專利名稱：：樣品中不溶的分析物的測量的制作方法樣品中不溶的分析物的測量本申請要求2007年3月30日提交的美國臨時(shí)申請60/920,814和2008年1月3日提奪的美國臨時(shí)申請61/018,717的申請日的權(quán)益。
背景技術(shù)：
：多個(gè)分子探針排列在表面或者“芯片”上已經(jīng)用于多項(xiàng)生物學(xué)和化學(xué)測定中。進(jìn)行測定以確定感興趣的靶分子是否與任意探針相互作用。在選擇的條件下探針暴露于靶分子之后，檢測裝置確定靶分子是否與指定探針相互作用。這些系統(tǒng)可用于多項(xiàng)篩選方法中，以獲得關(guān)于探針或者靶分子的信息。例如，它們可用于篩選結(jié)合感興趣的受體的肽或潛在藥物，以篩選含有不溶分析物的樣品中例如遺傳突變、等位基因變體或者特定病原體或者病原體株系的存在；研究基因表達(dá)，例如鑒別其表達(dá)與特定生理學(xué)狀況、發(fā)育階段或者疾病狀態(tài)等相關(guān)的mRNA。發(fā)明描述從固定組織中精確測量基因、特別是基因表達(dá)或者寡核苷酸具有許多益處。在臨床樣品情況中，所述方法可以靶向被測量的寡核苷酸，而不必需要改變臨床實(shí)踐-直接從固定的組織測量而不必制備冷凍樣品。有大量儲存的可用于回顧性研究的建檔的固定材料，以用于鑒別和確認(rèn)生物標(biāo)記和靶基因，或者用于開發(fā)和確認(rèn)監(jiān)測、預(yù)測或診斷測定，或者用于與基因表達(dá)的安全性關(guān)聯(lián)，或者用于了解疾病進(jìn)程等。然而，從固定組織中進(jìn)行這種測量存在問題。通過PCR或雜交方法測量需要大量組織和復(fù)雜提取以及樣品制備方法。此外，通常觀測到測量質(zhì)量隨著組織儲存的時(shí)間延長而降低。相反，可以對新鮮固定的組織或者建檔的組織進(jìn)行原位測量(在組織內(nèi)標(biāo)記和觀測RNA)，并產(chǎn)生相似質(zhì)量的數(shù)據(jù)。本文描述的是從固定組織中測量寡核苷酸的方法，包括從組織中恢復(fù)探針，其中是所述探針而不是天然寡核苷酸自身作為測量基礎(chǔ)。本發(fā)明進(jìn)一步描述了使用核酸酶保護(hù)作用作為從固定組織中測量寡核苷酸的方法。如PCR等方法要求溶解、提取和純化靶RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄并且對所得cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。bDNA需要溶解靶RNA。因此，需要逆轉(zhuǎn)交聯(lián)或者僅一部分RNA可以作為可溶RNA而恢復(fù)以用于通過這些方法測量。本發(fā)明揭示的方法使得可以測量交聯(lián)的寡核苷酸以及可溶的寡核苷酸。得自臨床或動物實(shí)驗(yàn)的組織切片通常被以適于后續(xù)顯微鏡檢測的形式固定、包埋和儲存。傳統(tǒng)的固定方法通常應(yīng)用醛固定劑，其通過在組織蛋白質(zhì)內(nèi)和之間產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)而固定組織。交聯(lián)趨于保護(hù)組織形態(tài)和完整性，使組織變硬以進(jìn)行切片，并且抑制微生物攻擊。在組織樣品固定后，將其典型包埋于包埋介質(zhì)中，以便樣品可以被切成薄片。石蠟是最常用的包埋介質(zhì)，但是也可以使用丙烯酰胺和火棉膠。本領(lǐng)域也已知其它非福爾馬林固定方法，如乙醇或醛固定方法。醛固定方法趨于導(dǎo)致組織樣品結(jié)構(gòu)明顯改變。這些改變通常趨于導(dǎo)致也許存在于組織樣品中的靶喪失其與靶向該抗原的抗體的反應(yīng)性。福爾馬林固定法明顯鎖住組織樣品中蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。由于近來新的組織化學(xué)試劑的開發(fā)，現(xiàn)在可以進(jìn)行在許多組織最初儲存時(shí)不可能進(jìn)行的組織化學(xué)分析。因此，已經(jīng)開發(fā)了許多方法可以逆轉(zhuǎn)由于醛固定法產(chǎn)生的一些改變，以及增強(qiáng)組織樣品的組織化學(xué)染色性質(zhì)。5一種常規(guī)的用于改善已經(jīng)在福爾馬林中固定以及在丙烯酰胺凝膠中包埋的組織樣品的染色能力的實(shí)驗(yàn)室方法涉及將丙烯酰胺凝膠包埋的組織在1.0%2-巰基乙醇中處理15分鐘，隨后用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗。恢復(fù)組織樣品的組織化學(xué)染色性質(zhì)的方法在Key等的美國專利No.5，244，787中描述。另一恢復(fù)組織樣品的組織化學(xué)染色性質(zhì)的方法在Shi等的美國專利No.5，578，452中描述。固定的或者保存的樣品中生物學(xué)靶的測量是具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)。已知在這個(gè)過程中蛋白質(zhì)變性通常失去抗原性(即抗體識別能力)。碳水化合物可以被化學(xué)改變，特別是糖蛋白部分中與肽和蛋白質(zhì)相關(guān)的那些碳水化合物。在細(xì)胞環(huán)境中核酸可以彼此之間交聯(lián)以及與其它分子包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物交聯(lián)。這些分子的恢復(fù)和分析是昂貴且費(fèi)時(shí)的過程。由于多種原因?qū)е鹿潭ńM織中核酸的研究特別困難。福爾馬林固定石蠟包埋的樣品中的添加層或包膜對于常規(guī)探針和試劑是相當(dāng)大的難題。此外，由于大多數(shù)探針依賴于直接附著以進(jìn)行檢測，因此靶中的二級和/或三級結(jié)構(gòu)中的修飾存在難以識別和檢測結(jié)構(gòu)的難題。另一方面是識別的特異性，其可能由于在固定期間非天然暴露于化學(xué)制品及其它因素而喪失。本領(lǐng)域關(guān)于在固定的生物樣品中分析核酸的知識相對缺乏。DanielD'Orazio(AmericanJournalofPathology.2002；160:383_384)觀測了在固定樣品中測量RNA，然而從匹配的冷凍組織中的定量測量與固定組織測量結(jié)果不相關(guān)。作者進(jìn)一步提出由Sprecht(例如Her-2/NeumRNA)觀測的固定組織樣品之間的大的差異可能是由固定對于可用于測量的RNA的影響所致的假象，固定參數(shù)如固定延遲、時(shí)間和溫度可以是導(dǎo)致較大的表達(dá)差異的因素?？赡艿氖窃摬町惪赡苁怯捎谂c可溶RNA交聯(lián)的比率的差異所致。本領(lǐng)域關(guān)于分析固定的生物樣品中的核酸及其它生物靶的試劑和方法的知識基于原位檢測方法。已經(jīng)揭示了原位雜交方法(ISH)，當(dāng)其針對固定樣品時(shí)克服了流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FCM)、核型確定以及分子遺傳學(xué)技術(shù)的限制。然而，ISH中使用的這種探針非特異于通過缺失、易位、倒位或者擴(kuò)增而被中斷或改變的特定基因。因此，如果分析的序列在樣品中沒有合適表現(xiàn)，則遺傳異常性的檢測也許不可能。此外，可以檢測的變量(即靶)的數(shù)目非常低，自動化通常不可能。另外，ISH技術(shù)利用新鮮分離的細(xì)胞或者培養(yǎng)的細(xì)胞而不是固定的石蠟化組織。迄今為止，先前的雜交研究是用于細(xì)胞系、分離的新鮮組織或者冷凍的組織切片。然而，在臨床上并不總是可以在獲得活檢組織后立即進(jìn)行分析，因此通常利用的是石蠟包埋的組織。再者，使用固定的石蠟包埋的組織是有利的，因?yàn)樵摻M織結(jié)構(gòu)得以保持。例如，核酸傾向于被核酸酶作用。確信固定組織的原位雜交只可以用針對重復(fù)核酸序列的探針進(jìn)行，因?yàn)楣潭ㄗ柚箚慰截愋蛄械臋z測。因此，核酸序列的單一缺失(例如SNP)不可被檢測。原位方法可用于從固定組織中測量DNA和RNA、成像所述組織并且從雜交的組織結(jié)合的探針的這些圖像中定量。檢測可以通過熒光(FISH)或者發(fā)光方法進(jìn)行，以及可以測量DNA(例如拷貝數(shù))或者RNA的方法。Hellborg(Ann.One.，2007)描述了替代熒光原位雜交(FISH)檢測RNA的PCR和微陣列測量法。然而，依賴于PCR的技術(shù)和微陣列技術(shù)均有限制。例如，通過PCR的提取和測定是昂貴且麻煩的(Shibutanietal.，LabInvest2000，80199-208)。另一重要方面是微陣列在FFPE上進(jìn)行，其中要求可溶RNA品質(zhì)良好。因此，微陣列可用于測量可溶集合。然而這些技術(shù)不能從固定樣品中快速定量測量RNA，特別是當(dāng)靶是不溶性質(zhì)時(shí)。顯然，檢測固定組織中相關(guān)生物靶和生物標(biāo)記的方法是有利的?？梢允褂脝侮嚵袦y量固定樣品，所述陣列是低密度和高密度陣列、固定(捕獲探針印刷為陣列)或者可編程(印刷的錨(anchor)與添加的編程/捕獲接頭的組合)，或者可使用多個(gè)陣列，如可以印刷在微量滴定板的孔中或者珠陣列上，包括在測量每個(gè)樣品中多個(gè)基因的溶液中的珠，或者通過固定或者不固定于表面上核酸酶保護(hù)蛋白的標(biāo)記并成像，或者通過使用凝膠、電泳、層析、質(zhì)譜分析、測序，作為混合物或者作為每個(gè)反應(yīng)混合物中檢測的單獨(dú)靶，如在常規(guī)微滴板測定中，或者通過核酸酶保護(hù)探針的PCR(或者其它擴(kuò)增方法)或者通過雜交捕獲，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用的其它方法。本文描述的試劑和方法使得可以在同一實(shí)驗(yàn)中從同一樣品中、甚至從ArrayPlate的同一孔中，測量宿主的寡核苷酸以及固定組織樣品的感染因子(不同物種)?？梢赃M(jìn)行來自固定樣品的不同形式寡核苷酸的測量，單個(gè)樣品以及進(jìn)行樣品之間的對比，包括例如疾病與正常對比，治療與對照對比，或者同一樣品如mRNA與DNA，或者microRNA與RNA，或者核糖體RNA與mRNA，或者線粒體RNA與mRNA，或者這些任意組合。本發(fā)明也允許使用適體(aptamer)或其它探針測量蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及使用合適探針同時(shí)測量蛋白質(zhì)和寡核苷酸。另一方面，本發(fā)明涉及探針與交聯(lián)的(及可溶的)RNA的雜交(或結(jié)合)，然后除去和測量探針或者探針/靶分子，甚至在靶分子被破壞、斷裂或者裂解的情況下測量，但是所述探針或者探針復(fù)合物是完整的或者充分保持在一起。例如，在bDNA的情況中，探針復(fù)合物可以在交聯(lián)的靶RNA上形成，然后用于釋放該復(fù)合物，即使認(rèn)為該過程可導(dǎo)致RNA模板破壞，但是組合的復(fù)合物仍保持足夠完整以使得可以在組織外測量。其中探針與交聯(lián)或者表面結(jié)合的靶分子及可溶靶分子締合或者僅與交聯(lián)或者表面結(jié)合的靶分子締合的任何方法，均被降低至靶分子的可分析量，然后從組織中除去并測量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在任何類型的單陣列或多陣列上進(jìn)行一或多項(xiàng)生物或化學(xué)測定的組合物、裝置和方法，所述陣列包括測量直至幾十萬個(gè)靶分子的高密度陣列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了同時(shí)進(jìn)行多個(gè)生物學(xué)或化學(xué)測定的組合物、裝置和方法，并且可以高效分析含有不溶靶的多個(gè)樣品-例如在診斷測定中待篩選的多個(gè)患者樣品，或者在開發(fā)藥物的方法中待檢測的多個(gè)潛在藥物或治療劑。本發(fā)明提供了組合，其可用于檢測樣品中的一或多個(gè)靶。這種組合包含具有多個(gè)空間獨(dú)立的區(qū)域的表面，其被稱作測試區(qū)，且其可以是孔，其中至少兩個(gè)是基本相同的。每個(gè)表面包含至少2個(gè)、優(yōu)選至少20或者更多個(gè)、例如至少大約25、50、96、864或者1536個(gè)等等這樣基本相同的區(qū)域。每個(gè)測試區(qū)限定了導(dǎo)入含有(或潛在含有)一或多個(gè)靶的樣品的空間，且含有生物學(xué)或化學(xué)陣列。(短語如“含有靶的樣品”或者“檢測樣品中的靶”不意味著排除其中不含有或者檢測不到不溶靶的樣品或確定(檢測嘗試)。一般而言，本發(fā)明涉及確定靶是否包含于樣品中的陣列，而無論其是否被檢測到)。這個(gè)陣列包含通稱的“錨”(anchor)，其每一個(gè)均與雙功能接頭分子相締合，所述接頭分子第一部分特異于錨，第二部分包含特異于至少一個(gè)靶的探針。將本發(fā)明的組合物置于與含有一或多個(gè)靶的樣品接觸，其任選與檢測分子反應(yīng)，隨后通過檢測裝置詢問，該裝置檢測在測試區(qū)中靶分子與探針之間的反應(yīng)，從而產(chǎn)生測定結(jié)果。本發(fā)明提供了特別用于高通量生物測定中的方法和組合物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于高通量篩選以進(jìn)行藥物開發(fā)。例如，可以同時(shí)在多個(gè)(例如100個(gè))96孔微滴板中進(jìn)行高通量測定。例如通過使用大約16個(gè)錨和接頭對的陣列，可以在平板的每個(gè)孔進(jìn)行16項(xiàng)不同測試。也就是說，100個(gè)平板，每個(gè)平板具有96孔，每個(gè)孔進(jìn)行16項(xiàng)測試，可以共進(jìn)行203，600項(xiàng)測試；例如，9，600個(gè)藥物候選物可以在16個(gè)不同參數(shù)或測定中同時(shí)檢測。高通量分析與每次僅檢測一個(gè)參數(shù)的測定相比提供了關(guān)于每種藥物的更多信息。例如，在一個(gè)最初的高通量篩選測定中可以確定藥物候選物是否是選擇性、特異性和/或無毒性的。非高通量方法必須經(jīng)過大量跟蹤測定以檢測每個(gè)感興趣藥物的這些參數(shù)。本領(lǐng)域已知高通量篩選測定的一些步驟。同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)生物學(xué)測定以及一次進(jìn)行多次測定(即非常高通量)的能力是本發(fā)明的兩個(gè)重大優(yōu)勢。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，使用由聚苯乙烯制成的具備衍生化表面以附著伯胺如氨基酸或者修飾的寡核苷酸的96孔DNA結(jié)合平板(CorningCostar)，可以將16個(gè)不同寡核苷酸的集合點(diǎn)(spotted)在每個(gè)平板的每個(gè)孔的表面上作為錨。該錨可以共價(jià)附著于衍生化的聚苯乙烯，相同的16個(gè)錨可用于所有篩選測定。對于任何特殊測定，可以使用給定的接頭集合以編程每個(gè)孔的表面以特異于多如16個(gè)不同的靶或者感興趣的測定類型，不同測試樣品可以施加于每個(gè)平板中96孔的每一孔?？梢远啻问褂猛诲^集合，以針對其它靶和感興趣的測定再編程孔的表面，或者其可以與同一接頭集合再多次使用。這種靈活性和再利用性代表本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)勢。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是檢測至少一種不溶靶的方法，包括將可能包含所述靶的樣品與上述組合在所述靶與所述組合有效結(jié)合的條件下接觸。本發(fā)明另一實(shí)施方案是確定RNA表達(dá)模式的方法，包括將包含作為靶的至少兩個(gè)RNA分子的樣品與上述組合在所述RNA靶與探針有效地特異性雜交的條件下一起保溫，其中所述組合的至少一個(gè)探針是核酸(例如寡核苷酸)，其特異于(即選擇性)至少一個(gè)不溶RNA靶。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是鑒別調(diào)節(jié)RNA表達(dá)模式的物質(zhì)(或者條件)的方法，其是上述確定RNA表達(dá)模式的方法，且進(jìn)一步包括對比在存在所述物質(zhì)(或條件)下產(chǎn)生的RNA表達(dá)模式與在不同條件下產(chǎn)生的RNA表達(dá)模式。例如，圖1舉例說明了這些錨之一，錨1，其在本發(fā)明大多數(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中是寡核苷酸。與錨1附著的是接頭分子，接頭1，其包含兩部分。第一部分特異于所述錨，在此是可以與所述錨特異性雜交的寡核苷酸。第二部分是特異于感興趣的不溶靶的探針，在此靶向mRNA，是可以與所述靶雜交的寡核苷酸。盡管在該圖中未示出，但是其余15個(gè)錨均可以通過錨特異性部分與其自身接頭雜交；每個(gè)接頭可含有例如特異于與mRNA1不同(或相同)的mRNA的探針部分。該舉例的組合可用于同時(shí)測定多如96個(gè)不同樣品的mRNA1存在情況(或者同時(shí)由測定陣列中其它5個(gè)探針限定(編程)的mRNA靶)。為了進(jìn)行測定，將每個(gè)樣品以小體積加入一個(gè)所述區(qū)域或孔中，在使探針與不溶靶有效雜交的條件下保溫，在這個(gè)實(shí)施例中所述樣品可以是從96個(gè)獨(dú)立細(xì)胞系之一中提取的RNA。為了確定mRNA1是否存在于樣品中，應(yīng)用可以識別模式和/或可以詢問每個(gè)區(qū)域中信號存在的特異性位置的檢測裝置。如果所述細(xì)胞系在其mRNA在體內(nèi)用標(biāo)記物標(biāo)記的條件下保溫，以及如果mRNA1存在于樣品中，則檢測儀將在錨/探針復(fù)合物1限定的位置檢測到從標(biāo)記的mRNA中發(fā)出的信號。或者，所述mRNA可以在加入所述區(qū)域(孔)之前或者之后在體外直接標(biāo)記?；蛘撸鰉RNA可以在與探針雜交之前或之后間接標(biāo)記，例如通過將該RNA與標(biāo)記的“檢測”寡核苷酸(靶特異性報(bào)道寡核苷酸)保溫進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記的“檢測”寡核苷酸與不同于探針識別的序列的序列互補(bǔ)。在這個(gè)舉例的實(shí)施例中，可以同時(shí)分析15個(gè)樣品。由于本發(fā)明可以同時(shí)分析至少20個(gè)或更多如1536個(gè)或更多個(gè)樣品，因此其是非常高通量的測定系統(tǒng)。如本文所用，“不溶的”是指這樣的實(shí)體，其相對于其溶劑在包含這二者的混合物或乳液中異質(zhì)存在?！安蝗艿摹币部梢杂糜诒碚黝w粒性質(zhì)的物質(zhì)，例如細(xì)胞、液泡、膜和/或其聚集體?！安蝗艿摹币部梢杂糜诿枋霰M管在溶液中能同質(zhì)存在，但是因?yàn)槠涓街诒砻婊蛘吖潭ㄓ跉埢?residue)上而異質(zhì)存在。該術(shù)語也可以用于定義在分解或溶解后剩余的物質(zhì)(例如沉淀物)。如本文所用，“不溶的”通用于任何溶劑。優(yōu)選地，所述溶劑是極性的(例如水、鹽水、PBSJrebs-Ringer緩沖液、網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物、血清等)，溶解度在4°C_100°C溫度確定?！安蝗艿摹碧匦钥梢酝ㄟ^常規(guī)技術(shù)確定，例如光散射或者過濾或者離心技術(shù)。不溶物包括這樣的靶，其與其它分子或組織化學(xué)或物理交聯(lián)，以及與顆粒如細(xì)胞器官、膜、表面、細(xì)胞或者亞細(xì)胞體物理(如由于螯合(sequestration)在其中所致)或化學(xué)締合。涉及分析“不溶的”靶的本發(fā)明的方法不包括分析可溶靶的現(xiàn)有技術(shù)。如本文所用，“固定”是指通過將生物樣品置于福爾馬林、緩沖的福爾馬林、多聚甲醛或者等價(jià)的保存溶液中保存。在一些情況中，固定的樣品也被置于石蠟中，備用于切片機(jī)切割，且可以用除了福爾馬林之外的許多物質(zhì)如戊二醛、乙醇等固定。如本文所用，“靶”是指希望確定其存在、活性和/或量的物質(zhì)，且其與給定探針具有親和性。靶可以是人造的或者天然發(fā)生的物質(zhì)。另外，它們可以其未改變的狀態(tài)或者與其它種類物質(zhì)的聚集體形式應(yīng)用。靶可以直接或者通過特定結(jié)合物質(zhì)共價(jià)或者非共價(jià)地附著于結(jié)合成員。舉例的可用于本發(fā)明中的靶包括但不限于受體(囊泡、脂質(zhì)、細(xì)胞膜上的受體或者許多其它受體)；結(jié)合特定受體的配體，興奮劑或拮抗劑；與特定抗原決定簇(如在病毒、細(xì)胞或其他材料上)反應(yīng)的多克隆抗體、單克隆抗體和抗血清；藥物；核酸或多核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、EST、cDNA、衍生自RNA或DNA的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物、miRNA、siRNA、RNAi，及其突變、變體或修飾)；蛋白質(zhì)(包括酶如與裂解神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的那些酶、蛋白酶、激酶等)；酶底物；肽；輔因子；凝集素；糖；多糖；細(xì)胞(可包括細(xì)胞表面抗原)；細(xì)胞膜；細(xì)胞器官等；以及可以復(fù)合的、共價(jià)鍵交聯(lián)等形式存在的其它這種分子或其他物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語核酸、多核苷酸、多核酸和寡核苷酸可互換使用。靶也被稱作抗_探針。如本文所用，“探針”是可以由特定靶特異性識別的物質(zhì)，例如分子。潛在的探針/靶或者靶/探針結(jié)合配對體類型包括受體/配體；配體/抗配體；核酸(多核苷酸)相互作用，包括DNA/DNA、DNA/RNA、PNA(肽核酸)/核酸；LNA(鎖核酸(lockednucleicacid))、酶、其它催化劑或者其他物質(zhì)，底物、小分子或者效應(yīng)分子等。舉例的本發(fā)明包含的探針包括但不限于有機(jī)或無機(jī)材料或聚合物，包括金屬，螯合劑或者與金屬特異性相互作用的其它化合物，塑料，細(xì)胞膜受體的興奮劑和拮抗劑，毒素和毒液，病毒表位，激素(例如阿片樣物質(zhì)肽、類固醇等)，激素受體，脂質(zhì)(包括磷脂)，肽，酶(如蛋白酶或激酶)，酶底物，輔因子，藥物，凝集素，糖，核酸(包括寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、LNA或者修飾的或取代的核酸)，寡糖，蛋白質(zhì)，酶，多克隆和單克隆抗體，單鏈抗體，或者其片段。探針聚合物可以是線性或環(huán)形的。探針依靠不同活性或者不同結(jié)合力而可以區(qū)別磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)。如凝集素這樣的探針可區(qū)別糖基化蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語核酸、多核苷酸、多核酸和寡核苷酸可互換使用。上述作為“探針”的任何物質(zhì)也可以作為“靶”，反之亦然。此外，可以使用其它靶以助于組織的破壞，從而使得探針可以進(jìn)入靶分子，如用于免疫組織化學(xué)的方法，或者在固定組織中進(jìn)行功能或酶測定，或者例如使用蛋白酶K或膠原酶或者皂苷或去污劑，或者使用特異性緩沖液以“復(fù)性”組織內(nèi)靶分子。任何相容表面均可與本發(fā)明聯(lián)合使用。所述表面(通常是固體)可以是任何有機(jī)或無機(jī)材料或者其組合，包括(只是舉例而已)塑料如聚丙烯或聚苯乙烯；陶瓷；硅；(熔融)二氧化硅，石英或玻璃，其可以具有例如玻璃顯微鏡載玻片或者玻璃蓋玻片的厚度；紙，如濾紙；重氮化纖維素；硝化纖維濾膜；尼龍膜；或者聚丙烯酰胺或者其它類型凝膠墊，例如由氣凝膠制成的氣墊或者氣珠，其例如是多孔固體包括薄膜，通過任何常規(guī)方法通過干燥濕凝膠制備。當(dāng)進(jìn)行測定的方法包括光學(xué)檢測時(shí)，可以使用透光的基材。表面可以是與例如常規(guī)檢測方法相容的任何厚度或不透明的。例如，表面可以是厚底的透明平板或不透明平板。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表面是例如組織培養(yǎng)皿的多孔塑料表面，例如24-、96_、256-、384-、864_或者1536-孔平板(例如修飾的平板如CorningCostarDNA結(jié)合平板)。錨可以與表面例如直接結(jié)合而締合，或者可以與一種類型的表面例如玻璃締合，隨后將其與第二種表面例如微滴定平板中的塑料“孔”接觸。表面的形狀不重要。