專(zhuān)利名稱(chēng)：同位素標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，具體涉及利用有機(jī)合成的方法，制備γ-15N和α-、γ-雙15N標(biāo)記L-谷氨酰胺。
背景技術(shù)：
氮-15(簡(jiǎn)稱(chēng)15N，下同)是氮元素的穩(wěn)定同位素，可以用作示蹤劑，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域，尤其對(duì)生命科學(xué)研究有極為重大的意義。特別是在蛋白質(zhì)的人工合成方面，氮-15氨基酸起著獨(dú)特的示蹤作用，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛，市場(chǎng)前景良好。
由于此類(lèi)產(chǎn)品產(chǎn)量小，對(duì)純度和豐度要求高。目前主要是通過(guò)化學(xué)合成法或生物發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法設(shè)備要求簡(jiǎn)單，生產(chǎn)的氨基酸是DL型氨基酸，豐度高，但不具有光學(xué)活性，需要再經(jīng)化學(xué)或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被廢棄，導(dǎo)致氮-15原料利用率降低，增加了生產(chǎn)成本。生物發(fā)酵法具有反應(yīng)步驟少，產(chǎn)品光學(xué)純度高的優(yōu)點(diǎn)。但需要較大的設(shè)備投入，對(duì)菌種的要求高，后提取步驟較多。
L-谷氨酰胺是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分之一，其酶法生產(chǎn)較為困難。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)的方法以化學(xué)合成法為主。主要以L-谷氨酸同甲醇用鹽酸或干燥的HCl氣體為催化劑，生成中間體L-谷氨酸-γ-甲酯鹽酸鹽，再加入過(guò)量二硫化碳和氨水后氨解得到L-谷氨酰胺；或由L-谷氨酸-γ-甲酯與水合肼等反應(yīng)得酰肼，再加氫還原后得到L-谷氨酰胺。以上方法消耗大量氨水或其它有機(jī)胺類(lèi)物質(zhì)，是常用的L-谷氨酰胺生成方法，不適用同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的合成。目前尚未看到由化學(xué)合成法生成同位素15N標(biāo)記L-谷氨酰胺的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了提供一種工藝簡(jiǎn)單、15N原料利用率高的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)1.一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應(yīng)將原料L-谷氨酸分散在醇類(lèi)溶劑中，60℃～150℃回流溫度下逐漸加入無(wú)機(jī)或有機(jī)酸催化劑，并在此溫度下反應(yīng)5～25小時(shí)；用乙醚重結(jié)晶得到L-谷氨酸二酯鹽固體；L-谷氨酸、醇、催化劑的用量比為1∶5～40∶0.2～1.5；(2)選擇性裂解將L-谷氨酸二酯鹽分散在冰乙酸中，在30℃～90℃下，逐滴滴加恒沸HI酸，反應(yīng)4～30小時(shí)，反應(yīng)母液經(jīng)減壓脫除溶劑后，加入適量有機(jī)胺中和，放置后過(guò)濾得到L-谷氨酸-α-酯固體；L-谷氨酸二酯鹽、乙酸、HI酸的用量比為1∶5～100∶1～5；(3)酰氯化將L-谷氨酸-α-酯固體、氯化亞砜于回流和攪拌下反應(yīng)2～10小時(shí)，除去溶劑并蒸餾后得到產(chǎn)物α-酯-L-谷氨酰氯；(4)酰胺化將α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氫氧化鈉水溶液混合后，加入非標(biāo)記或15N標(biāo)記無(wú)機(jī)氮源，在-10℃～20℃低溫下條件下氨解1～10小時(shí)，冷卻、提取和干燥后，蒸去溶劑得到α-酯-L-谷氨酰胺產(chǎn)品；(5)解保護(hù)將15N標(biāo)記α-酯-L-谷氨酰胺通過(guò)皂化或加氫的方法脫除α-酯，得到同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺。
所述的醇類(lèi)溶劑選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或苯甲醇中的一種或幾種的混合物。
所述的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸選擇鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亞砜、三氯氧磷、對(duì)甲苯磺酸中的一種或幾種。
所述的原料L-谷氨酸包括非標(biāo)記或15N標(biāo)記的L-谷氨酸。
所述的用量比為摩爾比。
所述的解保護(hù)工藝得到的產(chǎn)品為γ-15N標(biāo)記或α-、γ-雙15N標(biāo)記的L-谷氨酰胺。
