專利名稱：檢測樣品中的分析物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于檢測樣品中的分析物的方法。本方法是基于 以多核苷酸為底物的聚合酶活性，其中多核苷酸底物連接于結(jié)合分析物 的分子，例如抗體。通過摻入適當(dāng)標(biāo)記的核苷酸，和/或摻入半抗原偶聯(lián) 核苷酸，可檢測聚合酶的活性，其中半抗原偶聯(lián)核苷酸能夠結(jié)合半抗原 的適當(dāng)標(biāo)記的配體。
背景技術(shù)：
低水平的靶分析物的檢測、計數(shù)和鑒定，是常規(guī)醫(yī)療、工業(yè)和環(huán)境 診斷法的基礎(chǔ)。例如，對樣品進(jìn)行分析，以檢測來自感染體、癌細(xì)胞、
激素、生產(chǎn)雜質(zhì)、污染物和用于生物恐怖主義(bioterrorism)的介質(zhì)的分 子。
許多不同類型的所述檢測方法被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床實驗 醫(yī)學(xué)中。已經(jīng)證實在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中，用于檢測特異大分子種類(例如 蛋白質(zhì))的方法是很有價值的分析技術(shù)，特別是用于鑒定正常和異常組 織樣品的分子組分。所述檢測方法的實例包括免疫測定法、用于鏡檢 的免疫化學(xué)染色法、熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)等等。
通常，檢測方法使用至少一種結(jié)合特異靶分析物并產(chǎn)生可檢測信號 的分析試劑。這些分析試劑通常具有兩種組分(1)探針大分子，例 如，可通過高度特異性和親合性結(jié)合靶分析物的抗體，和(2)可檢測標(biāo) 記，例如放射性同位素或共價連接的可檢測分子。通常，探針大分子的 結(jié)合特性限定了檢測方法的特異性，相關(guān)標(biāo)記的檢測能力決定了檢測方
法的靈敏性。檢測法的靈敏性反過來涉及所用標(biāo)記的類型和用于檢測標(biāo) 記的現(xiàn)有設(shè)備的質(zhì)量以及類型。
在個體中，癌癥的診斷仍然是難以實現(xiàn)的任務(wù)。盡管可以使用從血
液或組織樣品中獲得的一些診斷性標(biāo)記，例如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋 白(AFP)或前列腺特異抗原(PSA)，但迄今為止，對于這些個體中的癌癥 存在，根據(jù)其它臨床診斷的證實，使用這些標(biāo)記的分析法并不具有顯著 的靈敏性和/或特異性。
免疫學(xué)檢測、或免疫測定法，廣泛用于醫(yī)療診斷中。以抗體和相應(yīng) 的靶分析物的相互作用為基礎(chǔ)，免疫測定法用于檢測從小尺寸(如，濫 用的藥物)到大尺寸(如，HIV蛋白)范圍的寬范圍的分子。血清學(xué)檢 測是檢測宿主對預(yù)先暴露抗原的免疫反應(yīng)、而不是直接測試抗原的免疫 測定法，即它們檢測針對抗原的宿主抗體的存在。從大型自動化中心實 驗室系統(tǒng)到非處方(over-the-counter, OTC)妊娠測試均可獲得許多的免疫 測定系統(tǒng)。檢測覆蓋各種形式，包括乳膠凝集試驗、沉淀試驗、酶聯(lián)免 疫測定、直接熒光分析、免疫組織學(xué)測試、補體結(jié)合試驗、血清學(xué)試 驗、免疫電泳分析、快速"試紙"檢測(如，側(cè)向橫流測試(lateral flow test)和流動測試(flow through test))。許多免疫學(xué)檢測的一個缺 點是它們相對不敏感。更具體地說，許多免疫測定法，例如酶聯(lián)免疫測 定(ELISA)，僅僅導(dǎo)致單個標(biāo)記部分與分析物的結(jié)合。結(jié)果，樣品中分 析物水平較低時，所述的方法不產(chǎn)生足夠強的信號來提供樣品中分析物 的量的精確讀數(shù)，并因此容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
在已經(jīng)發(fā)展的試圖改進(jìn)免疫測定法靈敏性的方法中，至少一種方 法是"免疫PCR" (Sano等，1992; Adler等，2003; Joerger等，1995; Sperl等，1995)。該方法以形成分析物-抗體復(fù)合體為基礎(chǔ)，其中抗體偶 聯(lián)于多核苷酸。然后，將多核苷酸作為模板用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR》 擴增產(chǎn)物作為測試樣品中分析物水平的指示物。然而，眾所周知，該方 法的主要問題是PCR指數(shù)擴增靶多核苷酸的缺陷，和由此引起的在靈敏
性與準(zhǔn)確性之間獲得合適平衡以提供樣品中分析物水平的真實指示的困 難。
Zhang等人(2001)描述了已經(jīng)研發(fā)的、試圖改進(jìn)免疫測定法的靈敏 性的另一方法。Zhang等人(2001)設(shè)計了涉及包含RNA聚合酶啟動子的 多核苷酸的方法，而不是依賴于偶聯(lián)抗體的多核苷酸的PCR擴增。 RNA聚合酶結(jié)合啟動子之后，轉(zhuǎn)錄互補于多核苷酸的RNA。然而，該 方法的缺點在于所產(chǎn)生的產(chǎn)物是RNA，而RNA在許多生物樣品中非 常易于降解。
需要可用于檢測樣品中的分析物的另外的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人設(shè)計了用于在樣品中檢測分析物的分析方法。本發(fā)明的分 析方法導(dǎo)致形成可檢測的復(fù)合體，其包含超過一種與分析物結(jié)合的標(biāo)記 部分。
在第一個方面中，本發(fā)明提供用于篩查樣品中存在或不存在分析物 的方法，該方法包括-
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物-第一化合物復(fù)合 體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中 第二化合物包含多核苷酸，
iii) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚 合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或b)能容許聚 合酶合成多核苷酸的互補鏈，和
iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進(jìn)一步合成多核 苷酸。
在第二個方面中，本發(fā)明提供用于篩査樣品中存在或不存在分析物 的方法，該方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物-第二化合物復(fù)合體的第二化合物，以形 成分析物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，
ii) 將分析物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以 形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，
iii) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚
合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或b)能容許聚
合酶合成多核苷酸的互補鏈，和
iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進(jìn)一步合成多核 苷酸。
檢測到分析中所產(chǎn)生的聚合酶產(chǎn)物，表明存在所分析的分析物。還 可測定產(chǎn)物的量，并且產(chǎn)物的量與被分析的分析物的量有關(guān)。因此，本 發(fā)明的方法可用于檢測、或用于檢測并定量測試樣品中的分析物。
在特別優(yōu)選的實施方案中，聚合酶延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多 核苷酸的單鏈突出端(single stranded overhang)。
上述實施方案不但具有不需要加入引物的優(yōu)點，而且額外的優(yōu)點在 于連接于(例如)抗體的多核苷酸相對較短。因此，在另外的優(yōu)選實施 方案中，多核苷酸長度小于約100個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約75個 核苷酸、更優(yōu)選長度小于約50個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約40個核苷 酸、更優(yōu)選長度小于約30個核苷酸、更優(yōu)選長度小于約20個核苷酸。
在另一個實施方案中，該方法不包括使用雜交多核苷酸的引物。
延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多核苷酸的單鏈突出端的聚合酶的實 例，包括但不限于，poly(A)聚合酶、T4RNA連接酶、端粒酶以及末端 轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，聚合酶為端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶。端粒酶可分離自天然來源或重組產(chǎn)生。此外，端粒酶可來自產(chǎn)生所 述分子的生物體，或其具有端粒酶活性的變體/衍生物/突變體。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞、特別是人癌細(xì)胞，可提供用于本發(fā)明方 法的端粒酶的便利來源。因此在優(yōu)選的實施方案中，通過裂解產(chǎn)生端粒 酶的癌細(xì)胞來獲得端粒酶。值得注意的是，現(xiàn)己確定在被用于本發(fā)明方 法之前，不必從細(xì)胞裂解物其它成分中純化端粒酶。因此，優(yōu)選不必實 施任何過程來從被裂解細(xì)胞的其它成分中純化端粒酶。
如上指出的，優(yōu)選地，聚合酶能夠在缺少合適引物時延伸多核苷酸
或合成多核苷酸的互補鏈。然而，在一些利用酶(例如Taq聚合酶)的 實施方案中，需要有合適的引物，所述的引物在反應(yīng)條件下可雜交多核 苷酸并起到引發(fā)互補鏈的合成的作用。根據(jù)多核苷酸序列，很容易設(shè)計 合適的引物。所述的引物通常較小，長度至少約12個核苷酸、長度至 少約15個核苷酸、長度至少約18個核苷酸、長度至少約21個核苷酸、 或長度至少約24個核苷酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，引物是線性 的。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，引物是非環(huán)狀的。
在另一個實施方案中，聚合酶是DNA聚合酶。合適的DNA聚合酶 包括但不限于，Taq聚合酶、噬菌體T4聚合酶、噬菌體T7聚合酶以及 大腸桿菌(Eco/Z)DNA聚合酶I的Klenow片段。
在另外的實施方案中，其中在聚合酶是RNA聚合酶的情況下，多 核苷酸不包含被RNA聚合酶用來引發(fā)RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子區(qū)。
優(yōu)選地，第一化合物和/或第二化合物附著在固相支持物上?？墒褂?技術(shù)人員已知的任何合適的固相支持物。實例包括但不限于，磁珠、生 物傳感器芯片、微量滴定板的孔、浸染棒以及微陣列玻片。
在另一個實施方案中，在存在至少一種以可檢測方式標(biāo)記的核苷酸 的情況下，實施步驟iii)?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何適當(dāng)標(biāo)記的核苷 酸。實例包括但不限于，放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生 物發(fā)光標(biāo)記以及酶標(biāo)記。
在另外的實施方案中，在存在至少一種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況 下，實施步驟iii)，其中半抗原能結(jié)合配體。合適半抗原的實例包括但 不限于，半胱氨酸、賴氨酸、絲氨酸、生物素、抗生物素蛋白以及鏈霉 抗生物素蛋白。
優(yōu)選地，以可檢測方式標(biāo)記配體?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適 的可檢測標(biāo)記。實例包括但不限于，放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā) 光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記以及酶標(biāo)記。
優(yōu)選地，步驟iii)還包括將聚合酶活性的產(chǎn)物暴露于以可檢測方式 標(biāo)記的配體。
優(yōu)選地，可檢測的標(biāo)記是酶?？墒褂眉夹g(shù)人員已知的任何合適的標(biāo)
記的酶。實例包括但不限于，e-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、 神經(jīng)氨酸酶以及辣根過氧化物酶。優(yōu)選地，步驟m)的聚合酶活性的產(chǎn) 物是至少包含多核苷酸和摻入其中的半抗原偶聯(lián)的核苷酸的復(fù)合體，其
中至少部分半抗原結(jié)合于酶標(biāo)配體，并且步驟iv)包括將步驟iii)的產(chǎn)物