其例如可以是平坦表面如方形、長方形或者圓形；或者是三維表面，如珠、顆粒、鏈狀、沉淀物(precipitate)、管狀、球體等；或者濾膜、珠、毛細(xì)管內(nèi)，或者微流體表面，或者納米粒子。表面包含一個(gè)區(qū)域(如一般用于高密度陣列)或者在空間上離散且可尋址或可鑒別的多個(gè)區(qū)域。每個(gè)區(qū)域包含一系列錨或者一系列捕獲探針(一般用于陣列中或者用于捕獲表面上分子)。所述區(qū)域是怎樣間隔的、其物理特性及其彼此相對方向不重要。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)域可以由抵抗液體通過的任何物理屏障而彼此分離。例如在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述區(qū)域可以是多孔培養(yǎng)皿(例如組織培養(yǎng)皿)的孔，例如24-、96-、256-、384_、864-或者1536-孔平板?；蛘?，表面如玻璃表面可以被蝕刻而具有例如864或1536個(gè)離散的淺孔。或者，表面可以包含未分離的區(qū)域或孔，例如塑料、玻璃或紙的平坦表面，各個(gè)區(qū)域可進(jìn)一步通過覆蓋描繪分離區(qū)域的結(jié)構(gòu)(例如一片塑料或玻璃)而限定。任選地，表面可以在描繪各個(gè)區(qū)域之前已經(jīng)包含一或多個(gè)錨陣列，或者與接頭關(guān)聯(lián)的錨。在另一實(shí)施方案中，每個(gè)區(qū)域中的錨陣列可以由表面上的無錨的空白區(qū)彼此分離，或者由化學(xué)界面如蠟或硅酮分隔以防止小液滴的散布。在另一實(shí)施方案中，所述區(qū)域可以限定為試管或者液體控制通路，例如針對流經(jīng)(flow-through)測定設(shè)計(jì)，例如Beattieetal(1995).Clin.Chem.4，700-706揭示。試管可以是任何大小的，例如毛細(xì)管或者大口徑管，可以使得液體流過；或者可以是用凝膠如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠部分或完全充填，由此可以通過例如電泳轉(zhuǎn)運(yùn)(通過、流過、泵過)化合物；或者用通路例如線性通路的空間填充基質(zhì)充填，例如Albotaetal.(1998).Science281,1653-1656、Cumpstonetal.(1998).Mat.Res.Soc.Symp.Proc.488，217-225和/或Cumpstonetal.(1999).Nature398，51_54所述。在這種空間填充基質(zhì)中，其中的液體和/或分子不僅可以與管壁垂直的方向流動，也可以側(cè)向擴(kuò)散。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試管中填充凝膠或者填充空間的基質(zhì)；所述凝膠或填充空間的基質(zhì)被激活以結(jié)合錨，不同的錨相繼通過，使得在凝膠中形成錨陣列(例如線性陣列)；接頭、靶等相繼通過。該陣列可以是線性、二維或者三維陣列。在一個(gè)試管中可以進(jìn)行多項(xiàng)測定。例如，試管中的錨或者與接頭締合的錨的一個(gè)單陣列可以在使用相同或不同樣品的相繼測定中再次使用(例如剝離(stripped)及再次使用，或者再次編程)。在另一實(shí)施方案中，在一個(gè)測定中使用多個(gè)試管，例如在含有不同陣列的多個(gè)試管中分析感興趣的樣品。試管中所述錨及錨/接頭的締合可以是本文別處所述的任何類型。表面內(nèi)或表面上的區(qū)域也可以通過修飾表面自身而限定。例如，塑料表面可包含由修飾的或者衍生的塑料制成的部分，其可作為例如加入特定類型聚合物的部位(例如，PEG可以附著于聚苯乙烯表面，然后用羧基或者氨基基團(tuán)、雙鍵、醛等衍生化)?；蛘?，塑料表面可包含造模結(jié)構(gòu)如突出或凸起，其可作為加入錨的平臺。在另一實(shí)施方案中，區(qū)域可以是凝膠墊，例如聚丙烯酰胺凝膠墊或氣墊，其以希望的模式排列在表面例如玻璃上，或者夾在兩個(gè)表面例如玻璃和石英平板之間。錨、接頭等可以固定在這種墊的表面上，或者可以包埋于其中。凝膠墊在表面上的各種其它排列方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以通過常規(guī)方法產(chǎn)生。檢測區(qū)域的相對方向可以是任何形式，包括但不限于方形或矩形或其他表面中平行或垂直陣列、圓形或其它表面中放射狀延伸陣列，或者線性陣列等。本發(fā)明的空間離散的區(qū)域以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在。也就是說，存在至少1、2、優(yōu)選至少20或者至少大約24、50、96、256、384、864、1536、2025或更多個(gè)基本相同的空間離散(分離)的區(qū)域。增加重復(fù)區(qū)域數(shù)目可以更高通量地測定。如本文所用，基本相同的區(qū)域是指含有相同或基本相同的錨陣列和/或錨/接頭復(fù)合物的區(qū)域。如本文所用，基本相同是指一個(gè)陣列或區(qū)域與另一陣列或區(qū)域在根據(jù)本發(fā)明分析靶時(shí)呈現(xiàn)基本相同的功能?；旧喜挥绊懝δ芗窗械臋z測性的差異是小的核苷酸缺陷(缺失/插入/取代)或者寡核苷酸缺陷(不良的表面結(jié)合力)等，其在陣列內(nèi)不顯著影響靶確定結(jié)果。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到當(dāng)僅檢測一個(gè)樣品或者檢測一個(gè)組合樣品時(shí)，或者當(dāng)陣列較大時(shí)，可以使用一個(gè)區(qū)域，且表面上的所有區(qū)域非必須彼此基本相同。例如，如果平行檢測兩個(gè)不同系列的陣列，可以有利地在一個(gè)表面上包含這兩個(gè)系列陣列。例如，兩個(gè)不同系列的陣列可以以交替線形(alternatingstriped)模式排列，以便于二者進(jìn)行對比。在另一實(shí)施方案中，業(yè)者希望包含可以與表面上其它區(qū)域區(qū)別的形式檢測且從而用作“注冊區(qū)”的區(qū)域。例如，注冊區(qū)可包含寡核苷酸或肽，其展示不同模式熒光分子，可以由掃描檢測裝置作為“起始點(diǎn)”識別，以對準(zhǔn)表面上區(qū)域的位置。檢測區(qū)域的大小和物理間隔無限制。典型區(qū)域是面積為大約1-大約700mm2，優(yōu)選1-大約40mm2，間隔為大約0.5-大約5mm，根據(jù)包含的區(qū)域常規(guī)選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，區(qū)域間隔大約5mm。例如，每個(gè)區(qū)域可包含矩形格，具有例如8行和6列略圓形錨斑點(diǎn)，該斑點(diǎn)直徑為大約100微米，間隔500微米；這個(gè)區(qū)域覆蓋大約20毫米方形區(qū)域。本發(fā)明也包括更大和更小區(qū)域面積和間隔。所述區(qū)域也可以進(jìn)一步細(xì)分，由此區(qū)域中的一些或者所有錨與相鄰錨通過例如缺口(indentation)或凹陷(dimple)而物理分離。例如，一個(gè)區(qū)域中細(xì)分(亞區(qū))的數(shù)目范圍是從大約10個(gè)至大約100個(gè)或者更多或更少。在一個(gè)實(shí)施方案中，是1536孔培養(yǎng)皿的一個(gè)孔的區(qū)域可以再細(xì)分為更小的孔，例如大約4個(gè)至大約900個(gè)孔，優(yōu)選大約16個(gè)至大約36個(gè)孔，從而形成孔內(nèi)孔陣列。這種凹陷的表面降低了將一個(gè)錨(或者一組錨)物理性置于每個(gè)指定空間(位置)的偏差，且含有錨的區(qū)域的大小更均一，從而便于與探針結(jié)合的靶的檢測。如本文所用，術(shù)語“錨”是指任何實(shí)體或物質(zhì)，例如分子，其與表面締合(例如固定于表面上，或者共價(jià)或非共價(jià)附著于表面，或者其是這個(gè)表面的一部分(例如塑料表面衍生部分)，且其可以與本文所述接頭或其它物質(zhì)特異性相互作用或締合。與例如接頭分子締合的錨的一部分可以與表面直接締合，或者所述錨可以包含中間“間隔物”部分。這種間隔物可以是任何材料，例如本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述間隔物是線性碳分子，例如大約5-20Cs，優(yōu)選大約12Cs。在另一實(shí)施方案中，所述間隔物是核酸(本文別處所述任何類型)，其與例如接頭分子不特異性相互作用或者締合。如本文所用，術(shù)語“錨”也可以是指一組基本相同的錨。每組錨的位置在此稱作位置(locus)。如本領(lǐng)域所熟知，一個(gè)位置中存在的各個(gè)錨分子的數(shù)目僅受例如導(dǎo)入的錨的大小的物理限制。例如，直徑為大約25-200μm的位置可包含數(shù)百萬個(gè)錨。如本文所用，“錨/接頭復(fù)合物”是指錨和接頭以特定方式通過分子締合組合在一起。與所述接頭的相互作用可以是不可逆的，如通過某些共價(jià)鍵作用，或者是可逆的，如通過核酸雜交作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述錨是核酸，其可以是任何長度(例如寡核苷酸)或者任何類型(例如DNA、RNA、PNA、LNA或者RNA或DNA分子的PCR產(chǎn)物)。所述核酸可以被修飾或取代(例如包含非天然發(fā)生的核苷酸如肌苷；通過各種已知連接方式如氨基磺酸酯、磺酰胺、phosphorothionate、磷酸甲酯、氨基甲酸酯等結(jié)合；或者是半合成分子，如DNA-鏈霉親和素綴合物等)。優(yōu)選單鏈核酸。核酸錨可以是與本發(fā)明相容的任何長度。例如，所述錨可以是寡核苷酸，長度范圍是從大約8至大約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約10、15、20、25或30個(gè)核苷酸。在另一實(shí)施方案中，所述錨的長度可以是大約50至大約300個(gè)核苷酸，或者更長或更短，優(yōu)選大約200至大約250個(gè)核苷酸。例如，錨可以包含大約150至大約200個(gè)“間隔物”核酸的核苷酸，以及與該間隔物相鄰的例如大約10、15、20、25或30個(gè)核苷酸的較短序列，其被設(shè)計(jì)為與接頭分子相互作用(接頭特異性序列)。這種間隔物可以是任何長度或者任何類型核酸，且可以具有在本發(fā)明中發(fā)揮功能的任何堿基組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在一個(gè)位置的每個(gè)錨和/或在一個(gè)區(qū)域中不同位置的每個(gè)錨的間隔物是基本相同的；所述錨因此主要由于其接頭特異性序列而彼此不同。間隔物可以賦予錨一定優(yōu)勢，使得改良其性能。例如，這種錨的接頭特異性部分遠(yuǎn)離表面，因此與如果它們與表面較近相比物理限制較小且位阻較小。這樣便于例如在指定位置具有不同靶特異性的多個(gè)不同接頭(例如大約2至大約100個(gè))與錨的締合。如下文更詳細(xì)的論述，單獨(dú)的錨(除了間隔物之外)可包含多個(gè)接頭特異性序列，這些序列例如以一前一后線性方式排列；這樣使得在指定位置多個(gè)不同類型的接頭與至少一個(gè)這種錨締合。下文也更詳細(xì)地論述了另一方式，其中多個(gè)不同類型的接頭可以與錨在“混合位置”這樣的指定位置締合，兩或多個(gè)錨與具有不同靶特異性的不同接頭締合。由于包含間隔物的錨的物理靈活性，因此所述錨在指定位置可易于與多個(gè)不同接頭分子結(jié)合，而不受相鄰錨分子的物理限制。多個(gè)接頭分子與錨在指定位置結(jié)合的優(yōu)勢是使得可以在特定位置檢測更多的靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在指定位置結(jié)合的多個(gè)接頭具有特異于感興趣的同一靶核酸的不同部分(例如核酸內(nèi)的不同寡核苷酸序列)的探針。這樣與用單一探針檢測相比擴(kuò)大了靶的檢測。在另一實(shí)施方案中，所述多個(gè)接頭具有特異于不同(例如不相關(guān)的)靶的探針。這樣使得可以檢測特定位置內(nèi)的多個(gè)不同靶。包含間隔物的錨的另一優(yōu)勢是可更易于提供這樣的接頭，其與相對較大分子如蛋白質(zhì)締合，和/或其結(jié)合相對較大的靶如蛋白質(zhì)、膜或細(xì)胞。核酸錨的堿基組成不受限制。錨的任何堿基組成均是可接受的，只要所述錨具有本發(fā)明目的之功能即可。例如，在一個(gè)位置或者在一個(gè)區(qū)域中不同位置的單鏈核酸錨可以包含部分或者完全隨機(jī)的序列(例如隨機(jī)產(chǎn)生的序列，如A、G、T和/或C的相對量無限制)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述錨不是“序列異構(gòu)體”(例如隨機(jī)序列異構(gòu)體)，即具有同量G、C、A和T但是以不同順序排列的寡核苷酸。也就是說，例如一個(gè)區(qū)域不同位置中的錨不符合等式GnCnAmTm，其中η和m是整數(shù)。見例如圖1示出的錨，其不是隨機(jī)序列異構(gòu)體。在本發(fā)明的錨中，G和C的量不需要近于相同，A和T的量也不需要近于相同。此外，G、C、A和T的相對凈量不必須受限制。例如，一個(gè)區(qū)域中錨的堿基組成可以是從GC相對較多(即G+C>50%)至具有等量的G、C、A和T以及至AT相對較多(即A+T>50%)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述錨是隨機(jī)產(chǎn)生的，例如以G、C、A和T的相對量不受限的方式產(chǎn)生。包含核酸間隔物以及一或多個(gè)接頭特異性部分的錨不太可能符合堿基組成的任何特定限制。例如，如果位于一個(gè)區(qū)域中不同位置的錨具有基本相同的間隔物，例如基本相同的25-mer或者200-mer，但是每個(gè)錨具有不同的接頭特異性部分(例如25-mer)，即使所述接頭特異性部分符合特殊要求(例如A和G的數(shù)目大約相等；T和C的數(shù)目大約相等；寡核苷酸符合等式GnCnAmTm；和/或G+C含量符合特殊要求)，所述錨總體上也不符合那些特殊要求。相似地，即使在一個(gè)區(qū)域中不同位置的錨的接頭特異性部分彼此顯著不同(例如，每個(gè)接頭特異性部分具有與該區(qū)域中其它接頭特異性序列彼此有至少大約20%或50%或80%不同的序列)，考慮核酸全長，所述錨的凈序列相同性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)更低。例如，如果每個(gè)錨包含基本相同的250-mer間隔物以及與該區(qū)域中每個(gè)其它接頭特異性部分100%不同的25-mer接頭特異性部分，則該錨仍彼此有10%不同。錨也可以是肽或蛋白質(zhì)。例如，其可以是多克隆或單克隆抗體分子或其片段，或者單鏈抗體或其片段，其特異性結(jié)合接頭的抗原或者抗抗體分子的那部分；換句話說，所述錨可以是肽，接頭結(jié)合的那部分可以是抗體等。在另一實(shí)施方案中，所述錨可以是凝集素(如伴刀豆球蛋白A或者來自如鱟、花生、綠豆、Phaseolus、小麥胚芽等生物體的凝集素)，其特異于特定的碳水化合物。在另一實(shí)施方案中，所述錨可包含有機(jī)分子，如修飾或衍生的塑料聚合物，其可以是寡核苷酸的特異性固相化學(xué)合成的某階段。在這種情況中，衍生的塑料可以作為離散的、衍生的位置陣列分布，其在生產(chǎn)過程期間可以在組合的塑料表面完整形成。在另一實(shí)施方案中，所述錨可以利用金屬離子例如Ni、Zn、Ca、Mg等與特定蛋白質(zhì)或螯合劑之間的特異性或者優(yōu)先結(jié)合。例如，所述錨可以是多組氨酸，接頭的錨特異性部分可以是鎳，其通過鎳螯合劑與靶特異性探針附著?；蛘?，螯合劑可以是錨，多組氨酸是探針相關(guān)部分?；蛘?，所述錨可包含無機(jī)物質(zhì)。例如，其可包含金屬如鈣或鎂，接頭的錨特異性部分可以是優(yōu)選的螯合劑分別如EDTA或EGTA，其與靶特異性探針附著。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到許多其它類型的分子也可以作為錨，如結(jié)合探針和靶論述的那些一般類型分子。錨也可以是雜合結(jié)構(gòu)，如DNA雙鏈體，或者包含例如DNA和以本文別處描述的任何方式特異性相互作用的蛋白質(zhì)的雙鏈體。例如，雙鏈體錨的“堿基部分”(與表面直接接觸的那部分)可包含任選修飾的單鏈核酸；優(yōu)選地，所述堿基部分也包含間隔物，例如上述線性碳分子間隔物。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二個(gè)單鏈核酸與這個(gè)堿基部分締合(例如雜交)，形成包含至少部分雙鏈(雙鏈體)核酸的錨。例如，堿基部分可包含線性碳分子間隔物，其一端與表面附著，另一端與單鏈DNA寡核苷酸附著，所述單鏈DNA寡核苷酸為大約10-100個(gè)核苷酸、優(yōu)選大約25個(gè)核苷酸；該雙鏈體的第二部分可包含與堿基部分的至少一部分(例如大約40個(gè)核苷酸的末端)互補(bǔ)的序列，隨后是任選的間隔物(例如大約5-15個(gè)、優(yōu)選大約10個(gè)核苷酸)，再后面是接頭特異性序列(例如，長度為大約8至大約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約15、20、25或30個(gè)核苷酸，最優(yōu)選大約25個(gè)核苷酸)。錨雙鏈體的互補(bǔ)部分及其接頭特異性序列的相對長度和堿基組成可以不同，以適應(yīng)測定需要，使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的優(yōu)化方法進(jìn)行。例如，可以選擇這樣的序列，由此在雙鏈體錨自身保持完整的條件下，接頭可以與雙鏈體錨分子解離(例如解鏈)。如果需要，可以再次使用剩余的雙鏈體錨陣列，以與相同或不同接頭分子雜交?；蛘?，可以選擇這樣的序列，由此錨/接頭雜交體與雙鏈體錨的兩個(gè)互補(bǔ)部分在相同條件下解離，僅剩余后面與表面接觸的堿基部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)區(qū)域的特定位置或者所有位置中的所有或者幾乎所有堿基部分是相同或者基本相同的。只有當(dāng)雙鏈體錨的互補(bǔ)部分是首次加回(firstaddedback)時(shí)，可以再次使用這種解離之后剩余的堿基部分陣列(例如與接頭分子雜交)，這是需要參與雙鏈體形成的堿基部分序列信息的方法。生產(chǎn)可以或者不可以由不熟悉堿基部分序列的使用者再次使用的錨陣列的能力，代表應(yīng)用這種雜交錨的優(yōu)勢。例如，生產(chǎn)者可以阻止其錨未被授權(quán)的再次使用。這種再次使用的阻止也可以例如預(yù)防退化的性能或者過量使用所致不可靠性等問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，在一個(gè)區(qū)域中指定位置的一組錨是基本相同的(例如特異于一種類型接頭的“錨特異性”部分，或者僅特異于一個(gè)靶)。在另一實(shí)施方案中，具有多個(gè)不同接頭和/或多個(gè)不同靶特異性的多個(gè)不同的錨可以存在于一個(gè)指定位置，稱作“混合的位置”，例如所述多個(gè)是大約2-大約100個(gè)，例如至少大約2個(gè)、至少大約4個(gè)或者至少大約10個(gè)?；旌系奈恢玫膬?yōu)勢是其使得可以在一個(gè)特定位置檢測更多的不同靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)混合的位置含有一個(gè)錨，其在每一個(gè)或者至少幾個(gè)位置中是相同的。例如，在一個(gè)以上的位置中是相同的錨可用于質(zhì)量保證和/或控制或者用于信號標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)然，“混合的位置”對于僅具有單一區(qū)域(非重復(fù)區(qū)域)的表面也是有利的。這種單一區(qū)域的每個(gè)位置中的錨可以與接頭相互作用，或者與感興趣的靶直接相互作用。檢測區(qū)域中錨的數(shù)目(即在單獨(dú)位置的錨組數(shù))可以是至少2個(gè)，優(yōu)選大約8個(gè)至大約900個(gè)(包括更多或更少)，更優(yōu)選大約8個(gè)至大約300個(gè)，最優(yōu)選大約30個(gè)至大約100個(gè)(例如大約64個(gè))。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在具有96個(gè)檢測區(qū)域(例如孔)的表面有大約16、36、45或者100個(gè)錨/檢測區(qū)域，或者在具有384個(gè)檢測區(qū)域(例如孔)的表面有大約9、16或25個(gè)錨/檢測區(qū)域。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測區(qū)域中的每個(gè)錨與陣列中每個(gè)其它錨具有不同特異性。然而，兩或多個(gè)錨可以呈現(xiàn)相同特異性，且所有的錨可以是相同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中本發(fā)明的組合包含大量檢測區(qū)域(例如大約864、1536或更多個(gè))，由此可以同時(shí)處理大量檢測樣品，感興趣的是針對僅少數(shù)(例如大約2、4、6或者9個(gè))參數(shù)檢測的那些樣品。換句話說，對于包含大量區(qū)域的組合，有利地是每個(gè)區(qū)域僅具有大約2-9個(gè)錨。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，陣列可以由這樣的分子組成，其直接捕獲靶如核酸酶保護(hù)探針而不使用錨/接頭復(fù)合物。此外，陣列可以由僅幾個(gè)至幾十萬個(gè)捕獲位點(diǎn)組成，一般稱作高密度陣列，且每個(gè)表面上可以僅有一個(gè)這樣的陣列或者多個(gè)陣列。檢測區(qū)域中或其上的錨的物理間隔和相對方向(即在各個(gè)位置的幾組錨)無限制。典型地，錨之間的距離為大約0.003至大約5mm或更小，優(yōu)選大約0.03至大約Imm之間。包括較大和較小的錨間隔(和面積)。所述錨可以相對于彼此和區(qū)域邊界以任何方向排列。例如，其可以二維方向排列如方形、矩形、六邊形或者其它陣列，或者是圓形陣列，其中錨從中心以放射狀直線或同心圓形式放射。所述錨也可以一維線性陣列方式排列。例如，寡核苷酸可以與DNA或RNA序列的特定位置雜交形成超分子陣列，或者以線性排列流經(jīng)凝膠，或者在流經(jīng)裝置或者流經(jīng)裝置內(nèi)的結(jié)構(gòu)的表面上。或者，所述錨可以“條形碼”樣排列方式排列。例如，錨可以排列成彼此平行的長列。每個(gè)長列之間的間隔或者寬度可以規(guī)律性不同，以產(chǎn)生更類似于條形碼的簡單的可識別模式，例如第一列和第三列可以是余者的兩倍，列可以省略等。額外的空列可以置于最后一列之后，以劃分一個(gè)檢測區(qū)域的界限，條形碼模式可以在隨后的檢測區(qū)域中重復(fù)。錨的模式不需要精確登記單獨(dú)的測定孔(檢測區(qū)域)或者單獨(dú)的測定小滴的位置。術(shù)語“測定位置”用于描述應(yīng)用測定樣品的測定表面的位置(這些可以由測定樣品的單獨(dú)小滴的位置或者由多孔平板上各個(gè)測定孔壁或間隔物的位置限定)。錨模式自身(例如條形碼樣模式寡核苷酸錨)用于定義其中每個(gè)單獨(dú)的錨以模式識別定位的情況-就像條形碼的每個(gè)列由相對于剩余列的位置識別。因此，第一個(gè)錨不需要在每個(gè)測定位置的一邊或者一角。第一個(gè)錨通過模式識別發(fā)現(xiàn)，而不是相對于測定位置的位置而發(fā)現(xiàn)。只要每個(gè)測定位置使用的面積(例如小滴的面積或者孔的面積)足夠大到能確定含有重復(fù)模式錨的至少一個(gè)完整單位，則每個(gè)測定點(diǎn)將檢測樣品由(條形碼)模式指定的所有靶的測定位置，無論所述模式位于測定位置的區(qū)域中何處。錨不需要嚴(yán)格或者甚至是固定的模式排列在每個(gè)檢測區(qū)域中。例如，每個(gè)錨均可以附著于顆粒、珠等，處于檢測區(qū)域中的隨機(jī)位置。每個(gè)錨的位置可以通過使用例如可檢測標(biāo)記確定。例如，特異于每種類型的錨的接頭分子可以用不同的熒光、發(fā)光等標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，且包含特殊成對接頭/錨的顆粒的位置可以通過接頭發(fā)射的信號的性質(zhì)鑒別，例如激發(fā)光譜或發(fā)射光譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備具有各種這樣附著標(biāo)記的一系列接頭，每個(gè)接頭均具有可區(qū)別的光譜?；蛘?，可以直接標(biāo)記錨。