專利名稱：：一種免疫抑制劑-抗cd25嵌合單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程和免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種抗CD25嵌合單克隆抗體及其編碼序列，包含所述抗體的編碼序列的表達載體和宿主細胞，以及生產(chǎn)所述抗體的方法。
背景技術(shù)：
：器官移植是治療終末期器官疾病的最有效的治療手段。以腎移植為例，同種異體腎移植是目前治療末期腎病的最有效的方法。腎移植是中國臨床開展最早、例數(shù)最多、技術(shù)最成熟的大器官移植，己成為治療終末期腎病的常規(guī)手術(shù)。近年來，器官移植病例數(shù)不斷增長。以腎移植手術(shù)為例至2001年底，中國腎移植的累積總數(shù)達40393例，中國腎移植水平已進入國際先進行列。供體腎臟移植到患者體內(nèi)，擔(dān)任體內(nèi)衛(wèi)兵的T細胞等免疫系統(tǒng)將會對異己的腎臟展開進攻，也就是產(chǎn)生移植排斥反應(yīng)。在這個過程中，L細胞受IL-1作用后增生，并且釋放IL-2。IL-2可進而促進TH細胞增生并為CTL細胞(CD8+細胞毒性1細胞)的分化提供輔助信號。CTL細胞與HLA-I抗原結(jié)合后可引起分化，成為成熟的CTL，排斥移植組織。由此可見，阻斷IL-2因子與其受體的結(jié)合對于器官移植的排斥反應(yīng)相當重要。器官移植后的急性排斥反應(yīng)較常見，這種反應(yīng)可能會引起移植腎臟的壞死或者移植腎功能衰退。因此，能夠降低和減弱這類反應(yīng)的藥物對于器官移植的成功與否至關(guān)重要。臨床上一般采用免疫抑制劑對器官移植病人進行治療，抑制移植排斥反應(yīng)的發(fā)生或減輕反應(yīng)程度。因此，接受腎移植者不得不終身服用免疫抑制藥物以達到以下目的l.合理應(yīng)用以預(yù)防和治療排斥反應(yīng)(保護異己的腎臟)；2.保持患者適度的免疫抵抗力(保護患者本身)。新的免疫抑制劑的研制，使臨床腎移植得到更為廣泛的開展，腎移植數(shù)量急劇增長，效果明顯提高，腎移植一年存活率在先進的移植中心已超過85%,術(shù)后大多數(shù)患者恢復(fù)正常生活和工作。其中免疫抑制劑在預(yù)防和治療腎移植排斥反應(yīng)中起了關(guān)鍵作用。然而，迄今應(yīng)用于臨床的免疫抑制劑并沒有達到非常滿意的效果。雖然移植的腎一年存活率達80-90%，但急性排斥反應(yīng)發(fā)生率仍高達50%。目前，臨床上使用較多的免疫抑制劑有化學(xué)藥物他克羅姆(Neoral)，他可莫司(FK506)或普樂可復(fù)、驍悉(MMF)、雷帕霉素(RAPA)及一些單克隆抗體藥物。臨床試驗表明單克隆抗體類藥物的療效較化學(xué)類藥物好，但由于單克隆抗體藥物生產(chǎn)成本高，造成治療費用相當昂貴。并且，現(xiàn)有單克隆抗體產(chǎn)品存在一些主要的問題鼠源性單克隆抗體為異種蛋白，進入人體會引起機體的排異反應(yīng)，針對需要多次重復(fù)治療的鼠源性單克隆抗體的抗體可將其快速從體內(nèi)清除，這是限制鼠源性單克隆抗體治療性臨床應(yīng)用的最大障礙。同時，鼠源性單克隆抗體激活人體其他免疫系統(tǒng)如補體系統(tǒng)的能力差，從而影響其臨床治療效果。為解決上述問題，嵌合性和人源化單克隆抗體應(yīng)運而生。比如，人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)中有90%或以上與人的抗體結(jié)構(gòu)相同，從而降低了產(chǎn)品的異源性。但是，人源化單克隆抗體在進行抗體工程的處理過程中通常會失去對靶抗原的親和力和穩(wěn)定性，同時也存在生產(chǎn)細胞建株困難等難點，且一直缺乏有效的解決方法。此外，一種單克隆抗體通常針對的是一個特異性的抗原表位，很多情況下一種單克隆抗體往往無法完全地抑制相應(yīng)的抗原的活性。因此為了更好地抑制某一抗原，往往需要開發(fā)出多種特異性針對該抗原不同表位的抗體。在實踐中，如果一種針對抗原某一表位的單克隆抗體效果不好，則需要采用針對該抗原其它表位的抗體，或者需要多種抗體聯(lián)合使用。綜上，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的、免疫抑制效果好、安全有效且產(chǎn)量高的新型抗器官移植排斥的單克隆抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新型免疫抑制劑-一抗CD25嵌合單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供生產(chǎn)所述的嵌合單克隆抗體的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一目的在于提供包含所述抗體的編碼序列的表達載體和宿主細胞。在本發(fā)明的第一方面，提供一種單克隆抗體，所述抗體的VH鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的氨基酸序列SEQIDNO:9所示的CDR1，SEQIDNO:10所示的CDR2，和SEQIDNO:11所示的CDR3;并且，所述抗體的VL鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的氨基酸序列SEQIDNO:12所示的CDR1，SEQIDNO:13所示的CDR2，禾口SEQIDNO:14所示的CDR3。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的VL鏈具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的VH鏈和VL鏈分別具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的重鏈具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；或者所述單克隆抗體的輕鏈具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種DNA分子，它編碼所述的單克隆抗體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的DNA分子具有SEQIDNO:l所示的編碼抗體VH鏈的核苷酸序列和SEQIDNO:3所示的編碼抗體Vji的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的DNA分子具有SEQIDNO:5所示的編碼抗體重鏈的核苷酸序列，禾BSEQIDNO:7所示的編碼抗體輕鏈的核苷酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種表達載體，所述表達載體中含有編碼所述的單克隆抗體的VH鏈的DNA;禾B/或編碼所述的單克隆抗體的Vt鏈的DNA。