暴露于可允許酶產(chǎn)生可檢測信號的條件。
優(yōu)選地，通過酶與底物反應(yīng)來產(chǎn)生可檢測信號。用于本發(fā)明方法的
合適底物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。實例包括但不限于，魯米諾或9，10-
二氫化吖啶(acridan)。還需要用于酶活的輔因子，例如在包含魯米諾 作為底物的反應(yīng)中所存在的過氧化氫。此外，提供可增強可檢測信號的 分子。所述的分子在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于對碘酚或?qū)?苯基苯酚。
優(yōu)選地，可檢測信號是發(fā)光或熒光。
本發(fā)明的每種方法都極有可能包括除去未結(jié)合的分析物、化合物、 底物等等的步驟。所述步驟的實例包括但不限于
，第一方面的步驟i)還包括洗滌分析物-第一化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第一化合物，
，第二方面的步驟i)還包括洗滌分析物-第二化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第二化合物，
*步驟ii)還包括洗滌分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，以除去 未結(jié)合的第一和/或第二化合物，
，除去未摻入的以可檢測方式標(biāo)記的核苷酸、和/或
，除去未摻入的以可檢測方式標(biāo)記的配體。
第一化合物是特異結(jié)合樣品中的分析物的任何化合物。在優(yōu)選的實 施方案中，第一化合物是蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，第一化合物是抗體。
第二化合物包含多核苷酸，特異結(jié)合分析物和/或第一化合物-分析 物復(fù)合體。優(yōu)選地，第二化合物是蛋白質(zhì)-多核苷酸偶聯(lián)物。更優(yōu)選地， 第二化合物是抗體-多核苷酸偶聯(lián)物。此外，優(yōu)選第二化合物結(jié)合分析 物。
在優(yōu)選的實施方案中，分析物是疾病狀態(tài)的標(biāo)記。更優(yōu)選地，疾病 狀態(tài)選自但不限于，癌癥和感染。
使用本發(fā)明方法可檢測的合適分析物，包括有機和無機分子，所述 分子包括生物分子。在優(yōu)選的實施方案中，分析物是蛋白質(zhì)、肽或小分 子，例如有機小分子。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以
形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含可被 端粒酶延伸的多核苷酸，
iii) 在允許端粒酶延伸多核苷酸的條件下，在存在至少一種半抗原 偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露 于端粒酶，
iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將端粒酶活性的產(chǎn)物暴露于酶
標(biāo)記的配體，
v) 在存在酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù)合
體，以及
vi) 檢測由酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。 在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以 形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含可被 末端轉(zhuǎn)移酶延伸的多核苷酸，
iii) 在允許末端轉(zhuǎn)移酶延伸多核苷酸的條件下，在存在至少一種半 抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體 暴露于末端轉(zhuǎn)移酶，
iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將末端轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物暴露 于酶標(biāo)記的配體，
V)在存在酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù)合 體，以及
vi)檢測由酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
在另一方面中，本發(fā)明提供了用于篩査樣品中存在或不存在分析物
的方法，該方法包括
i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，
ii) 將分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合分析物-第一化合物復(fù)合 體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，
iii) 將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合第二化合物 的第三化合物，其中第三化合物包含多核苷酸，
w)在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物-第三化合物復(fù)合
體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延長多核苷酸，或 b)能容許聚合酶合成多核苷酸的互補鏈，禾口 v)檢測步驟iv)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，
其中步驟iii)的部分b)不包括使用互補鏈作為模板進(jìn)一步合成多核 苷酸，并且其中將第一和/或第二化合物附著于固相支持物。
在本發(fā)明的該方面中，"第三化合物"被認(rèn)為是可用于任何分析物 的檢測方法的"通用"試劑。在該方面中，優(yōu)選第二化合物是抗體，第 三化合物包含抗體，其中第二化合物(抗體)來自于第一動物物種，第 三化合物的抗體結(jié)合第二化合物(抗體)并來自于不同的動物物種。所 述的抗體及其制備方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，第二化合物(抗 體)來源于用分析物免疫的小鼠，第三化合物包含抗小鼠抗-IgG兔抗 體。在另一個實例中，第二化合物(抗體)來源于用分析物免疫的兔， 第三化合物包含抗兔抗-IgG山羊抗體。
使用"通用"試劑的測定法所具有的優(yōu)點，在于不需要生成用于檢 測不同分析物的多核苷酸偶聯(lián)物。例如，可從小鼠制備兩種分別獨立地 結(jié)合已知癌標(biāo)記CEA和PSA的不同抗體，然而，相同的多核苷酸偶聯(lián) 的抗-小鼠抗-IgG兔抗體可用于檢測這些分析物的不同方法。
在應(yīng)用聚合酶后，可從復(fù)合體解離出所合成或延伸的多核苷酸鏈， 然而在本發(fā)明的任何方面中，不需要實施解離步驟即可容易地進(jìn)行所合 成或延伸的鏈的檢測。
通過改變關(guān)鍵因子的濃度(例如結(jié)合分析物的化合物濃度、核苷酸 前體濃度、標(biāo)記的核苷酸前體與未標(biāo)記的核苷酸前體的比例、聚合酶量 以及檢測方法)，實施者可將本發(fā)明方法的靈敏性控制在某種程度上。 通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法，可優(yōu)化具體的分析法。
還提供了蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被其 延伸的序列，蛋白質(zhì)共價連接于DNA。所述的偶聯(lián)物可用于本發(fā)明的 方法中。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是抗體。
在另一個方面中，本發(fā)明提供包含了本發(fā)明的蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物 的試劑盒。
顯而易見的是，本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特征和特性可適用于本發(fā) 明的許多其它方面。
貫穿說明書的用語"包括"，或其變體，例如"包含"或"含 有"，可被理解為暗示包括了所述的要素、整體或步驟，或包括了所述 的要素、整體或步驟的集合，但不排除任何其它的要素、整體或步驟， 或不排除任何其它的要素、整體或步驟的集合。
在下文中通過下列非限制性實施例并參照附圖，來描述本發(fā)明。


圖l一本發(fā)明第一個方面的方法的實施方案的示意圖。在該實例 中，第一化合物是結(jié)合磁珠的抗體。磁珠使得在洗滌步驟中使用磁選機 容易地將磁珠上形成的復(fù)合體與未結(jié)合成分分離。將包含分析物的樣品 與可使得分析物結(jié)合其上的第一化合物一起溫育，而后通過第二化合物 進(jìn)行溫育步驟。在該實例中，第二化合物是抗體-DNA偶聯(lián)物，其與第 一化合物在不同的位置結(jié)合分析物。多核苷酸包括能結(jié)合人端粒酶并被 其延伸的序列。然后，在存在合適的核苷酸前體(包括生物素標(biāo)記的 dUTP)的情況下，將分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體與人端粒酶 一起溫育。然后，將摻入到延長的多核苷酸中的生物素標(biāo)記的dUTP， 與抗生物素蛋白標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)—起溫育。然后，在存在 過氧化氫、魯米諾和碘酚的情況下，通過溫育分析物-第一化合物-第二 化合物-生物素dUTP-抗生物素蛋白-HRP復(fù)合體，并在光度計中檢測光 信號，以將HRP活性作為樣品中分析物的量的指示物。
圖2—NY-ESO與兩種抗NY-ESO-l抗體(ES121和E978)的同時 結(jié)合的BIAcore分析。
圖3—通過使用抗-NY-ESO-l抗體偶聯(lián)的珠和作為抗原的NY-ESO-1陽性黑素瘤細(xì)胞系的裂解物，基于磁珠的夾心法ELISA表明與黑素瘤 細(xì)胞數(shù)目直接相關(guān)的線性響應(yīng)。
圖4一通過使用抗-EGFR抗體偶聯(lián)的珠和作為抗原的純化的 EGFR，基于磁珠的夾心法ELISA表明與重組蛋白濃度直接相關(guān)的線性 響應(yīng)。
圖5—在Superdex75柱(Amersham Bioscience)上可將交聯(lián)劑修飾 的抗體與未修飾的抗體分離，這表明使用兩種不同的抗體的偶聯(lián)反應(yīng)是 成功的，并且根據(jù)表觀分子大小可純化這些試劑。
圖6—在與還原的寡核苷酸偶聯(lián)后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。這些 數(shù)據(jù)證實在圖5中所報道的觀測結(jié)果，其中當(dāng)用溴化乙錠染色時，結(jié)合 寡核苷酸的抗體產(chǎn)生強的帶。
圖7—在Superose12柱(30/10)(Amersham Bioscience)上，使用空間 排阻層析法，從過量寡核苷酸分離的偶聯(lián)抗體的分布型。這些數(shù)據(jù)支持
了圖5中所作的預(yù)測使用標(biāo)準(zhǔn)色譜法，可實施結(jié)合寡核苷酸的抗體的 純化。
圖8 — 1.5%瓊脂糖凝膠，其顯示了通過空間排阻層析法，在 Superose12柱(30/10)(Amersham Bioscience)上進(jìn)行純化后的寡核苷酸偶 聯(lián)抗體。顯示了每種抗體的峰值洗脫餾分8、 9、 10。
圖9一偶聯(lián)之前的抗體(泳道l&3)和純化的偶聯(lián)抗體(泳道 2&4)的SDS-PAGE (3-8% Tris-乙酸)，表明寡核苷酸結(jié)合抗體的復(fù)合 體具有合適的和預(yù)期的分子量。
圖IO—在Superose 12層析后，偶聯(lián)抗體的Mono Q洗脫曲線。峰 值不均一性表明多個寡核苷酸可偶聯(lián)抗體，進(jìn)一步提供適于延伸反應(yīng) 的時機，并因此增強了本發(fā)明的測定法的檢測能力。
圖11 —在離子交換分離層析(MonoQ柱)后，寡核苷酸-偶聯(lián)抗體的 1.5%瓊脂糖凝膠。獨立地證實某些寡核苷酸-偶聯(lián)抗體具有多個附著的 核酸部分。
圖12—使用端粒酶，延伸結(jié)合抗體的寡核苷酸。增強的發(fā)光表明 在存在端粒酶的情況下，所摻入的生物素化UTP增加。
圖13—通過放大發(fā)光法(amplified luminescence)檢測NY-ESO-1 的測定結(jié)果(n-3)。
圖14一在使用末端轉(zhuǎn)移酶而放大信號后，檢測磁珠結(jié)合寡核苷酸。
圖15—顯示偶聯(lián)抗體的端粒酶識別序列的延伸反應(yīng)的基于磁珠的分 析。將末端轉(zhuǎn)移酶與作為底物的熒光素-dUTP —起用于延伸反應(yīng)。HI= 熱失活。
圖16 —放大的蛋白發(fā)光分析，其中顯示在存在末端轉(zhuǎn)移酶和熒光
素-dUTP的情況下，通過LMH42-寡核苷酸偶聯(lián)物對可溶性EGFR (殘 基1-621)的特異檢測。
圖17—基于磁珠的端粒酶分析，其中顯示在衍生于膀胱癌細(xì)胞系 (LAR41)的粗提取物和預(yù)凈化的提取物中的酶活性。HI-熱失活。
具體實施例方式
常規(guī)技術(shù)和定義