本發(fā)明提供了一套15N標(biāo)記L-谷氨酰胺的制備方法，該方法在現(xiàn)有的有機(jī)合成L-谷氨酰胺技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合15N原料昂貴的特點(diǎn)，對(duì)了工藝條件進(jìn)行改變，使之具有良好的經(jīng)濟(jì)性和使用價(jià)值。該方法適用于合成γ-和α、γ雙15N標(biāo)記L-谷氨酰胺。本方法過(guò)程簡(jiǎn)單，15N原料利用率高，得到的L-谷氨酰胺產(chǎn)品純度在99％以上，豐度在98％以上。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應(yīng)將14.7g(0.1mol)L-谷氨酸、19克一水對(duì)甲苯磺酸和30ml苯懸浮分散在80ml苯甲醇中，配備油水分離器，于110℃回流24小時(shí)，加入過(guò)量乙醚沉淀、重結(jié)晶后得到L-谷氨酸二芐酯對(duì)甲苯磺酸32.4g(單程收率65％)，熔點(diǎn)139.5～141.1℃。
反應(yīng)母液經(jīng)減壓脫除乙醚后，補(bǔ)加適量酸和苯甲醇，回流下繼續(xù)反應(yīng)5～20小時(shí)，至薄層層析顯示無(wú)L-谷氨酸存在。參照以上步驟處理仍可得到10.2gL-谷氨酸二芐酯對(duì)甲苯磺酸，合并后酯化總收率85.3％。
(2)選擇性裂解反應(yīng)將10g(0.02mol)L-谷氨酸二芐酯對(duì)甲苯磺酸溶解于100ml冰乙酸中，加入10ml脫色恒沸HI酸，50℃下反應(yīng)8小時(shí)。母液脫除溶劑后加適量三正丁胺中和后，放置冰箱過(guò)夜。析出的晶體經(jīng)過(guò)濾、洗滌后得3.2gα-芐酯L-谷氨酸(收率67％)，熔點(diǎn)145～147℃，[α]25D＝+12.3°(c＝2.90.1N HCl)。
(3)酰氯化反應(yīng)將2.4g(0.01mol)α-芐酯L-谷氨酸懸浮在200ml無(wú)水乙醚中，0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應(yīng)2.5小時(shí)，除去溶劑并蒸餾后得到2.2gα-酯-L-谷氨酰氯固體(收率87％)。
(4)氨解反應(yīng)取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1gα-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液處理?；旌衔锝?jīng)冷卻、過(guò)濾、提取后，最后得到4.5gα-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率95％)。
(5)解保護(hù)將4.5gα-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應(yīng)5小時(shí)，母液經(jīng)濃縮、提取后得到2.42gγ-15N標(biāo)記L-谷氨酰胺(收率87％)，熔點(diǎn)183～185℃，[α]20D＝+32.3°(c＝10 2N HCl)。
實(shí)施例2一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應(yīng)將14.7g(0.1mol)L-谷氨酸和30ml苯懸浮分散在80ml苯甲醇中，配備油水分離器，向其中通入過(guò)量無(wú)水氯化氫氣體，于60℃回流12小時(shí)，加入過(guò)量乙醚沉淀、重結(jié)晶后得到L-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽20.7g(單程收率57％)，熔點(diǎn)99.5～101.1℃。
反應(yīng)母液經(jīng)減壓脫除乙醚后，補(bǔ)加適量酸和苯甲醇，回流下繼續(xù)反應(yīng)5～10小時(shí)，至薄層層析顯示無(wú)L-谷氨酸存在。參照以上步驟處理仍可得到7.1gL-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽，合并后酯化總收率76.4％。
(2)選擇性裂解反應(yīng)將7.3g(0.02mol)L-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽溶解于80ml冰乙酸中，加入10ml脫色恒沸HI酸，50℃下反應(yīng)12小時(shí)。母液脫除溶劑后加適量三正丁胺中和后，放置冰箱過(guò)夜。析出的晶體經(jīng)過(guò)濾、洗滌后得2.7gα-芐酯L-谷氨酸(收率57％)，熔點(diǎn)144～146℃，[α]25D＝+12.3°(c＝2.90.1N HCl)。
(3)酰氯化反應(yīng)將2.4g(0.01mol)α-芐酯L-谷氨酸懸浮在200ml無(wú)水乙醚中，0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應(yīng)2.5小時(shí)，除去溶劑并蒸餾后得到2.2gα-酯-L-谷氨酰氯固體(收率87％)。
(4)氨解反應(yīng)取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1gα-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液處理?；旌衔锝?jīng)冷卻、過(guò)濾、提取后，最后得到4.5gα-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率95％)。
(5)解保護(hù)將4.5gα-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應(yīng)5小時(shí)，母液經(jīng)濃縮、提取后得到2.42gγ-15N標(biāo)記L-谷氨酰胺(收率87％)，熔點(diǎn)183～185℃，[α]20D＝+32.3°(c＝102N HCl)。
實(shí)施例3一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應(yīng)將14.7g(0.1mol)L-谷氨酸、15ml氯化亞砜和30ml苯懸浮分散在80ml苯甲醇中，配備油水分離器，于150℃回流6小時(shí)，加入過(guò)量乙醚沉淀、重結(jié)晶后得到L-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽15.5g(單程收率42.6％)，熔點(diǎn)99.1～101.3℃。