在本發(fā)明的第四方面，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞中含有所述的表達載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞中同時含有表達載體l:編碼權(quán)利要求l所述的單克隆抗體的VH鏈的DNA;和表達載體2:編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的VL鏈的DNA。在本發(fā)明的第五方面，提供一種藥物組合物，它含有有效量的所述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體的Vh魅和vl鏈分別具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第六方面，提供一種預(yù)防或治療器官移植排斥反應(yīng)的方法，所述的方法包括給予患者有效量的所述的單克隆抗體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了表達載體pSV2neo/HCMV+VH+hCyl和pSV2neo/HCMV+VL+hCk的構(gòu)建流程圖。圖2顯示了表達載體pSV2neo/HCMV+VH+hCyl(A)和pSV2neo/HCMV+VL+hCk(B)的質(zhì)粒圖譜。圖3顯示了采用本發(fā)明的抗體進行混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)抑制試驗的結(jié)果。圖4顯示了本發(fā)明的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其中，灰色陰影且?guī)聞澗€部分為CDR區(qū)，每條鏈中各有3個CDR區(qū)，依次為CDR1、CDR2禾口CDR3。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地獲得一種含有獨特的CDR區(qū)的抗CD25單克隆抗體，該抗體具有極其優(yōu)異的免疫抑制作用，并且其既良好地保留了特異性和親和力，又具有很低的免疫原性以及良好的安全性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。單克隆抗體本發(fā)明提供了一種嵌合的抗CD25單克隆抗體，它包括人源的恒定區(qū)(如人源恒定區(qū)IgGl序列和Kappa序列)。所述的抗CD25單克隆抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)均具有獨特的不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明包括具有所述的抗CD25單克隆抗體的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體，具有所述的抗CD25單克隆抗體可變區(qū)鏈的單克隆抗體。本發(fā)明還包括具有含所述的互補決定區(qū)(CDR)的輕鏈和重鏈的任何抗體，以及CDR區(qū)與本發(fā)明的抗CD25單克隆抗體的CDR具有90y。以上(較佳地95y。以上)的同源性的任何抗體。抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描述，稱為互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)，所述的CDR區(qū)將可變區(qū)間隔成4個框架區(qū)域(FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的e折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的CDR和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點?？梢酝ㄟ^比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了FR或CDR區(qū)域。對于本發(fā)明的抗CD25單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定。經(jīng)驗證，本發(fā)明的抗CD25單克隆抗體的CDR區(qū)是全新的，可見其針對的是一個獨特的CD25抗原表位，技術(shù)構(gòu)思不同于現(xiàn)有的抗CD25抗體。作為本發(fā)明的優(yōu)選例，提供了一種嵌合抗體，所述的抗體中約70%的成份與人單抗完全相同，其恒定區(qū)(C區(qū))用人單抗的恒定區(qū)替代，其具有特別優(yōu)異的免疫抑制作用，且特異性高，免疫原性低、安全性高。本發(fā)明還提供了編碼所述的抗CD25單克隆抗體的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規(guī)技術(shù)，利用雜交瘤技術(shù)獲得。單克隆抗體的表達、純化一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的抗體序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體是例如含病毒啟動子的質(zhì)粒表達載體，且在所述表達載體中分別插入了抗CD25單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)與恒定區(qū)的IgGl(hCyl)融合序列和輕鏈可變區(qū)VL與人體Kappa(hCk)融合序列。一種特別優(yōu)選的表達載體是載體pSV2neo。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有細菌細胞如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9;動物細胞如CH0、C0S7、NS0、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞等。特別適用于本發(fā)明的宿主細胞是真核宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCL法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC:h。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的單克隆抗體。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。本發(fā)明的抗體優(yōu)選的是采用哺乳動物細胞來生產(chǎn)，哺乳動物細胞通常需要在含血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。需要對細胞進行無血清的適應(yīng)過程后，方可讓細胞在無血清培養(yǎng)基中正常的生長。同時，如果所述的細胞使用的是GS表達系統(tǒng)，則需要使用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，才可以表達抗CD25嵌合單克隆抗體。