專利名稱：胰島素前體基因在酵母中的分泌表達(dá)和人胰島素的制備的制作方法
胰島素是由A、B兩條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)激素。在體內(nèi)，胰島素是以一條肽鏈形式被合成，稱前胰島素原(Preproinsulin)。在成熟過(guò)程中前胰島素原相繼被轉(zhuǎn)變?yōu)槿詾橐粭l肽鏈的胰島素原(Proinsulin)和胰島素(Steiner，D.F.et al.，F(xiàn)ec.Proc.Fed.Am.Soc.Exp.Biol.，1974，332105;Science，1967，157697.)。
胰島素作為治療糖尿病的特效藥物，用于臨床已有70多年了(Banting，F(xiàn).G.&Best，C.H.，J.Lab.Clin.Med.，1922，7251;Banting，F(xiàn).G.，et al.，Canadian Med.Associ.J.，1922，12141.)。由于糖尿病患者在世界人口中的比例相當(dāng)高，對(duì)胰島素的需求量很大，是臨床上用量最大的蛋白質(zhì)類藥物。因此，有關(guān)胰島素的生產(chǎn)和研究一直在吸引著人們的密切關(guān)注和濃厚興趣。在胰島素的生產(chǎn)方面，不僅表現(xiàn)在對(duì)傳統(tǒng)的生產(chǎn)技術(shù)的革新和改進(jìn)，而且不斷吸收和采用新的科技成果。重組DNA技術(shù)出現(xiàn)后，胰島素是最早被表達(dá)的蛋白質(zhì)之一(Ullrich，A.et al.，Science，1977，1961313;Crea，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，755764)?；蚬こ倘艘葝u素是第一個(gè)被投放市場(chǎng)的生物工程藥物，并正在取代著經(jīng)典的由家畜胰臟中抽提的動(dòng)物胰島素(Klausner，A.，Bio/Technology，1993，11S35.)。
有關(guān)胰島素的基因工程的報(bào)道很多，目前能用于生產(chǎn)胰島素的主要可歸納為以下三種類型其中有兩種類型是用大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的，即表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白的形式沉淀于細(xì)胞漿中(Goeddel，D.V.，et al.，Proc.Natl.Amer.Sci.USA，1979，76106;Chance，R.E.，etak.，PeptideSynthesis-Structure-Function，1981，ed.D.H.Rich&E.Gross，pp.721-728，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL;Chance，R.E.，et al.，Diabetes Care，1981，4147.)，或者是通過(guò)信號(hào)肽將表達(dá)產(chǎn)物分泌到菌體外周空間(Talmadge，K.，et al.，Proc.Natl.Amer.Sci.USA，1980，773988;Chan，S.J.，et al.，Proc.Nalt.Amer.Sci.USA，1981，785401)。第三種類型是用酵母系統(tǒng)，使表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)細(xì)胞壁分泌到培養(yǎng)基中(Markussen，J.，et al.，Diabetologia，1986，29568A;Thim，L.，et al.，Proc.Nalt.Amer.Sci.USA，1986，836766;Markussen，J.，et al.，Protein Engineering，1987，1215)。所得表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)不同的加工處理，最后得到基因工程胰島素。與本發(fā)明最為接近是Markussen的工作，其專利和有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道為Markussen，J.，et al(1985)，European Patent O 427 296 Al.Markussen，J.，et al(1987)，Protein Engineering 1，(3)215.Markussen，J.，et al(1986)，Peptides 1986，Walter de Gruyter & CO;Berlin-New York，pp189-194.