例如，每種類型的錨均可以用標(biāo)記物標(biāo)記，所述標(biāo)記物發(fā)出與其它類型錨上標(biāo)記物不同光譜的熒光?；蛘撸鲱w粒、珠等在大小或形狀或顏色或熒光或者信號發(fā)射方面彼此不同?？梢詰?yīng)用本文描述的任何標(biāo)記和檢測方法。例如，熒光可以通過基于CCD的成像系統(tǒng)、通過掃描熒光顯微鏡或者熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)進(jìn)行測量。錨可以與接頭分子的一部分_錨特異性部分_相互作用或者成為締合。術(shù)語“相互作用，，或者“締合”在本文是指兩種物質(zhì)或化合物(例如錨與接頭的錨特異性部分，探針與其靶，或者靶與靶特異性報(bào)道分子)彼此充分結(jié)合(例如附著、結(jié)合、雜交、連接、退火、共價(jià)連接或者另外方式的締合)，可以進(jìn)行目的測定。術(shù)語“特異性”或者“特異于”在本文是指兩種成分(例如錨與接頭的錨特異性區(qū)域，探針與其靶，或者靶與靶特異性報(bào)道分子)彼此選擇性結(jié)合，且在無任何保護(hù)技術(shù)的情況中，一般不結(jié)合非用于結(jié)合所述成分的其它成分。實(shí)現(xiàn)特異性相互作用所需的參數(shù)可以常規(guī)確定，例如使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法。對于核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可實(shí)驗(yàn)性確定核酸(例如寡核苷酸錨)在選擇的嚴(yán)格性條件下可以與另一核酸(例如接頭的錨特異性部分)雜交的特征(如長度、堿基組成和互補(bǔ)程度)，同時(shí)使與其它物質(zhì)或分子(例如其它寡核苷酸接頭)的非特異性雜交最小化。典型地，錨的DNA或其它核酸序列、接頭的一部分或者檢測寡核苷酸與其結(jié)合配體具有足夠的互補(bǔ)性，以使其在選擇的雜交條件下雜交，Tm高于室溫大約10-20°C(例如大約37°C)。一般而言，寡核苷酸錨的長度可以從大約8至大約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約15、20,25或者30個(gè)核苷酸。如本文所用，“高嚴(yán)格雜交條件”是指當(dāng)核酸之間存在至少95%、優(yōu)選大約97-100%的核苷酸互補(bǔ)性(相同性)時(shí)發(fā)生雜交的任何條件。然而，根據(jù)目的不同，可以選擇需要較低互補(bǔ)性的雜交條件，例如大約90%、85%、75%、50%等?？梢宰兓碾s交反應(yīng)參數(shù)是鹽濃度、緩沖液、PH、溫度、保溫時(shí)間、變性劑如甲酰胺的量和類型等(見例如Sambrooketal.(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.)Vols.1-3,ColdSpringHarborPress,NewYork；Hamesetal.(1985).NucleicAcidHybridization,ILPress；Davisetal.(1986)，BasicMethodsinMolecularBiology,ElsevirSciencesPublishing,Inc.，NewYork)。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將核酸(例如接頭寡核苷酸)加入檢測區(qū)域中(例如多孔平板如96或384或更多孔平板的孔)，體積為大約0.1至大約100μ1或更多(在優(yōu)選的實(shí)施方案中，體積為大約1至大約50μ1，最優(yōu)選大約40μ1)，濃度為在緩沖液例如6XSSPE-T(0.9ΜNaCl,60mMNaH2PO4,6mMEDTAand0.05%TritonX-100)中大約0.01至大約5μΜ(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約0.1μΜ)，并且與結(jié)合配體(例如表面上寡核苷酸錨)雜交大約10分鐘至大約3小時(shí)(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為至少大約15分鐘)，溫度為大約4°C至大約37°C(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約室溫溫度)?？梢赃x擇條件以高通量進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)條件可以是近于生理?xiàng)l件?？梢宰鳛殄^或者接頭一部分的其它類型物質(zhì)或分子(例如多肽、凝集素等)的設(shè)計(jì)以及實(shí)現(xiàn)與其結(jié)合配體特異性相互作用的反應(yīng)條件為本領(lǐng)域常規(guī)及常用技術(shù)(例如Niemeyeretal(1994).Nucl.AcidsRes.22，5530—5539；Fodoretal(1996).U.S.PatentNo.5，510，270；Pirrungetal(1992)，U.S.PatentNo.5，143，854所述)。在保溫參數(shù)是緩沖液、鹽濃度、PH、溫度、保溫時(shí)間、存在降低與含有作為錨的抗體的檢測區(qū)域(例如多孔平板_在優(yōu)選的實(shí)施方案中是96或384或更多孔平板-的孔)非特異性相互作用的載體和/或制劑或條件等的情況中，可以加入抗_抗體(例如抗原或抗體特異性二級抗體)，體積為大約0.1至大約100μ1或更多(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約1至大約50μ1，最優(yōu)選大約40μ1)，濃度為在緩沖液如6XSSPE-T、PBS或者生理鹽水中大約IOpM至大約10ηΜ(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約InM)，與表面上錨保溫大約10分鐘至至少大約3小時(shí)(在優(yōu)選的實(shí)施方案中保溫至少大約15分鐘)，溫度為大約4°C至大約45°C(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約4°C)。對于肽錨，優(yōu)選其長度為大約5至大約20個(gè)氨基酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在選擇的反應(yīng)條件下陣列中的每個(gè)錨均可以與其對應(yīng)接頭的錨特異性部分相互作用，程度與陣列中其它錨作用程度基本相同。這可以保證所述錨指定基本一致的接頭陣列以及因此的探針。檢測區(qū)域中的錨(即在各個(gè)位置的幾組錨)可以是“通用(generic)”系列，每個(gè)錨均可以與一或多個(gè)不同的接頭相互作用，所述接頭均具有特異于這種錨的部分但是具有不同的“探針”部分；因此一個(gè)通用錨陣列可用于編程或者定義不同系列的探針。這種通用錨陣列的靈活性可以參見圖1所示。圖1示出這些錨之一，即錨1，其與包含特異于錨1的一部分以及特異于靶mRNAl的第二部分的接頭1接觸?；蛘撸梢杂美缃宇^2代替，其與接頭1相似，包含特異于錨1的一部分，但是含有特異于靶mRNA2而不是靶mRNAl的第二部分。因此，錨1可用于限定(或者編程，或者定義，或者確定)兩或多個(gè)不同靶mRNA的任一探針。產(chǎn)生和附著高分辨模式(陣列)寡核苷酸或肽的方法可能昂貴、費(fèi)時(shí)和/或難以物理產(chǎn)生。使用預(yù)先形成的錨陣列編程多個(gè)探針陣列的能力是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢。盡管圖1示出的通用錨定義了寡核苷酸探針的模式，但是相同的錨陣列也可以用于編程其它探針的陣列，例如受體蛋白。顯然，可以進(jìn)行許多改變，限定錨/接頭相互作用的類型范圍，例如更多更復(fù)雜的層次如“夾心(sandwiched)”或者“piggybacked”探針，如蛋白質(zhì)/抗體組合。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)通用系列的錨可以與一系列接頭締合(共價(jià)或非共價(jià))，形成“綴合的”錨的修飾的陣列，如下文詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的錨的表面本身即呈現(xiàn)出新優(yōu)勢。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，錨可以與接頭可逆地相互作用；因此，一個(gè)通用系列的錨可再次用于編程不同系列的探針。例如，通過導(dǎo)致兩個(gè)寡核苷酸解離的加熱步驟可以使寡核苷酸錨與接頭的寡核苷酸部分分離，然后可以與第二個(gè)接頭再次結(jié)合。再次使用昂貴的、費(fèi)時(shí)和/或難以物理產(chǎn)生的錨陣列的能力是本發(fā)明的另一優(yōu)勢。錨非必須與接頭相互作用。例如，錨可以與可檢測分子如熒光染料結(jié)合(直接或間接)，從而可以使斑點(diǎn)定位于例如用于在檢測表面與檢測儀之間登記(registration)的格子內(nèi)?；蛘撸^可以用已知量的可檢測分子標(biāo)記，以作為內(nèi)部量化標(biāo)記用于定標(biāo)目的。如本文所用，術(shù)語“接頭”是指雙功能物質(zhì)，其包含特異于選擇的(設(shè)計(jì)的)錨或者所述錨的亞集(subset)的第一部分(或者部分(moiety)或部分(part))(錨特異性)，以及包含特異于感興趣的靶的探針的第二部分(靶特異性)。接頭的這兩部分可以通過共價(jià)或者非共價(jià)鍵連接，且可以直接或者通過中間物(例如間隔物)連接。當(dāng)然，接頭的錨特異性部分的化學(xué)性質(zhì)是所述錨或者與其相互作用作用的錨的功能。例如，如果錨是寡核苷酸，則接頭的與其相互作用的那部分可以是例如特異性結(jié)合所述寡核苷酸的肽，或者在選擇的嚴(yán)格雜交條件下與其可以有效且特異性雜交的核酸。所述核酸可以是例如寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、PCR產(chǎn)物，或者取代或修飾的核酸(例如，包含非天然發(fā)生的核苷酸，例如肌苷；通過各種已知連接方式如氨基磺酸酯、磺酰胺、phosphorothionate、磷酸甲酯、氨基甲酸酯結(jié)合；或者作為半合成分子如DNA-鏈霉親和素綴合物等)。優(yōu)選單鏈部分。接頭的特異于寡核苷酸的那部分的長度可以是大約8至大約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約15、20、25或30個(gè)核苷酸。如果所述錨是抗體，則接頭的可以與其相互作用的那部分可以是例如抗-抗體、抗原或者這些分子之一的小片段，其可以與所述錨特異性相互作用。與上述其它類型錨特異性相互作用且可以作為接頭的錨特異性部分的物質(zhì)或分子為本領(lǐng)域熟知，且可以使用常規(guī)程序設(shè)計(jì)(例如見上述)。當(dāng)然，接頭的靶特異性部分的化學(xué)性質(zhì)是其探查以及與其相互作用的靶的功能。例如，如果所述靶是特定的mRNA，則接頭的靶特異性部分可以例如是在選擇的雜交條件下與所述靶特異性結(jié)合、但是與干擾RNA或DNA不雜交的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法實(shí)驗(yàn)性確定優(yōu)選與靶雜交而與非特異性干擾DNA或RNA最小程度雜交的寡核苷酸的特征(例如見上述)。總的來說，用于辨別大量過多的非靶向RNA背景中存在的靶mRNA的寡核苷酸探針的長度可以是大約8至大約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選大約18、20、22或25個(gè)核苷酸。用于其中沒有大量競爭靶背景的生物化學(xué)測定中的寡核苷酸探針可以較短。使用本領(lǐng)域公認(rèn)的程序(例如計(jì)算機(jī)程序BLAST)，可以選擇寡核苷酸探針的序列，由此其是互相不相關(guān)的，且在與已知遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫中潛在干擾序列不同。使得寡核苷酸探針與RNA特異性雜交的雜交條件的選擇可以通過使用本領(lǐng)域公認(rèn)程序常規(guī)確定(例如見上述)。例如，可以將靶RNA[例如，從在任何容器中生長的組織或細(xì)胞中提取的總RNA或mRNA(及任選用感興趣的制劑處理)，所述容器如多孔微滴定平板的孔(例如96或384或更多孔)]加入含有寡核苷酸探針陣列(見上述)的檢測區(qū)域中，在如6XSSPE-T或其他緩沖液中，任選含有降低非特異性結(jié)合的物質(zhì)(例如大約0.5mg/ml降解的鯡或鮭精DNA，或者酵母RNA)，并且在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的溫度下保溫大約10分鐘至至少18小時(shí)(在優(yōu)選的實(shí)施方案中為大約3小時(shí))。雜交的嚴(yán)格性可以與用于使所述錨與接頭的錨特異性部分結(jié)合的嚴(yán)格性相同或低于該嚴(yán)格性。其它類型探針的設(shè)計(jì)和使用也為本領(lǐng)域熟知，如上文論述。在一個(gè)實(shí)施方案中，在指定位置與錨締合的所有或者基本上所有接頭均含有相同(或者基本相同)的探針，其特異于一個(gè)特定的感興趣的靶。在另一實(shí)施方案中，在指定位置與所述錨締合的一或多個(gè)接頭包含多個(gè)不同探針，因此特異于多個(gè)不同靶。這些探針可以被置于接頭中，作為分支結(jié)構(gòu)的一部分，或者優(yōu)選地可以以線性關(guān)系排列；且其可以是相同材料(例如均是核酸或者均是肽序列)或者不同材料的組合。實(shí)際上，每個(gè)接頭上具有多個(gè)探針增加了在特定位置可以檢測的靶的數(shù)目。在一個(gè)實(shí)施方案中，指定接頭上的多個(gè)探針均特異于特定的感興趣的靶(例如，其特異于一個(gè)感興趣的mRNA的不同部分，或者其特異于相應(yīng)于該mRNA的不同部分的核酸酶保護(hù)片段)；這樣可以增加靶測定的靈敏性，例如在樣品中少量存在的靶。接頭上探針的數(shù)目可以例如是大約2-50個(gè)，優(yōu)選大約2、4或10個(gè)。當(dāng)然，包含這種多個(gè)不同探針的接頭對于使用僅含有一個(gè)(非重復(fù))區(qū)域的表面也是有利的。接頭的錨特異性部分和靶特異性部分可以通過任何共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合(附著、連接)，其性質(zhì)對于本發(fā)明無關(guān)緊要。這兩部分可以直接結(jié)合，或者通過中間分子結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中接頭的這兩部分均是寡核苷酸，其可以通過共價(jià)鍵如磷酸二酯鍵結(jié)合形成單一共線性核酸。在另一實(shí)施方案中，其中錨特異性部分是寡核苷酸，而靶特異性部分是受體例如受體蛋白，則這兩部分可以通過生物素與鏈霉親和素分子的相互作用而結(jié)合。本領(lǐng)域已知這種連接的許多變化(例如見Niemeyeretal(1994).NAR22，5530-5539)?；蛘撸@兩部分可以直接結(jié)合，例如寡核苷酸可以被酰胺化，隨后通過酰胺鍵與肽或蛋白質(zhì)直接連接(例如交聯(lián))，或者通過酰胺鍵或者脂質(zhì)附著作用與膜成分結(jié)合。形成這種共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)熟知且可易于優(yōu)化。在接頭的錨特異性部分與靶特異性部分之間也可以存在間隔序列(例如核酸)。在兩種物質(zhì)經(jīng)締合(例如，通過保溫兩個(gè)核酸、兩個(gè)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)加核酸等)形成復(fù)合物(例如錨/接頭復(fù)合物)之后，使用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的保留完整特異性相互作用、但是除去非特異性結(jié)合的材料的條件，對所得復(fù)合物可優(yōu)選進(jìn)行處理(例如洗滌)，以除去未結(jié)合的物質(zhì)(例如接頭)。例如，可以在相同或者比用于獲得所述復(fù)合物(例如錨/接頭復(fù)合物)的條件略為更嚴(yán)格的條件下洗滌反應(yīng)混合物大約1次至大約10次或更多次。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到可以產(chǎn)生各種類型的錨和接頭的夾心。例如，可以在錨陣列(例如具有基本相同的序列的錨)中附著第一系列的接頭，每個(gè)接頭均具有特異于該錨的第一部分以及特異于第二系列接頭之一的第二部分，等等。實(shí)際上，這個(gè)夾心的第二層使得第一系列的錨(例如相同寡核苷酸)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂小熬Y合的”錨的不同系列特異性的不同陣列。各個(gè)系列的接頭與錨可以根據(jù)要求彼此共價(jià)或非共價(jià)締合。本發(fā)明的組合可以通過使用常規(guī)技術(shù)常規(guī)生產(chǎn)。可用于本發(fā)明中的一些表面易于商購自供應(yīng)商。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面是96-、384_或者1536-孔微滴定平板，如由CorningCostar銷售的修飾的平板?；蛘?，包含孔(所述孔繼而包含缺口(indentations)或“凹陷(dimples)”)的表面可以通過如下方法形成，即，將如鋁或鋼等物質(zhì)進(jìn)行微切削加工制備模子，然后將塑料或者相似材料顯微注入該模子中形成結(jié)構(gòu)?；蛘?，可以裝配由玻璃、塑料、陶瓷等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。分隔物可以是一片例如具有間隔孔的材料如硅酮，由此當(dāng)三片材料連接在一起時(shí)每個(gè)孔形成檢測孔的壁。細(xì)分部分(subdivide!·)可以是例如一薄片材料如硅酮，成形為篩子或者細(xì)網(wǎng)形狀?；|(zhì)可以是一片扁平材料如玻璃，形狀是符合用于生物化學(xué)測定的典型微滴板的下層部分。基質(zhì)的上表面可以是扁平的，或者可以是有缺口的，其將與細(xì)分部分形狀匹配以提供每個(gè)樣品孔內(nèi)的完整的細(xì)分部分或孔。這三片材料通過標(biāo)準(zhǔn)程序連接在一起，例如用于裝配硅酮晶片的程序。寡核苷酸錨、接頭部分或者檢測物可以通過常規(guī)技術(shù)合成，例如使用商購的寡核苷酸合成儀和/或通過將已經(jīng)如此合成的亞片段連接在一起而合成。太長以至于不易通過這種方法合成的核酸可以使用常規(guī)程序通過擴(kuò)增方法如PCR產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將預(yù)先形成的核酸錨如寡核苷酸錨置于檢測區(qū)域的表面上或其中，這通過任何常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，包括光刻或絲網(wǎng)印刷化學(xué)吸附術(shù)、噴墨技術(shù)沉積、毛細(xì)管、篩或流體通路芯片、使用電極陣列的電化學(xué)模式、與Pin或quill接觸、或者變性之后焙燒或UV照射到濾膜上(見例如Ravaetal(1996)·U.S.PatentNo.5，545，531；Fodoretal(1996)·U.S.PatentNo.5,510,270；Zanzucchietal(1997).U.S.PatentNo.5,643,738；Brennan(1995).U.S.PatentNo.5，474，796；PCTW092/10092；PCTWO90/15070)。錨可以置于檢測區(qū)域表面的上部，或者例如在聚丙烯氨酰胺凝膠墊的情況中可以包埋于表面中，以此方式一些錨從表面突出，且可以與接頭相互作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)先形成的寡核苷酸錨在5’末端用游離氨基衍生化；以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的濃度(例如大約1μΜ)溶解于緩沖液如50mM磷酸鹽緩沖液ρΗ8.5和ImMEDTA中；使用Pixusnanojet分送器(CartesianTechnologies)以大約10.4納升(nanoliters)液滴分布于檢測孔中特定位置上，檢測孔的上表面是新鮮的干燥的DNA結(jié)合平板(CorningCostar)。根據(jù)寡核苷酸附著和蒸發(fā)的相對比率，也許需要在制備期間控制孔中的濕度。在另一實(shí)施方案中，可以通過使用常規(guī)方法在檢測區(qū)域表面上直接合成寡核苷酸錨，所述方法例如是生長的寡核苷酸鏈的光活化去保護(hù)作用(例如聯(lián)合使用定點(diǎn)屏蔽(sitedirecting“mask”))，或者通過使用nanojet分送器模式化分配去活化的化合物的納升液滴?？梢詫邮軉蝹€(gè)核苷酸的所有生長中的序列進(jìn)行去保護(hù)，然后在表面上加入核苷酸。在另一實(shí)施方案中，使用常規(guī)方法使寡核苷酸錨通過其3’末端附著于表面。肽、蛋白質(zhì)、凝集素、螯合作用實(shí)施方案、塑料及其它類型錨或者接頭部分也可以常規(guī)產(chǎn)生，且使用合適的可利用的技術(shù)，錨可以置于表面上或其中(見例如Fodoretal(1996).U.S.PatentNo.5，510，270；Pirrungetal(1992).U.S.PatentNo.5，143，854；Zanzucchietal(1997).U.S.PatentNo.5,643,738；Loweetal(1985).U.S.PatentNo.4，562，157；Niemeyeretal(1994).NAR22,5530-5539)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，揭示的組合用于各種篩選程序中和/或用于獲得關(guān)于探針或靶分子的水平、活性或結(jié)構(gòu)的信息。這種測定被稱作MultiArrayPlateScreen(MAPS)方法或測定，包含錨陣列或者錨加上用于進(jìn)行測定的探針的表面被稱作MAPS陣列或MAPS平板。反應(yīng)混合物的成分、測定或者篩選程序可以任何順序裝配。例如，錨、接頭和靶可以相繼裝配；或者在存在或者不存在報(bào)道分子的條件下可以將靶與接頭在溶液中裝配，然后與錨接觸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及檢測至少一個(gè)靶的方法，所述方法包括將可能包含所述靶的樣品與雙功能接頭在有效獲得所述靶與所述接頭之間的第一個(gè)雜交產(chǎn)物的條件下接觸，所述接頭具有特異于寡核苷酸錨的第一部分和包含特異于所述靶的探針的第二部分；將所述第一個(gè)雜交產(chǎn)物與本發(fā)明的組合在有效獲得所述第一個(gè)雜交產(chǎn)物與所述組合之間的第二個(gè)雜交產(chǎn)物的條件下接觸，其中所述組合在加入所述第一個(gè)雜交產(chǎn)物之前包含一個(gè)表面，所述表面包含多個(gè)空間離散的區(qū)域，其中至少兩個(gè)區(qū)域是基本相同的，每個(gè)區(qū)域包含至少8個(gè)不同的寡核苷酸錨，將所述第一個(gè)雜交產(chǎn)物或者第二個(gè)雜交產(chǎn)物與標(biāo)記的檢測探針接觸，并檢測所述檢測探針。下文描述的每個(gè)測定或程序均可以高通量進(jìn)行，其中在每個(gè)平板或避免上同時(shí)快速測定大量樣品(例如，根據(jù)所述組合中區(qū)域的數(shù)目，測定多如大約864、1036、1536、2025個(gè)或更多個(gè)樣品)。此外，可以同時(shí)處理許多平板或表面。例如，在藥物開發(fā)方法中，可以將包含藥物候選物的大量藥品(例如組合化學(xué)文庫的成員，如小分子、肽、寡核苷酸或者其它物質(zhì)的變體)加入所述組合的獨(dú)立區(qū)域中，或者可以加入生物或生物化學(xué)藥品，然后加入所述組合的獨(dú)立區(qū)域中，并且與位于該區(qū)域中的探針陣列保溫，對每個(gè)樣品進(jìn)行測定。隨著近來高密度微滴板、DNA測定點(diǎn)位工具以及如從密集的微滴板中產(chǎn)生和收集數(shù)據(jù)的激光技術(shù)、機(jī)器人技術(shù)、改良的分送器、精密的檢測系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)管理軟件的出現(xiàn)和持續(xù)發(fā)展，本發(fā)明的方法可用于每天篩選和分析數(shù)千個(gè)或者數(shù)萬個(gè)或更多個(gè)化合物。