除非另外特別定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語具有對 于所屬領(lǐng)域(如，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋 白質(zhì)化學(xué)以及生物化學(xué)領(lǐng)域)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。
除非另外指出，本發(fā)明中所用的重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)以及免疫技 術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法。所述的技術(shù)在下列 來源的文獻(xiàn)中已經(jīng)得到全部描述和說明，例如J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley禾口 Sons (1984); J. Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); T.A. Brown (編者)，Essential Molecular Biology: A Practical Approach,第1巻和第2巻，IRL Press (1991); D.M. Glover和 B.D. Hames (編者)，DNA Cloning: A Practical Approach,第1-4巻，IRL Press (1995年禾卩1996年)；禾Q F.M. Ausubel等(編者)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988年，包括迄今為止的所有更新版)；Ed Harlow和David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988);和J.E. Coligan等(編者)Current Protocols in
Immunology, John Wiley & Sons (包括迄今為止的所有更新版)，并且以 引用的方式并入本文。
"樣品"指疑似含有目的分析物的物質(zhì)?？墒褂脧膩碓粗苯荧@得的 樣品，或在至少一個步驟后，使用至少部分純化來自從來源直接獲得的 樣品的目的分析物。所述的樣品包括，例如，人、動物、植物、微生物 或人造樣品?？稍诓桓缮娣治龅娜魏伪憷慕橘|(zhì)中制備樣品。通常，樣 品是如下更詳述的水性溶液或生物流體。樣品可來源于任何來源，例如 生理流體，包括血液、血清、血漿、唾液、痰液、眼晶狀體液、汗液、 糞便、尿液、乳液、腹水、粘液、滑液、腹膜液、皮膚分泌液、咽分泌 液、支氣管肺泡灌洗液、氣管吸痰液、腦脊髓液、精液、子宮頸粘液、 陰道分泌液或尿道分泌液、羊水，等等。本文中，細(xì)胞組織的流體勻漿 液，例如毛發(fā)、皮膚和指甲碎屑、肌肉的提取液，以及水果和堅果的皮 也被認(rèn)為是生物流體。預(yù)處理包括從血液、稀釋的粘性流體等等制備血 漿。處理方法包括過濾、蒸餾、分離、濃縮、干擾組分的失活以及加入 試劑。除了生理流體之外，可使用適于工業(yè)、環(huán)境或食品生產(chǎn)分析以及 診斷分析的其它樣品，例如水、食品、土壤浸出液等等。另外，疑似含 有分析物的固體物質(zhì)可作為測試樣品，只要將其改變以形成液體介質(zhì)或 釋放分析物。在測試之前，生物、工業(yè)以及環(huán)境樣品的選擇和預(yù)處理， 在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并不需要另外說明。
術(shù)語"分析物"指通過本發(fā)明方法而被檢測或分析的物質(zhì)。典型分 析物包括但不限于，有機分子、無機分子、蛋白質(zhì)、肽、細(xì)胞、微生物 及其片段和產(chǎn)物，或用于研究附著位點、結(jié)合元件或受體(例如抗體) 的任何物質(zhì)。
如本文中所用的，"核苷酸"指堿基-糖-磷酸酯組合。核苷酸是核 酸序列(DNA和RNA)的單體單元。術(shù)語核苷酸包括脫氧核糖核苷三 磷酸，例如dATP、 dCTP、 dITP、 dUTP、 dGTP、 dTTP或其衍生物。所 述的衍生物包括，例如，7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP。根據(jù)本發(fā)明，
"核苷酸"可以是未標(biāo)記的，或者通過眾所周知的技術(shù)進(jìn)行可檢測標(biāo) 記。然而，本發(fā)明方法中所用的至少一種核苷酸是可被檢測標(biāo)記的，或 被偶聯(lián)于合適的半抗原。
術(shù)語"半抗原"指可連接于核苷酸并被聚合酶摻入多核苷酸的任何 分子。此外，半抗原能結(jié)合至少一種分子(本文中通常是指"半抗原" 的"配體")，也就是說連接于合適的可檢測標(biāo)記，例如本文中所述的 標(biāo)記。正如技術(shù)人員理解的，用語"半抗原"和"配體"僅僅作為限定 本發(fā)明實施方案的便利術(shù)語。具體地說，半抗原和配體是結(jié)合對的成 員，然而，究竟結(jié)合對的哪一個成員連接于例如核苷酸并不重要。例如 在一個實施方案中，半抗原可以是生物素，配體是鏈霉抗生物素蛋白， 然而在另一個實施方案中，半抗原是鏈霉抗生物素蛋白，而配體是生物 素。用于本發(fā)明方法的合適半抗原和配體("結(jié)合對")是本領(lǐng)域中眾 所周知的。
多核苷酸偶聯(lián)物
本發(fā)明方法需要包含多核苷酸的偶聯(lián)化合物和結(jié)合目的靶的分子 (例如蛋白質(zhì)，如抗體)。在許多實施方案中，目的靶是待測分析物。 然而，本發(fā)明也提供使用"通用"偶聯(lián)化合物，這是針對可直接結(jié)合分 析物的分子(例如抗體)。
多核苷酸可以是DNA或RNA或其組合。多核苷酸可以是單鏈或雙 鏈或其組合。
如本文中所用的，術(shù)語"多核苷酸"也指還能被延伸或作為多核苷 酸合成的模板的DNA和/或RNA衍生物。所述衍生物的實例是肽核酸 (PNA)。 PNA通常具有由肽鍵連接的重復(fù)N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元組成 的骨架，而不是具有核糖骨架。通過甲叉羰基鍵，各種嘧啶和嘌呤堿基 連接于骨架。與DNA/DNA雙螺旋相比，PNA對降解較不敏感，并且與 DNA可形成更加穩(wěn)固的雙螺旋。
通過本領(lǐng)域中任何已知的技術(shù)，將多核苷酸偶聯(lián)于結(jié)合目的靶的分 子上。實例包括但不限于，使用生物素-抗生物素蛋白的相互作用、二硫
鍵的形成、胺偶聯(lián)(參見，例如，Hendrickson等人，1995年)、硫醇 偶聯(lián)(參見，例如，Niemeyer等人，2003年)、或醛-肼的相互作用 (參見，例如，Kozlov等人，2004年)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它偶 聯(lián)劑，包括間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯或相關(guān)化合物、 碳二亞胺(例如l-乙基-3-(3-二乙氨基丙基)碳二亞胺(EDC))、琥珀酰亞 胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)乙垸-l-羧酸酯(SMCC)、戊二醛交聯(lián)劑。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，可將超過一種的多核苷酸偶聯(lián)于單個 分子(例如抗體)上。這可增強分析的靈敏性。
例如，將多核苷酸偶聯(lián)于抗生物素蛋白，優(yōu)選是鏈霉抗生物素蛋白 或中性抗生物素蛋白，然后連接于生物素化抗體。另外，例如，可使用 類似于Chu等人(1986)描述的方法，其中生物素通過二硫鍵連接于多核 苷酸的5'末端，并且生物素化的多核苷酸與抗生物素蛋白結(jié)合以形成多 核苷酸-生物素-抗生物素蛋白加合物，于是這可偶聯(lián)于生物素化抗體。 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用于將抗生物素蛋白連接于多核苷酸的其它 方法是已知的，例如使用蛋白A(Sano等人，1992)的方法、使用結(jié)合目的 靶的分子(例如蛋白質(zhì)，如抗體)的方法
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，在一些情況中，將多核苷酸偶聯(lián)于可結(jié)合 目的靶的分子(例如蛋白質(zhì)，如抗體)，可引起空間位阻，導(dǎo)致聚合酶 的減少。通過使用合適接頭(例如在文獻(xiàn)中以前描述的那些接頭，包括 Kwon等人(2004)、 Arora等人(2002)以及Ansari等人(2001)論述的接 頭)，可防止這種情況。
聚合酶
通常，在本發(fā)明方法中，可使用任何能延伸多核苷酸、和/或合成多 核苷酸互補鏈的聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴DNA的DNA聚合酶實例包括，但 不限于Tth DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Pwo聚合酶、來自細(xì)菌例 如大腸桿菌(五.co/Z)的DNA聚合酶I的K.lenow片段，以及T4 DNA聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴RNA的DNA聚合酶實例包括，但 不限于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Superscript III和Tth聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴DNA的RNA聚合酶實例包括，但 不限于T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和T3RNA聚合酶。
本發(fā)明方法中所用的合適的依賴RNA的RNA聚合酶實例包括，但 不限于Q|3復(fù)制酶、丙型肝炎RdRp、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)dRp 、蕪菁黃花葉病毒(turnip yellow mosaic virus)復(fù)制酶和RNA噬 菌體phi 6的依賴RNA的RNA聚合酶。
在特別優(yōu)選的實施方案中，聚合酶延伸單鏈多核苷酸或部分雙鏈多 核苷酸的單鏈突出端。所述聚合酶的實例包括但不限于，poly(A)聚合 酶、T4RNA連接酶、端粒酶和末端轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明方法中所用的端粒酶可分離自永生性人細(xì)胞。通過在低滲緩 沖液中或非離子型去垢劑中進(jìn)行提取，可純化端粒酶。還可通過DEAE 柱和后續(xù)純化技術(shù)，來進(jìn)行純化。然而，通過僅僅裂解合適的細(xì)胞而不 需要實施任何純化步驟，可獲得端粒酶。含有端粒酶的細(xì)胞來源可以是 人腫瘤細(xì)胞系，例如LIM 1215(Whitehead等，1985)、 Hela細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞(Graham等,1977)以及T-75細(xì)胞(vanBokhoven等，2001)。
端粒酶還可分離自許多其它來源，例如酵母或四膜蟲(Bryan 等,199S)?；蛘?，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組方法制備端粒酶。
通過人端粒酶而延伸的合適的多核苷酸序列實例包括，但不限于 TTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO :1) 、 TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT (SEQ ID NO 2)、TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO :3)以及TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAG (SEQ ID NO :4)。如 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，上述核酸可以是截短的或延長的，并還可用于本 發(fā)明方法。
四膜蟲可合成端粒重復(fù)序列5' TTGGGG 3' (SEQ ID NO:5)?？寺【?碼序列上的模板，并可改變其序列，以編碼人端粒重復(fù)序列5'TTAGGG 3' (SEQ ID NO:6)。然后通過改變RNA序列重組四膜蟲酶，以制備合成 人端粒序列的端粒酶?？蓮乃哪はx獲得大量的這種酶，純化，并加入細(xì) 胞。
在本領(lǐng)域中，已知通常通過癌細(xì)胞生產(chǎn)端粒酶。因此，在本發(fā)明方 法中，當(dāng)使用端粒酶(特別是哺乳動物端粒酶)作為用于檢測癌分析物 的酶時，優(yōu)選所述分析物與可內(nèi)源性包含在來自受檢對象的樣品中的任 何端粒酶是分離的。
末端轉(zhuǎn)移酶是催化單核苷酸dNTP反復(fù)添加到多核苷酸底物末端的 3'-OH上的聚合酶。適于這種酶的許多優(yōu)選的底物是突出的3'端，但所 述底物也可將核苷酸添加到DNA片段的平末端和3'凹末端上。通常鈷 是適于這種酶活性的必需輔因子，這些酶在某些情況下，可被引入分 析。末端轉(zhuǎn)移酶是在淋巴細(xì)胞中表達(dá)的哺乳動物酶類?？缮虡I(yè)上購買 酶，也通常可通過?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá)來進(jìn)行生產(chǎn)。商業(yè)來源的 實例是Promega(麥迪遜，威斯康星,美國)。