本發(fā)明是用酵母分泌表達(dá)化學(xué)合成的豬單鏈胰島素前體(PSCI)基因，然后在體外通過(guò)轉(zhuǎn)肽方法將PSCI轉(zhuǎn)變?yōu)槿艘葝u素。PSCI為豬B1-30-Xn-Y-豬A1-21或豬B1-29-Wn-Xn-Y-豬A1-21，其中W和X為除Lys或Arg以外的任一天然氨基酸，Y為L(zhǎng)ys或Arg，n＝1-15。
用于轉(zhuǎn)化酵母的質(zhì)粒由質(zhì)粒pVT(Vernet，T.，et al.，Gene，1987，52225)組建而成。PSCI基因用DNA合成儀合成，編碼酵母α交配因子前導(dǎo)序列(α-MFL)的DNA片段，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以酵母總DNA為模板復(fù)制獲得。將PSCI基因和α-MFL的DNA片段連接后，插入到質(zhì)粒pVT102-U中的醇脫氫酶1的啟動(dòng)子(ADHp)和3'端終止序列之間的多克隆部位，構(gòu)建成分泌表達(dá)質(zhì)粒pVT102-U/α-MFL-PSCI。進(jìn)一步，用磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(PGKp)代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp，得到了另一個(gè)分泌表達(dá)質(zhì)粒pPGK/PSCI。選用釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B)，同上述質(zhì)粒構(gòu)建成工程菌種，酵母菌Saccharomyces cerevisiae YS90，PVT102U/α-MFL-SCI(XV-700-6B)(CCTCC NOM93050)和醇母菌Saccharomyces cerevisiae YS91，pPGK/SCI(XV-700-6B)，(CCTCC NOM93051)(保藏在中國(guó)·武漢·武漢大學(xué)校內(nèi)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。用構(gòu)建的工程菌培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了PSCI在酵母中的高分泌表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到40-50mg/L，并建立了簡(jiǎn)便的分離純化表達(dá)產(chǎn)物的方法。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化和轉(zhuǎn)肽得到15-20mg/L結(jié)晶人胰島素，其氨基酸組成和序列與人胰島素相符，受體結(jié)合能力和生物活力與天然豬胰島素相同。
本發(fā)明的技術(shù)特征在下述的實(shí)施例中作具體描述。
本發(fā)明的附圖作以下說(shuō)明

圖1.α-MFL DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.ψX174的HaeⅢ酶解片段。
2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.4.純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.pBR322的HaeⅢ酶解片段。
溴乙啶染色。
圖2.pVT102U/α-MFL-PSCI轉(zhuǎn)化子的原位雜交。
圖3.質(zhì)粒pVT102U/α-MFL-PSCI的構(gòu)建。
圖4.1.4%的瓊脂糖電泳1.ψ×174的HindⅢ酶切片段;
2.以酵母總DNA為模板擴(kuò)增的PGKp，主要條帶約為620bp(片段1)。
圖5.酶切片段的1%瓊脂糖電泳1.λ-DNA的HindⅢ酶切片段;
2.pVT102-U/αMFL-PSCI的EcoRI+SphI酶切片段;
3.pVT102-U/αMFL-PSCI的EcoRI+BamHI酶切片段。
圖6.質(zhì)粒pRGK/PSCI的構(gòu)建。
圖7.點(diǎn)雜交的放射自顯影圖。
A以Primer S作探針;
B以PSCI片段作探針。
圖8.pVT102-U/αMFL-PSCI和pPGK/PSCI酶切片段的1%瓊脂糖電泳圖。
1.分子量標(biāo)準(zhǔn)pBR328 DNA·BglI+pBR322 DNA·HinfI;
2.pVT102-U/αMFL-PSCI的SphI酶切片段;
3.pPGK/PSCI的SphI的酶切片段;
4.pVT102-U/αMFL-PSCI的SphI+BamHI酶切片段;
5.pPGK/PSCI的SphI+BamHI酶切片段;
6.質(zhì)粒pVT102-U/αMFL-PSCI。
圖9.PSCI的Sephadex G-50(2.6×150cm)凝膠過(guò)濾。
圖10.PSCI的PAGE圖譜。
a.PSCI;
b.豬胰島素。
圖11.PSCI結(jié)晶(乙醇系統(tǒng))。
圖12.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)6小時(shí)混合物HPLC圖譜峰1(18.29分)，PSCI峰2(19.95分)，DAI;
峰3(26.24分)，[B30ThrOBut]hIns。
圖13.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)混合物PAGE圖譜a.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)0時(shí);b.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)2小時(shí);c.[B30ThrOBut]hIns和豬1ns混合物;d.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)4小時(shí);e.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)6小時(shí)。