此外，通過控制培養(yǎng)基的各營養(yǎng)成分，控制培養(yǎng)時候的溶氧(DO)、pH、溫度、攪拌速度等因素，可以進一步提高表達量。作為本發(fā)明的優(yōu)選實例，采用含有BDCH0培養(yǎng)基、Excell620培養(yǎng)基和蛋白水解物Pramatone的混合培養(yǎng)基作為重組細胞的擴增培養(yǎng)基。作為本發(fā)明的優(yōu)選實例，采用含有BD培養(yǎng)基、Excel620和Priraitone培養(yǎng)基作為重組細胞擴增的無血清培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^各種方法來增加編碼抗體的DNA或RNA的表達。作為一種優(yōu)選方式，可在重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)之前設(shè)置一段Kozak序列，該序列有助于mRNA的表達。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。作為一種優(yōu)選方式，當表達出來的抗CD25嵌合單克隆抗體存在于培養(yǎng)上清時，培養(yǎng)上清液可以通過鹽析、超濾等方法進行初步純化，然后再進行層析純化；或者，也可直接進行層析純化。例如，適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括但不限于(a)親和層析選擇ProteinA-S印harose親和凝膠介質(zhì)，低pH緩沖液洗脫；(b)離子交換層析陽離子交換層析、陰離子交換層析；或(C)凝膠過濾層析。經(jīng)過2-3步純化，可得到抗CD25嵌合單克隆抗體純品，純化得率40%以上，純度95%以上。在本發(fā)明中，通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，抗CD25嵌合單克隆抗體表達量可超過100mg/升。在本發(fā)明的一個較佳實施方式中，本發(fā)明人首先從生產(chǎn)抗CD25單克隆抗體的雜交瘤中獲得了抗CD25單克隆抗體的重鏈可變區(qū)VH(SEQIDN0:1)和輕鏈可變區(qū)VL(SEQIDN0:3)的cDNA片段，然后采用分子生物學(xué)常規(guī)手段構(gòu)建分別含有重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的表達載體，構(gòu)成的表達載體中重鏈可變區(qū)VH與人恒定區(qū)的IgGl融合(SEQIDN0:5)，輕鏈可變區(qū)(VL)與人體Kappa融合(SEQIDNO:7)，并處于病毒啟動子HCMV的調(diào)控下。將這兩個表達載體共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞經(jīng)培養(yǎng)，表達出抗CD25嵌合單克隆抗體。所述的單克隆抗體為人-鼠嵌合性單抗，其中有70%成分與人單抗完全相同，其恒定區(qū)(C片段)用人體單抗的恒定區(qū)替代，也即鼠源單抗-抗CD25單克隆抗體重鏈恒定區(qū)由人恒定區(qū)的IgGl替換；鼠源單抗-抗CD25單克隆抗體輕鏈恒定區(qū)由人恒定區(qū)的Ka卯a(chǎn)序列替換。在本發(fā)明的較佳實施方式中，經(jīng)高密度無血清懸浮培養(yǎng)，抗CD25嵌合單克隆抗體以可溶形式存在于培養(yǎng)液上清，表達水平高，占菌體總蛋白50%左右，抗CD25嵌合單克隆抗體表達量達100125mg/L上清液。由于表達水平較高，抗CD25嵌合單克隆抗體又具有天然活性，避免了復(fù)雜的復(fù)性過程，通過簡便、快速的二步純化方法，即獲得高質(zhì)量的抗CD25嵌合單克隆抗體純品，每升培養(yǎng)液可得抗CD25嵌合單克隆抗體純品45mg以上，產(chǎn)品純度95%以上。上述抗體生產(chǎn)方法工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得抗CD25嵌合單克隆抗體純品約45mg或更多，因此特別適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種治療移植排斥反應(yīng)的藥物組合物，它含有有效量的上述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。本發(fā)明的藥物組合物可直接用于排斥反應(yīng)的治療。此外，還可同時使用其它相關(guān)的治療劑。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的單克隆抗體以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約l微克/千克體重-約5毫克/千克體重。使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明的單克隆抗體施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)提供了一種具有全新的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗CD25單克隆抗體，其可通過特異性結(jié)合與封閉白細胞介素2(IL-2)受體，特異性阻斷IL-2與其受體的結(jié)合，從而減少急性排異反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明的抗體在濃度43.30ng/ml時，就有50%細胞的生長受到抑制，因此具有極其優(yōu)異的免疫抑制作用。(2)本發(fā)明的嵌合CD25單克隆抗體與鼠源性抗CD25單克隆抗體相比，免疫原性大大減少，同時保留了鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)。通過鼠-人嵌合抗體構(gòu)建，在免疫原性大大減少的同時，保留了親本抗體的特異性。不僅治療效果好，而且副作用低。(3)采用新型的NSO表達體系與無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)，具有表達量高、操作簡單、易于后續(xù)純化的優(yōu)點。(4)表達工藝簡單，表達量高。通過控制關(guān)鍵的細胞培養(yǎng)工藝條件，使表達水平達到100mg/L以上。(5)純化工藝簡便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表達于上清，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)抗CD25嵌合單克隆抗體成為可能。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sarabrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化1.抗CD25單克隆抗體重鏈可變區(qū)VH與輕鏈可變區(qū)VL的獲得獲得抗CD25單克隆抗體重鏈可變區(qū)VH與輕鏈可變區(qū)VL的步驟如圖1所示。