例如，在其中探針是寡核苷酸的實(shí)施方案中，所述測定可以是對大量樣品進(jìn)行診斷核酸或多核苷酸篩選(例如結(jié)合或其它測定)，以確定遺傳變異或缺陷的存在(例如與疾病如囊性纖維性變相關(guān)的多態(tài)性或特異性突變，見例如Iitiaetal(1992).MolecularandCellularProbes6，505-512))、病原性生物體(如細(xì)菌、病毒和原生動物，其宿主是動物，包括人，或者是植物)，或者診斷特定生理狀態(tài)或疾病的mRNA轉(zhuǎn)錄模式。包含EST—部分(包括全長拷貝)的核酸探針陣列可用于評估從中衍生EST(或其它)的細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄模式。核酸探針也可以檢測特異性結(jié)合特定核酸序列的肽、蛋白質(zhì)，或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(反之亦然)。相似地，在其中探針是抗原結(jié)合分子(例如抗體)的實(shí)施方案中，所述測定可以篩選不同的蛋白質(zhì)，或者篩選蛋白質(zhì)表達(dá)模式，其用于診斷特定生理狀態(tài)或疾病病癥。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合可用于監(jiān)測生物化學(xué)反應(yīng)，例如蛋白質(zhì)、核酸、小分子等的相互作用，例如抗原與抗體之間相互作用的有效性或特異性；或者受體(如純化的受體或者與細(xì)胞膜結(jié)合的受體)與其配體、激動劑或拮抗劑的相互作用；或者酶(如蛋白酶或激酶)與其底物的相互作用，或者底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的量的增加或減少等等。這種生物化學(xué)測定可用于鑒定探針或靶的性質(zhì)，或者作為篩選測定的基礎(chǔ)。例如，為了篩選樣品中特定蛋白酶的存在(例如參與血液凝固的蛋白酶，如蛋白酶Xa和Vila)，可以在所述組合上測定樣品，所述組合中探針是特異于每個(gè)感興趣的蛋白酶的熒光底物。如果靶蛋白酶結(jié)合并裂解底物，則該底物通常由于例如兩個(gè)能量轉(zhuǎn)移對之間的裂解和分離的結(jié)果而將發(fā)出熒光，且該信號可以被檢測。在另一實(shí)施例中，為了篩選樣品特定激酶的存在(例如Src、酪氨酸激酶或者ZAP70)，可以在所述組合上測定含有一或多種感興趣的激酶的樣品，其中所述探針是可以被感興趣的激酶之一選擇性磷酸化的肽。使用本領(lǐng)域公認(rèn)的常規(guī)可確定的條件，可以將樣品與底物陣列在合適的緩沖液中與必需的輔因子一起保溫根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間。(在一些測定例如調(diào)節(jié)感興趣的激酶活性的因子的生物化學(xué)研究中，可以調(diào)節(jié)每種激酶的濃度，由此每種底物以相似比率被磷酸化)。在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的條件下對每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行處理(例如洗滌)以除去激酶和不希望的反應(yīng)成分(任選)之后，磷酸化的底物可以通過例如將其與可檢測的試劑如熒光素標(biāo)記的抗磷酸酪氨酸或者抗磷酸絲氨酸抗體(例如濃度為大約lOnM或者更多或更少)一起保溫進(jìn)行檢測，且信號可以被檢測。在另一實(shí)施例中，可以進(jìn)行結(jié)合測定。例如，可以在適當(dāng)磷酸化的肽的探針陣列上測定SH2結(jié)構(gòu)域如GRB2SH2或ZAP70SH2；或者可以在特定受體的探針陣列上篩選血清以發(fā)現(xiàn)免疫缺陷的存在。另外，可以在這種陣列形式中進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定。本發(fā)明的組合也可以用于檢測突變酶，其較其野生型對應(yīng)物活性更高或更低，或者篩選各種物質(zhì)包括除草劑或殺蟲劑。當(dāng)然，MAPS測定可用于確定(測量、量化)樣品中活性靶的數(shù)量，條件是探針未被完全占據(jù)，即不超過大約90%的可利用探針位點(diǎn)與靶結(jié)合(或者反應(yīng)或雜交)。在這些條件下，可以對靶進(jìn)行量化，因?yàn)榫哂休^多的靶將導(dǎo)致更多的探針結(jié)合。另一方面，在其中超過大約90%的可利用探針位點(diǎn)被結(jié)合的條件下，存在更多的靶不明顯增加與探針結(jié)合的表達(dá)的量。任何迄今為止提及的類型的靶均可以這種方式量化。此外，通過向結(jié)合混合物中加入已知量未標(biāo)記的靶證實(shí)即使靶過量存在(例如，如果其以使MAPS探針陣列中可利用的探針的量飽和的這種大量存在)，也可以“改變反應(yīng)的靈敏性”以使得可以量化這種大量的靶。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合可用于篩選調(diào)節(jié)靶與指定探針的相互作用的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以通過與探針、靶、或者由靶加上探針形成的復(fù)合物的直接或者間接相互作用而可以調(diào)節(jié)所述靶/探針相互作用。所述調(diào)節(jié)可以是多種形式，包括但不限于增加或降低靶與探針的結(jié)合親和性，增加或降低靶與探針結(jié)合的比率，競爭性或非競爭性抑制探針與靶的結(jié)合，或者增加或降低探針或靶的活性，在一些情況中這可導(dǎo)致探針/靶相互作用增強(qiáng)或降低。這種物質(zhì)可以是人工生產(chǎn)或者天然發(fā)生的物質(zhì)。這種物質(zhì)也可以其未改變的狀態(tài)或者以與其它物質(zhì)的聚集體形式應(yīng)用；其也可以直接或者通過特定結(jié)合物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)附著于結(jié)合膜。例如，為了鑒別潛在的“血液稀釋劑”或者與導(dǎo)致血液凝固的蛋白酶級聯(lián)之一相互作用的物質(zhì)，可以用多個(gè)候選物質(zhì)檢測感興趣的蛋白酶混合物，然后檢測上述活性。本發(fā)明可以使用的這種物質(zhì)的其它例子非常多種多樣，包括殺蟲劑和除草劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合可用于篩選調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式的物質(zhì)。例如可以使用寡核苷酸陣列鑒別這樣的mRNA，其從一系列基因的表達(dá)模式與特定生理學(xué)狀態(tài)或者發(fā)育階段或者與疾病相關(guān)(“相關(guān)”基因、RNA或者表達(dá)模式)。術(shù)語“相關(guān)”是指RNA的合成模式與細(xì)胞的生理狀況相關(guān)聯(lián)，但是非必須一給定RNA的表達(dá)與特定生理學(xué)狀態(tài)相關(guān)或者導(dǎo)致該狀態(tài)。例如，可以鑒別在細(xì)胞中表達(dá)的、上轉(zhuǎn)變和/或下轉(zhuǎn)變的mRNA小亞集，其作為特定疾病狀態(tài)的模型；將這個(gè)改變的表達(dá)模式與在正常細(xì)胞(未表現(xiàn)出病理學(xué)表型)中的表達(dá)模式進(jìn)行對比，可以作為疾病狀態(tài)的指征(“指示”基因，RNA或者表達(dá)模式)。術(shù)語“相關(guān)”與“指示”可互換使用。例如，用腫瘤促進(jìn)劑如佛波醇肉豆蔻酸酯處理細(xì)胞可表現(xiàn)出模擬在腫瘤生長早期階段可見的基因表達(dá)模式。在另一癌癥模型中，當(dāng)小鼠胰島素瘤細(xì)胞(例如細(xì)胞系TGP61)感染腺病毒時(shí)，表現(xiàn)出例如c-Jun和MIP-2表達(dá)增加，而管家基因如GAPDH和L32的表達(dá)保持基本不受影響。在與來自疾病模型的細(xì)胞直接或者間接地在體內(nèi)或在體外(例如在組織培養(yǎng)物中)接觸后調(diào)節(jié)指示基因表達(dá)模式的物質(zhì)，可以作為患有該疾病的生物體(例如人或其它動物患者，或者植物)的治療劑或藥物。所述物質(zhì)也可以通過與核酸例如在體外(試管)表達(dá)系統(tǒng)中直接接觸而調(diào)節(jié)表達(dá)模式。如本文所用，“調(diào)節(jié)”是指導(dǎo)致參與可測量反應(yīng)的分子的量和/或活性增加或降低。本發(fā)明的組合可用于篩選這種物質(zhì)。例如，可以使用常規(guī)的本領(lǐng)域公認(rèn)的方法(例如可商購的試劑盒)將一系列細(xì)胞(例如來自疾病模型的細(xì)胞)與一系列物質(zhì)接觸(例如接觸大約10分鐘至大約48小時(shí)或更長時(shí)間)，由此可以產(chǎn)生總RNA或mRNA提取物。如果希望擴(kuò)大RNA的量，可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序如RT-PCR擴(kuò)增(見例如Irmisetaleds.,(1996)PCRProtocols:AGuidetoMethodsinAmplification,AcademicPress,NewYork)?？梢詫⑺鎏崛∥?或者從中擴(kuò)增的產(chǎn)物)與包含適當(dāng)?shù)闹甘綬NA的探針的多個(gè)基本相同的陣列接觸(例如保溫)，由此可以鑒別與指示基因表達(dá)模式改變相關(guān)的那些物質(zhì)。相似地，可以鑒別調(diào)節(jié)與特定生理學(xué)狀態(tài)或者發(fā)育階段相關(guān)的表達(dá)模式的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以是人工生產(chǎn)的或者是天然發(fā)生的物質(zhì)，包括環(huán)境因素如參與胚胎發(fā)育或者調(diào)解生理反應(yīng)的物質(zhì)，或者在農(nóng)業(yè)中重要的物質(zhì)如殺蟲劑或除草劑。這種物質(zhì)也可以其未改變的狀態(tài)或者以與其它物質(zhì)的聚集體形式使用；且其可以共價(jià)或非共價(jià)地直接或者通過特定結(jié)合分子附著于結(jié)合膜。本發(fā)明另一實(shí)施方案是可用于檢測樣品中至少一個(gè)靶的試劑盒，其包含表面，其包含多個(gè)空間離散的區(qū)域，其中至少兩個(gè)區(qū)域是基本相同的，每個(gè)區(qū)域包含至少8個(gè)不同的錨(寡核苷酸，或者本文所述其它類型之一)，以及容器，其包含至少一種雙功能接頭分子，所述分子具有特異于至少一個(gè)所述錨的第一部分以及包含特異于至少一個(gè)所述靶的探針的第二部分。22在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了如上述a)的表面以及將雙功能接頭分子附著于至少一個(gè)所述錨的一系列指導(dǎo)，所述接頭分子具有特異于至少一個(gè)所述錨的第一部分和包含特異于至少一個(gè)靶的探針的第二部分。該指導(dǎo)可包含例如(但不限于)表面上每個(gè)錨的描述，存在多少錨以及其位于表面的哪部分的指示，以及使接頭與錨特異性附著(締合、結(jié)合等)的方案。例如，如果錨是寡核苷酸，則該指導(dǎo)可包含每個(gè)錨的序列，從業(yè)者從中可以設(shè)計(jì)互補(bǔ)的接頭的錨特異性部分以與所述錨特異性相互作用(例如雜交)；如果錨是肽，則該指導(dǎo)可以傳達(dá)關(guān)于例如與所述肽特異性相互作用的抗體的信息。所述指導(dǎo)也可以包含使錨與接頭締合的方案，例如雜交(或者其它類型締合)的條件和試劑如保溫溫度和時(shí)間，除去(例如洗滌)未締合的分子的條件和試劑等。此外，所述指導(dǎo)可包含關(guān)于本文論述的任何類型的對照接頭的構(gòu)建和使用的信息，以及例如量化、標(biāo)準(zhǔn)化、“微調(diào)(fine-time)”或者校準(zhǔn)使用所述組合進(jìn)行的測定的方法的信息。所述指導(dǎo)可包含本申請中揭示的任何參數(shù)、條件或?qū)嵤┓桨?，所有這些均可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)方法進(jìn)行。如本申請別處論述，從業(yè)者可以使多種類型的接頭附著于本發(fā)明的包含指定錨陣列的表面，從而編程任何眾多探針陣列。另外，從業(yè)者可以從本發(fā)明的表面除去指定系列接頭，并加入另一系列接頭(與第一系列接頭相同或不同)，使得所述表面可以多次再使用。這種靈活性和可再用性是本發(fā)明的另一優(yōu)勢。另一方面，本發(fā)明涉及確定多個(gè)多核苷酸的哪一個(gè)與給定核酸互補(bǔ)的方法，其中一或多個(gè)所述多核苷酸可以與所述核酸互補(bǔ)，且其中每個(gè)所述多核苷酸包含兩個(gè)不同的寡核苷酸序列，第一個(gè)寡核苷酸序列定義對應(yīng)所述多核苷酸的寡核苷酸探針，第二個(gè)寡核苷酸序列定義對應(yīng)所述多核苷酸的檢測寡核苷酸，所述方法包括將包含所述核酸分子的樣品與所述組合的至少一個(gè)區(qū)域接觸，其中所述區(qū)域包含寡核苷酸探針陣列，其至少一個(gè)對應(yīng)每個(gè)所述多核苷酸，將所述樣品與所述區(qū)域保溫，從而使得所述核酸分子結(jié)合所述多核苷酸相應(yīng)的寡核苷酸探針，所述探針與所述核酸的一部分互補(bǔ)，將包含與一或多個(gè)所述多核苷酸相應(yīng)寡核苷酸探針結(jié)合的所述核酸分子的所述區(qū)域與對應(yīng)所述陣列的給定寡核苷酸探針之一對應(yīng)的多核苷酸的檢測寡核苷酸一起保溫，從而使檢測寡核苷酸與已經(jīng)結(jié)合所述給定寡核苷酸探針或者與所述核酸互補(bǔ)的其它寡核苷酸探針的核酸分子結(jié)合，檢測所述檢測寡核苷酸的存在，從而鑒別所述陣列的哪個(gè)多核苷酸對應(yīng)的寡核苷酸探針與結(jié)合所述多核苷酸對應(yīng)的給定寡核苷酸探針的核酸的一部分互補(bǔ)，從而鑒別哪個(gè)多核苷酸與所述給定核酸互補(bǔ)，其中所述寡核苷酸探針陣列固定于所述組合的區(qū)域中，其中所述組合包含表面，其包含等于待研究的多核苷酸的數(shù)目的多個(gè)空間離散的基本相同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域包含等于待研究的多核苷酸的數(shù)目的多個(gè)不同錨，每個(gè)錨均與雙功能接頭締合，所述接頭具有特異于所述錨的第一部分以及包含對應(yīng)至少一個(gè)所述多核苷酸的寡核苷酸探針的第二部分。在本發(fā)明另一方面中，上述作圖EST或其它多核苷酸的方法進(jìn)一步包含在一或多23個(gè)步驟之間除去未結(jié)合的樣品部分的步驟。分離自交聯(lián)的靶的探針可以在檢測之前擴(kuò)增或修飾，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法進(jìn)行，例如通過PCR進(jìn)行。在這種情況中，回收的探針可以被延伸、加標(biāo)簽，或者標(biāo)記以及擴(kuò)增。本發(fā)明方法中使用的核酸，例如靶、參與靶檢測的寡核苷酸或者核酸酶保護(hù)片段(如本文別處所述)，可以通過任何常規(guī)酶促方法擴(kuò)增，所述方法包括PCR及連接酶反應(yīng)。一種這樣的擴(kuò)增方法是轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(見例如Abeetal.(1993).J.Clin.Microbiol.31,3270-3274)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，使一或多個(gè)感興趣的核酸靶與特定的多核苷酸保護(hù)片段雜交并進(jìn)行核酸酶保護(hù)反應(yīng)，在MAPS平板上測定與感興趣的靶增加的那些保護(hù)片段。當(dāng)然，這種MAPS平板可含有與接頭未締合的錨(例如其可以與靶或者感興趣的核酸酶保護(hù)片段直接締合)；本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本說明書可以顯而易見與任何類型探針陣列聯(lián)合使用的核酸酶保護(hù)的優(yōu)勢，其任何有益的起源均被權(quán)利要求。如果感興趣的靶是RNA切保護(hù)片段是DNA，則核酸酶保護(hù)/MAPS測定(NPA-MAPS)可以減少大量處理RNA的需要，這對于由于污染核酸酶而降解并因此難以運(yùn)行是靈敏的。用核酸酶保護(hù)方法處理樣品也可以使得樣品粘度降低。對樣品進(jìn)行核酸酶保護(hù)可以使得測定的靈敏性和再現(xiàn)性增大。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢是該測定可以足夠靈敏，以至于不需要擴(kuò)增靶(例如通過PCR擴(kuò)增)即可檢測信號。在NPA-MAPS測定中，探針陣列中的探針是與感興趣的靶核酸相同鏈性(strandedness)的寡核苷酸，而不是如在標(biāo)準(zhǔn)MAPS測定中與其互補(bǔ)。在NPA-MAPS測定中，感興趣的靶可以是任何核酸，例如基因組DNA、cDNA、病毒DNA或RNA、rRNA、tRNA、mRNA、寡核苷酸、核酸片段、修飾的核酸、合成的核酸等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法用于測定存在于組織或細(xì)胞RNA提取物中的一或多個(gè)mRNA靶。含有感興趣的靶的樣品首先在選擇的嚴(yán)格條件(見上文關(guān)于實(shí)現(xiàn)特異性雜交的適當(dāng)反應(yīng)條件的論述)下與過量的一或多個(gè)特異性保護(hù)片段雜交。保護(hù)片段是多核苷酸，其可以是例如RNA、DNA(包括PCR產(chǎn)物)、PNA或者修飾的或取代的核酸，其特異于感興趣的核酸靶的一部分。“特異性”保護(hù)片段是指這樣的多核苷酸，其在選擇的嚴(yán)格條件下與其目標(biāo)結(jié)合配偶體充分互補(bǔ)以與之結(jié)合，但是與其它非目標(biāo)核酸不結(jié)合。保護(hù)片段的長度可以是至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選50至大約100個(gè)核苷酸，或者大約如全長cDNA長度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述保護(hù)片段是單鏈DNA寡核苷酸。在一個(gè)雜交反應(yīng)中可包含特異于多如100個(gè)或更多個(gè)靶的保護(hù)片段。在雜交后，將樣品用一或多種核酸酶的混合物處理以破壞核酸，除了已經(jīng)與感興趣的核酸雜交的保護(hù)片段以及(任選)在核酸保護(hù)期間已經(jīng)雜交且被保護(hù)免于核酸酶消化的核酸靶的一部分(以雙鏈體雜交體)之外。例如，如果樣品包含細(xì)胞提取物，則除了感興趣的那些核酸之外的不希望的核酸如基因組DNA、tRNA、rRNA和mRNA在這個(gè)步驟中基本上可以被破壞?？梢允褂萌魏味喾N多樣的核酸酶，包括例如胰腺RNAse、綠豆核酸酶、S1核酸酶、RNAseA、核糖核酸酶T1、外切核酸酶III、外切核酸酶VII、RNAseCLB、RNAsePhyM,RNAseU2等，根據(jù)雜交復(fù)合物以及樣品中存在的不希望的核酸而定。RNAseH可以特別用于消化與DNA保護(hù)片段結(jié)合的剩余RNA。這些酶的反應(yīng)條件為本領(lǐng)域熟知，且可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化。也可以使用化學(xué)方法，例如RNA的堿性水解。正如所要求的，樣品可以通過本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)一步處理，以除去未雜交的材料和/或使剩余的酶失活或除去(例如苯酚提取，沉淀，柱過濾等)。雜交以及隨后的核酸酶消化和(任選)化學(xué)降解的過程稱作核酸酶保護(hù)程序；本領(lǐng)域已經(jīng)描述了許多核酸酶保護(hù)程序(見例如Leeetal(1987).Meth.Enzymol.152,633-648.Zinnetal(1983)·Cell34，865-879.)。將經(jīng)過核酸酶保護(hù)及隨后(任選)失活核酸酶的方法處理的樣品與MAPS探針陣列接觸，并進(jìn)行MAPS測定的常規(guī)步驟。結(jié)合的保護(hù)片段可以通過例如與標(biāo)記的靶特異性報(bào)道分子雜交而檢測，如本文針對標(biāo)準(zhǔn)MAPS測定所述，或者可以用可檢測分子對保護(hù)片段自身進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)標(biāo)記。如果需要，可以包含一或多個(gè)對照物以標(biāo)準(zhǔn)化NPA-MAPS測定。例如，可以使用對應(yīng)預(yù)期以基本恒定量存在于一系列每個(gè)樣品中的核酸的一或多個(gè)保護(hù)片段(例如組成型產(chǎn)生的mRNA，基因組DNA的一部分，tRNA或rRNA)。在測量以可變量存在的核酸(例如mRNA)的測定中檢測并量化內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)對照例如基因組DNA的能力是在該測定中使用保護(hù)片段的一個(gè)優(yōu)勢。由于標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)的量也許低于感興趣的表達(dá)的mRNA的量，因此可以對該測定進(jìn)行調(diào)整，使得對應(yīng)表達(dá)的基因的信號不淹沒(swampout)對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)的信號。調(diào)整信號水平的方法是本發(fā)明常規(guī)進(jìn)行的方法，且為技術(shù)人員熟知。例如，可以使用本文針對平衡信號強(qiáng)度(例如信號弱化、微調(diào))描述的任何方法(例如使用被阻斷的接頭(blockedlinker)；標(biāo)記設(shè)計(jì)為用以在比設(shè)計(jì)為檢測mRNA的水平高的水平檢測標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)信號部分；將特異于標(biāo)準(zhǔn)化核酸的不同部分或者特異于對應(yīng)該核酸不同部分的保護(hù)片段的多個(gè)接頭置于設(shè)計(jì)為檢測標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)的位置等)?？梢酝瑫r(shí)或相繼檢測所述標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)和感興趣的核酸靶(例如mRNA)，例如通過本文別處所述任何方法進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，保護(hù)片段被直接標(biāo)記，而不是通過與靶特異性報(bào)道分子雜交而標(biāo)記。例如，所述報(bào)道分子通過配體-抗配體相互作用結(jié)合保護(hù)片段，例如將鏈霉親和素酶復(fù)合物加入生物素?；谋Ｗo(hù)寡核苷酸中。在另一實(shí)施例中，保護(hù)片段被化學(xué)修飾(例如通過與辣根過氧化物酶(HRP)或者與熒光染料直接結(jié)合)，并使用或不使用保護(hù)片段的核酸部分檢測這種化學(xué)修飾(例如在通過酶處理或化學(xué)處理修飾裂解后)。在任何上述方法中，保護(hù)片段可以在與對應(yīng)的接頭分子雜交之前或之后進(jìn)行標(biāo)記。為了控制核酸酶保護(hù)程序適當(dāng)運(yùn)行，即正如所希望的未雜交的核酸被消化，可以設(shè)計(jì)一或多種保護(hù)片段以含有突出的(未雜交的)節(jié)段，如果所述程序適當(dāng)運(yùn)行則其應(yīng)該被核酸酶裂解。突出片段的存在與否可以通過與互補(bǔ)的標(biāo)記的檢測探針一部分雜交而檢測，或者可以用可檢測分子共價(jià)或非共價(jià)標(biāo)記保護(hù)片段自身的突出部分。這種控制可以在將樣品與探針陣列接觸之前進(jìn)行，或者作為MAPS測定的一部分。當(dāng)然，由于可以易于區(qū)別不同的標(biāo)記(例如具有不同吸光譜的)，因此在一個(gè)測定中可包含幾個(gè)不同標(biāo)記的寡核苷酸。此外，在測定期間可以使用通過凝膠電泳分析的標(biāo)準(zhǔn)核酸酶保護(hù)測定，以核實(shí)保護(hù)片段如期被處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然了解校正核酸酶消化的其它控制方法。例如，在測定中可包含已知對于樣品中任何核酸均不具有特異性核酸酶保護(hù)片段(例如在植物核酸的測定中，可包含特異于已知在該植物中不存在的動物基因的保護(hù)片段)。