圖14.[B30ThrOBut]hIns經(jīng)TFA處理后HPLC圖譜。
圖15.[B30ThrOBut]hIns經(jīng)TFA處理后PACE圖譜。
a.PSCI;b.轉(zhuǎn)肽反應(yīng)混合物;c.[B30ThrOBut]hIns;d.hIns;e.[B30ThrOBut]hIns和豬1ns混合物。
圖16.人胰島素結(jié)晶。
圖17.基因工程人胰島素和豬胰島素與人胎盤(pán)細(xì)胞膜胰島素受體的結(jié)合曲線。
實(shí)施例1.單鏈胰島前體基因PSCI分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.菌種、噬菌體、質(zhì)粒和克隆步驟克隆步驟按常規(guī)方法進(jìn)行(Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nded，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。大腸桿菌JM103在2YT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌在含有氨芐青霉素(Ap，100μg/ml)的2YT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。穿梭質(zhì)粒pVT102-U(Vernet，T.，et al.，Gene，1987，52225)為T(mén)hierry Vernet所贈(zèng)。輔助噬菌體R408為MichaelSmith所贈(zèng)。酵母菌XV700-6B(Leu-2，Ura-3，pep-4，Michael Smith所贈(zèng))在YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中培養(yǎng)，并用氯化鋰方法轉(zhuǎn)化(Broker，M.，BioTechniques，1987，5516)。轉(zhuǎn)化子在含2%瓊脂、0.67%酵母氮源、2%葡萄糖、氨基酸(每種200μg/ml)、腺嘌呤(50μg/ml)和肌醇(200μg/ml)的培養(yǎng)基上選擇。將轉(zhuǎn)化的酵母菌接種在YPD培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)。
2.分泌表達(dá)質(zhì)粒pVT102-U/α-MFL-PSCI的構(gòu)建
(1).用基因擴(kuò)增法(PCR)制備編碼α-MFL的DNA片段及其在大腸桿菌中的克隆PCR(Mullis，K.B.&Faloona，F(xiàn).A.，Methods in Enzymolgy，1987，155335)以手工方法在不同溫度的三個(gè)水浴中進(jìn)行。100μl的緩沖液中含10mM的四種脫氧核苷三磷酸各5μl，膜板DNA 1μg和兩種引物各10-50pmole，將上述溶液在100℃加熱五分鐘，然后在45℃退火2分鐘。Taq DNA聚合酶2.5單位，在72℃使引物延伸1.5分鐘。反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行25至35次，每一循環(huán)包括在92℃變性0.5分鐘，在45℃復(fù)性1分鐘和在72℃延伸1.5分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物的大小和產(chǎn)率用5μl樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
引物B(GGATCCATGAGATTTCCTTCA)和引物X(TCTAGAGATACCCTTCTTCTTT)用ABI380A型DNA合成儀合成并用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝膠電泳純化。得到的PCR產(chǎn)物為具有下列改變的編碼α-MFL的DNA片段GGATCCATGAGATTTCCTTCA---------AAAGAAGAAGGGGTATCTCTAGACCTAGGTACTCTAAAGGAAGT---------TTTCTTCTTCCCCATAGAGATCT與原來(lái)α-MFL順序(Kurjan，J.&Herskowitz，I.，Cell，1982，30933)相比較，在堿基No.1的前面加上了BamHI的位點(diǎn);亮氨酸的密碼TTG(堿基No.244-246)改為CTA，和前面的T及后面的GA形成XbaI位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳分析表明PCR的主要產(chǎn)物為250bp左右的編碼α-MFL的DNA片段(圖1)。將其克隆到pVT102-U，形成pVT102-U/α-MFL。
穿梭質(zhì)粒pVT系列(Vernet，T.，et al.，Gene，1987，52225)具有醇脫氫酶1的啟動(dòng)子(ADHp)和3'終止序列，中間是多克隆部位(MCS)。同時(shí)，通過(guò)輔助噬菌體(helper phage)的感染，可以從pVT方便地得到單鏈DNA，無(wú)需再克隆即能測(cè)定DNA順序或進(jìn)行基因定位突變。因此，利用輔助噬菌體R408制備了單鏈DNA(Russel，M.，et al.，Gene，1986，45335)并用Sanger等(Sanger，F(xiàn).G.，et al.，Proc.Nalt.Amer.Sci.USA，1977，745463)末端終止法測(cè)定DNA順序，確認(rèn)了產(chǎn)物α-MFL的順序。