以植物血凝素(PHA)激活的人體淋巴細胞免疫LOU/C大鼠(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，繼而用其脾細胞與非分泌型骨髓細胞系IR983F(參見BazinH(1982)ProductionofratmonoclonalantibodieswiththeLOUratnon-secretingIR983Fmyelomacellline.ProteinBiolFluids29:615—618)融合獲得抗CD25單克隆抗體的雜交瘤細胞。根據(jù)Chomezybski和Sacchi(Anal.Biochem.162.156.187)的方法或常規(guī)方法，用Trizol試劑從生產(chǎn)抗CD25單克隆抗體的雜交瘤中，分離出總RNA(GibcoBRLGaithersburg.USA)。使用Oligo(dT)隨機引物，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Gibco)說明書用超級反轉(zhuǎn)錄酶H將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。并以該cDNA為模板，使用小鼠不同重鏈恒定區(qū)(CH)或輕鏈恒定區(qū)(CL)的特異性引物及小鼠不同高變區(qū)(VH或VL)的特異性引物，PCR擴增出抗CD25單克隆抗體的重鏈可變區(qū)VH(SEQIDNO:l)或輕鏈可變區(qū)VL(SEQIDNO:3)DNA片段。此方法為常規(guī)的方法，或可參考Clothia等描述的方法(J.Mol.biol.186.651.1985)。采用的特異性引物如下VH區(qū)的PCR引物CAGAAAGCTTGCCGCCACCATGGACTCCAGGCTCAC(SEQIDNO:15);禾口CGAGGATCCACTCACCTGAAGAGACAGTGACC(SEQIDNO:16)cVL區(qū)的PCR引物CCGAGGATCCACTCACGTTTCAGTTCCAGCTTGGTCCCAG(SEQIDNO:17);和AACGCGTGCCGCCACCATGAGGTGCCTAACTCAGTTCCTGGGGT(SEQIDNO:18)。PCR條件變性94°Cl分鐘；退火52°C1分鐘；延伸72°C1分鐘；循環(huán)數(shù)35。所用的酶Taq(PerkinElmerUSA)。PCR產(chǎn)物的測序(雙脫氧核苷酸法)是用ABIPrismBigdyeTerminator(PerkinElmerUSA)試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說明書來完成的。測序反應(yīng)的產(chǎn)物用毛細管電泳法分析。所獲得的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示，其相應(yīng)的編碼序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示。其中，各CDR區(qū)如表1或圖4所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.表達質(zhì)粒pSV2neo/HCMV+VH+hCyl和pSV2neo/HCMV+VL+hCk的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化宿主細胞在引物的5，端添加上一段Kozak序列，該序列有助于m脂A(參見Kozak等，J.cell.Biol.108.229.1989)的表達。同時添加了限制性內(nèi)切酶位點序列(HindIII、BamHI序列對應(yīng)于VL;Mlul、BamHI序列對應(yīng)于VH)，使其能在表達載體中克隆。VH區(qū)的PCR引物(其中，下劃線表示酶切位點，方框表示KOZAK序列)15)CAGAAAGCTTGCC^CCACCATGG[ACTCCAGGCTCAC(SEQIDNO:取lCGAGGATCCACTCACCTGAAGAGACAGTGACC(SEQIDNO:16);VL區(qū)的PCR引物:IDNO:17);禾口AACGCGTGCC|GCCACCATG^GGTGCCTAACTCAGTTCCTGGGGT(SEQIDNO:18)。通過常規(guī)PCR擴增獲得VH和VL的DNA序列。PCR條件是變性94°Cl分鐘;退火52°Cl分鐘;延伸72°Cl分鐘;循環(huán)數(shù)25。所用的酶Taq(PerkinElmerUSA)。獲得啟動子HCMV和恒定區(qū)的人IgGl(基因序列如SEQIDNO:5的第412-1467位所示)，人抗體輕鏈Kappa序列(基因序列如SEQIDNO:7的第397-720位所示)。采用常規(guī)的方法，將HCMV和恒定區(qū)的IgGl插入到質(zhì)粒pSV2neo(購自Biolab公司)的多克隆位點中，獲得重組質(zhì)粒pSV2neo/HCMV+hCyl。將HCMV和人抗體輕鏈Kappa序列插入到質(zhì)粒pSV2neo(購自Biolab公司)中，獲得重組質(zhì)粒pSV2neo/HCMV+hCk。VH經(jīng)過Mlul、BamH:[雙酶切后克隆到表達載體pSV2neo/HCMV+hCyl中，VL經(jīng)過HindIII、BamHI雙酶切克隆到表達載體pSV2neo/HCMV+hCk中，進而，獲得重組的表達載體pSV2neo/HCMV+VH+hCyl和pSV2neo/HCMV+VL+hCk?？贵w的VL鏈或VH鏈基因被克隆到載體中后，VH與VL分別與恒定區(qū)的IgGl和人抗體輕鏈Kappa融合，并處于病毒啟動子HCMV的調(diào)控下，獲得的表達載體的示意圖譜見圖2。重組表達載體pSV2neo/HCMV+VH+hCyl和pSV2neo/HCMV+VL+hCk鑒定，用常規(guī)方法進行正、逆向序列測序，證實克隆序列與設(shè)計序列完全一致。用FuGENE6(BoehringerManheim)試劑，根據(jù)說明書方法，將獲得的重組表達載體pSV2固/HCMV+VH+hCyl禾口pSV2腦/HCMV+VL+hCk共轉(zhuǎn)染COS-7細胞(ATCCNo.CRL1651)(5000細胞/ml)進行瞬時表達，經(jīng)過三天培養(yǎng)，上清液中分泌的抗體用ELISA檢測。獲得高表達的細胞株。采用同樣方法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NS0細胞(ECACC)，通過ELISA檢測，獲得高表達的工程細胞。所獲得的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:8所示，其相應(yīng)的編碼序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:7所示。實施例2最佳培養(yǎng)基的選擇由種子細胞庫復(fù)蘇無血清細胞株一支，接種到T25方瓶中進行培養(yǎng)，48小時后，按照l:3的比例將細胞接種入3個T25方瓶中，后可以按照l:3的比例進行擴增培養(yǎng)。將細胞以相同的密度接種入不同的培養(yǎng)基中，考察48小時后細胞的數(shù)目和表達量。