在靶檢測之后，可以消除檢測探針(例如HRP-標(biāo)記的探針)信號(例如變性、殺滅、猝滅(quenched)、阻抑、阻斷)，洗滌平板以除去在接下來的步驟中也許起干擾作用的任何所得試劑、物質(zhì)或緩沖液(例如變性劑)，然后用不同的檢測探針(例如也是HRP-標(biāo)記的探針)檢測突出部分。信號變性的使用及隨后加入具有相同發(fā)出信號部分的不同檢測探針可以在測定的不同階段應(yīng)用。可以利用兩種不同的熒光探針以及雙色檢測而不用變性或信號阻斷。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所述，寡核苷酸探針用于篩選包含一或多種多態(tài)性的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸(例如DNA如基因組DNA，或者RNA如mRNA)包含一或多個(gè)SNP?？梢允褂贸Ｒ?guī)的本領(lǐng)域公認(rèn)的方法進(jìn)行該程序。例如，為了篩選包含已知SNP的DNA或者從這種DNA表達(dá)的mRNA，使“SNP-特異性”保護(hù)片段與包含可能包含該SNP的核酸的樣品雜交。文中“SNP-特異性”保護(hù)片段是指這樣的保護(hù)片段，其包含改變堿基的SNP，或者如果分析mRNA則包含這個(gè)序列的反向互補(bǔ)體。然后將樣品用一或多種適當(dāng)?shù)暮怂崦冈谶m當(dāng)?shù)母鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)可確定的條件下處理，在錯配的部位(例如一個(gè)堿基錯配)消化未雜交的單鏈核酸及裂解雙鏈(雙鏈體)核酸(例如，DNA-DNA雜交體、DNA-RNA雜交體等)。合適的核酸酶包括例如Sl或者RHAseH。如果包含SNP的核酸存在于樣品中并且與SNP特異性保護(hù)片段雜交，則該保護(hù)片段將幸免于消化程序，且可以對其進(jìn)行MAPS測定以及通過特異于該保護(hù)片段序列的檢測探針或檢測寡核苷酸進(jìn)行檢測。不包含SNP的核酸在核酸中SNP特異性保護(hù)片段與對應(yīng)的野生型序列之間的錯配部位被裂解。如果需要，可以使用常規(guī)方法(例如加熱變性、酶促裂解等)除去位于裂解部位末端或者近端的保護(hù)片段那一部分?？梢栽O(shè)計(jì)測定以使得裂解的分子(或其一部分)不結(jié)合接頭，或者使得即使這種裂解的分子的一部分結(jié)合接頭，其也不被適當(dāng)設(shè)計(jì)的檢測探針或檢測寡核苷酸檢測出。另一實(shí)施方案是檢測SNP，其例如可用于檢測基因組DNA中的SNP。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用一個(gè)探針陣列測定樣品中不同類型的靶，例如DNA、RNA、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和分泌的蛋白質(zhì)的各種組合。除了上述高通量測定之外，許多其它測定也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。使用多探針測定的優(yōu)勢是在與實(shí)際實(shí)驗(yàn)探針相同反應(yīng)條件下每個(gè)探針中包含許多“對照”探針的能力。例如，陣列中每個(gè)區(qū)域均可包含陽性和/或陰性對照。如本文所用，術(shù)語“陽性對照探針”是指已知與靶充分相互作用作用或者與其以數(shù)量上或性質(zhì)上已知方式相互作用，從而作為探針/靶相互作用的標(biāo)準(zhǔn)。這種探針例如可以控制雜交效率。如本文所用，術(shù)語“陰性對照探針”是指已知與靶基本上不相互作用的對照探針。這種探針例如可以控制雜交特異性?？梢詰?yīng)用的對照類型探針的例子，考慮其中寡核苷酸探針陣列用于篩選一組調(diào)節(jié)疾病相關(guān)基因表達(dá)的物質(zhì)的測定。作為如每個(gè)樣品裂解的細(xì)胞數(shù)、mRNA的回收或者雜交效率等變量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化對照，探針陣列可包含特異于一或多個(gè)基礎(chǔ)水平或者組成型管家基因如結(jié)構(gòu)基因(例如肌動蛋白、微管蛋白等)或者其表達(dá)不期望由待檢測物質(zhì)調(diào)節(jié)的DNA結(jié)合蛋白(例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等)的探針。此外，為了確定待檢測的物質(zhì)是否導(dǎo)致不希望的副作用，如細(xì)胞死亡或細(xì)胞毒性，探針陣列可包含特異于某基因的探針，所述基因已知被誘導(dǎo)作為細(xì)胞凋亡(編程性細(xì)胞死亡)過程的一部分，或者其在細(xì)胞損傷(例如熱激蛋白)或細(xì)胞毒性(例如P450基因)條件下被誘導(dǎo)。陣列中可包含其它對照探針以“微調(diào)”測定的靈敏性。例如，考慮調(diào)節(jié)與特定疾病狀態(tài)相關(guān)的mRNA產(chǎn)生的物質(zhì)的測定。如果先前的分析表明相關(guān)mRNA之一(即mRNA_A)與其它mRNA相比以這種大量產(chǎn)生，其信號淹沒其它mRNA，則可以調(diào)整接頭以“微調(diào)，，該測定，從而使信號強(qiáng)度相等?？梢约尤搿氨蛔钄嗟慕宇^(blockedlinker)”以稀釋靶特異性接頭集合，并因此降低該測定對于所述mRNA的靈敏性，所述接頭包含針對mRNA靶設(shè)計(jì)的錨特異性寡核苷酸序列，但是其缺少探針特異性序列。阻斷接頭與非阻斷接頭的適當(dāng)比率可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)方法確定。通過用無活性元件稀釋活性元件以“微調(diào)”對特定靶的測定也可以在該測定中的其它步驟進(jìn)行。例如，其可以在檢測水平進(jìn)行，通過用“無活性的”靴特異性報(bào)道分子例如具有相同靶特異性部分(例如寡核苷酸序列)但是沒有發(fā)信號實(shí)體或者用失活或無活性形式的發(fā)信號實(shí)體稀釋標(biāo)記的靶特異性報(bào)道分子。如本文所用，術(shù)語“發(fā)信號實(shí)體(signalingentity)，，是指發(fā)射可檢測信號或者能產(chǎn)生這種信號的標(biāo)記物、標(biāo)簽、分子或者任何這種物質(zhì)，例如熒光分子、發(fā)光酶或者本文揭示的任何發(fā)信號實(shí)體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述“微調(diào)”可以在含有靶的復(fù)合物與檢測接頭接觸的步驟進(jìn)行?？梢栽O(shè)計(jì)一系列檢測接頭，例如以微調(diào)測定中針對每個(gè)靶的靈敏性。例如，已知某特定靶以非常高的水平存在于樣品中，則可用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定量的“被阻斷的檢測接頭”稀釋該靶的檢測接頭，所述被阻斷的檢測接頭包含靶特異性部分(例如寡核苷酸序列)，但是無特異于報(bào)道試劑的部分，或者包含靶特異性部分和預(yù)先與無活性報(bào)道試劑結(jié)合的報(bào)道試劑特異性部分。也就是說，代替包含特異于報(bào)道試劑的部分，該部分可以不存在或者被阻止(例如阻斷)與報(bào)道試劑相互作用(例如雜交)。這種微調(diào)在本文有時(shí)被稱作信號“弱化”。在本發(fā)明測定中檢測的樣品可包含上述任何靶或其他靶。測定的液體樣品可以是適于檢測區(qū)域大小的任何體積，范圍是從大約100納升至大約100微升。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將大約1微升的液滴應(yīng)用于1536孔微滴定平皿的每個(gè)孔中?？梢酝ㄟ^適于高通量分析的任何方法使樣品與探針陣列接觸，例如通過移液管、基于噴墨的分配或者通過使用針式復(fù)制工具(implicatingpintool)。將樣品在有效實(shí)現(xiàn)探針與靶結(jié)合或者其它穩(wěn)定相互作用的條件下保溫(例如見上述的鹽濃度、PH、溫度、保溫時(shí)間等)。這些條件可常規(guī)確定。在保溫后，任選對樣品進(jìn)行處理(例如洗滌)以除去未結(jié)合的靶，使用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的保留完整特異性相互作用但是除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)的條件。例如，可以在與用于實(shí)現(xiàn)探針/靶結(jié)合的條件相同或者略為更嚴(yán)格的條件下洗滌樣品大約1至10次。含有靶RNA例如mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA或總RNA的樣品可以通過任何多種多樣的方法制備。例如，可以將從中檢測mRNA的體外細(xì)胞培養(yǎng)物鋪板于表面的區(qū)域上，如微滴定平板的各個(gè)孔中。任選地，在達(dá)到希望的細(xì)胞密度之后，可以用感興趣的物質(zhì)如刺激劑或者潛在治療劑處理這些細(xì)胞，可以通過各種方式將這些物質(zhì)加入細(xì)胞中，例如使用針式復(fù)制工具(如得自Beckman的96或384針式工具)、通過移液管或者通過噴墨分配，并且根據(jù)所述測定情況與細(xì)胞保溫適當(dāng)時(shí)間，例如大約15分鐘至大約48小時(shí)?？梢酝ㄟ^使用常規(guī)的本領(lǐng)域公認(rèn)的方法(例如可商購試劑盒)制備體外或體內(nèi)來源的組織或細(xì)胞的總RNA、mRNA等提取物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在存在或不存在核酸酶保護(hù)片段的條件下被裂解(或者透化)，直接使用粗制的裂解物(例如微滴定平板孔中)，而不用進(jìn)一步純化例如其它細(xì)胞成分。如果細(xì)胞在無核酸酶保護(hù)片段的條件下被裂解，則這種保護(hù)片段可任選隨后加入該裂解物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如其中檢測核酸酶保護(hù)片段，通過將感興趣的細(xì)胞(例如微滴定平板孔表面上的細(xì)胞、組織或整體生物體樣品中的細(xì)胞等)與水溶液培養(yǎng)基(裂解溶液)接觸，所述培養(yǎng)基包含表面活性劑或去污劑(例如SDS，大約0.01%至大約0.5%w/v)和一種物質(zhì)(例如甲酰胺(例如大約8-60%，ν/ν)、胍-HCl(例如大約0.1-6Μ)、異硫氰酸胍(例如大約0.05-8Μ)或者尿素(例如大約40-46%，w/v，或者大約7M))，其單獨(dú)或者與一或多種其他物質(zhì)組合可作為離液劑。該水溶液培養(yǎng)基可以由任何標(biāo)準(zhǔn)緩沖液緩沖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖液是大約0.5-6XSSC，更優(yōu)選是大約3XSSC。任選地，該水溶液培養(yǎng)基也可包含適當(dāng)濃度的tRNA，例如大約0.1-2.Omg/ml，優(yōu)選大約0.5mg/ml。在加入細(xì)胞中之前也可以將核酸酶保護(hù)片段加入該水溶液培養(yǎng)基中。每個(gè)保護(hù)片段的最佳濃度可以通過使用常規(guī)方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)保護(hù)片段的濃度為大約3-300pM,更優(yōu)選大約30pM。將細(xì)胞在水溶液中保溫脂質(zhì)其變得透化和/或被裂解，DNA和/或mRNA從細(xì)胞中釋放進(jìn)該水溶液培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在水溶液培養(yǎng)基中在根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的溫度(例如大約37°C至大約115°C，優(yōu)選大約90°C至大約115°C)下保溫根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間(例如大約1分鐘至大約60分鐘)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，其中DNA和RNA均以能結(jié)合保護(hù)片段的變性形式從細(xì)胞中釋放，將細(xì)胞在水溶液培養(yǎng)基中在大約90-115°C、優(yōu)選大約105°C保溫大約1分鐘至60分鐘，優(yōu)選大約5分鐘至20分鐘。如果需要，例如當(dāng)希望在不存在RNA情況中測定DNA時(shí)，保溫混合物中可包含任何各種常規(guī)核糖核酸酶。適當(dāng)核糖核酸酶的選擇以及消化條件的優(yōu)化為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且易于確定。在另一實(shí)施方案中，mRNA可以通過將細(xì)胞在水溶液培養(yǎng)基中在大約90°-100°C、優(yōu)選大約95°C以及任選存在一或多種保護(hù)片段的條件下保溫大約5分鐘至20分鐘、優(yōu)選大約10分鐘而制備。在這種情況中，mRNA以能結(jié)合保護(hù)片段的變性形式從細(xì)胞中充分釋放，且DNA基本保留在細(xì)胞的內(nèi)部或者附著于細(xì)胞，或者由于其雙鏈性質(zhì)而難以由探針利用，或者從細(xì)胞中釋放，但是是不能結(jié)合保護(hù)片段的形式(例如未變性)。不受任何特定機(jī)制的約束，看起來從裂解的/透化的細(xì)胞中釋放的核酸被充分變性以使得其可以結(jié)合保護(hù)片段形成對內(nèi)源或外源試劑或酶降解抗性的穩(wěn)定雙鏈體，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)(例如核酸酶)被變性和/或失活。在通過上述程序制備感興趣的核酸之后，可以將樣品以適當(dāng)體積稀釋，以便水溶液培養(yǎng)基不抑制外源加入的蛋白質(zhì)的功能，所述蛋白質(zhì)如核酸酶(例如Si核酸酶)、聚合酶(例如PCR反應(yīng)所需的聚合酶)，或者結(jié)合蛋白(例如鏈霉親和素)。如上述稀釋量、水溶液中使用的成分的相同性和量可以通過使用常規(guī)方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。對于本發(fā)明的任何方法，可以用本領(lǐng)域熟知的和/或在本文別處描述的任何多種多樣的方法(例如針對檢測核酸酶保護(hù)片段所述方法)對靶進(jìn)行標(biāo)記(加標(biāo)簽)。例如，靶分子可以與提供檢測信號的化學(xué)基團(tuán)直接或間接結(jié)合，例如化學(xué)發(fā)光分子，或者催化化學(xué)發(fā)光分子產(chǎn)生的酶，或者熒光分子如熒光素或cy5，或者時(shí)間分辨熒光分子(timeresolvedfluorescentmolecule)如螯合的鑭族元素金屬，或者放射性化合物。或者，可以在靶與探針反應(yīng)之后用一或多種標(biāo)記的靶特異性報(bào)道分子對靶進(jìn)行標(biāo)記(例如圖1所示抗體、寡核苷酸，或者與探針和靶聯(lián)合的上述任何一般類型的分子)。一種類型的熒光分子可以是“上轉(zhuǎn)換磷光(upconvertingphosphore)，，，即在長波長(例如IR)吸收及被激發(fā)的熒光，然后在較短波長發(fā)射(例如可見光)。由于上轉(zhuǎn)換磷光以比被分析的典型樣品中存在的大多數(shù)潛在干擾材料長的波長吸收，因此上轉(zhuǎn)換磷光與在較低波長吸收的磷光相比使得可以降低樣品中材料的干擾。大多數(shù)上轉(zhuǎn)換磷光的狹窄發(fā)射光譜也使得可以同時(shí)檢測大量不同的上轉(zhuǎn)換磷光。上轉(zhuǎn)換磷光為本領(lǐng)域熟知，包括例如稀土金屬離子如鐿(Yb)、鉺(Er)、銩(Tm)和鐠(Pr)，特別是氧硫化物鹽形式。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了多如80或更多種可獨(dú)立檢測的上轉(zhuǎn)換磷光(見例如BiologicalAgentDetectionandIdentification,April27-30,1999,DARPA,BiologicalffarfareDefense,DefenseSciencesOffice)。所述磷光可任選附著于任何表面，例如附著于微球體或乳膠珠。與其它熒光標(biāo)記一樣，上轉(zhuǎn)換磷光可以通過能量轉(zhuǎn)移至十分接近的接頭、靶或報(bào)道分子上的標(biāo)記(或者由其調(diào)節(jié))而檢測。此外，與本文揭示的其它發(fā)信號實(shí)體一起，上轉(zhuǎn)換磷光可用于量化靶，且可以用于本文描述的任何各種各樣的程序中，例如檢測核酸酶保護(hù)片段。當(dāng)然，上轉(zhuǎn)換磷光也可用于檢測以任何其它形式分布在表面上的靶，例如與表面直接結(jié)合、與表面上不同寡核苷酸陣列直接結(jié)合或者通過雙功能接頭與基本均勻或者以任何希望的組構(gòu)或模式分布于表面上錨(不同或基本相同的靶)結(jié)合的靶(包括核酸保護(hù)片段)?？梢允褂萌魏伪砻?，例如流經(jīng)系統(tǒng)(flow-through)，或者固體表面如珠。用于本發(fā)明任何測定中的珠可以是任何類型，例如由任何磁性和/或非磁性材料制成；用于一個(gè)測定中的珠可以是基本相同或不同的大小和/或形狀。也可以使用許多更復(fù)雜的夾心型檢測程序。例如，可以將靶與雙功能分子雜交，所述雙功能分子含有特異于靶的第一部分和可以由共同(即相同)的報(bào)道試劑如標(biāo)記的多核苷酸、抗體等識別的第二部分?？梢栽O(shè)計(jì)這樣的雙功能分子，由此在一個(gè)測定中可以使用任何希望數(shù)目的共同報(bào)道分子。對于本發(fā)明的任何方法，可以使用多種復(fù)雜的夾心型檢測程序標(biāo)記(加標(biāo)簽)靶。例如，靶可以與雙功能(或多功能)分子(檢測接頭)相互作用例如雜交，所述分子含有特異于靶的第一部分以及特異于“報(bào)道試劑”的第二部分。術(shù)語“特異于”具有與關(guān)于例如探針與靶相互作用所用該術(shù)語相同的含義。如本文所用，術(shù)語“報(bào)道試劑”是指與探針和靶連接的標(biāo)記的多核苷酸、抗體或者本文論述的任何一般類型的分子。檢測接頭的這兩部分可以上述任何方式識別(相互作用或締合)其各自的結(jié)合配體，聯(lián)合例如探針和靶進(jìn)行。檢測接頭也可包含其它序列，例如特異于靶但是與對應(yīng)的錨結(jié)合的接頭的靶特異性部分不同(不相重疊)。檢測接頭中存在的任何序列均可以作為識別序列以檢測探針或報(bào)道劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測接頭是多核苷酸。檢測接頭可以被設(shè)計(jì)為使得在一個(gè)測定中可以使用任何希望數(shù)目的共同報(bào)道試齊U。例如，可以設(shè)計(jì)這樣一組檢測接頭，由此每個(gè)檢測接頭均特異于不同靶，但是包含相同(共同)或有限數(shù)目之一的報(bào)道試劑的結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)測定中使用有限數(shù)目(例如一個(gè))報(bào)道試劑標(biāo)記多個(gè)靶的能力提供了降低成本和降低背景的優(yōu)勢。當(dāng)然，檢測接頭/報(bào)道試劑組合可用于檢測靶，其以任何方式分布于表面，例如上述可以由上轉(zhuǎn)換磷光檢測的靶排列類型。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測接頭可以被設(shè)計(jì)為檢測核酸酶保護(hù)片段，在這種方式中優(yōu)選標(biāo)記保護(hù)片段，所述保護(hù)片段已經(jīng)在核酸酶保護(hù)期間通過核酸酶作用從對照“突出”序列中裂解。在這個(gè)實(shí)施方案中，檢測接頭包含特異于靶的第一部分和特異于共同的對照突出序列的第二部分，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突出序列在測定開始時(shí)存在于基本所有的核酸酶保護(hù)片段上。如所期望地，如果在核酸酶保護(hù)期間對照突出序列已經(jīng)從核酸酶保護(hù)片段中裂解，則檢測接頭的靶特異性部分將與裂解的保護(hù)片段雜交，但是檢測接頭的對照突出序列特異性部分不被結(jié)合，且保留可用于進(jìn)一步雜交中。另一方面，如果對照突出特異性序列未被從保護(hù)片段中裂解，例如由于核酸酶保護(hù)期間的不完全的核酸酶消化所致，則檢測接頭的靶特異性部分和對照突出序列特異性部分均與保護(hù)片段雜交，且不可用于進(jìn)一步雜交中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)一步步驟中，包含核酸酶保護(hù)片段和結(jié)合的檢測接頭的復(fù)合物與報(bào)道試劑雜交，所述報(bào)道試劑包含發(fā)出信號部分(例如熒光染料、半抗原、酶或者具有可檢測信號或者發(fā)信號實(shí)體的任何其它分子，如本文所述)以及特異于檢測接頭的對照突出特異性部分的那部分(例如寡核苷酸)。報(bào)道試劑優(yōu)選結(jié)合并標(biāo)記這些復(fù)合物，其中核酸酶保護(hù)片段的對照突出序列已經(jīng)被裂解除去(復(fù)合物中檢測接頭的對照突出特異性部分可用于與報(bào)道試劑進(jìn)一步雜交)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知夾心檢測程序的許多其它變化。可常規(guī)確定在實(shí)現(xiàn)結(jié)合或者其它穩(wěn)定相互作用的條件下，靶與靶特異性報(bào)道分子保溫或者靶/檢測接頭復(fù)合物與報(bào)道試劑保溫的方法(見上述)。例如，可以將熒光寡核苷酸報(bào)道分子(濃度為在緩沖液如6XSSPE-T或其他緩沖液中大約IOnM-IμM、或者更優(yōu)選大約30ηΜ)可以與結(jié)合的靶在大約15°C至大約45°C(優(yōu)選在大約室溫)溫度保溫大約15分鐘至2小時(shí)或更長時(shí)間(優(yōu)選大約30-60分鐘)。在保溫后，可任選處理樣品(例如洗滌)以除去未結(jié)合的靶特異性報(bào)道分子，使用根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的保留完整特異性相互作用、但是除去非特異性結(jié)合材料的條件。例如，可以在與用于實(shí)現(xiàn)靶/報(bào)道分子結(jié)合的相同或略嚴(yán)格的條件下洗滌樣品大約1次之大約10次。用靶特異性報(bào)道分子標(biāo)記可以提供初始雜交反應(yīng)的另一特異性層次，例如在其中靶特異性寡核苷酸報(bào)道分子被靶向靶核酸序列的與探針寡核苷酸不同的部分的情況中，或者在其中探針和報(bào)道抗體識別靶抗原的不同表位的情況中。此外，用靶特異性報(bào)道分子標(biāo)記使得可以“微調(diào)”反應(yīng)的靈敏性。例如，如果是相關(guān)表達(dá)模式一部分的靶mRNA在極低水平表達(dá)，則通過使結(jié)合靶與一些(例如大約2-5個(gè)或更多個(gè))靶特異性寡核苷酸報(bào)道分子雜交而可以增強(qiáng)信號水平(信號擴(kuò)大)，每個(gè)報(bào)道分子均特異性雜交靶mRNA的不同部分。獨(dú)立檢測兩種類型標(biāo)記的能力可以允許MAPS測定中另一類型的對照。針對特定錨位置設(shè)計(jì)的一些(例如大約10-100%)接頭可具有附著于其一端的標(biāo)記(例如熒光)。例如，羅丹明或者Cy5熒光可以附著于接頭的5’末端。這種修飾的接頭被稱作“對照接頭”。在接頭與對照接頭的混合物與錨已經(jīng)締合，且含有靶的樣品已經(jīng)與所得探針陣列保溫之后，可以使用具有不同熒光(例如熒光素或另一檢測標(biāo)記如化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)的靶特異性報(bào)道分子(或者所述靶可以用熒光標(biāo)記或者其它檢測標(biāo)記直接標(biāo)記)；可以確定兩個(gè)信號的比率。對照接頭的存在可以校準(zhǔn)檢測區(qū)域中和檢測區(qū)域之間功能性(例如能與接頭相互作用)錨的數(shù)目(即檢測所述陣列每個(gè)位置結(jié)合靶的能力，以標(biāo)準(zhǔn)化信號)，作為量化結(jié)合的靶的基礎(chǔ)，有助于確定錨位置的位置和/或提供陽性對照，例如在其中由于樣品中無所述靶而導(dǎo)致無信號的情況中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)不同標(biāo)記(例如熒光團(tuán))可用于檢測靶分子的兩個(gè)不同群；然而，通過空間分辨信號識別靶存在的能力使得可以針對不同靶分子使用一種類型的標(biāo)記。