反應(yīng)母液經(jīng)減壓脫除乙醚后，補(bǔ)加適量氯化亞砜和苯甲醇，回流下繼續(xù)反應(yīng)2～5小時(shí)，至薄層層析顯示無(wú)L-谷氨酸存在。參照以上步驟處理仍可得到4.1gL-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽，合并后酯化總收率53.6％。
(2)選擇性裂解反應(yīng)將7.3g(0.02mol)L-谷氨酸二芐酯鹽酸鹽溶解于80ml冰乙酸中，加入10ml脫色恒沸HI酸，50℃下反應(yīng)24小時(shí)。母液脫除溶劑后加適量三正丁胺中和后，放置冰箱過(guò)夜。析出的晶體經(jīng)過(guò)濾、洗滌后得2.9gα-芐酯L-谷氨酸(收率61.1％)，熔點(diǎn)144～146℃，[α]25D＝+12.3°(c＝2.90.1N HCl)。
(3)酰氯化反應(yīng)將2.4g(0.01mol)α-芐酯L-谷氨酸懸浮在200ml無(wú)水乙醚中，0.012mol的氯化亞砜于回流和攪拌下反應(yīng)2.5小時(shí)，除去溶劑并蒸餾后得到2.2gα-酯-L-谷氨酰氯固體(收率87％)。
(4)氨解反應(yīng)取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氫氧化鈉1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及5.1gα-酯-L-谷氨酰氯的50ml苯溶液處理。混合物經(jīng)冷卻、過(guò)濾、提取后，最后得到4.5gα-芐酯-L-谷氨酰胺(15N收率95％)。
(5)解保護(hù)將4.5gα-酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml乙醇中，加入0.5g 5％Pt/C催化劑，于常壓下加氫反應(yīng)8小時(shí)，母液經(jīng)濃縮、提取后得到2.3gγ-15N標(biāo)記L-谷氨酰胺(收率82.7％)，熔點(diǎn)184～185℃，[α]20D＝+32.4°(c＝10 2N HCl)。
權(quán)利要求
1.一種同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，該方法包括以下工藝步驟(1)酯化反應(yīng)將原料L-谷氨酸分散在醇類(lèi)溶劑中，60℃～150℃回流溫度下逐漸加入無(wú)機(jī)或有機(jī)酸催化劑，并在此溫度下反應(yīng)5～25小時(shí)；用乙醚重結(jié)晶得到L-谷氨酸二酯鹽固體；L-谷氨酸、醇、催化劑的用量比為1∶5～40∶0.2～1.5；(2)選擇性裂解將L-谷氨酸二酯鹽分散在冰乙酸中，在30℃～90℃下，逐滴滴加恒沸HI酸，反應(yīng)4～30小時(shí)，反應(yīng)母液經(jīng)減壓脫除溶劑后，加入適量有機(jī)胺中和，放置后過(guò)濾得到L-谷氨酸-α-酯固體；L-谷氨酸二酯鹽、乙酸、HI酸的用量比為1∶5～100∶1～5；(3)酰氯化將L-谷氨酸-α-酯固體、氯化亞砜于回流和攪拌下反應(yīng)2～10小時(shí)，除去溶劑并蒸餾后得到產(chǎn)物α-酯-L-谷氨酰氯；(4)酰胺化將α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氫氧化鈉水溶液混合后，加入非標(biāo)記或15N標(biāo)記無(wú)機(jī)氮源，在-10℃～20℃低溫下條件下氨解1～10小時(shí)，冷卻、提取和干燥后，蒸去溶劑得到α-酯-L-谷氨酰胺產(chǎn)品；(5)解保護(hù)將15N標(biāo)記α-酯-L-谷氨酰胺通過(guò)皂化或加氫的方法脫除α-酯，得到同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，所述的醇類(lèi)溶劑選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或苯甲醇中的一種或幾種的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸選擇鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、氯化亞砜、三氯氧磷、對(duì)甲苯磺酸中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，所述的原料L-谷氨酸包括非標(biāo)記或15N標(biāo)記的L-谷氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，所述的用量比為摩爾比。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同位素標(biāo)記15N-L-谷氨酰胺的制備方法，其特征在于，所述的解保護(hù)工藝得到的產(chǎn)品為γ-15N標(biāo)記或α-、γ-雙15N標(biāo)記的L-谷氨酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記
文檔編號(hào)C07C237/06GK101041628SQ20061002494
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2006年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日
發(fā)明者羅勇, 王博, 強(qiáng)歌, 陸平曄, 李美華 申請(qǐng)人:上?；ぱ芯吭?br>