這里，利用PCR方法同時(shí)完成了α-MFL序列的擴(kuò)增，突變和在兩端加上了所需的酶切位點(diǎn)。
(2).PSCI基因的合成及其在大腸桿菌中的克隆將PSCI基因分成8個(gè)片段，用ABI 380A型DNA合成儀合成，用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝膠電泳純化后，用T4DNA連接酶連接成175bp左右的大片段，其序列如下LDKRFVNQHLCGSHLVCTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTT,GGTT-TATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAA-CCAA-EALYLVCGERGFFYTPG-AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT.TCTACACTC-CT-C.TTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAGA-AGATGTGAG.GA-KAAKGIVEQCCTSICSAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACC,TCCATCTG-CTCC-TTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGG-AGGTAGAC.GAGG-LYQLENYCNTTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTTCGA這個(gè)片段含有Leu、Asp、Lys和Arg的密碼子和PSCI基因，在基因的5'端和3'端有XbaI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的黏性末端。將此片段克隆到pVT102-U/α-MFL，得到PSCI基因分泌表達(dá)質(zhì)粒PVT102-U/α-MFL-PSCI并用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。以PSCI基因?yàn)槟０?，用PCR方法制備含32P脫氧核苷酸的高放射活性探針。用此探針作菌落雜交，篩選轉(zhuǎn)化子(圖2)。
制備pVT102-U/α-MFL-PSCI的單鏈DNA(Russel，M.，et al.，Gene，1986，45335)并用DNA測(cè)序方法確認(rèn)了PSCI基因的順序。
從pVT102-U構(gòu)建pVT102-U/α-MFL-PSCI的過(guò)程見(jiàn)圖3。
3.分泌表達(dá)質(zhì)粒pPGK/PSCI的構(gòu)建磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)基因是酵母中最有效的表達(dá)基因之一。PGK啟動(dòng)子(PGKp)已被用來(lái)構(gòu)建了一系列高效表達(dá)載體，并成功地表達(dá)了若干真核基因。為了用PGKp代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp，首先用PCR從酵母的總DNA中擴(kuò)增了PGKp(Ogden，J.E.，et al.，Mol.Cell.Biol.，1986，64335)順序(615bp)，并分別在其5'和3'端加上了SphI和BamHI酶切位點(diǎn)(圖4)。擴(kuò)增引物S(CCGCATGCTCATACTATT-ATCAGGGCCA)和B(GGGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGTAAAA)用ABI 380A型DNA合成儀合成，用16%聚丙烯酰胺-8M尿素凝膠電泳純化。
pVT102-U/α-MFL-PSCI用EcoRI+SphI酶切后，得三個(gè)片段，分別約為1.2Kb，1.85Kb和4.25Kb?；厥?.85Kb片段(圖5)。而以EcoRI+BamHI酶切該質(zhì)粒，得到分別約為2.5Kb和5Kb的兩個(gè)片段，回收5Kb片段(圖5)。
將回收的5Kb和1.85Kb片段與PCR擴(kuò)增的PGKp片段混合在一起，連接，得到分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKG/PSCI，該質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6。
用pPKG/PSCI轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，取20個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，抽提質(zhì)粒DNA，點(diǎn)在尼龍膜上，以擴(kuò)增PGKp時(shí)用的引物S和PSCI片段為探針，作點(diǎn)雜交(圖7)。轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA的酶切圖譜如圖8所示。用SphI+BamHI酶切，可分別將pPKG/PSCI和pVT102-U/α-MFL-PSCI中的啟動(dòng)子切下來(lái)，前者約600bp，后者約400bp，分別與PGKp和ADHp大小相符(PGKp為620bp，ADHp為415bp)(圖8)。