測試的培養(yǎng)基如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2中，BDCHO培養(yǎng)基購自美國BD公司，Excell620培養(yǎng)基購自JRH公司，Pramatone禾口DOMA購自LifeTechnologies公司。實驗數(shù)據(jù)表明，細胞在B+E+P培養(yǎng)基中的細胞生長速度和產(chǎn)物的表達量均達到最高，抗體的表達水平超過100mg/L。所以優(yōu)選采用B+E+P培養(yǎng)基作為該細胞的擴增培養(yǎng)基。實施例3工程細胞髙密度無血清懸浮培養(yǎng)研究本發(fā)明人考察了生產(chǎn)抗CD25嵌合單克隆抗體的工程細胞在BDCH0、BDCHO+excel620+Pramatone、Excell620+DOMA+Pramatone以及Excell620培養(yǎng)基中的適應(yīng)過程，結(jié)果如表3所示。表3培養(yǎng)基適應(yīng)過程描述結(jié)論BDCHO經(jīng)過適應(yīng)，細胞可以正常傳代培養(yǎng)，但培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)較大的細胞團，影響部分細胞的傳質(zhì)。在T25方瓶中細胞密度可達8.8Xl()Scells/ml?？梢赃m應(yīng)BDCHO+Excel1620+Pr測atone目前細胞可以正常的在該細胞中傳代，細胞團組成在10個左右，已經(jīng)不太會影響細胞的正常生長。在T25方瓶中細胞密度可達12.3X105cells/ml。可以適應(yīng)Excell620細胞轉(zhuǎn)入該培養(yǎng)基之后，細胞的個體形態(tài)開始增大，直至最后破裂。無法適應(yīng)Excel620+DOMA+Primitone換入該培養(yǎng)基后，2-4代期間細胞生長仍比較正常，但隨后細胞的活性開始下降，細胞開始不可逆轉(zhuǎn)的死亡，說明該培養(yǎng)基無法滿足本細胞生長的需求。無法適應(yīng)綜上所述，優(yōu)選采用BDCHO+Excel620+Praraatone培養(yǎng)基作為該細胞擴增的無血清培養(yǎng)基，進行細胞在250mlspinner中擴增培養(yǎng)，得到一定量的培養(yǎng)上清，提供純化進行純化工藝研究，并得到一定量的純品提供質(zhì)控進行結(jié)構(gòu)確證方面的工作。實施例4抗CD25嵌合單克隆抗體的純化細胞培養(yǎng)液4。C下8900rpra離心20min，得上清。1.層析l(親和層析)層析介質(zhì)rProteinA緩沖液溶液A:PBS(20mMPB+0.1MNaCl，pH7.0)溶液B:50mMGly，pH2.8上樣將細胞培養(yǎng)液離心上清上樣。清洗上樣后用5CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗后用直接用10(m的溶液B洗脫。收集收集抗CD25嵌合單克隆抗體樣品峰。樣品處理用調(diào)節(jié)緩沖液(50mMGly,pH7.2)調(diào)節(jié)樣品pH至7.0。2.層析2(陽離子層析)層析介質(zhì)SPSepharoseFF緩沖液溶液A:PB(lOmMPB，pH7.0)溶液B:PBS(10mMPB+1MNaCl，pH7.0)上樣將中和后的抗CD25嵌合單克隆抗體溶液上樣。清洗上樣后用5CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗后用10CV將溶液B從0%升至100%。收集收集抗CD25嵌合單克隆抗體樣品峰。樣品經(jīng)過上述二步純化，即親和層析、陽離子層析以后，純度可達到95%以上。實施例5抗CD25嵌合單克隆抗體的生物活性檢測混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)抑制試驗用常規(guī)方法分離人外周血淋巴細胞(HPBM)，調(diào)整細胞密度為lX10Vml，然后混合；加入不同濃度的純化后的單克隆抗體，濃度范圍為0至1000ng/ml。細胞在37。C，5%(302的條件下培養(yǎng)6天，然后加入10plMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，用酶標儀檢測細胞的增殖情況。結(jié)果見圖3，樣品在抗體濃度范圍內(nèi)具有明顯的線性關(guān)系，顯著抑制了混合淋巴細胞增殖反應(yīng)，顯示了體外免疫調(diào)節(jié)活性。并且，在抗體濃度3.9ng/ml時，即表現(xiàn)出抑制作用；而在樣品濃度為43.30ng/ml時，有50%細胞的生長受到抑制，因此本發(fā)明的抗體具有極其優(yōu)異的免疫抑制作用。安全性試驗在臨床試驗中，給予受試者約0.2mg/kg體重的本發(fā)明前述制備的抗CD25嵌合單克隆抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的抗體對人體沒有可見的不良影響，在進入人體后不發(fā)生可見的排異反應(yīng)，且不產(chǎn)生過敏現(xiàn)象。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>—種免疫抑制劑-抗CD25嵌合單克隆抗體<130>065211<160>18<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉411<212>DNA<213〉小鼠〈400〉1atggactccaggctcaatttagttttccttgtccttttcataaaaggtgtccagtgtgag60gtgcagctggtggagtctggggg哪Ctt3gtgcagcctggaaggtccctgaaactgtcc120tgtgcagcctcaggattcactttccgtaactttgacatggcctgggtccgccaggctcca180acgaagggtctggagtgggtcgcatccattagtcctagtggtggtaccacttactatcga240gactccgfgcagggccgattcactgtctccc犯a^aigcELccctatacctg300caattggacagtctgaggtctgaggacacggccacttattactgtacacgacacccgtgg360tttggttactggggccaaggcactctggtcactgtctcttcaggtgagtgg411<210>2<211〉137〈212>PRT<213>小鼠〈400〉2MetAspSerArgLeuAsnLeuValPheLeuValLeuPhelieLysGly151015ValGinCysGluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGin202530ProGlyArgSerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPhe354045ArgAsnPheAspMetAlaTrpValArgGinAlaProThrLysGlyLeu505560GluTrpValAlaSerlieSerProSerGlyGlyThrThrTyrTyrArg65707580AspSerValGinGlyArgPheThrValSerArgAspAsnAlaLysSer859095ThrLeuTyrLeuGinLeuAspSerLeuArgSerGluAspThrAlaThr100105110TyrTyrCysThrArgHisProTrpPheGlyTyrTrpGlyGinGlyThr115120125LeuValThrValSerSerGlyGluTrp130135<21()〉3<211〉3%<212>DNA<213>小鼠<400>3atgaggtgccgatattgtgaatcacctgcctatctgcagatcaggagtct已gUigcgtggtacacgtttgtaactcagtttgacccagggagtctagtaaggccaggacacagacaggttaggctgaggagagctgggaccctggggttgtgcactccccgagtctgctggtctcctcagcagtggcagttgtgggtgtgcttgtgctctaatcctgtcccacagcaatgctcctgatctgggtcaggaatattactgtcctgaaaggattcctggcttctggagagcaagacataattggatgtccagatttcacagcaatttctagtcaatggggtcagcttcccttgaattggtacccgtgcaactgaaaatcagagtttccg60120180240300360396〈210〉4<2U>132<212〉PRT<213〉小鼠〈400〉4MetArgCys1GlyValAsnVeilProSer35LeuLeuHis50ProGlyGin65SerG]yValThrLeuLysCysGinGin115LeuGluLeuLys130LeuThrGin5GlyAsplie20GlyGluSerSerAsnGlySerProGin70SerAspArg85lieSerSer100PheLeuGluPheLeuGlyLeuLeuValLeuTrpliePro1015ValMetThrGinGlyAlaLeuProAsnPro2530AlaSerlieThrCysGinSer*SerLysSer4045LysThrTyrLeuAsnTrpTyrLeuGinArg5560LeuLeulieTyrTrpMetSerThrArgAla7580PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe9095ValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyr105110PheProTyrThrPheGlyAlaGlyThrLys120125<210〉5<211>1467<212〉DNA<213〉人工序列<22()>〈221〉misc一feature<223〉融合基因〈400〉5atggactccaggctcaatttagttttccttgtccttttcataaaaggtgtccagtgtgag60gtgcagctggtggsgtctgggggaggcttagtgcagcctggaaggtccctgaaactgtcc120tgtgcagcctcaggattcactttccgtaactttgacatggcctgggtccgccaggctcca180acgaagggtctggagtgggtcg(:atccattagtcctagtggtggtaccacttactatcga240gactccgtgcagggccgattcactgtctccagagataatgca^a_￡igcaccctatacctg300caattggacagtctgaggtctgaggacacggccacttattactgtacacgacacccgtgg360tttggttactggggcc卿gcactctggtcactgtctcttcaggtgagtggatcctctgc420gcctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagcctcc480accaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcaca540gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg.600tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactc660tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatc720tgcaacgtgaatcacaagccC3gC^CELCC,gtggacaagagagttgagcccaaatct780tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtca840gtcttcctcttcccccc犯aacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc900acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtg960gscggcgtggaggtgcataatgcca_ag￡Lcaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg1020taccgtgtggtcagcgtcctca'ccgtcctgcaccaggactggctg站tggcaaggagtac1080aagtgcaaggtctcca^c肌agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc1140a闊ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgacc1200aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg1260gagtggg卿gcaatgggcagccggagaacccacgcctcccgtgctggac1320tccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcag1380gggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcaC犯CC3Ct3cacgcagaag1440agcctctccctgtccccgggt肌atga1467<210〉6<211>488〈212〉PRT<213〉人丁.