poly(A)聚合酶以不依賴序列的模式將腺苷添加到RNA的3'末端 上。通常使用距polyA位點約10-30個核苷酸的共有序列AAUAAA (SEQ ID NO:7)和該位點3'端的富GU和/或富U元件。如果AAUAAA 信號位于分子末端的合適距離，該信號通常對于聚腺苷酸化起始和延伸 反應(yīng)是足夠的。技術(shù)人員很容易制備可作為poly(A)聚合酶底物的RNA 分子。如本文中概述，酶可用于將標(biāo)記ATP添加到RNA分子的3'端，
以生成標(biāo)記RNA?？芍亟M制備poly(A)聚合酶，或通過從基本上任何真 核細(xì)胞進(jìn)行純化而獲得poly(A)聚合酶。本發(fā)明方法中所用的poly(A)聚 合酶商業(yè)來源包括Ambion公司(Austin,得克薩斯，美國)、 Invitrogen(Carlsbad,加利福尼亞，美國)以及USB公司(Cleveland,俄亥俄， 美國)。
多核苷酸合成及其檢測
在一個實施方案中，偶聯(lián)多核苷酸作為用于聚合酶合成互補鏈的模 板。在另一個實施方案中，通過聚合酶的作用，來延伸偶聯(lián)的多核苷 酸。
在一個實施方案中，通過將合適引物退火到偶聯(lián)多核苷酸區(qū)來引發(fā) 聚合酶活性。只要能特異退火到多核苷酸區(qū)，引物可以是任何長度或堿 基組成。在存在一種或多種核苷三磷酸的情況下，并且如果需要，還可 在存在輔助結(jié)合蛋白的情況下，實施延伸反應(yīng)。
優(yōu)選通過分析與摻入的核苷酸相結(jié)合的半抗原的存在，測定dNTP 的摻入。在優(yōu)選的實施方案中，通過測量連接于特異dNTP的生物素分 子的存在，來檢測合成的多核苷酸鏈。通過酶聯(lián)鏈霉抗生物素蛋白分子 和例如化學(xué)發(fā)光的底物，顯示與多核苷酸鏈相關(guān)的生物素的存在。
在一個實施方案中，通過聚合酶，將半抗原標(biāo)記的核苷酸(例如生 物素、地高辛配基)摻入不斷延伸的多核苷酸鏈。然后加入與半抗原結(jié) 合蛋白(配體)偶聯(lián)的酶以標(biāo)記多核苷酸。加入適于酶(例如堿性磷酸 酶、辣根過氧化物酶或e-半乳糖苷酶)的化學(xué)發(fā)光底物，來發(fā)光(由檢 測器記錄)。
用于將底物轉(zhuǎn)變成光的合適酶，包括螢光素酶，例如昆蟲螢光素 酶。螢光素酶產(chǎn)生作為催化終產(chǎn)物的光。最著名的發(fā)光酶是螢火蟲 (P/^i"^ (鞘翅目)的發(fā)光酶(參見，例如，美國專利
5,618,722)。另外，已經(jīng)克隆了許多來自牙買加叩頭蟲(尸;;rop/onw
<formula>formula see original document page 29</formula>鞘翅目)的螢光素酶基因。在存在螢光素、5'三磷酸腺 苷(ATP)、鎂離子和氧的情況下，螢火蟲螢光素酶催化生物發(fā)光，得到 0.88的量子產(chǎn)率。個別螢光素酶有時可產(chǎn)生不同波長的光，這使得能夠 同時監(jiān)測不同波長的發(fā)光。
螢光素酶可直接水解dATP，同時伴隨釋放光子。這產(chǎn)生假陽性信 號，因為水解發(fā)生獨立于由于聚合酶活性引起的dATP的摻入。為了避 免這種問題，可使用被摻入DNA中的dATP類似物，B卩，dATP類似物 是DNA聚合酶的底物而不是螢光素酶的底物。 一種所述的類似物是a-硫代-dATP。因此，使用a-硫代-dATP避免了假性光子的產(chǎn)生，其中當(dāng) dATP被水解而沒有被摻入生長的核酸鏈時，可出現(xiàn)假性光子的產(chǎn)生。
具有市售化學(xué)發(fā)光底物的酶的實例，包括e-半乳糖苷酶、堿性磷酸
酶、神經(jīng)氨酸酶和辣根過氧化物酶。
堿性磷酸酶常常偶聯(lián)于被用作二級檢測試劑的鏈霉抗生物素蛋白、 抗生物素蛋白或抗體。這些檢測試劑廣泛地用于各種應(yīng)用，包括 ELISA、和Northem、 Southern以及Western印跡技術(shù)。可使用顯色底物 (例如產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀的BCIP)、熒光磷酸酶底物以及化學(xué)發(fā)光底 物。堿性磷酸酶的CDP-Star 和CSPDTM (購自 Applied Biosystems,Foster City,力卩利福尼亞,美國)的化學(xué)發(fā)光底物，能相對靈 敏、快速、簡易地檢測堿性磷酸酶和堿性磷酸酶標(biāo)記的分子。
NA-Star 化學(xué)發(fā)光底物(Applied Biosystems)能靈敏地檢測神經(jīng)氯酸 酶活性。這種底物為廣泛應(yīng)用的熒光底物甲基傘形基N-乙酰神經(jīng)氨酸的 高靈敏度的替代物。通過產(chǎn)生用膜或儀器檢測的可見光，1,2-二氧環(huán)丁 烷化學(xué)發(fā)光底物能極敏感地檢測生物分子。酶誘導(dǎo)分解時，化學(xué)發(fā)光底 物放射可見光，提供低本底發(fā)光伴隨著高強度光輸出。
辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物可購自幾家制造商，包括 Alpha Diagnostic International，Inc.(San Antonio,Tex.) 禾卩 Pierce Biotechnology Inc.(Rockford，IL，USA)。 Alpha Diagnostic International's Nu
-Glo底物以穩(wěn)定的兩種組分溶液提供，且為基于魯米諾的溶液。在存在 過氧化氫的情況下，HRP將魯米諾轉(zhuǎn)換成激發(fā)態(tài)二階陰離子，它們在恢 復(fù)成其基態(tài)時發(fā)光?？赏ㄟ^使用暗室光度計或X光膠片測量所得的信 號，以提供永久記錄。
使用各種檢測裝置，如膠片、光電倍增管、CCD、 CMOS、消光光 度計、光度計、電荷注入器件(CID)、或其它固態(tài)檢測器，以及本文中 所述的裝置，可檢測和量化發(fā)光。在一個實施方案中，通過使用配備熔 合光導(dǎo)纖維束，進(jìn)行確定放射的光子量。在另一個實施方案中，通過 使用配備了微通道板增強器的CCD相機，實現(xiàn)了放射的光子的定量。 可使用薄型背照式CCD(back-thinned CCD)來提高靈敏性。Bronks等人 (1995)描述了CCD檢測器。
示例性CCD系統(tǒng)是配備了 Lockheed-Martin LM485 CCD芯片和單 根纖維直徑6-8pm的1-1光纖連接器(束)的Spectral Instruments, Inc. (Tucson, Arizona,美國)系列的600 4-端口相機。這種系統(tǒng)具有超過1600 萬像素，并具有10%至大于40%的量子效率。因此，根據(jù)波長，在 CCD傳感器上成像的差不多40%的光子被轉(zhuǎn)變成可檢測的電子。
在其它實施方案中，熒光部分可用作標(biāo)記，并可使用共聚焦掃描顯 微鏡來檢測反應(yīng)事件。另外，可使用掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡。
在本發(fā)明方法中，可利用其它可通過放射的光子而被檢測的底物 (標(biāo)記)的實例。9,10-二氫化吖啶底物與酶的反應(yīng)，產(chǎn)生可發(fā)光的激發(fā) 態(tài)中間體。例如，反應(yīng)可發(fā)生在Pierce Lumi-Phos WB底物和堿性磷酸 酶之間，然而可根據(jù)被其上的9,10-二氫化吖啶分子所取代的可裂部分而 改變所用的酶。魯米諾底物與過氧化物酶的反應(yīng)，產(chǎn)生不穩(wěn)定中間體， 該中間體發(fā)光可發(fā)光并被轉(zhuǎn)化成3-aminophtalate 二階陰離子。這種反應(yīng) 出現(xiàn)在Pierce SuperSignal ELISA Femto最高靈敏度的底物中。此外， 1,2-二氧環(huán)丁烷底物與酶的反應(yīng)，會產(chǎn)生不穩(wěn)定中間體，該中間體斷裂 產(chǎn)生兩種產(chǎn)物分子，即能發(fā)光的金剛烷酮和化學(xué)激發(fā)的熒光團。例如，
反應(yīng)可發(fā)生在Lumigen PPD和堿性磷酸酶之間。根據(jù)基于1,2-二氧環(huán)丁 烷的底物上取代的可裂部分，所用的酶可以不同。
對于大多數(shù)應(yīng)用而言，需要洗去未摻入的試劑，例如，用洗滌緩沖 液洗去未摻入的dNTP?？墒褂貌环恋K復(fù)合體的形成/穩(wěn)定性、和/或其檢 測的任何洗滌緩沖液。所述的洗滌緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
固相支持物
通常，本發(fā)明方法中所用的至少一種試劑需要被附著于合適的固相 支持物。在特別優(yōu)選的實施方案中，將第一化合物附著在固相支持物 上。然而，在某些情況中，通過與載體的非特異性相互作用(例如，在 蛋白質(zhì)和聚苯乙烯之間的疏水性相互作用)而被直接吸收，分析物可起 到俘獲試劑的作用。
在本領(lǐng)域中，本發(fā)明方法中所用的合適的固相支持物是常規(guī)的和眾 所周知的?？煽紤]各種可能的載體。例如，合適的固定化支持物包括但 不限于，合成聚合物支持物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸縮 水甘油酯(polyglycidylmethacrylate)、取代的聚苯乙烯(如，氨化 (animated)或羧化的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚氯乙烯，等 等)，玻璃，金，瓊脂糖，硝酸纖維素，和尼龍。這些材料可作為薄 膜、微量滴定板、加樣孔、珠、玻片、粒子、針(pin)、釘(peg)、試管、 膜或生物傳感器芯片?；蛘撸d體包括磁性和非磁性粒子。優(yōu)選的磁性 粒子是磁珠，例如購自Dynal Biotech (Oslo，挪威)、Polymer Labs Lodestar Beads (Shropshire ，英國)或Millipore CPG Beads (Millipore ,Lane Cove,澳大利亞)的磁珠。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用于將各種分子附著到各種金屬、玻 璃、塑料等等的許多方法和接頭分子以及底物都是眾所周知的(參見， 例如，EP188,256 ; US,671,958 ; US4,659，839 ; US4,414，148 ; US4,699，784; US4，680,338; US4,569,789; US4,589,071以及H, Weetall,
Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, Marcell Dekker， Inc.,紐約(1975))。例如，"接頭"可用于將合適分子附著到固相支持 物上。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，合適的接頭是眾所周知的，包括但不 限于，直鏈或支鏈碳接頭、雜環(huán)碳接頭或肽接頭。
具有與表面基團反應(yīng)的一種官能團和與期望分子(例如第一化合 物)反應(yīng)的另一種官能團的雙功能接頭，可用于形成所需的偶聯(lián)物?；?者，衍生化作用可包括化學(xué)處理。例如，將二氧化硅或玻璃基板進(jìn)行硅 垸化，以構(gòu)建官能團。類似地，例如，通過將連接于蛋白抗體的糖部分 與過碘酸酯進(jìn)行二元醇裂解(glycol cleavage)以產(chǎn)生游離醛基，可將蛋 白質(zhì)或糖蛋白進(jìn)行衍生化。在抗體或蛋白質(zhì)或糖蛋白上的游離醛基可與 表面的游離胺基或肼基反應(yīng)，以結(jié)合其上面的結(jié)合配偶體(參見 US4,671,95S)。用于在多肽(例如抗體或抗體片段)上產(chǎn)生游離巰基的 方法，也是已知的(參見US4,659,839)。
在水性環(huán)境中，可使用陣列來實施獨立平行的普通反應(yīng)。陣列具有 至少l，OOO個離散的反應(yīng)室的基片，其中反應(yīng)室含有能與試劑反應(yīng)的原 料，測量每個反應(yīng)室的容積，以便當(dāng)將含有至少一種試劑的一種或多種 流體輸送到每個反應(yīng)室中時，試劑溢出加樣孔的擴散時間超出原料與試 劑反應(yīng)以形成產(chǎn)物所需的時間。通過在基片上形成多個空腔，可形成反 應(yīng)室。通過蝕刻、鑄?；蛭⑶邢骷庸?，可在基片中形成多個空腔?？涨?具有平底或凹底。在優(yōu)選的實施方案中，基片是光導(dǎo)纖維束。在另外的 實施方案中，通過在平面表面上形成不連續(xù)的膜片(patch)，可形成反應(yīng) 室。與周圍的平表面相比，膜片具有不同的表面化學(xué)。
抗體
出于本發(fā)明目的，除非相反規(guī)定，術(shù)語"抗體"包括保持對靶分析 物的結(jié)合活性的所有的抗體片段。所述的片段包括Fv、 F(ab')、 F(ab')2
和dAb片段，以及單鏈抗體(scFv)。此外，抗體及其片段可以是人源化 抗體，例如EP-A-239400中所述的抗體。
用于本發(fā)明方法的抗體可以是單克隆或多克隆的。然而，為了降低 與本底信號相關(guān)的任何問題，優(yōu)選抗體是單克隆的。
術(shù)語"特異性結(jié)合"指抗體結(jié)合樣品中的特殊分析物但不是其它分 子和/或非靶分析物的能力。