實(shí)施例2.PSCI基因在酵母中的分泌表達(dá)用pPGK/PSCI或pVT102-U/α-MFL-PSCI轉(zhuǎn)化的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae XV700-6B細(xì)胞(分別稱YS-91和YS-90)在選擇培養(yǎng)基中，于30℃生長(zhǎng)48小時(shí)。取轉(zhuǎn)化子接種于5mlYPD培養(yǎng)液中，生長(zhǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接到50mlYPD培養(yǎng)液，繼生長(zhǎng)約20小時(shí)后，轉(zhuǎn)入盛有YPD的搖瓶或10L發(fā)酵罐培養(yǎng)三天。用胰島素放射免疫方法測(cè)定YS-91在搖瓶和10升發(fā)酵罐中PSCI的濃度分別為24mg/L和40-50mg/L。
實(shí)施例3.表達(dá)產(chǎn)物PSCI的分離純化和鑒定離心除去菌體，取發(fā)酵液于0-4℃加丙酮或三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，在4℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，用少量乙酸溶解后，上Sephadex G-50柱，用10%乙酸洗脫，收集與胰島素相應(yīng)位置的峰(圖9)，冷凍干燥，再用上述Sephadex G-50柱分離一次，冷凍干燥。所得PSCI用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶(圖10)。PSCI的結(jié)晶(乙醇系統(tǒng)，pH6.8)如圖11所示。
用上述分離純化程序，從1升發(fā)酵液中可得到純的PSCI 30-40mg。
實(shí)施例4.轉(zhuǎn)肽和人胰島素產(chǎn)物的鑒定1.轉(zhuǎn)肽取定量PSCI溶于DMSO/1，4-丁二醇/水的混合液中，加過(guò)量叔丁酯保護(hù)的Thr(ThrOBut)，調(diào)pH至6.5，加胰蛋白酶(蛋白質(zhì)∶酶＝5∶1)于25℃反應(yīng)6小時(shí)，加酸終止反應(yīng)(朱尚權(quán)崔大敷，科學(xué)通報(bào)，1984，201263)。HPLC分析表明，反應(yīng)混合物有三個(gè)峰(圖12)，峰1是未反應(yīng)的PSCI，峰2為去B30Ala胰島素(DAI)，峰3是轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物，即B30蘇氨酸為叔丁酯保護(hù)的人胰島素([B30ThrOBut]hIns)。圖13是反應(yīng)混合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。
由圖12中的峰計(jì)算，[B30ThrOBut]hIns為51%，PSCI為41%，DAI為8%。PSCI和DAI回收后可以再進(jìn)行轉(zhuǎn)肽。hIns經(jīng)三氟乙酸(TFA)處理，脫去叔丁酯保護(hù)基，得到人胰島素。HPLC分析表明人胰島素為單一峰(圖14)，回收率幾乎100%。圖15為[B30ThrOBut]hIns經(jīng)TFA處理后的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
用上述轉(zhuǎn)肽條件，從每升發(fā)酵液中可得純的人胰島素15-20mg。應(yīng)該指出，41%的PSCI和8%的DAI(圖12)回收后仍可進(jìn)行轉(zhuǎn)肽。因此，人胰島素的最終得率還可進(jìn)一步提高。
2.基因工程人胰島素的鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)肽得到的人胰島素的結(jié)晶如圖16所示。氨基酸組成與理論值相符(表1)表1豬胰島素(P-Ins)和人胰島素(h-Ins)的氨基酸分析p-Ins. h-Ins.
氨基酸 實(shí)驗(yàn)值 理論值 實(shí)驗(yàn)值 理論值A(chǔ)sx 3.08 3 3.21 3Thr 1.99 2 3.10 3Ser 2.59 3 2.66 3Glx 7.00 7 7.63 7Gly 4.00 4 4.00 4Ala 2.12 2 1.31 1VaL 3.69 4 4.00 4Ile 1.70 2 1.80 2Leu 5.98 6 6.03 6Tyr 3.81 4 3.58 4Phe 2.86 3 3.14 3His 1.86 2 2.00 2Lys 1.02 1 1.16 1Arg 1.06 1 1.10 1Pro 0.64 1 0.50 1注樣品經(jīng)6N HCl 20小時(shí)，110℃水解用ABI公司的蛋白質(zhì)順序儀雙頭測(cè)定基因工程人胰島素氨基酸順序，所得結(jié)果與人胰島素氨基酸序列完全相同。
由圖17可見(jiàn)，基因工程人胰島素具有與豬胰島素相同的與人胎盤(pán)細(xì)胞膜胰島素受體的結(jié)合能力(馮佑民等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1982，14137)。小白鼠驚厥方法測(cè)定表明其體內(nèi)生物活力也與豬胰島素相同(表2)表2單組分豬胰島素(MC-Ins)和基因工程人胰島素(h-Ins)的小鼠驚厥反應(yīng)活力測(cè)定樣品 h-Ins MC-Insμg0.5 6/10 6/100.25 1/10 1/10豬和人胰島素的差別只在B30位的氨基酸殘基不同，豬胰島素為Ala，人胰島素是Thr。因此，轉(zhuǎn)肽時(shí)如果用叔丁酯保護(hù)的丙氨酸(AlaOBut)代替ThrOBut，即可得到豬胰島素。
權(quán)利要求