序列<220><221>MISC一FEA，E<223〉融合蛋tl<400>6MetAspSerArgLeu15ValGinCysGluVal20ProGlyArgSerLeu35ArgAsnPheAspMetAsnLeuValPheLeuValLeuPhelieLysGly1015GinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGin2530LysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPhe4045AlaTrpValArgGinAlaProThrLysGlyLeuGluTrpValAlaSer65AspSerValGinGly85ThrLeuTyrLeuGin100TyrTyrCysThrArg115LeuValThrValSer130LeuCysProThrPro145ThrLysGlyProSer505560lieSerProSerGlyGlyThrThrTyrTyrArg707580ArgPheThrValSerArgAspAsnAlsLysSer9095LeuAspSerLeuArgSerGluAspThrAlaThr105110HisProTrpPheGlyTyrTrpGlyGinGlyThr120125SerGlyGluTrplieLeuCysAlaTrpAlaGin135140ArgSerHisGlyThrThrSerLeuAlaAlaSer150155160ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThr165170175SerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPhePro180185190GluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyVal195200205HisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSer210215220SerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlie225230235240CysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrL,ysValAspLysArgVal245250255GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAla260265270ProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheL'euPheProProLysPro275280285LysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysValVal290295300ValAspValSerHisGluAspProGluVall,ysPheAsnTrpTyrVal305310315320AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGin325330335TyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGin340345350AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysI.ysValSerAsnLysAla355360365LeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinPro370375380ArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThr385390395400LysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSer405410415AsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyr420425430LysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyr435440445SerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPhe450455460SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLys465470475480SerLeuSerLeuSerProGlyLys485<210>7<211〉720<212>DNA<213>人T序列<220〉<221〉misc—feature<223〉融合基岡<400〉7atgaggtgcctaactcagttcctggggttgcttgtgct.ctggattcctggagtcaatggg60gatattgtgatgacccagggtgcactccccaatcctgt,cccttctggagagtcagcttcc120atcacctgccagtctagtaagELgtCtgCtgcacagcaaitggc肌gacatacttgaattgg180tatctgcagaggccaggacagtctcctcagctcctgatctattggatgtctacccgtgca240tcaggagtctcagacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactga犯atc300agtagcgtggaggctgaggatgtgggtgtgtattactgtcagcaatttctagagtttccg360tacacgtttggagctgggaccaagctggaactgaaacgaactgtggctgcaccatctgtc420ttcatcttcccgccatctgatgagcagttga^tctgg犯ctgcctctgttgtgtgcctg480ctg肌t肌cttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaa540tcgggtaactcccagg卿gtgtcacagagcaggacagca3ggacagcacctacagcctc600agcagcaccctgacgctgagcaaagcagaccgcctgcgaa660gtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcsc犯agagcttcaacaggggagagtgttag720<210〉8〈211〉239〈212〉PRT<213〉人工序列<220>〈221〉MISC—FEATURE<223〉融合蛋ri<400〉8MetArgCysLeuThrGinPheLeu15GlyValAsnGlyAsplieValMet20ValProSerGlyGluSerAlaSer3540LeuLeuHisSerAsnGlyLysThr5055GlyLeuLeuValLeuTrpliePro1015ThrGinGlyAlaLeuProAsnPro2530lieThrCysGinSerSerLysSer45TyrLeuAsnTrpTyrLeuGinArg60ProGlyGinSerProGinLeuLeulieTyrTrpMetSerThrArgAla65707580SerGlyValSerAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe859095ThrLeuLyslieSerSerValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyr100105110CysGinGinPheUuGluPheProTyrThrPheGlyAlaGlyThrLys115120125LeuG]uLeuLysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePhePro130135140ProSerAspGluGinLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeu145150155160LeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGinTrpLysValAsp165170175AsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAsp180185190SerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLys195200205AlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGin210215220GlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys225<210〉9〈211〉5<212〉PRT<213〉小鼠〈400〉9ValGinProGlyArg15230235<210〉<211〉<212〉<213〉1016PRT小鼠<400〉10AsnPheAspMetAlaTrpValArgGinAlaProThrLysGlyLeuGlu151015<210〉<211〉<212〉<213>118PRT小鼠<400〉11LysSerThrLeuTyrLeuGinLeu15<210>12<211〉11<212>PRT<213>小鼠<400>12MetThrGinGlyAlaLeuProAsnProValPro1510<210>13<211〉7<212〉PRT<213>小鼠〈400〉13LeuHisSerAsnGlyLysThr15〈210〉14<211〉9<212〉PRT<213>小鼠<400〉14GlySerGlySerGlyThrAspPheThr15<210〉15<211>36<212〉腿<213〉人T.序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400〉15cagaaagcttgccgccaccatggactccaggctcac36<210>16<211>32<212>DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>16cgaggatccactcacctgaaga.gacagtgacc32<210〉17<211〉40<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400〉17ccgaggatccactcacgtttcagttccagcttggtcccag40〈210〉18<211〉44<212>還<213〉人工序列<220>〈221〉misc_feature<223〉引物<400>18aacgcgtgccgccaccatgaggtgcctaactcagttcctggggt4權(quán)利要求1.一種單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的VH鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的氨基酸序列SEQIDNO9所示的CDR1，SEQIDNO10所示的CDR2，和SEQIDNO11所示的CDR3；并且，所述抗體的VL鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的氨基酸序列SEQIDNO12所示的CDR1，SEQIDNO13所示的CDR2，和SEQIDNO14所示的CDR3。2.如權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的VH鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的Vj連具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。4.如權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，其特征在于，其VH鏈和VL鏈分別具有SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的重鏈具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；或者所述抗體的輕鏈具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。6.—種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求l所述的單克隆抗體。7.—種表達載體，其特征在于，所述表達載體中含有編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的VH鏈的DNA;和/或編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的VL鏈的DNA。8.—種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞中含有權(quán)利要求7所述的表達載體。9.一種藥物組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求l所述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。10.—種預(yù)防或治療器官移植排斥反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的方法包括給予患者有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗CD25單克隆抗體，所述的抗體含有獨特輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)，針對獨特的CD25抗原(IL-2受體)表位。本發(fā)明還公開了所述抗體的編碼序列，包含該序列的表達載體和宿主細胞，以及生產(chǎn)所述抗體的方法。本發(fā)明的抗CD25單克隆抗體具有極其優(yōu)異的免疫抑制作用，免疫原性很低且特異性很高。文檔編號C07K16/18GK101210049SQ20061014873公開日2008年7月2日申請日期2006年12月30日優(yōu)先權(quán)日2006年12月30日發(fā)明者軍任,孫九如,翊張,徐曉燕,磊游,顧小偉,黃陽濱申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司;上海新生源生物醫(yī)藥有限公司