獨(dú)立檢測標(biāo)記(例如在可區(qū)分波長發(fā)射的一個(gè)標(biāo)記，如熒光素和羅丹明，或者不同的上轉(zhuǎn)換磷光)使得本發(fā)明方法有額外靈活性。例如，兩個(gè)或多個(gè)靶的每一個(gè)可以用其自身獨(dú)特可檢測的標(biāo)記直接或間接標(biāo)記。這使得除了(或代之)例如鑒別表面上定位靶的位置或通過其定位的珠的大小鑒別靶之外，基于特異于標(biāo)記的特征(例如發(fā)射的顏色)而檢測靶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，靶的多樣性可以在一個(gè)區(qū)域內(nèi)的單個(gè)位置獨(dú)立地檢測。例如，可以在用單組(基本上相同)錨限定的位置檢測兩個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6或更多個(gè))靶。即，可以使用一組接頭，每個(gè)均具有特異于相同錨的錨特異部分加上特異于不同靶的靶特異部分。如果使用一組例如4個(gè)這種接頭，所有4個(gè)均可以結(jié)合在一單個(gè)位置的一組錨的各個(gè)成員，使得4個(gè)不同靶結(jié)合在該位置。如果每個(gè)這些靶用一種不同的可區(qū)分的標(biāo)記(直接或間接)標(biāo)記，研究者可以獨(dú)立地確定在該位置4個(gè)靶的每一個(gè)的存在。因此，可以在上述情景中使用在一個(gè)區(qū)域中的例如5個(gè)錨的陣列(錨的組)以檢測多達(dá)20個(gè)不同的靶。類似地，當(dāng)單一類型的錨不是被分布在一個(gè)位置，而是均勻地或以任何希望的方式分布于固定表面如珠或流經(jīng)裝置上時(shí)，多個(gè)靶，例如多達(dá)80個(gè)或更多個(gè)，可以被獨(dú)立地檢測；并且其它方面如珠大小或散射可以用于提供關(guān)于靶性質(zhì)或靶組的信息。具有不同靶特異性的多個(gè)接頭(例如從大約2個(gè)至大約50個(gè)或更多個(gè))與在一給定位置(一組基本上相同的錨或“混合位置”)的錨的結(jié)合，在本文中有時(shí)稱為“混合接頭”，構(gòu)成了對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的本發(fā)明其它實(shí)施方案的基礎(chǔ)。例如，在一給定位置，錨可以結(jié)合特異于多個(gè)不同保護(hù)片段的接頭混合物，每種均相應(yīng)于(特異于)感興趣核酸(例如mRNA)的不同部分。這種多個(gè)不同接頭在一個(gè)位置的存在使得檢測感興趣靶(例如mRNA)例如以低豐度存在于樣品中的靶的靈敏性顯著增加。每個(gè)位置可以被設(shè)計(jì)以便設(shè)計(jì)用于該位置的相應(yīng)于mRNA不同部分的接頭數(shù)與在樣品中的該mRNA的豐度成反比(以經(jīng)驗(yàn)可確定方式)。例如，如果一種感興趣的mRNA在初步實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)以大大過量于第二種感興趣的mRNA而存在于樣品中，相應(yīng)于這兩種mRNA的不同部分的接頭的相對數(shù)目可以被調(diào)整以便相應(yīng)于每種mRNA的信號的相對強(qiáng)度基本上相同。即，信號強(qiáng)度可以被調(diào)整以便相應(yīng)于第一種mRNA的信號不淹沒相應(yīng)于第二種mRNA的信號。以此方式，人們可以調(diào)整測定以允許同時(shí)檢測以非常不同的量存在于樣品中的多個(gè)mRNA，平衡相應(yīng)于每種mRNA的信號強(qiáng)度。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述，給定的位置可以包含特異于多個(gè)不相關(guān)或不同靶或保護(hù)片段的接頭，使得用一個(gè)錨陣列檢測大大增加數(shù)量的靶或保護(hù)片段。例如，如果350個(gè)錨的一個(gè)陣列的每個(gè)位置包含特異于10個(gè)不同靶的接頭，則該陣列可以用于檢測多達(dá)3500個(gè)靶。這種安排使得人們可以有效將可以檢測低密度靶的陣列轉(zhuǎn)化為可以檢測高密度靶的陣列。結(jié)合在一個(gè)位置的多個(gè)分子(例如保護(hù)片段)可以依次或同時(shí)檢測，例如用本申請所述的檢測方法檢測。(對于“檢測接頭”和“報(bào)道試劑”的討論，參見例如上述關(guān)于復(fù)雜夾心型檢測方法的章節(jié))。在一個(gè)實(shí)施方案中，在給定位置的第一個(gè)靶(例如保護(hù)片段)被檢測，例如用第一種檢測系統(tǒng)(例如檢測接頭/報(bào)道試劑，或特異于其的檢測探針)檢測；然后使用常規(guī)程序(例如改變PH以失活包含產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號的酶的報(bào)道試劑)除去或失活該第一種檢測接頭/報(bào)道試劑或探針，以及用特異于在同一位置的第二個(gè)靶的第二種檢測接頭/報(bào)道試劑或檢測探針以檢測第二個(gè)靶；如此進(jìn)行所需的多個(gè)循環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一種檢測接頭/報(bào)道試劑或檢測探針被加入到上述組合中，但是其在第二種檢測接頭/報(bào)道試劑或檢測探針被加入之前不被去除或失活。在這一實(shí)施方案中，相應(yīng)于第二個(gè)靶的信號量可以通過減去相應(yīng)于第一個(gè)靶的信號量而確定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一種和第二種檢測接頭/報(bào)道試劑或檢測探針基本上同時(shí)被加入上述組合中，并單獨(dú)檢測，例如使用本文它處所述差異可檢測標(biāo)記進(jìn)行檢測。在本文所述任何檢測方法中，檢測接頭可以包含特異于相同或不同報(bào)道試劑的部分。例如，如果在一給定位置4個(gè)靶與接頭結(jié)合，則特異于所述4個(gè)靶的每一個(gè)的檢測接頭可以各自包含特異于一不同報(bào)道試劑的部分。因此，在全部4種檢測接頭均與靶雜交后，可以使用4種不同報(bào)道試劑如上所述依次或同時(shí)檢測靶。其它檢測方法以及上述方法的組合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。當(dāng)然，“混合接頭”也有利地用于含有單個(gè)(非重復(fù))區(qū)域的表面。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，特異于感興趣靶的“錨”不與接頭結(jié)合，而是直接與靶結(jié)合；靶隨之可以任選地與檢測接頭或檢測探針而相互作用。無論是標(biāo)記的或未標(biāo)記的靶均可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的各種程序檢測(參見例如Fodoretal(1996).U.S.Pat.No.5,510,270；Pirrungetal(1992).U.S.Pat.No.5，143，854；Koster(1997).U.S.Pat.No.5，605，798；Hollisetal(1997)U.S.Pat.No.5，653，939；Heller(1996).U.S.Pat.No.5，565，322；Eggersetal(1997).U.S.Pat.No.5,670,322；Lipshutzetal(1995).BioTechniques19,442-447；Southern(1996).TrendsinGenetics12，110-115)。檢測方法包括基于酶的檢測，比色法，SPA，放射自顯影，質(zhì)譜，電學(xué)方法，吸光度或發(fā)光(包括化學(xué)發(fā)光或電發(fā)光)檢測，來自例如用作標(biāo)記的顯微顆粒的光散射的檢測。另外，可以檢測熒光標(biāo)記，例如通過用電荷耦合裝置(CXD)成像或熒光顯微鏡術(shù)(例如掃描或共焦熒光顯微鏡術(shù))，或通過將掃描系統(tǒng)與CCD陣列或光電倍增管耦合，或通過使用用于檢測的基于陣列的技術(shù)(例如可以檢測測試區(qū)域的每10微米部分的表面電勢或者可以使表面等離子體共振用，如果分辨率足夠高)。或者，陣列可以含有標(biāo)記(例如一對能量轉(zhuǎn)移探針之一，如熒光和羅丹明)，其可以通過能量轉(zhuǎn)移至接頭、靶或報(bào)道分子上的標(biāo)記(或由其進(jìn)行的調(diào)節(jié))而檢測。基于熒光檢測系統(tǒng)的宿主是熒光強(qiáng)度，熒光偏振(FP)，時(shí)間分辨的熒光，熒光共振能量轉(zhuǎn)移和均相時(shí)間釋放熒光(homogeneoustime-releasedfluorescence)(HTRF)0重復(fù)條形碼樣模式的分析可以用模式識別(通過其相對于其它斑點(diǎn)或線的位置而發(fā)現(xiàn)針對每一特異標(biāo)記靶的合適斑點(diǎn)或線)接著定量標(biāo)記強(qiáng)度而完成。條形碼識別裝置和用于分析一或二維陣列的計(jì)算機(jī)軟件常規(guī)產(chǎn)生和/或市售可得(參見例如Ravaetal(1996)U.S.PatentNo.5，545，531)?？捎糜跈z測的另一方法是2-光子熒光，包括如下應(yīng)用，其中結(jié)合于陣列表面的成分的內(nèi)源性或綴合的熒光染料通過結(jié)合接近于陣列表面而增強(qiáng)，例如通過與形成陣列的基質(zhì)緊密并置，或通過與包括在錨或接頭或另外摻入結(jié)合的復(fù)合物中的其它物質(zhì)緊密并置。其它熒光方法或用途包括終生熒光(lifetimefluorescence)，極化，能量轉(zhuǎn)移等。例如，這種方法允許同時(shí)檢測和區(qū)分同一位置中的多個(gè)靶，在一些情況中，可以區(qū)分結(jié)合的標(biāo)記和未結(jié)合的標(biāo)記，無需從陣列洗掉未結(jié)合的標(biāo)記，因此促進(jìn)快速可逆或弱相互作用由陣列測量。制備和實(shí)驗(yàn)本發(fā)明陣列的方法，包括制備表面或區(qū)域如本文描述的那些，合成或純化及附著或組織物質(zhì)如本文描述的錨、接頭、探針和檢測劑，以及檢測和分析如本文所述的標(biāo)記的(labeledortagged)物質(zhì)，是熟知及常規(guī)的技術(shù)。除了上述參考文獻(xiàn)中公開的方法之夕卜，參見例如Affymax,Affymetrix,Nanogen,Protogene,Spectragen,Millipore和Beckman(從它們可獲得用于本發(fā)明的產(chǎn)品)的專利；分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)科學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書，包括上述那些，及Cozetteetal(1991)U.S.Pat.5，063，081；Southern(1996)，CurrentOpinioninBiotechnology7,85-88；Cheeetal(1996).Science274,610-614;andFodoretal(1993).Nature364,555-556。附圖簡述本發(fā)明的各種特征和伴隨優(yōu)勢在結(jié)合附圖考慮時(shí)會更好地理解，其中在若干視圖中相同或相似部分用類似標(biāo)號指代，其中圖1示出生物學(xué)樣品中不溶性靶(即例如交聯(lián)RNA)的檢測示意圖。圖2㈧示出生物學(xué)樣品中基因表達(dá)的定量核酸酶保護(hù)測定(qNPA)。固定的組織被裂解，沉淀組織部分和上清中的mRNA含量使用ARRAYPLATE用qNPA測定進(jìn)行量化。冷凍組織樣品用作陽性對照。B)示出第二個(gè)裂解樣品的沉淀和上清中的RNA含量的比例。C)提供了A)的一個(gè)具體實(shí)施方案，用于分析福爾馬林固定石蠟包埋組織中的RNA靶。圖3示出該技術(shù)用于測量組織中的RNA的適用性。圖4(A)是在FFPE結(jié)腸上的ArrayPlatemRNA測定的示意圖。(B)示出冷凍肝臟和福爾馬林固定石蠟包埋切片的滴定。插圖中示出代表性測量(右組)。圖5(A)示出冷凍和固定肝臟中相當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)。組⑶示出冷凍vs.FFPE肝臟的基因表達(dá)的相關(guān)性。圖6示出來自新鮮固定的vs.儲存18年的固定樣品的相同定量結(jié)果。圖7證實(shí)在FFPE肝臟上進(jìn)行的ArrayPlatemRNA測定的線性。圖8示出冷凍vs.FFPE肝臟中的相對基因表達(dá)。圖9(A)示出了在FFPE肝臟上進(jìn)行的ArrayPlatemRNA測定的再現(xiàn)性及該測定針對冷凍vs.新鮮樣品的靈敏性。(B)示出了qNPA診斷劑在病毒核酸測量中的驗(yàn)證。圖10示出在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)基因表達(dá)測定中分析的基因列表。圖11示出在ARRAYPLATEDLBCL基因表達(dá)測定中基因的布局圖。圖12示出所述測定針對各種介質(zhì)的相容性。用qNPA測定在新鮮制備的樣品、福爾馬林固定石蠟包埋的樣品和OCT冷凍樣品上測量的各種基因的表達(dá)被分析。圖13示出新鮮制備的樣品、福爾馬林固定石蠟包埋樣品和OCT冷凍樣品之間有關(guān)各種基因表達(dá)的雙向(two-way)相關(guān)性。基因表達(dá)分析用qNPA測定進(jìn)行。圖14示出用ARRAYPLATE分析對臨床活檢組織塊的測試。用3種不同生物標(biāo)記分析了4種不同活檢樣品。圖15示出用于臨床活檢組織塊的ArrayPlatemRNA測定的再現(xiàn)性。圖16(A)示出來自陣列1的基因表達(dá)的結(jié)果(參見圖15)。圖⑶示出在4種活檢樣品中基因表達(dá)的平均標(biāo)準(zhǔn)化信號。圖17(A)示出來自陣列2的基因表達(dá)的結(jié)果(參見圖15)。圖⑶示出在4種活檢樣品中基因表達(dá)的平均標(biāo)準(zhǔn)化信號。圖18示出在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤樣品(病例1)中抗原表達(dá)的免疫組織化學(xué)(IHC)分析。樣品用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并分析HLA-DR，BCL-6，BCL-2，CD-20和BCL-68表達(dá)。圖19示出在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤樣品(病例2)中抗原表達(dá)的免疫組織化學(xué)(IHC)分析。樣品用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并分析HLA-DR，BCL-6，BCL-2，CD-20和BCL-68表達(dá)。圖20示出在病例3的良性反應(yīng)性淋巴結(jié)(LN)中抗原表達(dá)的免疫組織化學(xué)(IHC)分析。樣品用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并分析IILA-DR,BCL-6,BCL-2，CD-20和BCL-68表達(dá)。圖21-23總結(jié)了圖18-20的結(jié)果并顯示在3種生物學(xué)樣品中HLA-DR、BCL-6和BCL-2表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析(IHC)。IHC發(fā)現(xiàn)與用ARRAYPLATEqNPA測定對活檢樣品進(jìn)行的基因表達(dá)分析相關(guān)。圖24示出在蛋白質(zhì)(用免疫組織化學(xué)分析)和RNA(用定量核酸酶保護(hù)測定[qNPA]分析)水平HLA-DR、BCL-6和BCL-2表達(dá)之間的相關(guān)性。圖25擴(kuò)大了圖24的研究以包括⑶20和⑶3抗原。圖26提供了定量核酸酶保護(hù)測定(ARRAYPLATE)進(jìn)行基因表達(dá)研究的應(yīng)用的代表性例子。用qNPA測定測量了在(A)人類肝細(xì)胞或⑶犬肝細(xì)胞中各種細(xì)胞色素P450同種型的表達(dá)的利福平誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)。圖27總結(jié)了圖26的結(jié)果，以擴(kuò)展格式提供了數(shù)據(jù)。由5yM利福平顯著誘導(dǎo)/抑制的基因示于右組。圖28提供了定制設(shè)計(jì)的陣列的代表性例子以及其所含基因(示出GenBank登錄號)。圖29示出在對照(未處理)和實(shí)驗(yàn)(安妥明處理的)PC_3樣品(n=3)中來自定制陣列1和2的基因表達(dá)的結(jié)果。現(xiàn)有技術(shù)提出需要提取RNA-將其增溶以用于PCR和微陣列方法。參考文獻(xiàn)還指出這一可溶的提取的RNA的質(zhì)量對于PCR或微陣列結(jié)果的質(zhì)量是關(guān)鍵的。因此qNPA是獨(dú)特的，因?yàn)闊o需提取。實(shí)施例用核酸酶保護(hù)測定測試了固定的組織(例如福爾馬林固定的，石蠟包埋福爾馬林固定的，或者preservcyte固定的，或者固定的，醇基固定劑)材料，但是也可以使用任何這樣的測定，其中使用雜交或結(jié)合探針結(jié)合靶寡核苷酸，然后以定量方式回收。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想測量交聯(lián)寡核苷酸的方法，其中生物合成產(chǎn)生探針?？梢允褂萌魏晤愋偷墓潭▌┳鳛闃悠凡牧?，只要靶寡核苷酸不被過量降解即可。為證實(shí)非提取自組織(假定交聯(lián)的寡核苷酸)并且不只是可溶性寡核苷酸的寡核苷酸的測量，裂解樣品然后離心。將上清與沉淀分離，然后將核酸酶保護(hù)探針加入到每一級分，它們被下述方案分別加工。這一測定被稱為定量核酸酶保護(hù)測定(qNPA)，但是也可以使用其它雜交和生物合成方法，其中所產(chǎn)生的探針可以與靶寡核苷酸分離并被測量。這一測定的示意圖如圖1?？倢?shí)驗(yàn)方案來自福爾馬林固定組織的沉淀的裂解物相對于上清的分析。裂解樣品，離心，然后測量沉淀和上清并與匹配的冷凍樣品相比較。核酸酶保護(hù)測定測量總RNA，而無論其是與沉淀相關(guān)并且未從裂解物提取出(交聯(lián)的)還是其從組織提取出的上清(可溶的)。因此，核酸酶保護(hù)探針/靶寡核苷酸雙鏈雜交體存在于沉淀內(nèi)。圖A描述了一個(gè)樣品，圖B描述了另一個(gè)樣品，證實(shí)在上清和沉淀中寡核苷酸的比率可以在樣品之間變化，這一方法通過測量兩個(gè)集合而測量樣品中的總寡核苷酸。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的新和舊石蠟塊之間的相關(guān)性。從已建檔18年的固定樣品和在原始樣品在18年前被固定時(shí)冷凍的組織塊制備的新鮮固定樣品獲得了定量上相同的結(jié)果。數(shù)據(jù)相對于管家基因標(biāo)準(zhǔn)化，然后繪圖確定固定18年的和新鮮固定的測量值之間的R2相關(guān)系數(shù)。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞用于驗(yàn)證從固定的、新鮮的和冷凍的組織測量得到定量上相同水平的基因表達(dá)。細(xì)胞沉淀在裂解前在OCT中冷凍，或者直接作為新鮮樣品裂解，或者用石蠟包埋、固定然后裂解。用數(shù)據(jù)(相對于管家基因而標(biāo)準(zhǔn)化)成對比較確定固定的與新鮮的，固定的與冷凍的，冷凍的與新鮮的樣品之間的R2相關(guān)系數(shù)。因此，當(dāng)分析均一群體時(shí)，結(jié)果近似相同，而無論樣品是否或者如何被新鮮或冷凍測試，或者是否其被固定并石蠟包埋。靶寡核苷酸測量的特異性。RNase和DNase實(shí)驗(yàn)證實(shí)ArrayPlate檢測RNA而非DNA。石蠟包埋的福爾馬林固定的組織被裂解并在95°C變性，然后分成各個(gè)樣品，這些樣品隨后用DNAse、RNAse或緩沖液處理。在這一處理后，樣品進(jìn)行熱變性以滅活DNAse和RNAse，然后加入核酸酶保護(hù)探針，進(jìn)行核酸酶保護(hù)方案。圖像證實(shí)未處理的和DNAse處理的樣品之間的相同結(jié)果，以及RNAse處理導(dǎo)致的總信號喪失，表明使用這一方案對來自固定的組織的RNA的特異性測量。ArrayPlateqNPA核酸酶保護(hù)測定和免疫組織化學(xué)的結(jié)果比較。具體的實(shí)施例是核酸酶保護(hù)測定，更具體是定量核酸酶保護(hù)測定。描述的是核酸酶保護(hù)探針與RNA的雜交，所述RNA可以是與組織交聯(lián)的，或者是可溶性RNA。用S1處理破壞未雜交的探針，降低探針至與靶寡核苷酸的量成比例的化學(xué)計(jì)量水平，所述靶寡核苷酸是交聯(lián)的及可溶的寡核苷酸。加熱下加入堿使得從寡核苷酸模板和組織釋放核酸酶保護(hù)探針，使得其可以接近而在編程的ArrayPlate上測量。其余方案部分以標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行，如方法中詳述。將大鼠肝切成兩半，一半冷凍，另一半在福爾馬林中固定。冷凍組織稱重，裂解，然后對每一測試樣品進(jìn)行稀釋。固定的塊切成5微米切片，這些切片以每個(gè)樣品2片、1片、1/2片或1/4片進(jìn)行測試。用核酸酶保護(hù)測定進(jìn)行測量，測量的是RNA。指示了測量的基因。測量的再現(xiàn)性通過計(jì)算針對每一基因的％CV及全部基因的平均％CV而評估。從HPV陽性對象收集陰道拭子并在Preservcyte中保存。HPV陽性診斷是根據(jù)PAP涂片和雜交捕獲測試而做出。設(shè)計(jì)一個(gè)陣列以測量宿主RNA、病毒RNA及病毒DNA。病毒DNA用探針測量，所述探針與基因的未轉(zhuǎn)錄部分中的序列雜交。樣品以雙份進(jìn)行測試(n=8)，數(shù)據(jù)未針對管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織實(shí)驗(yàn)中測量的基因列于這一表中。對于示出的圖，使用了陣列。當(dāng)提到彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)時(shí)，是指DB細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)，其是MHCII陰性DLBCL細(xì)胞系，或者是指DB轉(zhuǎn)染子DB-CIITA-3.1，其包括CIITA表達(dá)載體，以誘導(dǎo)主要組織相容性II類基因包括HLA-DRA，-DRB,-DPA，和-DQA的表達(dá)(Glinsmann-Gibson，2006)。細(xì)胞生長在具有10%胎牛血清的RPMI中至密度為4百萬/mL。離心16，000，000個(gè)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞沉淀，它們被1)制備成福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)材料，其是通過在福爾馬林中固定4小時(shí)，在TissueTek儀器上常規(guī)組織加工過夜和石蠟包埋而制成，或者2)制備成急速冷凍材料，其是通過在液氮中急速冷凍，在異戊烷中冷卻(quenched)，使用或不使用包埋介質(zhì)(最佳切割溫度或OCT，SakuraFinetechnicalCo,Torrance,CA)。大鼠肝臟類似地冷凍或制備為FFPE材料。FFPE用于測試ArrayPlate性能的臨床組織包括1個(gè)良性淋巴結(jié)(反應(yīng)性淋巴濾泡增生)和2個(gè)DLBCL(1個(gè)中心母細(xì)胞性，1個(gè)成免疫細(xì)胞性)，針對它們有多個(gè)急速冷凍和FFPE塊。從1989年的先前急速冷凍的良性淋巴組織塊產(chǎn)生新的FFPE塊，這是通過融化直至冷的，然后立即在4%福爾馬林中固定，并如下所述加工而產(chǎn)生。組織固定成大約5X5X5mm部分。冷凍的和FFPE切片以5微米厚度切片，為進(jìn)行核酸酶保護(hù)測定，將樣品置于HTG裂解緩沖液(25uL/切片)，短暫渦旋，在95°C加熱10分鐘，再次短暫渦旋，然后在-70°C冷凍直至分析。ArrayPlate核酸酶保護(hù)測定在先前已經(jīng)描述(Martel，2002)。簡而言之，在細(xì)胞如上被裂解、變性并在HTG緩沖液中加熱而透化后，測試?yán)鋬鰳悠贰５?，它們也可以在裂解后立即測試，探針可以在裂解時(shí)加入，或者樣品可以在95°C加熱步驟之前被冷凍。