組、PBS組、實(shí)驗(yàn)組小鼠，每組取4只，每只取血0.3mL，37。C放置lh，4。C過夜，5000g離心5min制備血清。用小鼠IL-4ELISAKit(晶美生物工程有限公司，貨號(hào)FMK0005-96)檢測(cè)血清中IL-4的含量。用均數(shù)f檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，對(duì)照組血清中IL-4水平為31.917±0.417pg/mL，與PBS組29.167土1.448pg/mL相比有顯著差異(代0.05)，而實(shí)驗(yàn)組血清中IL-4水平為38.583±2.083pg/raL，與PBS組、對(duì)照組相比則有明顯升高(K0.05)(圖6)。作為免疫耐受相關(guān)的典型細(xì)胞因子IL-4的升高，表明工程菌ATCC27092-pSW501可促進(jìn)NOD小鼠免疫耐受的產(chǎn)生?！?60>3<210〉1<211>59〈212〉PRT<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉1PheValAsnGinHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr151015LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThrArgArg202530*''SerProAsnGlyLysArgGlylieValGluGinCysCysThrSerlie354045CysSerLeuTyrGinLeuGluAsnTyrCysAsn5055<210〉2<211〉180〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉<400>2tttgtcaaccg認(rèn)gtggatgttg肪c3atgCtgt3C3tCaacatttatgttttctatactggatcacatacctaagacawtctgttcattagtagaagcgtagatctcttgtatcaacctttgtatctCt犯tggElELELttgagaactatgtttgtggt3Cgtggtattctgtaactaa60120180〈210〉3<211〉184〈212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉<400>3cttttttttgatcccctaaccaaagaagcgcgtaatatcagggtttaagagacaataaga60aaaaaagattgaaaaagtgacattaaattcttgacagggagagataggtttgatagaata120taataggggtaccgagctcgaattcctgcagcccaaatcgcgaaaccg犯cttaatggga180ggaa權(quán)利要求1、一種重組人胰島素，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有人胰島素功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述重組人胰島素的編碼基因，具有如下l)、2)或3)所述的序列1)序列表中SEQIDN2:2的自5'端第1一177位核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDN2:l蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；3)在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQIDNa:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。3、含有權(quán)利要求2所述的重組人胰島素編碼基因的重組表達(dá)載體、工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的的工程菌，其特征在于所述工程菌是將重組人胰島素的編碼基因通過原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到乳酸菌中，篩選得到可表達(dá)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素的工程菌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的工程菌，其特征在于所述重組人胰島素的編碼基因的5'端還連接有方便編碼的蛋白在所述工程菌的細(xì)胞壁中表達(dá)的信號(hào)肽基因。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌，其特征在于所述乳酸菌為干酪乳桿菌(7acz^Z^w77"scasei)ATCC27092或乳酸乳球菌(hcf&)MG1363,優(yōu)選為干酪乳桿菌(7ac"teci"〃scasei)ATCC27092。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述信號(hào)肽基因?yàn)镾PUsp45信號(hào)肽基因；所述SP一信號(hào)肽基因的核苷酸序列是GENBANK號(hào)為M60178的自5'端第101—214位核苷酸序列；所述信號(hào)肽基因的5'端還連接有組成型表達(dá)啟動(dòng)子。8、權(quán)利要求1所述的重組人胰島素及其編碼基因在制備預(yù)防和/或治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求3—7中任意一項(xiàng)所述的工程菌在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖尿病為I型糖尿??；所述藥物為權(quán)利要求3—7中任意一項(xiàng)所述的工程菌為有效成分的口服疫苗。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組人胰島素及其編碼基因與應(yīng)用。該重組人胰島素，是如下所述的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有人胰島素功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組人胰島素在天然人胰島素的A，B鏈序列之間引入連接肽利于形成β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，重組蛋白模擬的空間結(jié)構(gòu)與天然胰島素結(jié)構(gòu)非常相似，具有胰島素活性。本發(fā)明的含有重組人胰島素基因的乳酸菌工程菌能在腸道內(nèi)存活48小時(shí)以上，刺激NOD小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重組人胰島素特異性抗體，使與免疫耐受相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4水平明顯升高，誘導(dǎo)免疫耐受產(chǎn)生。文檔編號(hào)C07K14/62GK101148473SQ20071012145公開日2008年3月26日申請(qǐng)日期2007年9月6日優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日發(fā)明者還連棟,瑾鐘,陳思維申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所