如果期望是多克隆抗體，可用目的分析物(例如免疫原性多肽) 來免疫所選的哺乳動物(如，鼠、兔、羊、馬，等等)。收集來自免疫 動物的血清，并根據(jù)已知方法進(jìn)行處理。如果含多克隆抗體的血清含有 其它抗原的抗體，可通過免疫親和層析來純化多克隆抗體。在本領(lǐng)域 中，用于制備和加工多克隆抗血清的技術(shù)是已知的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地生產(chǎn)直接針對目的分析物的單克隆抗 體。通過雜交瘤來制備單克隆抗體的常規(guī)方法是眾所周知的。通過細(xì)胞 融合，也可通過其它方法，例如用致癌性DNA直接轉(zhuǎn)化B-淋巴細(xì)胞、 或用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染，可構(gòu)建生產(chǎn)永生化抗體的細(xì)胞系。根據(jù)各 種性質(zhì)，即，同種型和表位親合力，來篩選所生產(chǎn)的單克隆抗體組。
可選擇的技術(shù)包括篩選噬菌體展示文庫，其中，例如噬菌體在其衣 殼的表面上表達(dá)scFv片段與大量不同的互補決定區(qū)(CDR)。這種技術(shù)也 是本領(lǐng)域中眾所周知的。
用途
通過本發(fā)明方法可檢測的合適分析物，包括有機和無機分子，所述 分子包括生物分子。在優(yōu)選的實施方案中，分析物可以是環(huán)境污染物
(包括農(nóng)藥、殺蟲劑、毒素，等等)、化學(xué)品(包括溶劑、有機材料， 等等)、治療性分子(包括治療性和濫用的藥物、抗生素，等等)、生 物分子(包括激素、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、細(xì)胞膜抗 原和受體(神經(jīng)、激素、營養(yǎng)物以及細(xì)胞表面受體)或其配體，等
等)、全細(xì)胞(包括原核細(xì)胞(例如病原菌)和真核細(xì)胞(包括哺乳動 物腫瘤細(xì)胞))、病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病 毒，等等)、可用于生物恐怖主義的因子(例如炭疽)和孢子，等等。 特別優(yōu)選的分析物是環(huán)境污染物、核酸、蛋白質(zhì)(包括酶、抗體、抗 原、生長因子、細(xì)胞因子，等等)、治療性和濫用的藥物、細(xì)胞、以及 病毒。
特別優(yōu)選的靶分析物包括蛋白質(zhì)和核酸。如本文中所用的"蛋白 質(zhì)"，包括蛋白質(zhì)、多肽和肽。蛋白質(zhì)可由天然存在的氨基酸和肽鍵、
或合成的多肽模擬物結(jié)構(gòu)而組成。側(cè)鏈可以是(R)構(gòu)型或(S)構(gòu)型。
待檢的分析物包括激素，例如生長激素、胰島素、促腎上腺皮質(zhì) 激素(ACTH)、甲狀腺剌激激素(TSH)、促黃體生成素(LH)，以及胃腸激 素，如胰高血糖素樣肽；生長因子，例如表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子例如VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D以及VEGF-E、神經(jīng)生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)以及相關(guān)分子、 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)以及肝細(xì)胞生長因 子；細(xì)菌毒素；細(xì)菌代謝物及其抗體；外生孢子成分；病毒殼體成分； 酶，例如堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳 酸脫氫酶(LDH)、凝血因子；脂蛋白，例如極低密度脂蛋白(VLDL)、高 密度脂蛋白(HDL)以及低密度脂蛋白(LDL);受體，例如激素受體，如胰 島素受體、生長激素受體、EGF受體，和神經(jīng)受體，如乙酰膽堿受體； 癌標(biāo)記，例如下述癌標(biāo)記；細(xì)胞表面抗原，例如組織相容性抗原；自身 抗體；C-反應(yīng)蛋白；以及其它生理活性的物質(zhì)，例如肽酶抑制劑，如巨 球蛋白；以及補體，例如載體蛋白、IGF-結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白。
本發(fā)明可用于檢測樣品中腫瘤抗原(分析物)的存在。使用本發(fā)明 方法，可檢測的腫瘤抗原實例，包括但不限于，AFP (適于肝細(xì)胞癌和 生殖細(xì)胞腫瘤的標(biāo)記)、CA 15-3 (適于眾多癌的標(biāo)記，包括乳腺 癌)、CA 19-9 (適于眾多癌的標(biāo)記，包括胰腺癌和膽道腫瘤)、CA
125 (適于各種癌的標(biāo)記，包括卵巢癌)、降鈣素(適于各種腫瘤的標(biāo) 記，包括甲狀腺髓樣癌)、苯鄰二酚胺和代謝物
(phaeochromoctoma) 、 CEA (適于各種癌的標(biāo)記，包括結(jié)腸直腸癌及 其他胃腸道癌)、上皮生長因子(EGF)和/或上皮生長因子受體(EGFR)
(兩者都與各種上皮癌相關(guān)，包括結(jié)腸癌)、A33結(jié)腸上皮抗原(結(jié)腸 癌)、hCG/phCG (適于各種癌的標(biāo)記，包括生殖細(xì)胞腫瘤和絨毛膜 癌)、尿中的5HIAA (類癌瘤綜合征)、PSA (前列腺癌)、血清素
(類癌瘤綜合征)、甲狀腺球蛋白(甲狀腺癌)、和CT抗原(Scanlan 等，2002)例如NY-ESO-l (食道癌和膀胱癌以及黑素瘤的標(biāo)記)、 LAGE 、 MAGE (與許多肝癌以及黑素瘤相關(guān))、GAGE (肝癌)、 SSX2 (肉瘤)分化抗原(例如Melan A/MART1 ， GP100和酪氨酸 酶)、突變抗原(例如CDK4、 P-連環(huán)蛋白)、擴增抗原(例如P53和 Her2)、以及剪接變體抗原(例如ING1)。
本發(fā)明還可用于檢測樣品中微生物和/或其產(chǎn)生的分析物的存在。耙 可以是但不限于，病毒、細(xì)菌、真菌或原生動物?？捎糜诒景l(fā)明的具體 的非限制實例包括細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌(M;;cok^m'a wZ^cm/。^ )、立克次氏體(WcA:eto/a n'cfe咖7)、萊姆病螺方定體(5。/7^//0 6wgdor/er/)、鼠疫耶爾森氏菌(y^s/"/a pes泡)、梅毒螺旋體(7Vepowema j7"〃/(iww)、沙目艮衣原體(C7j/a附y(tǒng)c//(2 frvac/zo附a他)、月巿炎衣原體(C7z/awj^/a p"ewmo"/ae)、 月巿炎支原體(Afyco; /asma / "ewmow'ae)、 支原體屬 (Afyco/ /osm(3 s/ .)、嗜月巿軍團菌(丄6《/0恥//0/ "6"附0; / 7(3)、杜莫夫軍團菌 (Z^g/o"6//a <^mwo#0、 發(fā)酵支原體(Afyco/ /as7W0！ ybvw6"^ww)、 埃立克體 0E/w7z'c/z/a ■ / .)、流感嗜血桿菌(i7ae附o; /H71^/"y/we"z(3e)、腦膜炎奈瑟氏球 菌(iVe&sen'a mew."g7Y/fifc)、肺炎鏈球菌(5" re/ tococcM51 /wewwow/a)、 無乳 鏈球菌CS.aga/"W^)以及單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Z^敏/a wo"oc"ogewes);病毒，例如1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、 1型人T細(xì) 胞嗜淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-1)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、單純
性皰疹、皰疹病毒6、皰疹病毒7、 Epstein-Barr病毒、巨細(xì)胞病毒、水 痘帶狀皰疹病毒、JC病毒、細(xì)小病毒...—B 19、流感病毒A、 B和C、 輪 狀病毒、人腺病毒、風(fēng)疹病毒、人腸道病毒、生殖器人乳頭瘤病毒 (HPV)、以及漢坦病毒；真菌，例如新型隱球菌(Co^toco"^ "e。ybr附flra)、 卡氏月市囊蟲(戶"gw/woc^sto can'"")、 莢膜組織胞槳菌 (///stop/os附(2 ca/wzJafw附)、皮炎芽生菌(丑/ostomyces cfer附""ricfts)、孝且球抱 子菌(Cocc/c /ozV/as /m腦Y/s)以及紅色毛癬菌(7Wc/zo/ 一o" rw6r謂)；和原 生動物，例如克魯斯氏錐體蟲(7b;;^"osowfl craz/)、利什曼原蟲屬 (Le/s/z附(2mV3！ s; .)、 癥原蟲屬(尸/aswcxi/M附痢疾P可米巴(五ma附oe6" ///加/Wco)、 田鼠巴貝蟲(5a6as/a附/cro")、 蘭氏賈第鞭毛蟲(GV"Wa /am6"a)、環(huán)孢子蟲(C^c/ospora )以及艾美耳球蟲屬(五/wen'a s/ )。 本發(fā)明方法也可用于檢測隱孢子蟲屬(07p加/7onA'"m sp.)卵囊；用于鑒 定細(xì)菌毒素，例如來自霍亂弧菌(F/6n》c/zo/erae 01)、產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌、志賀氏桿菌屬CS/2/^化平)、腸侵染性大腸桿菌、幽門螺桿菌 (//e//cofeac^ / ;z/on')、產(chǎn)毒素難辨梭菌(C7o欲W謂d驕"7e)、金黃葡萄 球菌OSto; /^/ococcws aw/"eus)以及化膿性鏈球菌(iS/re/ tococc船/jyogewas)夕卜 毒素。
試劑盒
公開的檢測方法所需要的至少部分材料和試劑可一起組裝在試劑盒 中。本公開的試劑盒通常至少包括為實施請求保護的方法所必需的聚合 酶和核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包含蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物， 其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被其延伸的序列。在另一優(yōu)選實施方案 中，試劑盒也包含用于檢測樣品中的分析物的說明書。試劑盒還可包含 用于檢測聚合酶活性的工具。
試劑盒可還包含以不同的濃度提供的對照樣品，以使使用者你能繪
制合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，用于檢測NY-ESO-l的試劑盒包含濃度為 25、 50、 100、 250以及500ng/ml的重組NYESO-l。
在每種情況中，優(yōu)選試劑盒具有適于每種單個試劑和聚合酶的不同 容器。通常將每種生物制劑在它們各自的容器中進(jìn)行適宜地等分。試劑 盒的容器工具通常包括至少一種小瓶或試管。裝有試劑并對其進(jìn)行等分
的培養(yǎng)瓶、瓶及其它容器工具也是可以的。優(yōu)選嚴(yán)格限制地保持試劑盒 的單個容器，以備商業(yè)銷售。
實施例
實施例1—NY-ESO-l與兩種抗NY-ESO-l抗體(ES121和E978)的同時結(jié) 合
通過胺偶聯(lián)化學(xué)作用，將小鼠抗人-NY-ESO-l mAb ES121(Jungbluth等，2001)固定化在CM5 BIACore表面等離子共振(SPR) 生物傳感器表面上。以流速5pl/min，將重組抗原NY-ESO-l (40mM尿 素/DDW中含15(Hig/ml) (Murphy等，2005)注射在ES121固定化表面 上。以流速5^il/min，注射抗體ES121，以確保沒有非特異性結(jié)合，然后 將小鼠抗人-NY-ESO-l mAb E978(Jungbluth等，2001)(Invitrogen Carlsbad, California,美國)注射在表面上。
結(jié)果表明抗原NY-ESO-l以相對較高的親合力與固定化ES121 mAb的表面結(jié)合，而且當(dāng)再次將ES121 mAb注射在抗體-抗原表面上 時，幾乎看不到非特異性結(jié)合(圖2) 。 mAbE978的最后注射，顯示它 通過高親合力和特異性可識別和結(jié)合表面上所捕獲的NY-ESO-l。以抗 體結(jié)合的相反順序?qū)嵤┰搶嶒?，具有相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2—一級抗體偶聯(lián)和鑒定
將M270 Carboxylic Acid Dynal⑧珠偶聯(lián)于抗NY-ESO-l抗體(E978) 或抗EGFR抗體。根據(jù)制造商的說明書，使用l-乙基-3-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)試劑，通過胺偶聯(lián)化學(xué)作 用，將各種抗體(25mM MES pH5)共價偶聯(lián)于M270羧酸珠。使用 Superose 12柱(10/30)，通過空間排阻層析(SEC)來監(jiān)測偶聯(lián)效率。
為了測定有效的mAb偶聯(lián)，和為了證實mAb仍然具有生物活性， 將基于珠的自動化夾心ELISA分析進(jìn)行顯色。將偶聯(lián)于磁珠(300pg/ml 的偶聯(lián)珠)的抗體與其各種抗原(細(xì)胞裂解物或純化蛋白)進(jìn)行溫育， 然后將該復(fù)合體與另一種已被生物素化的抗NY-ES0-1或抗EGFR抗體 (含2昭/ml的PBS/3%BSA緩沖液)進(jìn)行溫育。根據(jù)ECL Protein Biotinylation Module試齊!j盒(Amersham Bioscience), 進(jìn)行生物素化。為 了檢測，然后將它與作為最終化學(xué)發(fā)光讀出的底物的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(lng/ml KPL ) —起溫育。加入5(HU魯米諾和50pl過氧化物 (SupersignalELISAFemto底物,Pierce)時，產(chǎn)生了化學(xué)發(fā)光。