裂解和加熱的細(xì)節(jié)可以根據(jù)被測量的靶分子而不同。例如，在靶寡核苷酸是DNA的一些情況中，可能必須加熱裂解物至105°C。也可以使用本領(lǐng)域?qū)＜沂煜さ幕蛘邷y量不同類型靶分鐘或從固定組織恢復(fù)測量活性所通用的其它裂解和破壞方法。特別是在這些實(shí)驗(yàn)是測量寡核苷酸靶的情況中，特異于感興趣基因的探針與樣品在60°C保溫6小時(shí)，形成特異的探針-RNA雙鏈體，然后未雜交的探針和RNA用S1核酸酶消化。接下來，堿水解破壞雙鏈體的mRNA，留下完整探針，其濃度與原始存在的特異mRNA的量成比例。在中和后，樣品與檢測平板雜交。檢測平板是從一組16個(gè)獨(dú)特錨DNA寡聚物以4x4格子點(diǎn)印在96孔板孔底上形成的。這一通用陣列通過加入16個(gè)接頭探針而被編程用于感興趣基因，所述接頭探針在一端含有結(jié)合感興趣基因的序列及在另一端含有結(jié)合一個(gè)錨寡聚物的序列。雜交后，樣品探針通過接頭探針而結(jié)合于平板。加入檢測接頭(雖然其可以在將樣品加入到編程的ArrayPlate的同時(shí)被加入)，其在不被接頭探針結(jié)合的一端含有結(jié)合樣品探針的序列，以及在另一端的結(jié)合檢測探針的通用序列。然后加入檢測探針，其結(jié)合全部檢測接頭。檢測探針含有酶，所述酶作用于最后加入的化學(xué)發(fā)光過氧化物酶底物。用OmixImager從平板底部成像，并用Vuescript(HTG)進(jìn)行分析，Vuescript計(jì)算所有元素的平均像素強(qiáng)度以確定每個(gè)基因的表達(dá)水平。當(dāng)數(shù)據(jù)被標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，表達(dá)水平針對1000任意水平的管家基因TBP而標(biāo)準(zhǔn)化。對于DLBL實(shí)驗(yàn)，測量的基因是圖10所列的那些，但是所示數(shù)據(jù)是針對陣列1和2(圖16和17)。由于人類腫瘤樣品中細(xì)胞組成的異質(zhì)性，我們包括了設(shè)計(jì)用于測試B細(xì)胞(⑶19、⑶20)、T細(xì)胞(⑶3)和組織細(xì)胞(⑶68)的腫瘤組成的探針。最后，選擇2個(gè)管家基因TBP和PRKG1，其是基于評估不同內(nèi)源表達(dá)的基因作為管家基因的作用的先前公開的研究而選擇，所述研究鑒別這2個(gè)基因在不同類型淋巴瘤中以低或中等水平非常穩(wěn)定地表達(dá)(Losses,2003)。這2個(gè)管家基因在三個(gè)陣列的每個(gè)中重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對于陣列上存在的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行IHC，我們慣常在石蠟中進(jìn)行臨床IHC測定。這些包括CD20、BCL2和HLA-DR。所有染色均在配有VentanaI-View檢測的VentanaBenchmarkXT儀器(VentanaMedicalSystemslncorporated,Tucson,Arizona)(VMSI)上進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)室染色程序，使用on-instrument抗原提取。使用抗⑶20(VMSI，cloneL26)、BCL2(VMSI，cloneB4-2/100/D5)和HLA_DR(Biogenix，cloneLN3)的單克隆抗體。在Labophot-2顯微鏡上用10X目鏡和40X/0.65物鏡(Nikon,Melville,NY)照相。用SP0T-RT2.2.0彩色照相機(jī)和SPOTAdvanced4.0.9軟件(Diagnosticlnstruments,SterlingHeights，MI)捕獲和數(shù)碼獲得圖像，然后插入PowerPoint10(Microsoft,Redman,WA)進(jìn)行加工。結(jié)果為證實(shí)核酸酶保護(hù)在固定樣品中原位進(jìn)行，使用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)大鼠肝臟(5ym切片)作為起始材料。組織切片用30yl裂解緩沖液處理。裂解后，將核酸酶保護(hù)探針加入到樣品中，隨后熱變性(95°C，10分鐘)。離心樣品并除去上清。組織沉淀用30u1裂解緩沖液處理并與核酸酶保護(hù)探針保溫。在熱變性(95°C，10分鐘)后，在沉淀和上清上用提供底物的ARRAYPLATE進(jìn)行qNPA測定。冷凍組織用作對照。測定克服了從福爾馬林固定的材料提取mRNA的假象。這些結(jié)果示于圖2。上清及沉淀的組織切片與匹配的冷凍組織相比較。結(jié)果顯示靶寡核苷酸可以從沉淀測量。在圖A中，大部分發(fā)光計(jì)數(shù)來自沉淀而非上清。相反，在不同樣品(組B)中，從上清也有顯著水平的靶寡核苷酸被測得。在這一實(shí)驗(yàn)中，靶寡核苷酸是RNA,但是它們也可以是例如DNA、microRNA或核糖體RNA。固定將寡核苷酸與組織交聯(lián)。與沉淀結(jié)合的寡核苷酸的測量提示交聯(lián)的寡核苷酸無需增溶即可被測量，與原位方法所測相同的集合(其中RNA被標(biāo)記并在組織中被觀測到)，并且測量之和(當(dāng)上清未與沉淀分離時(shí))提供了樣品中總靶寡核苷酸的測量。在圖A和圖B中測試的樣品之間的差異提示交聯(lián)的與可溶的寡核苷酸之比可以變化，可能是由于固定方案差異所致，即使樣品是相同的。因此，僅僅測量交聯(lián)集合或者僅僅測量可溶集合可能不能精確測量樣品中靶寡核苷酸水平。組(C)提供了用于這一研究中的實(shí)驗(yàn)方案的詳細(xì)描述。結(jié)果證實(shí)在qNPA測定中的核酸酶保護(hù)步驟在原位發(fā)生，而檢測步驟可以是exsitu、原位或者兩者。福爾馬林固定石蠟包埋樣品中基因表達(dá)的分析福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)腸組織如先前所述在裂解緩沖液中勻漿并用緩沖液、補(bǔ)加RNAase的緩沖液或者補(bǔ)加DNAase的緩沖液處理。沉淀如先前所述進(jìn)行qNPA測定。測量大約0.4個(gè)切片/孔。這些研究顯示該技術(shù)測量組織中的RNA的適用性。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖3中示出。從勻漿樣品中消除靶RNA的RNAase處理導(dǎo)致從樣品喪失了活靶。用DNAase處理樣品對qNPA測定沒有任何顯著作用。定量核酸酶保護(hù)測定使得可以進(jìn)行定量確定為評價(jià)本文所用核酸酶保護(hù)測定的定量性質(zhì)，用qNPA測定將FFPE切片對相同的冷凍組織滴定。從冷凍組織中分離RNA并加樣到玻片上。以類似方式加樣FFPE切片。在FFPE結(jié)腸上的ArrayPlatemRNA測定的示意圖在圖A中提供。這一研究的結(jié)果在圖4(A)和(B)中示出，其示出冷凍組織vs.FFPE肝的基因表達(dá)的相關(guān)性。組(B)的右側(cè)高亮示出了一個(gè)示例。如圖所示，從冷凍樣品或固定樣品鑒別的各種基因的個(gè)體表達(dá)譜經(jīng)目測互相相關(guān)性很好。37為進(jìn)一步定量從不同生物學(xué)樣品獲得的這些結(jié)果，對冷凍vsFFPE切片組織中各種基因的表達(dá)譜進(jìn)行回歸分析。在所用樣品中測量了同一組基因，數(shù)據(jù)針對管家基因標(biāo)準(zhǔn)化，然后繪圖以確定每個(gè)成對比較之間的R2相關(guān)性系數(shù)。這一回歸分析的結(jié)果示于圖5(B)。在兩個(gè)樣品之間觀察到強(qiáng)相關(guān)性(R2=0854)。這些結(jié)果基本上表明從新鮮固定的組織和冷凍組織一樣獲得了等價(jià)的定量結(jié)果。盡管原位雜交測量RNA(其中RNA被標(biāo)記并在組織中觀測)已發(fā)現(xiàn)使用新鮮固定的組織或者使用固定然后儲存多年的組織是相當(dāng)?shù)?，但是這典型地對于PCR或者非原位進(jìn)行的雜交方法不是這樣。這樣限制了實(shí)用性，因?yàn)橛写罅拷n材料否則可以用于回顧研究以鑒別和驗(yàn)證生物標(biāo)記和靶基因，或者用于開發(fā)和驗(yàn)證監(jiān)測、預(yù)后或診斷測定，或者用于將安全性與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，或者用于了解疾病過程等等。測試了18年前從癌癥患者獲得的淋巴結(jié)組織。在那時(shí)已固定了一部分用于組織學(xué)，另一部分作為組織塊被冷凍?；颊弑辉\斷具有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。冷凍塊的部分被固定以提供新鮮固定的樣品用于與建檔18年的固定材料相比較。測量了來自每個(gè)樣品的一組基因，結(jié)果示于圖6。給出了在針對管家基因標(biāo)準(zhǔn)化后的相對發(fā)光值。R2相關(guān)性系數(shù)是0.93，提示從新鮮固定的組織與已固定18年的組織一樣獲得了基本上等價(jià)的定量結(jié)果。為測量qNPA信號對起始材料的量的依賴性之間的關(guān)系，用先前鑒定的FFPE切片進(jìn)行了基因表達(dá)研究。與用各種量的樣品(每種樣品量n=4)獲得的未標(biāo)準(zhǔn)化qNPA信號進(jìn)行比較。對于含有至少0.5FFPE切片/孔的樣品獲得了樣品大小與qNPA信號之間的線性關(guān)系。這些結(jié)果在所有被分析基因中均一致地觀測到。這些研究結(jié)果及被分析的基因類型示于圖7。為定量評價(jià)新鮮冷凍vs.FFPE肝樣品中的基因表達(dá)水平，用qNPA測定進(jìn)行了16個(gè)基因的比較分析。大部分這些基因的表達(dá)譜在這兩種樣品制備物(即冷凍vs.FFPE)之間的差異是基本上不可分辨的。這一研究結(jié)果示于圖8。本文描述的方法使得靶寡核苷酸靈敏測量。圖9中的表(A)比較了經(jīng)核酸酶保護(hù)測定對來自冷凍大鼠肝臟的稀釋液及不同數(shù)量的匹配的福爾馬林固定的肝臟樣品的5微米厚度切片的RNA測量。注意到僅用1/4的組織切片就可以測量所有基因。另外，測量的再現(xiàn)性很好，對于所有測量的基因平均CV為7%。這一再現(xiàn)性不比從冷凍匹配樣品測量的基因的再現(xiàn)性差。最后，1/4的切片對于每一基因和全部基因產(chǎn)生與19ug冷凍組織類似的發(fā)光計(jì)數(shù)，提示使用這一方法從固定組織進(jìn)行RNA測量的靈敏性可以如何。用PCR和其它基于雜交的方法從固定組織測量RNA已被證明非常不靈敏，需要大量組織。核酸酶保護(hù)方法的靈敏性很可能是測量總RNA而非僅可溶性集合的結(jié)果，因此這一相同靈敏性可以通過測量交聯(lián)靶寡核苷酸的任何方法獲得。如圖9的表(B)所示，用這一技術(shù)可以可靠地檢測許多靶基因。測量的再現(xiàn)性非常好，在所有測量的基因中平均CV小于20%?？梢詼y量其它核苷酸靶，可以成功測試用其它類型固定方法固定的樣品。收集臨床陰道樣品并在測試前保存在Preservcyte中。核酸酶保護(hù)測定測量宿主細(xì)胞RNA、病毒RNA和病毒DNA。為區(qū)分病毒DNA和樣品中存在的RNA，設(shè)計(jì)核酸酶保護(hù)探針以與基因的未轉(zhuǎn)錄部分的序列雜交。數(shù)據(jù)是未標(biāo)準(zhǔn)化的強(qiáng)度，及從8個(gè)重復(fù)樣品測量值確定的相關(guān)％CV。被證實(shí)的是測量宿主RNA、病毒RNA和病毒DNA的能力，證實(shí)從固定樣品測量多種類型的寡核苷酸靶，以及從同時(shí)位于ArrayPlate的同一孔中的同一樣品實(shí)際測量這些靶寡核苷酸的能力。這些附圖示出用探針進(jìn)行測量的概念，所述探針與交聯(lián)的寡核苷酸靶以及可溶的靶結(jié)合，其然后可以被分離和測量。具體的例子是核酸酶保護(hù)測定，更具體是定量核酸酶保護(hù)測定，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開發(fā)其它方法，包括利用經(jīng)生物合成手段產(chǎn)生的探針或者可以通過寡核苷酸雜交之外的方法結(jié)合以產(chǎn)生交聯(lián)寡核苷酸靶的相同測量的方法。描述了使用標(biāo)準(zhǔn)程序，對于新鮮或冷凍組織一樣的是，固定組織中的寡核苷酸靶可以被測量。示出了核酸酶保護(hù)探針與RNA的雜交，所述RNA可以是與組織交聯(lián)，以及是可溶的RNA。用S1處理降低探針至化學(xué)計(jì)量水平，與靶寡核苷酸的量成比例，所述靶寡核苷酸是交聯(lián)及可溶的寡核苷酸。加熱下加入堿從寡核苷酸模板及組織中釋放核酸酶保護(hù)探針，使得其可被接近而由非原位方法測量。但是注意到探針(來自較大一組探針中的一個(gè)或幾個(gè))可以首先在原位被測量。方案的其余部分以標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行，如方法中詳述。原位及組織裂解后依次測量探針是可能的。當(dāng)過量探針被洗掉后，或者在用S1核酸酶處理后，用例如熒光標(biāo)記或發(fā)光可以觀測靶結(jié)合探針，并原位定量。如果這特異針對一個(gè)探針或針對兩個(gè)或多個(gè)可以基于例如利用不同發(fā)射波長的探針而被區(qū)分的探針，則原位測量的這些靶的水平可以用于標(biāo)準(zhǔn)化或者另外幫助解釋在裂解后進(jìn)行的一較大組探針對一組靶的測量。以這種方式，空間或“contextural”信息可以與基因的測量相關(guān)聯(lián)，即使在空間信息已丟失后也可以。在探針在原位測量之前被洗掉的情況中，探針可以被設(shè)計(jì)具有非靶雜交序列突出端，其與寡聚物綴合的檢測探針互補(bǔ)，因此可以用該檢測探針標(biāo)記。或者，原位探針可以直接用檢測分子或能結(jié)合檢測分子或復(fù)合物的基團(tuán)如生物素標(biāo)記，然后在原位測量之前使用洗滌和/或S1步驟。這種標(biāo)記不影響核酸酶保護(hù)探針雜交它們的靶寡核苷酸的能力。存在許多其中在靶寡核苷酸測量之前固定樣品的能力有利的情況。例如，如果血液被直接收集進(jìn)固定劑，固定及保存靶寡核苷酸水平，則樣品被取得與其被測試之間的時(shí)間變得不重要。操作變得更容易。另外，固定的樣品可以通過可另外破壞或裂解細(xì)胞和組織的方法加工，導(dǎo)致靶寡核苷酸的改變或喪失，例如通過過濾，簡化樣品制備。其對于許多類型細(xì)胞、組織或完整生物體以及環(huán)境樣品或者樣品的收集遠(yuǎn)離測試地點(diǎn)的情況均是這樣的。實(shí)施例2:臨床研究彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的攻擊性淋巴瘤，占全部淋巴瘤的近40%。DLBCL的臨床國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分幫助基于臨床特征將患者分為各風(fēng)險(xiǎn)類別(Shipp，1993)。但是，即使在類別內(nèi)，患者的結(jié)局也是可變的。因?yàn)榭勺兊幕颊呓Y(jié)局，長久以來已懷疑DLBCL可能實(shí)際包括1種以上疾病。近年來，廣泛的基因表達(dá)譜(GEP)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果已證實(shí)DLBCL不是一種均一的疾病實(shí)體，GEP限定的亞型中的差異可以與患者存活相關(guān)。基于3個(gè)不同研究組的工作已鑒別了3組不同基因。第一組用LymphoChip研究了240個(gè)DLBCL。這一芯片被點(diǎn)印含有各種元件的寡核苷酸微陣列，已知其代表由B或T淋巴細(xì)胞表達(dá)的基因，參與免疫應(yīng)答的基因或者由淋巴瘤和白細(xì)胞細(xì)胞系表達(dá)的基因。(AliZadeh，1999)。研究人員發(fā)現(xiàn)了4種與患者存活高度相關(guān)的基因表達(dá)特征，稱為“生發(fā)中心”，“主要組織相容性(MHC)II類”、“淋巴結(jié)”和“增殖”。來自這4種特征的代表基因與基因BMP6被用于產(chǎn)生17基因結(jié)局預(yù)測評分，其提供了獨(dú)立于臨床IPI評分的另外的預(yù)后值(RoSenWald，2002)。另一個(gè)小組使用Affymetrix高密度寡核苷酸陣列平臺禾口有監(jiān)督學(xué)習(xí)分類方法(supervisedlearningclassificationapproach)開發(fā)DLBCL結(jié)局預(yù)測評分，使用一組13個(gè)基因獲得最佳精確性(Shipp，2002)。另一研究小組對先前報(bào)道與DLBCL中的存活顯著相關(guān)的基因進(jìn)行了文獻(xiàn)元分析(meta-analysis)。使用定量RT-PCR，這些研究人員評估了一系列66個(gè)DLBCL，并確定6個(gè)最具預(yù)測性的基因(LM02,BCL6,FN1,CCND2,SCYA3和BCL2)(Lossos,2004)。對于先前在態(tài)度鮮明文章中被鑒別為與DLBCL的患者結(jié)局顯著相關(guān)的總共34個(gè)基因，只有2個(gè)基因同時(shí)在Lymphochip和RT-PCR文章中被鑒別(BCL6和FN1)。通過Lymphochip數(shù)據(jù)集分析，鑒別了與患者存活高度相關(guān)的若干氧化還原作用(redox)相關(guān)基因，并且已產(chǎn)生了“RedoxScore”，包括代表基因，錳超氧化物歧化酶和過氧化氫酶(Tome，2005)。所有4篇文章均使用與DLBCL中的存活相關(guān)的一組關(guān)鍵基因集合的基因表達(dá)的量化。每個(gè)均提供了與其特定病例集合的結(jié)局強(qiáng)相關(guān)的一小組基因集合。所有均使用依賴急速冷凍材料作為分析基礎(chǔ)的技術(shù)，使得基因集合之間進(jìn)行比較或者擴(kuò)展到更廣患者組變得困難。因此，這些基因集合的比較，特別是使用適于石蠟包埋樣品的方法是確定這些預(yù)后基因研究的臨床實(shí)用性的下一步驟。定量核酸酶保護(hù)測定保證了定量mRNA而無需mRNA提取隨后進(jìn)行定量RT-PCR的困難步驟，因此可以適用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織。所述方法依賴于ArrayPlate測定，該測定先前已經(jīng)被描述用于藥物學(xué)應(yīng)用(Martel，2002)。在這一測定中，組織在96孔板中被裂解。設(shè)計(jì)用于感興趣基因的探針與裂解液保溫以允許特異探針-RNA雙鏈體的雜交。未雜交探針和RNA被消化，使用堿水解以從雙鏈體中分離mRNA，留下完整探針，其濃度與原始存在的特異mRNA的量成比例。這些剩余的探針然后被轉(zhuǎn)移至第二個(gè)96孔板，其使用接頭和檢測探針及化學(xué)發(fā)光檢測和定量。該平臺易于進(jìn)行并且具有處理高樣品容量的潛力。使用這一技術(shù)，開發(fā)了一種測定用于所有36個(gè)感興趣基因及管家基因和目的在于確定樣品的細(xì)胞組成的基因(B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞基因)。進(jìn)行了若干研究，用于測試和驗(yàn)證所述測定在冷凍和石蠟包埋材料兩者中的性能。先前在Rosenwaldetal.的文章中被分析的來自DLBCL病例的石蠟塊被再次使用用于確定該技術(shù)是否可以類似地定量預(yù)后顯著的基因及這是否與患者結(jié)局相關(guān)?？偟哪康氖情_發(fā)和驗(yàn)證一種測定，其可以用于在患有DLBCL的所有患者中進(jìn)行結(jié)局預(yù)測，而不限于具有可利用急速冷凍組織的少數(shù)幸運(yùn)者。在如下方面進(jìn)行了比較，即冷凍樣品與石蠟包埋樣品比較，新石蠟塊與幾乎有20年歷史的石蠟塊比較，并評價(jià)了結(jié)果與在先前公開的一組40個(gè)患者中的患者風(fēng)險(xiǎn)死亡率(patienthazardratioofdeath)之間的關(guān)系。這些研究證實(shí)這一技術(shù)特別當(dāng)用于建檔材料的實(shí)用性，因此在這一領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。患者及細(xì)胞系材料，F(xiàn)FPE和冷凍塊的制備為驗(yàn)證ArrayPlate的設(shè)計(jì)，使用一種DB細(xì)胞系(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA)，其是MHCII陰性DLBCL細(xì)胞系。另外，還利用了一種最近產(chǎn)生的DB轉(zhuǎn)染子DB-CIITA-3.1，其包括CIITA表達(dá)載體以誘導(dǎo)主要組織相容性II類基因包括HLA-DRA，-DRB,-DPA，和-DQA.的表達(dá)(Glinsmann-Gibson，2006)。細(xì)胞生長在具有10%胎牛血清的RPMI中至密度為4百萬/mL。離心16，000,000個(gè)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞沉淀，它們被1)制備成FFPE材料，其是通過在福爾馬林中固定4小時(shí)，在TissueTek儀器上常規(guī)組織加工過夜和石蠟包埋而制成，或者2)制備成急速冷凍材料，其是通過在液氮中急速冷凍，在異戊烷中冷卻(quenched)，使用或不使用包埋介質(zhì)(最佳切割溫度或OCT，SakuraFinetechnicalCo,Torrance,CA)。用于測試ArrayPlate性能的FFPE組織包括1個(gè)良性淋巴結(jié)(反應(yīng)性淋巴濾泡增生)和2個(gè)來自醫(yī)院檔案的DLBCL(1個(gè)中心母細(xì)胞性，1個(gè)成免疫細(xì)胞性)，選擇的是具有多個(gè)急速冷凍和石蠟塊并且含有接近100%腫瘤。從1989年的先前急速冷凍的良性淋巴組織塊產(chǎn)生新的石蠟塊，這是通過融化直至冷的，然后立即在4%福爾馬林中固定，并如下所述加工而產(chǎn)生。陣列排列如圖11所述。為研究在FFPE樣品上的ArrayPlate結(jié)果是否足夠類似于來自急速冷凍組織的GEP發(fā)現(xiàn)結(jié)果，使用了先前被GEP分析的樣品。先前，有45個(gè)急速冷凍樣品被貢獻(xiàn)于DLBCL的LLMPP研究。在這些樣品中，24個(gè)被包括在Rosenwaldetal的NEJM文章中，該文章描述了OPS在反映新生DLBCL中患者存活中的用途。在這些病例中，使用了18個(gè)石蠟塊。還利用了用LLMPP分析但未包括在所述新生DLBCL中的21個(gè)病例的石蠟塊，包括9個(gè)轉(zhuǎn)化的和12個(gè)復(fù)發(fā)的DLBCL病例。用于ArrayPlate的樣品制備以5微米厚度切割冷凍的和FFPE切片并立即置于實(shí)驗(yàn)室緩沖液中(25yL/切片)，短暫渦旋，在95°C加熱10分鐘，再次短暫渦旋，然后在-70°C冷凍直至分析。ArrayPlate上每孔使用1切片組織。樣品來自切割活檢，其固定為大約5X5X5mm部分。重要的是將石蠟塊切成薄片，因?yàn)闉楸∑懈畹腇FPE組織給出不良結(jié)果。ArrayPlate測定ArrayPlate測定先前已被描述(Martel，2002)。簡而言之，在細(xì)胞或組織被裂解、變性和如上所述經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室緩沖液中加熱透化后，將冷凍樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。在實(shí)驗(yàn)室，特異于感興趣基因的探針與樣品在60°C保溫6小時(shí)，形成特異的探針-RNA雙鏈體，然后未雜交的探針和RNA用S1核酸酶消化。DLBCL基因列于圖10的表中。接下來，用堿水解從雙鏈體分離mRNA，留下完整探針，其濃度與原始存在的特異mRNA的量成比例。在中和后，樣品與檢測平板雜交。檢測平板是從一組16個(gè)獨(dú)特錨DNA寡聚物以4x4格子點(diǎn)印在96孔板孔底上形成的。這一通用陣列通過加入16個(gè)接頭探針而被編程用于感興趣基因，所述接頭探針在一端含有結(jié)合感興趣基因的序列及在另一端含有結(jié)合一個(gè)錨寡聚物的序列。使用了三組接頭探針，每個(gè)測定3孔，針對感興趣的基因。雜交后，樣品探針通過接頭探針而結(jié)合于平板。加入檢測接頭，其在不被接頭探針結(jié)合的一端含有結(jié)合樣品探針的序列，以及在另一端含有結(jié)合檢測探針的通用序列。然后加入檢測探針，其結(jié)合全部檢測接頭。檢測探針含有酶，所述酶作用于最后加入的化學(xué)發(fā)光過氧化物酶底物。