1.一種用豬單鏈胰島素前體基因在酵母中分泌表達(dá)和人胰島素的制備方法，包括它的PSCI基因合成，編碼酵母α-交配因子前導(dǎo)序列的DNA片段的制備，PVT102-U/α-MFL-PSCI質(zhì)粒和pPGK/PSCI質(zhì)粒的構(gòu)建，用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌而得到工程菌YS-90及YS-91，以及分泌表達(dá)產(chǎn)物PSCI的分離純化及轉(zhuǎn)化為人胰島素的轉(zhuǎn)肽條件等，其特征在于a.使用了由化學(xué)合成的DNA片段，用T4DNA連接酶連接成175bp左右的大片段DNA(PSCI基因)，其序列如下L D K R F V N Q H L C G S H L VCTAGATAAAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTT.GGTT-TATTTTCTAAGCAATTGGTTGTGAACACGCCAAGGGTGAA-CCAA-E A L Y L V C G E R G F F Y T PG-AAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT.TCTACACTC-CT-C.TTCGAAACATGAACCAAACGCCACTTTCTCCAAAGA-AGATGTGAG，GA-K A A K G I V E Q C C T S I C SAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACC.TCCATCTG-CTCC-TTCCGACGATTCCCATAACAGCTTGTTACGACATGG-AGGTAGAC，GAGG-L Y Q L E N Y C NTTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACGTTGATCTTCGA這個(gè)片段含有Leu，Asp和Arg的密碼子和豬單鏈胰島素前體基因，在基因的5’端和3’端有XbaI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的粘性末端；PSCI為豬B1-30-Xn-Y-豬A1-21或豬B1-29-Wn-Xn-Y-豬A1-21，其中W和X為除Lys或Arg以外的任一天然氨基酸，Y為L(zhǎng)ys或Arg，n=1-15；b.將a中所述的PSCI基因克隆到質(zhì)粒pVT102-U/α-MFL中，得到PSCI基的分泌表達(dá)質(zhì)粒pVT102-U/α-MFL-PSCI，使用醇脫氫酶1啟動(dòng)子(ADHp)和醇脫氫酶1終止序列(ADHt)；c.使用磷酸甘油激酶啟動(dòng)子(PGKp)代替pVT102-U/α-MFL-PSCI中的ADHp，構(gòu)建成分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKG/PSCI；d.編碼酵母α交配因子前導(dǎo)序列(α-MFL)的DNA片段，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由酵母總DNA為模板復(fù)制獲得，得到的PCR產(chǎn)物為具有下列改變的編碼α-MFL的DNA片段；GGATCCATGAGATTTCCTTCA--------AAAGAAGAAGGGGTATCTCTAGACCTAGGTACTCTAAAGGAAGT--------TTTCTTCTTCCCCATAGAGATCT與原來(lái)α-MFL順序相比較，在堿基No.l的前面加上了BamHI的位點(diǎn)；亮氨酸的密碼TTG(堿基No.244-246)改為CTA，和前面的GA形成XbaI位點(diǎn)。e.選用釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B)和b中所述的表達(dá)質(zhì)粒pVT102U/α-MFL-PSCI構(gòu)建成工程菌Saccharomyces cerecisiae YS90，PVT102U/α-MFL-SCI(XV-700-6B)；f.選用釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(XV-700-6B)和c中所述的表達(dá)質(zhì)粒pPKF/PSCI構(gòu)建成工程菌Saccharomyces cerevisiaeYS91，pPGK/SCI(XV-700-6B)；g.分泌產(chǎn)物PSCI轉(zhuǎn)化為胰島素的轉(zhuǎn)肽條件是DMSO/1，4-丁二醇/水，25℃反應(yīng)6小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明為一種用單鏈胰島素前體基因在酵母中分泌表達(dá)和人胰島素的制備方法，包括基因合成，表達(dá)質(zhì)粒和工程菌構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和轉(zhuǎn)化成結(jié)晶人胰島素等。豬胰島素單鏈前體表達(dá)量達(dá)40—50mg/l，轉(zhuǎn)化為結(jié)晶人胰島素達(dá)15—20mg/l，并能不斷提高，本發(fā)明可發(fā)展成為基因工程人胰島素生產(chǎn)的工業(yè)體系。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1101945SQ9311258
公開(kāi)日1995年4月26日 申請(qǐng)日期1993年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月18日
發(fā)明者張友尚, 馮佑民, 朱尚權(quán), 胡紅明, 蔡若蓉, 賀潛斌, 唐月華, 徐明華, 許英鎬, 張新堂, 劉濱 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所