結(jié)果表明對于兩個實施例而言，偶聯(lián)于磁珠都是有效的，并且抗 體以允許各種抗原結(jié)合的方向進(jìn)行偶聯(lián)(圖3和圖4)。
實施例3 —寡核苷酸-抗體偶聯(lián)
將兩種抗體(抗-NY-ESO-l(ES121)和抗-EGFR)順利地偶聯(lián)于端粒酶 識別寡核苷酸(5'-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGG TTAG-3' -SEQIDNO:3)，所述的寡核苷酸包含5'硫醇修飾，容許通過 使用NHS-酯-馬來酰亞胺交聯(lián)劑N-[Y-馬來酰亞胺基丁酰-氧代]磺基琥珀 酰亞胺酯(磺基-GMBS,Pierce)經(jīng)過硫醇偶聯(lián)化學(xué)作用而進(jìn)行偶聯(lián) (Schweitzer等,2000)。使用HPLC、 SDS-PAGE凝膠電泳和TBE-瓊脂糖 電泳，監(jiān)測偶聯(lián)和純度(圖5至圖9)。使用BCA(Pierce )和Oligreen (Pierce)分析(參見下文)，通過分光光度法獲得定量和化學(xué)當(dāng)量。通過 氨基酸定量分析，獲得蛋白質(zhì)絕對濃度。由于多個標(biāo)記經(jīng)過賴氨酸殘基的偶聯(lián)，使用Mono-Q層析實現(xiàn)了不 均一性的進(jìn)一步分析(圖10)。通過SDS-PAGE (數(shù)據(jù)未顯示)和 1.5%瓊脂糖凝膠，分析餾分17-22回收的峰值，以顯示所產(chǎn)生的不同寡 核苷酸-抗體同工型(圖11)。
實施例4一寡核苷酸-抗體鑒定
在基于珠的延伸反應(yīng)分析中，分析實施例3中描述的寡核苷酸-抗 體，來確保寡核苷酸-抗體仍然具有生物活性，并能分別結(jié)合NY-ESO-l 或EGFR:該分析也表明寡核苷酸識別序列可通過酶(端粒酶)進(jìn)行延 伸。
經(jīng)過胺偶聯(lián)化學(xué)作用，將Dynal M270胺磁珠與可溶性的EGFR的 高親合力形式進(jìn)行偶聯(lián)。在Kingfisher微粒處理器中，進(jìn)行自動化分 析。將6pl/孔的偶聯(lián)EGFR的磁珠用封閉緩沖液(PBS/1%BSA)進(jìn)行封 閉，然后在室溫(RT)下將其與寡核苷酸-抗EGFR抗體一起溫育30分 鐘，或用于非放大分析抗EGFR抗體-生物素。根據(jù)ECL Protein Biotinylation Module試齊U盒(Amersham Bioscience), 進(jìn)行生物素化。然 后將樣品與用于擴增的反應(yīng)混合液一起溫育，其中混合液含有20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM KC1、 ImM EGTA、 ImM EDTA、 150mMNaCl、 0.005%Tween 20、 12.5|iM生物素-21-dUTP、 18.75nM dAdG、 lnl端粒酶和來自1(^個細(xì)胞的LIM1215裂解物(墨爾本路德維格 學(xué)院細(xì)胞系1215-Whitehead等，1985)。包括熱失活的端粒酶(95°C， 20 分鐘)作為對照。在擴增步驟后，進(jìn)行多次洗滌，然后室溫下將樣品與 0.5pg/ml鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起溫育30分鐘。在這次溫育后，在 重懸浮于終容積的工作緩沖液中之前，用工作緩沖液洗滌樣品 (0.1M Tris， 0.1M KCl,pH7.4)，然后將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板， 并在剛一加入50|il魯米諾和50^1過氧化物(Supersignal ELISA Femto底 物,Pierce )就在BMG Flurostar光度計中讀出發(fā)光。結(jié)果(11=2)表明來自放大分析的信號顯著地高于熱失活的對照和未 放大的ELISA信號(圖12)。
實施例5 —寡核苷酸-抗體定量
通過檢測ssDNA的基于熒光分析的Oligreen (Pierce)分析，來確定 寡核苷酸的含量。以通過未修飾寡核苷酸所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)，定 量寡核苷酸-抗體。
通過標(biāo)準(zhǔn)BCA分析來測定抗體濃度，由于沒有寡核苷酸引起的信 號干擾，使得可準(zhǔn)確地估計蛋白質(zhì)含量。在550nm讀出吸光度。
實施例6-使用端粒酶檢測NY-ESO-l
將偶聯(lián)于E978 mAb(180嗎)的磁珠與分離自黑素瘤細(xì)胞系LAR41的 NY-ESO-l陽性胞質(zhì)提取物一起溫育(0.5乂107細(xì)胞，室溫，60分 鐘)。黑素瘤細(xì)胞系的LAR(Ludwig Austin Repatriation)系列來源于路德 維格學(xué)院的病人活檢樣品，并在建立之前得到各個病人的同意。
在抗原結(jié)合后，將磁珠與ES121 mAb —起溫育(16|ag/ml，室溫下 60分鐘)，其中所述的ES121 mAb用適于端粒酶的寡核苷酸識別序列 (5'-TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG-3' - SEQ ID N0:3)進(jìn)行標(biāo)記，其中所述的寡核苷酸識別序列包含5'硫醇修飾，使 得使用NHS-酯-馬來酰亞胺交聯(lián)劑N-[ 馬來酰亞胺基丁酰-氧代]磺基琥 珀酰亞胺酯(磺基-GMBS,Pierce)(如上所述)通過硫醇偶聯(lián)化學(xué)作用來進(jìn)行 偶聯(lián)。
在存在反應(yīng)混合緩沖液(20mM Tris-HCl 、 1.5mM MgCl2、 63rnM KC1 、 lmM EGTA 、 lmM EDTA、 150mM NaCl、 0.005o/o Tween20、 12.5nm生物素-21-dUTP、 18.75pM dAdG)的情況下，分離自HEK293 (人胚腎)細(xì)胞德端粒酶用于延伸寡核苷酸(37°C， 60分鐘)。該步驟 在酶延伸DNA序列時，沿著DNA序列加入許多生物素殘基。然后將復(fù)
合體與鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起溫育(0.5pg/ml，室溫下30分 鐘)。在這次溫育后，用工作緩沖液洗滌樣品(O.lMTris， 0.1M KCl,pH7.4)，然后將樣品重懸浮于終容積5(^1的工作緩沖液中。然后 將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板，并在剛一加入魯米諾和5(^1過氧 化物(Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )就在BMG Flurostar光度計中 讀出發(fā)光。
使用適于自動操作的Kingfisher微粒處理器進(jìn)行收集分析。結(jié)果 (n-3)表明剛一加入5(^l魯米諾和5(Hil過氧化物(Pierce)就產(chǎn)生強烈的 發(fā)光信號(圖13)。
實施例7—使用末端轉(zhuǎn)移酶延伸結(jié)合于磁珠的寡核苷酸模板
將磁性Dynal珠與單鏈DNA寡核苷酸(TTTTTTAATCCGT CGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG-SEQ ID NO:3)進(jìn)行偶聯(lián)。在這 種情況中，由于末端轉(zhuǎn)移酶不象端粒酶那樣優(yōu)先延伸特異序列，因此上 述序列是端粒酶所用的相同序列。為了這種酶修改了延伸條件，所用的 延伸緩沖液是50mM乙酸鉀、20mMTris-乙酸、10mM乙酸鎂、0.25mM 氯化鈷、12.5joM生物素-21-dUTP、 18.75pM dAdG、 10U末端轉(zhuǎn)移酶， pH7.9。將末端轉(zhuǎn)移酶加入各孔中，每孔有寡核苷酸偶聯(lián)的磁珠 (30mg/ml)、 100nl延伸緩沖液，37。C下延伸30分鐘。然后在工作緩沖 液(0.1MTris、 0.1M氯化鉀)中洗滌延伸的磁珠三次。然后將磁珠與 0.5pg/ml鏈霉抗生物素蛋白-HRP —起于室溫下溫育30分鐘，并在重懸 浮于終體積5(^1的工作緩沖液中之前，用工作緩沖液洗滌3次。然后將 樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔平板，并在一加入50pl魯米諾和過氧化物 (Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )后就在BMG Flurostar光度計中讀 出發(fā)光。重復(fù)實驗兩次，包括熱失活的對照，其中通過在95'C下加熱 20分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示發(fā)光信號顯著地高于熱失活的對照，表明在該方法中， 端粒酶可被末端轉(zhuǎn)移酶取代(圖14)。
實施例8—使用末端轉(zhuǎn)移酶延伸結(jié)合于抗體的寡核苷酸模板
在0.1M硼酸鹽(pH9.6)中，通過過夜溫育，將Tosyl活化的Dynal珠 (15mg)偶聯(lián)于300昭的501FC (連接于抗體Fc區(qū)的EGF受體的配體結(jié) 合區(qū))。偶聯(lián)之后，充分洗滌珠，并通過與0.2MTris/0.1%BSA —起于 37t:溫育4小時，給未反應(yīng)的基團進(jìn)行加帽。然后洗滌珠，并貯存在 PBS/0.1。/oBSA中。
利用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等，2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG)(SEQ ID NO :3)的靶核苷酸功能化抗-EGFR抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/ 分鐘和25。C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸 排阻HPLC從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
在存在以端粒酶識別序列功能化的LMH42抗體的情況下，將1(^1 體積的501FC-偶聯(lián)的珠在室溫下溫育60分鐘，然后徹底洗滌。隨后用 1% BSA處理珠-501FC-抗體復(fù)合體，來降低非特異性本底信號。進(jìn)一步 洗滌之后，在存在50^1反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鉀、20mMTris-乙酸、 10mM乙酸鎂、0.25mM氯化鈷、12.5 y M熒光素-dUTP、 18.75pM dAdG; pH 7.9)和0.5^1末端轉(zhuǎn)移酶(10U酶)的情況下，將復(fù)合體在37 'C下溫育60分鐘。在工作緩沖液(O.lMTris、 0.1M氯化鉀)中，將延 長的磁珠洗滌三次，然后與lpg/ml抗熒光素-HRP在室溫下溫育30分 鐘。之后，用工作緩沖液將磁珠洗滌三次，然后重懸浮于終容積5(^1的 工作緩沖液中。然后將樣品轉(zhuǎn)入白色發(fā)光96孔板，并在加入50^1魯米 諾和50jil過氧化物(Supersignal ELISA Femto底物，Pierce )后在BMG Fluorostar光度計中讀出發(fā)光。重復(fù)處理兩次，包括熱失活的對照，其中 通過在95。C下加熱30分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示(圖15):末端轉(zhuǎn)移酶能延伸寡核苷酸底物并包含標(biāo)記的 核苷酸。因此，末端轉(zhuǎn)移酶顯然可用于本發(fā)明方法。
實施例9一使用末端轉(zhuǎn)移酶和熒光素-dUTP特異性檢測EGFR抗原
在0.1M硼酸鹽緩沖液(pH9.6)中，通過在37"C下過夜溫育，將 Tosyl活化的Dynal珠(15mg)偶聯(lián)于300昭的LMH41抗-EGFR mAb。偶 聯(lián)之后，充分洗滌磁珠，并通過與0.2MTris/0.1%BSA —起于37'C溫育 4小時，給未反應(yīng)的基團進(jìn)行加帽。然后洗滌磁珠，并貯存在 PBS/0.1。/oBSA中。
利用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等,2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG) (SEQ ID NO :3)的靶核苷酸功能化抗-EGFR抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/ 分鐘和25"C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸 排阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