用OmixImager從平板底部成像，并用Vuescript(實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行分析，Vuescript計(jì)算所有元件的平均像素強(qiáng)度以確定每個(gè)基因的表達(dá)水平。表達(dá)水平針對1000任意水平的管家基因TBP而標(biāo)準(zhǔn)化。一些孔含有這樣的斑點(diǎn)，其中一些元件的基因表達(dá)不在孔中其它斑點(diǎn)的范圍。如果范圍太高，則信號用已知數(shù)量的可以結(jié)合樣品探針但不結(jié)合平板的不可檢測的競爭寡核苷酸降低。如果范圍太低，則信號用針對同一基因的多個(gè)樣品探針增加，所述探針的結(jié)合樣品RNA的部分的序列不同，結(jié)合接頭探針的序列相同?；虻倪x擇如導(dǎo)言最后一段所述，使用了在4篇著名文章中被鑒別為對于DLBCL的預(yù)后重要的關(guān)鍵基因。這些基因有36個(gè)感興趣基因(Lossos，2004;Rosenwald，2002;Shipp，2002；Tome,2005)由于人類腫瘤樣品中細(xì)胞組成的異質(zhì)性，還包括了設(shè)計(jì)用于測試B細(xì)胞(⑶19，⑶20)、T細(xì)胞(⑶3)和組織細(xì)胞(⑶68)的腫瘤組成的探針。最后，選擇2個(gè)管家基因TBP和PRKG1，其是基于評估不同內(nèi)源表達(dá)的基因作為管家基因的用途的先前公開的研究而選擇，所述研究鑒別這2個(gè)基因在不同類型淋巴瘤中以低或中等水平非常穩(wěn)定地表達(dá)(Lossos，2003)。這2個(gè)管家基因在三個(gè)用于產(chǎn)生陣列的孔的每個(gè)中重復(fù)實(shí)驗(yàn)。加入寡dT探針以評估樣品中mRNA的數(shù)量(因?yàn)楣裠T探針應(yīng)該檢測具有polyA尾的所有mRNA)。但是，因?yàn)榧夹g(shù)原因，這一探針是非功能性的和未進(jìn)一步利用。最初還包括了細(xì)胞色素氧化酶，因?yàn)槠湓诰€粒體DNA中編碼，應(yīng)該以高水平表達(dá)。結(jié)果證明其既結(jié)合DNA又結(jié)合RNA，因此給出非常亮的且通常過飽和的信號，并因此不被進(jìn)一步考慮，除了其可以用于區(qū)分是否材料不足進(jìn)行測定，或者如果其完全消失，是否樣品被過于降解而不能使用。這些基因列于圖10的表中。免疫組織化學(xué)和照相(IHC)對于陣列上存在的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行IHC，慣常進(jìn)行這些基因的臨床IHC測定。這些包括〔020，〔03，〔068，8卬2，8(^6和111^-01。所有染色均在配有VentanaI-View檢測的VentanaBenchmarkXT儀器(VentanaMedicalSystemsIncorporated,Tucson,Arizona)(VMSI)上進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)室染色程序，使用on-instrument抗原提取。使用抗CD20(VMSI，cloneL26)，CD3(VMSI，clonePS1)，CD68(VMSI，cloneKP1),BCL2(VMSI,cloneB4-2/100/D5)，BCL6(cloneIG191E/AB)和HLA_DR(Biogenix，cloneLN3)的單克隆抗體。在Labophot-2顯微鏡上用10X目鏡和40X/0.65物鏡(Nikon,Melville,NY)照相。用SP0T-RT2.2.0彩色照相機(jī)和SPOTAdvanced4.0.9軟件(DiagnosticInstruments,SterlingHeights，MI)捕獲和數(shù)碼獲得圖像，然后插入PowerPoint10(Microsoft,Redman,WA)進(jìn)行加工。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在18個(gè)病例上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所述18個(gè)病例具有來自ArrayPlate和Affymetix/Lymphochip的基因表達(dá)分析的結(jié)果。針對每個(gè)基因衍生了對于3種研究方法的每個(gè)成對比較的Spearman等級順序(rank-order)相關(guān)性。對于給定的比較，處于能力考慮未進(jìn)行少于10個(gè)觀測的分析。計(jì)算了針對每一成對比較的在可利用基因之間的中位整體相關(guān)性；僅包括具有對于全部3個(gè)成對比較可利用數(shù)據(jù)的基因一避免偏倚。由陣列平板測量的基因表達(dá)在整體生存上的單變量分析結(jié)果(風(fēng)險(xiǎn)比，95%置信區(qū)間，及p值)得自Cox回歸模型(CoxDR.Regressionmodelsandlifetables.JRoyalStatSocB.1972；B34187-220.)。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞中基因表達(dá)的臨床研究如圖12_25示出。結(jié)果在冷凍組織上的測試性能及與FFPE比較對于所有44個(gè)感興趣基因，可以設(shè)計(jì)合適的特異探針和接頭探針。對于8個(gè)基因，信號需要用不可檢測的競爭寡核苷酸降低。對于4個(gè)基因，信號需要用多個(gè)探針的添加定量而增加。在2個(gè)管家基因PRKG1和TBP之間，TBP具有更強(qiáng)更均一的發(fā)光結(jié)果。所有數(shù)據(jù)因此針對任意設(shè)為1000的TBP而標(biāo)準(zhǔn)化(數(shù)據(jù)未示出)。測定性能線性下降至0.125mg樣品/孔。RNase和DNase處理證實(shí)該測定僅特異于RNA檢測。測試上清和細(xì)胞裂解物確定RNA不從組織中提取(僅使用細(xì)胞裂解物陽性結(jié)果)這可能解釋了冷凍和FFPE組織之間的良好相關(guān)性，因?yàn)闊o需從組織進(jìn)行RNA提取。在冷凍良性淋巴結(jié)上四次重復(fù)運(yùn)行的CV范圍為8-15%(數(shù)據(jù)未示出)。不同類型組織制備物之間的比較是優(yōu)異的，裂解物vs.急速冷凍(R2=0.989)，急速冷凍vs.FFPE(R2=0.991)，裂解物vsFFPE(R2=0.994)(數(shù)據(jù)未示出)。針對RT-PCR和IHC驗(yàn)證ArrayPlate技術(shù)ArrayPlate結(jié)果精確反映了用定量RT-PCR證實(shí)的在DB細(xì)胞系轉(zhuǎn)染子clone1-5中HLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA和HLA-DPA的mRNA的增加(數(shù)據(jù)未示出)。來自在這些包埋細(xì)胞系的FFPE上進(jìn)行的4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)范圍為7-9%(圖4A)。ArrayPlate結(jié)果與預(yù)后顯著基因和基因產(chǎn)物的免疫組織化學(xué)染色模式相關(guān)良好(圖5A-5D)。相同樣品的新的和建檔石蠟塊之間的相關(guān)性來自同一活檢的新的和舊的石蠟塊之間的相關(guān)性非常好(圖4B)。新石蠟塊取自己在活檢時(shí)冷凍的技術(shù)冷凍組織部分，其被快速解凍，在福爾馬林中固定，包埋。結(jié)果與18年前患者手術(shù)時(shí)從同一活檢制備的石蠟塊相比較。結(jié)果表明該測定對于非常老的建檔材料的適用性。不同mRNA定量技術(shù)之間的相關(guān)性用ArrayPlate分析分析了40例個(gè)另外的建檔FFPEDLBCL。39例被成功分析。1例完全沒有信號。與polyT探針的原位雜交證實(shí)該例不具有任何完整mRNA。其余39例的結(jié)果與先前Affymetrix和競爭GEP陣列結(jié)果用SpearmanRankStatistics進(jìn)行比較，如表2所示。由于對于所有平臺不是所有基因結(jié)果均可獲得，如表所示經(jīng)常缺少數(shù)據(jù)。ArrayPlate對Affymetrix的中位相關(guān)性是0.52，ArrayPlate對Lymphochip的中位相關(guān)性是0.55，Affymetrix對Lymphochip的中位相關(guān)性是0.78?？衫斫夂笠幌嚓P(guān)性較高，因?yàn)檫@2個(gè)分析是在衍生自同一冷凍組織塊的RNA等份上進(jìn)行，而ArrayPlate分析是在不同塊上進(jìn)行(盡管來自同一樣本)?？傊@些對于這一類型技術(shù)是優(yōu)異的相關(guān)性。與其它GEP技術(shù)相比的用ArrayPlate評估的預(yù)后基因的風(fēng)險(xiǎn)比44個(gè)基因的結(jié)果然后與用ArrayPlate成功分析的39個(gè)病例進(jìn)行比較以比較生存。首先，進(jìn)行基因表達(dá)對患者生存的單變量分析。但是，無一基因與生存顯著相關(guān)，其歸因于在這一研究組中病例數(shù)低(因?yàn)樗羞@些基因在較大患者組中均與生存相關(guān))。計(jì)算針對每個(gè)基因的死亡風(fēng)險(xiǎn)比。風(fēng)險(xiǎn)比>1，則死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，風(fēng)險(xiǎn)比<1，則死亡風(fēng)險(xiǎn)降低。對于每個(gè)基因這些風(fēng)險(xiǎn)比通常朝相同方向發(fā)展，如同它們在其顯著性被衍生的更大數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)的那樣。進(jìn)行了一致性比較(高于或低于1的風(fēng)險(xiǎn)比的結(jié)果)。對于Affymetrix和Lymphochip數(shù)據(jù)的比較，2種方法在33個(gè)基因中有29個(gè)基因一致(88%)，對于ArrayPlate和Affymetrix，2種方法在40個(gè)基因中有30個(gè)基因一致(75%)，對于ArrayPlate和Lymphochip，2種方法在34個(gè)基因中有27個(gè)一致(79%)。通?；虮磉_(dá)的定量測量與蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平的測量相關(guān)性不好。該圖證實(shí)來自福43爾馬林固定組織的基因表達(dá)的測量(其中在本例中經(jīng)核酸酶保護(hù)而測量總RNA)可以給出這樣的結(jié)果，其與經(jīng)免疫組織化學(xué)方法原位測量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平數(shù)量上相關(guān)。來自己被診斷患有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤或良性反應(yīng)性淋巴結(jié)的3個(gè)患者的固定組織樣品經(jīng)核酸酶保護(hù)測定而測量。3個(gè)基因(HLA-DR，Bel2和⑶20)的水平經(jīng)條形圖示出。對于每一患者，這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物用免疫組織化學(xué)(IHC)測量。繪出了染色的玻片，及每種蛋白質(zhì)標(biāo)記的相對數(shù)量水平(高、中、低)。注意到IHC蛋白質(zhì)水平與基因表達(dá)水平相關(guān)。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷是基于組織學(xué)和原位測量。這些數(shù)據(jù)提示其也可以基于用一種測定從組織測量基因表達(dá)水平，該測定中空間關(guān)系已喪失，但是總寡核苷酸水平被定量測定，或者可以用這種方法獲得額外的預(yù)后和診斷信息。實(shí)施例3qNPA技術(shù)在研究和/或診斷中的應(yīng)用本發(fā)明可以用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和診斷應(yīng)用中。例如，基因/蛋白質(zhì)表達(dá)中的藥物誘導(dǎo)的變化可以常規(guī)用上述方法進(jìn)行分析。以下描述了一個(gè)代表性例子。利福平介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)用上述qNPA技術(shù)分析了具有已知肝毒性作用的抗生素利福平對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。人或犬原代肝細(xì)胞與0-10uM利福平保溫，用qNPA分析各種代謝酶的原始轉(zhuǎn)錄物水平。這些結(jié)果如圖26-27所示。如圖26組(A)所示，這些基因表達(dá)研究提供了一種手段，用于利福平的酶誘導(dǎo)的藥理學(xué)測量(例如EC5(I水平)。另外，可以在人類和犬樣品中進(jìn)行比較研究。在人類中，細(xì)胞色素P450酶Cyp3A4，Cyp2C9,Cyp2B6,GSTA2和SULT2A1被利福平誘導(dǎo)。Cyp2D6和PXR被抑制，表明不利的藥物反應(yīng)。但是這些酶的抑制小于50%(圖27A)。在犬肝細(xì)胞中，CyplAl、Cyp2D15和Cyp2A337基因被上調(diào)。但是，與人細(xì)胞不樣。利福平處理不導(dǎo)致任何分析的基因的抑制。這些結(jié)果示于圖26和27的圖(B)。從前述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的關(guān)鍵特征，并且無需偏離本發(fā)明精神和范圍可以對本發(fā)明進(jìn)行變化和修飾以使其適應(yīng)各種應(yīng)用和條件。無需進(jìn)一步驗(yàn)證，據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員利用前述描述可以使用本發(fā)明至其最大程度。前述優(yōu)選的特異實(shí)施方案因此被認(rèn)為僅是示例性的，不是以任何方式對其余公開的限制性的。在前面的描述及實(shí)施例中，所有溫度均表示為未校正的攝氏度，所有份和百分比均是重量的，除非特別說明。前述實(shí)施例可以通過取代針對前述實(shí)施例所用的那些一般地或特異地描述的反應(yīng)物和/或本發(fā)明的操作條件而以類似成功性重復(fù)。上文和附圖中引用的所有申請、專利和公開出版物以及2007年3月30日提交的相應(yīng)的美國臨時(shí)申請60/920，814和2008年1月3日提交的美國臨時(shí)申請61/018，717，均全文包含在此作為參考。權(quán)利要求一種檢測生物學(xué)樣品中至少一種不溶靶的方法，包括(i)將所述樣品與特異性結(jié)合所述靶的至少一種核酸酶保護(hù)分子(NPM)接觸，(ii)將所述樣品在有效消除任何未結(jié)合的NPM的條件下暴露于一或多種試劑，(iii)任選地從所述靶分離結(jié)合的NPM，以及(iv)檢測所述NPM的存在。2.權(quán)利要求1的方法，包括檢測結(jié)合形式或游離形式的所述NPM。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述不溶靶被固定和/或交聯(lián)。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述不溶靶是肽、蛋白質(zhì)或核酸。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸分子包含核糖核酸(RNA)分子或者脫氧核糖核酸(DNA)分子，或者反義核苷酸，其可包含非天然堿基。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述RNA是信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、siRNA,以及反義RNA或者病毒RNA(vRNA)。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述DNA是基因組DNA(gDNA)、線粒體DNA(mtDNA)、葉綠體DNA(cpDNA)，或者病毒DNA(vDNA)，或者轉(zhuǎn)染的DNA。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述NPM包含特異性結(jié)合所述靶的核酸，或者適體。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述靶是蛋白質(zhì)、肽、多核苷酸或者能與所述核酸或適體NPM雜交的蛋白質(zhì)。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述靶是核酸。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述NPM包含DNA分子。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述NPM是單鏈DNA(ssDNA)或者支鏈DNA(bDNA)分子，或者含有LNA或PNA或者其它非天然堿基。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述NPM是特異性結(jié)合所述靶的核酸，且步驟(ii)包括用核酸酶處理以有效消除任何未結(jié)合的NPM。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述靶是核酸。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述靶是RNA分子(應(yīng)理解微小RNA是RNA分子？)、siRNA或者反義RNA，其可包含非天然堿基。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述靶RNA分子與完整NPM分子或者其一部分雜交。17.權(quán)利要求13的方法，其中所述NPM是單鏈(ssDNA)或者支鏈(bDNA)DNA。18.權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸酶是DNAase、RNAase或者其組合。19.權(quán)利要求13的方法，其中所述NPM是DNA分子，所述核酸酶是DNAase。20.權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸酶是Sl核酸酶。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學(xué)樣品是固定的。22.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學(xué)樣品包含導(dǎo)致靶分子交聯(lián)的物質(zhì)。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述固定包括用乙醇、福爾馬林、二硫-二(琥珀酰亞胺丙酸酯)(DSP)處理所述樣品。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶是交聯(lián)的。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述靶與如下物質(zhì)交聯(lián)二[硫代琥珀酰亞胺]辛二酸酯(BS3)、二琥珀酰亞胺辛二酸酯(DSS)、二琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG)、二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST)、戊二醛或者其衍生物。26.權(quán)利要求1的檢測固定的生物學(xué)樣品中至少一種不溶核酸靶的方法，包括(i)將所述樣品與至少一種核酸酶保護(hù)分子(NPM)在足以促進(jìn)所述靶與所述NPM結(jié)合的條件下接觸，所述NPM分子是特異性雜交所述核酸靶的核酸分子，(ii)將所述樣品在有效消除任何未結(jié)合的NPM的條件下暴露于一或多種核酸酶，(iii)任選從所述靶分離結(jié)合的NPM，但是使NPM不與組織結(jié)合，(iv)檢測所述NPM的存在。27.一種定量確定固定的生物學(xué)樣品中至少一種不溶靶的方法，包括(i)將所述樣品與特異性雜交所述核酸靶的至少一種核酸酶保護(hù)分子(NPM)在足以促進(jìn)所述靶與所述NPM結(jié)合的條件下接觸，(ii)將所述樣品在有效消除任何未結(jié)合的NPM的條件下暴露于一或多種試劑，(iii)任選從所述靶分離結(jié)合的NPM，但是使NPA不與組織結(jié)合，(iv)檢測所述NPM的存在。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述不溶靶是交聯(lián)的核酸。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述不溶核酸是交聯(lián)的mRNA、miRNA或者vRNA。30.權(quán)利要求27的方法，其中所述NPM是ssDNA或bDNA或者適體。31.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(ii)中所述試劑包含核酸酶。32.權(quán)利要求27的方法，其中所述NPM是DNA，步驟(ii)中的試劑包含DNAase。33.權(quán)利要求27的方法，其中所述步驟(ii)中的試劑包含SI核酸酶。34.權(quán)利要求27的方法，進(jìn)一步包括在檢測前擴(kuò)增結(jié)合的NPM。35.權(quán)利要求27的方法，其進(jìn)一步包括使用堿和/或加熱以從靶基質(zhì)分離結(jié)合的NPM。36.一種檢測生物學(xué)樣品中可溶和不溶形式的至少一種靶的方法，包括(i)將所述樣品與特異性結(jié)合所述靶的至少一種核酸酶保護(hù)分子(NPM)在足以促進(jìn)所述靶與所述NPM結(jié)合的條件下接觸，(ii)將所述樣品在有效消除任何未結(jié)合的NPM的條件下暴露于一或多種試劑，(iii)任選從所述靶分離結(jié)合的NPM，(iv)檢測所述NPM的存在。37.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶分子不用提取而被檢測。38.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶分子不用增溶而被檢測。39.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括使用靶分子作為模板，通過生物合成技術(shù)產(chǎn)生NPM。40.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將NPM裝配在靶分子上(例如使用PCR型引物)。41.權(quán)利要求1的方法，其包括用特異性結(jié)合所述NPM或者其一部分的探針檢測所述NPM。42.權(quán)利要求26的方法，其包括用特異性結(jié)合所述NPM或者其一部分的探針檢測所述NPM。43.權(quán)利要求27的方法，其包括用特異性結(jié)合所述NPM或者其一部分的探針檢測所述NPM。44.權(quán)利要求36的方法，其包括用特異性結(jié)合所述NPM或者其一部分的探針檢測所述NPM。45.權(quán)利要求27的方法，其包括用特異性雜交所述NPM或者其一部分的探針檢測所述NPM，其中由所述雜交的探針發(fā)射的信號與所述樣品中所述不溶靶的水平是化學(xué)計(jì)量相關(guān)的。46.一種檢測生物學(xué)樣品中至少一種固定的核酸靶的方法，包括(i)將所述樣品與特異性雜交所述靶的至少一種核酸酶保護(hù)分子(NPM)在足以促進(jìn)所述靶與所述NPM結(jié)合的條件下接觸，(ii)將所述樣品在有效消除任何未結(jié)合的NPM的條件下暴露于一或多種核酸酶，(iii)任選從所述靶分離結(jié)合的NPM，(iv)檢測所述NPM的存在。全文摘要本發(fā)明涉及可用于同時(shí)進(jìn)行單一、多個(gè)高效生物學(xué)或化學(xué)測定的組合物、設(shè)備和方法，使用特異性結(jié)合感興趣的表達(dá)的核酸酶保護(hù)分子進(jìn)行。所述核酸酶保護(hù)分子能檢測復(fù)雜的生物學(xué)樣品中的靶，所述樣品包括保存的、固定的、干燥的和/或交聯(lián)的樣品。本發(fā)明的試劑和方法提供了不用溶解或破壞樣品分析復(fù)雜的生物學(xué)樣品中感興趣的靶的有效方法。本發(fā)明也描述了這種方法在臨床和/或診斷應(yīng)用中的用途。文檔編號C12Q1/68GK101809165SQ200880018023公開日2010年8月18日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者B·塞利格曼,I·布特羅斯,M·朗斯維爾,R·馬特爾申請人:高通量基因組學(xué)公司