在存在不同濃度的EGFR抗原(sEGFR 1 - 621,Domagala等，2000)的 情況下，將lOpl體積的LMH41-偶聯(lián)珠在室溫下溫育60分鐘。多個洗 滌步驟之后，將抗原-抗體-磁珠復(fù)合體與被端粒酶識別序列功能化的 LMH42抗體在室溫下溫育60分鐘，然后徹底洗滌。隨后洗滌珠復(fù)合 體，然后在存在5(HU反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鉀、20mM Tris-乙酸、 10mM乙酸鎂、0.25mM氯化鈷、12.5^M熒光素-dUTP、 18.75pM dAdG; pH 7.9)和0.5pl末端轉(zhuǎn)移酶(10U酶)的情況下，將復(fù)合體在37 匸下溫育60分鐘。在工作緩沖液(0.1MTris、 0.1M氯化鉀)中，將延 長的磁珠洗滌三次，然后與lpg/ml抗熒光素-HRP在室溫下溫育30分 鐘。之后，用工作緩沖液洗滌磁珠三次，然后重懸浮于終容積5(^1的工 作緩沖液中。然后將樣品轉(zhuǎn)入白色的熒光96孔平板，并在加入5(^1魯 米諾和50|il過氧化物(Supersignal ELISA Femto底物,Pierce)后在BMG
Fluorostar光度計中讀出熒光。重復(fù)處理兩次，包括熱失活的對照，其中 通過在？5匸下加熱30分鐘來失活末端轉(zhuǎn)移酶。
結(jié)果顯示(圖16):末端轉(zhuǎn)移酶能延伸寡核苷酸底物并包含標(biāo)記的 核苷酸。這種延伸反應(yīng)發(fā)生于與抗體形成復(fù)合體的寡核苷酸上，所述抗 體則結(jié)合于抗原，而所述抗原又結(jié)合于與磁珠偶聯(lián)的抗體。因此，在該 實施例中，分析法能檢測靶分析物(EGFR)。
實施例IO—粗提取物和預(yù)凈化物中的端粒酶活性的比較
用10mlPBS，將鋪滿LAR41細(xì)胞的10cm培養(yǎng)皿在原位洗滌兩 次。將細(xì)胞從平板上刮入lml PBS中，并轉(zhuǎn)入1.5ml管中。進(jìn)行細(xì)胞計 數(shù)，并以13,0001"*111離心細(xì)胞5分鐘。除去上清液，并將RIPA裂解緩 沖液(50mMTris、 150mMNaCl、 lmM EDTA， l%Triton X-IOO、 1%去 氧膽酸鈉、0.1%SDS、蛋白酶抑制劑藥片(Roche ))加入細(xì)胞(200^1/1 乂106細(xì)胞)中。上下多次吸打細(xì)胞來裂解細(xì)胞，然后冰上溫育30分 鐘。隨后，以13，0001"導(dǎo)111于4°(:離心25分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入鮮的1.5ml 管中，并分析端粒酶活性。
在存在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM KC1、 lmMEGTA、 lmM EDTA、 150mMNaCl、 0.005% Tween20、 12.5pM生 物素-21-dUTP、 18.75nMdAdG)和源自膀胱癌細(xì)胞系(LAR41)的提 取物的情況下，將通過胺偶聯(lián)化學(xué)作用(參見上文)偶聯(lián)了端粒酶識別 序列的磁珠在37"C下溫育30分鐘，其中所述的提取物可以是未處理的 (細(xì)胞裂解后沒有對提取物進(jìn)行進(jìn)一步的操作)，或可以是通過以 13,000r.p.m將提取物離心25分鐘(Sorvall Heraeus Fresco Biofiige,轉(zhuǎn)子 514400)而預(yù)凈化的。離心之后，上清液(預(yù)凈化的提取物)用于與粗 提物一起進(jìn)行并列式端粒酶延伸反應(yīng)。
結(jié)果如圖17所示。作為對照，也顯示了熱失活(Hi)的樣品。顯 然，表達(dá)端粒酶的粗裂解細(xì)胞可作為用于本發(fā)明方法的酶源。
實施例11 —用于槍測CT抗原NY-ESO-l的放大的蛋白發(fā)光(APL)分析
利用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)化學(xué)作用(過夜偶聯(lián)，pH8.3)，將Tosyl活化的 Dynal珠偶聯(lián)于抗-NY-ESO-l mAb E978(Sugita等，2004)。偶聯(lián)之后，充 分洗滌磁珠，并貯存在PBS中。
禾l擁如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等，2004)，以含有端粒酶識別序 列(TTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAG)的耙核苷 酸功能化抗-NY-ESO-l抗體ES121(Chitale等,2004)。使用PBS緩沖液， 以流速lml/分鐘和25°。柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham) 上，利用尺寸排阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
利用BIAcore3000光學(xué)生物傳感器和固定化在傳感器表面上的mAb ES978，通過NHS/EDC化學(xué)作用以及夾心法ELISA，確定兩種抗體同 時結(jié)合NY-ESO-l的能力。
在含有0.5%甘油和蛋白酶抑制劑(MiniProtease, Roche)的 0.5%CHAPS、 10mM Tris-HCl 、 lmM MgCl2以及l(fā)mM EGTA(pH7.5) 中，通過裂解LIM 1215細(xì)胞(1(f細(xì)胞/ml)來產(chǎn)生活性的端粒酶制備 物。通過TRAP分析(Chemicon)確認(rèn)活性，通過BCA分析測定蛋白水 平，并將等分試樣貯存在-7(TC中以備在APL分析中活化端粒酶的寡核 苷酸靶。
使用重組NY-ESO-1驗證APL分析(Davis等,2004)。在TC培養(yǎng)基 中，通過連續(xù)稀釋來制備NY-ESO校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。
將mAbE978-Dynal珠(約107珠)加入1.5ml Eppendorf管中含有 NY-ESO-1標(biāo)準(zhǔn)品的組織培養(yǎng)基(高達(dá)1ml)。通過在25。C下振蕩1小 時將NY-ESO-1選擇性回收于偶聯(lián)Dynal珠上。然后通過磁性粒子收集 器來吸附珠，并用PBS洗滌。洗滌之后，將珠重懸浮在200^1的PBS緩 沖液中，其中該緩沖液含有寡核苷酸功能化的mAbES121,在25"C進(jìn) —步振蕩1小時，與已被捕獲在Dynal珠上的NY-ESO-1形成復(fù)合體。 然后吸附珠，并以延伸緩沖液(20mM Tris-HCl、 1.5mM MgCl2、 63mM
KC1 、 lmM EGTA 、 0.1嗎/ml，含0.005% Tween20(Xu等，2002))洗滌， 然后將珠重懸浮于含有dATP和dGTP以及生物素化dUTP (200pl)的延 伸緩沖液中。然后加入提取自LIM 1215細(xì)胞的端粒酶(l)al，參見上 文)，并將管在32t:下振蕩溫育30分鐘。然后用1X延伸緩沖液洗滌 珠，隨后進(jìn)一步洗滌(多次)來除去本底信號(例如通過提高NaCl濃 度、O.lMNaOH、降低pH或使用低濃度洗滌劑)，然后加入鏈霉抗生 物素蛋白-HRP(150plPBS中，含2pg/ml)并在32-C下溫育30分鐘。在重 懸浮于25^1相同緩沖液以備轉(zhuǎn)入96孔LumiNunc平板中之前，用含有 0.1M KC1的5 X 0.1M Tris-HCl(pH8.5)洗滌珠。
將LumiNunc平板轉(zhuǎn)入BMG FluoroStar光度計中，并使用儀器的自 動輸送泵來加入50pl魯米諾與增強劑以及50pl H202 (SuperSignal， Pierce Biotechnology Inc )，并記錄發(fā)光信號。
實施例12 —用于檢測抗CT抗原抗體的放大的蛋白發(fā)光(APL)分析
利用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)化學(xué)作用(過夜偶聯(lián)，pH8.3)，將Tosyl活化的 Dynal珠偶聯(lián)于重組NY-ESO-1 (Davis等，2004)。偶聯(lián)之后，充分洗滌 珠，并貯存在PBS中。
禾U用如前所述的肼化學(xué)作用(Kozlov等,2004)，以末端轉(zhuǎn)移酶的靶核 苷酸序列功能化抗人抗IgG山羊抗體。使用PBS緩沖液，以流速lml/分 鐘和25。C柱溫，在Superose12 10/300柱(GE Amersham)上，利用尺寸排 阻HPLC來從殘余反應(yīng)體純化所得的偶聯(lián)物。
將含有潛在的抗NY-ESO-l抗體的尿樣(100pl)加到含有NY-ESO-l-Dynal珠(約107珠)的白色Nunc 96孔平板中。通過在25"C下振蕩 (lO，OOOrpm)l小時，將抗-NY-ESO-l抗體選擇性回收到Dynal珠上。然 后通過磁力將珠吸附到平板表面，并用PBS充分洗滌。洗滌之后，將珠 重懸浮在15(Hxl的PBS緩沖液中，其中該緩沖液含有寡核苷酸功能化的 抗人抗IgG山羊抗體，在25t:進(jìn)一步振蕩(10，000rpm)1小時，與已被捕
獲在Dynal珠上的抗NY-ESO-l抗體形成復(fù)合體。然后將珠吸附到平板 表面，并用末端轉(zhuǎn)移酶延伸緩沖液(Genesearch反應(yīng)緩沖液，2.5mM CoCl2)洗滌珠，然后重懸浮于含有dATP和dGTP以及生物素化dUTP 的延伸緩沖液(5(^1)。然后加入末端轉(zhuǎn)移酶(lpl, Genesearch ,澳大利 亞)，并將管在32。C下振蕩(10，000rpm)溫育30分鐘。然后用1X延伸 緩沖液洗滌珠，隨后進(jìn)一步洗滌(多次)來除去本底信號(例如通過提 高NaCl濃度、O.lMNaOH、降低pH或使用低濃度洗滌劑)，然后加入 鏈霉抗生物素蛋白-HRP(150iUPBS中，含2ug/ml)并在32"C下溫育30 分鐘。然后用含有0.1MKC1的5X0.1M Tris-HCl(pH8.5)洗滌珠，然后 重懸浮于25^1相同緩沖液以備轉(zhuǎn)入96孔LumiNunc平板中。
將LumiNunc平板轉(zhuǎn)入BMG FluoroStar光度計中，并使用儀器的自 動輸送泵來加入50nl魯米諾與增強劑以及50pl H202 (SuperSignal ,Pierce Biotechnology Inc .)，并記錄發(fā)光信號。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是在不背離本發(fā)明廣泛描述的精神或范 圍的前提下，可如具體實施方案所示對本發(fā)明進(jìn)行多種改變和/或修飾。 因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的實施方案都被認(rèn)為是用于舉例說明 的，而不是限制性的。
以上論述的AU出版物全文并入本文中。
本說明書中所包括的任何討論的文件、法案、材料、設(shè)備、論文等 等，僅僅用于給出本發(fā)明的范圍。不應(yīng)當(dāng)理解為由于其存在于本申請 的各項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前，這些材料的任何或全部都已成為現(xiàn)有 技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或是在與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中屬于公知常識。
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權(quán)利要求
1.一種用于篩查樣品中存在或不存在分析物的方法，該方法包括i)將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合物復(fù)合體，ii)將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第一化合物復(fù)合體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，iii)在下列條件下將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷酸，或b)能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和iv)檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，其中步驟iii)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進(jìn)一步合成多核苷酸。
2. —種用于篩查樣品中存在或不存在分析物的方法，該方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第二化合物，以形成分析物-第二化合 物復(fù)合體，其中第二化合物包含多核苷酸，ii) 將所述分析物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第二化 合物復(fù)合體的第一化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合 體，iii) 在下列條件下將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露 于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷酸，或b) 能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和iv) 檢測步驟iii)中的a)或b)部分的產(chǎn)物， 其中步驟m)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進(jìn)一步合成 多核苷.酸。.
3. 權(quán)利要求l或2中所述的方法，其中聚合酶延長單鏈多核苷酸或部分雙鏈多核苷酸的單鏈突出端。
4. 權(quán)利要求3中所述的方法，其中聚合酶選自poly(A)聚合酶、 端粒酶和末端轉(zhuǎn)移酶。
5. 權(quán)利要求4中所述的方法，其中聚合酶是端粒酶，并且所述 端粒酶通過裂解產(chǎn)生端粒酶的癌細(xì)胞而獲得。
6. 權(quán)利要求5中所述的方法，其中不進(jìn)行將端粒酶與裂解的細(xì) 胞的其它成分分離的過程。
7. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述的方法，其中聚合酶是選自下 列的DNA聚合酶Taq聚合酶、噬菌體T4聚合酶、噬菌體T7聚合酶 以及大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。
8. 權(quán)利要求1至7中任何一項所述的方法，其中第一化合物和/ 或第二化合物附著于固相支持物上。
9. 權(quán)利要求8中所述的方法，其中固相支持物選自磁珠、生物 傳感器芯片、微量滴定板的加樣孔、浸染棒以及微陣列玻片。
10. 權(quán)利要求1至9中任何一項所述的方法，其中在存在至少一種 以可檢測方式標(biāo)記的核苷酸的情況下，實施步驟iii)。
11. 權(quán)利要求10中所述的方法，其中可檢測的標(biāo)記選自放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記以及酶標(biāo)記。
12. 權(quán)利要求1至9中任何一項所述的方法，其中在存在至少一種 半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，實施步驟iii)，其中所述的半抗原能夠 結(jié)合配體。
13. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中半抗原選自半胱氨酸、賴氨 酸、絲氨酸、生物素、抗生物素蛋白以及鏈霉抗生物素蛋白。
14. 權(quán)利要求12或13中所述的方法，其中配體是以可檢測方式標(biāo) 記的。
15. 權(quán)利要求14中所述的方法，其中可檢測的標(biāo)記選自放射性同 位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記以及酶標(biāo)記。
16. 權(quán)利要求14或15中所述的方法，其中步驟iii)還包括將聚合 酶活性的產(chǎn)物暴露于所述以可檢測方式標(biāo)記的配體。
17. 權(quán)利要求15或16中所述的方法，其中可檢測的標(biāo)記是酶。
18. 權(quán)利要求17中所述的方法，其中酶選自p-半乳糖苷酶、螢光 素酶、堿性磷酸酶、神經(jīng)氨酸酶以及辣根過氧化物酶。
19. 權(quán)利要求17或18中所述的方法，其中步驟iii)的聚合酶活性 的產(chǎn)物是至少包含其中摻入了半抗原偶聯(lián)的核苷酸的多核苷酸的復(fù)合 體，其中至少部分半抗原結(jié)合于酶標(biāo)記的配體，并且步驟iv)包括將步驟iii)的產(chǎn)物暴露于允許酶產(chǎn)生可檢測信號的條件下。
20. 權(quán)利要求19中所述的方法，其中通過酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢 測信號。
21. 權(quán)利要求20中所述的方法，其中底物是魯米諾或9，10-二氫化 吖啶。
22. 權(quán)利要求20或21中所述的方法，其中方法還包括提供增強所 述可檢測信號的分子。
23. 權(quán)利要求22中所述的方法，其中增強所述可檢測信號的分子 是對碘酚或?qū)Ρ交椒印?br> 24. 權(quán)利要求19至23中任何一項所述的方法，其中所述可檢測信 號是發(fā)光或熒光。
25. 權(quán)利要求1或3至24中任何一項所述的方法，其中步驟i)還 包括洗滌分析物-第一化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第一化合物。
26. 權(quán)利要求2至24中任何一項所述的方法，其中步驟i)還包括 洗滌分析物-第二化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第二化合物。
27. 權(quán)利要求1至26中任何一項所述的方法，其中步驟ii)還包括 洗滌分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，以除去未結(jié)合的第一和/或 第二化合物。
28. 權(quán)利要求1至9或25至27中任何一項所述的方法，其中方法 還包括除去未摻入的以可檢測方式標(biāo)記的核苷酸。
29. 權(quán)利要求1至7或14至27中任何一項所述的方法，其中方法 還包括除去未摻入的以可檢測方式標(biāo)記的配體。
30. 權(quán)利要求1至29中任何一項所述的方法，其中第一化合物是 蛋白質(zhì)。
31. 權(quán)利要求1至30中任何一項所述的方法，其中第一化合物是 抗體。
32. 權(quán)利要求1至31中任何一項所述的方法，其中第二化合物是 蛋白質(zhì)-多核苷酸偶聯(lián)物。
33. 權(quán)利要求1至32中任何一項所述的方法，其中第二化合物是 抗體-多核苷酸偶聯(lián)物。
34. 權(quán)利要求1至33中任何一項所述的方法，其中第二化合物結(jié) 合所述分析物。
35. 權(quán)利要求1至34中任何一項所述的方法，其中所述分析物是 疾病狀態(tài)的標(biāo)記。
36. 權(quán)利要求35中所述的方法，其中疾病狀態(tài)選自癌癥和感染。
37. 權(quán)利要求1至36中任何一項所述的方法，其中所述分析物是 蛋白質(zhì)或肽。
38. 權(quán)利要求l中所述的方法，其中方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物上，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物的第二 化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合 物包含可被端粒酶延伸的多核苷酸，iii) 在允許端粒酶延伸所述多核苷酸的條件下，在存在至少一種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù) 合體暴露于端粒酶，iv) 在允許半抗原結(jié)合配體的條件下，將端粒酶活性的產(chǎn)物暴露于 酶標(biāo)"l己的配體，v) 在存在所述酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù) 合體，以及vi) 檢測由所述酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
39. 權(quán)利要求l中所述的方法，其中方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，其中第一化合物附著于固相支持物上，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物的第二 化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體，其中第二化合 物包含可被末端轉(zhuǎn)移酶延伸的多核苷酸，iii) 在允許末端轉(zhuǎn)移酶延伸所述多核苷酸的條件下，在存在至少一 種半抗原偶聯(lián)的核苷酸的情況下，將所述分析物-第一化合物-第二化合 物復(fù)合體暴露于末端轉(zhuǎn)移酶， iv)在允許所述半抗原結(jié)合配體的條件下，將末端轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn) 物暴露于酶標(biāo)記的配體，V)在存在所述酶的底物的情況下，溫育多核苷酸-半抗原-配體-酶復(fù) 合體，以及vi)檢測由所述酶對底物的活性產(chǎn)生的可檢測信號。
40. —種用于篩査樣品中存在或不存在分析物的方法，方法包括i) 將樣品暴露于結(jié)合分析物的第一化合物，以形成分析物-第一化合 物復(fù)合體，ii) 將所述分析物-第一化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述分析物-第一化 合物復(fù)合體的第二化合物，以形成分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合 體，iii) 將所述分析物-第一化合物-第二化合物復(fù)合體暴露于結(jié)合所述第 二化合物的第三化合物，其中第三化合物包含多核苷酸，iv) 在下列條件下將分析物-第一化合物-第二化合物-第三化合物復(fù) 合體暴露于聚合酶，其中所述的條件是a)能容許聚合酶延伸所述多核苷 酸，或b)能容許聚合酶合成所述多核苷酸的互補鏈，和v) 檢測步驟iv)中的a)或b)部分的產(chǎn)物，其中步驟iii)的部分b)不包括使用所述互補鏈作為模板進(jìn)一步合成 多核苷酸，和其中所述第一和/或第二化合物附著在固相支持物上。
41. 一種蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中DNA包含可結(jié)合端粒酶并被 其延伸的序列。
42. 權(quán)利要求41中所述的蛋白質(zhì)-DNA偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì)是抗體。
43. —種試劑盒，包含權(quán)利要求41或42中所述的蛋白質(zhì)-DNA偶 聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中的分析物的方法。本方法是基于聚合酶對多核苷酸底物的活性，其中多核苷酸底物連接于結(jié)合分析物的分子，例如抗體。通過摻入適當(dāng)標(biāo)記的核苷酸，和/或摻入半抗原偶聯(lián)的核苷酸，可檢測聚合酶的活性，其中半抗原偶聯(lián)的核苷酸能夠結(jié)合適當(dāng)標(biāo)記的半抗原的配體。
文檔編號C07K16/46GK101115847SQ200580046714
公開日2008年1月30日 申請日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者E·C·尼斯, J·A·羅特哈克 申請人:希艾娜癌癥診療有限公司