專利名稱：活化的膠原骨修復(fù)材料及其專用融合活性骨修復(fù)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活化的膠原蛋白骨修復(fù)支架材料及其專用融合活性骨修復(fù)因子。
背景技術(shù)：
由創(chuàng)傷、感染、腫瘤以及發(fā)育異常等原因造成的骨缺損是骨科臨床每天都要面臨的問(wèn)題。人骨多形性蛋白BMP2具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性。它是一個(gè)全長(zhǎng)396個(gè)氨基酸殘基的糖基化蛋白，包括一段由19個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，由263個(gè)氨基酸殘基組成的pro-region以及由114個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽。成熟肽含有7個(gè)半胱氨酸和一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其功能形式是通過(guò)一對(duì)二硫鍵聯(lián)系形成的同型二聚體，每個(gè)單體內(nèi)的其余六個(gè)半胱氨酸形成三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(Wozney，J.M.et al.Novelregulators of bone formationmolecular clones and activities.Science 242，1528-34，1988)。但是天然BMP2含量很少，從人或動(dòng)物骨基質(zhì)中分離純化BMP2具有很大局限性。目前，人們著重研究通過(guò)基因工程的方法制備重組BMP2，以滿足臨床和基礎(chǔ)研究的需要。此外，功能類似于BMP2其它的可以誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子還包括BMP3，PDGF，F(xiàn)GF，EGF，TGF，VEGF，NGF，NT3/4等。
膠原材料是常用的骨修復(fù)材料。膠原是骨的主要有機(jī)成分，I型膠原及其交聯(lián)纖維結(jié)構(gòu)是骨細(xì)胞外基質(zhì)中最豐富的蛋白。膠原結(jié)構(gòu)對(duì)礦物沉積具有誘導(dǎo)作用，其表面含有礦物沉積的位點(diǎn)，可有效引發(fā)和控制礦化過(guò)程，促進(jìn)骨形成并誘發(fā)至植入物中。傳統(tǒng)的膠原載體是通過(guò)膠原分子的分子結(jié)構(gòu)阻止BMP2成分彌散，維持宿主靶細(xì)胞周圍的BMP2濃度，這樣一方面也要求其孔徑不能太大，但孔徑過(guò)小又不利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，這就需要控制一定的膠原孔徑，給工藝學(xué)上帶來(lái)一定難度。另一方面，使用目前的生物材料作為BMP2的載體，BMP2的用量很大，往往要達(dá)到毫克級(jí)(Kirker-Head，C.A.，Gerhart，T.N.，Armstrong，R.，Schelling，S.H.& Carmel，L.A.Healingbone using recombinant human bone morphogenetic protein 2 and copolymer.ClinOrthop Relat Res，205-17(1998)；Kokubo，S.et al.Bone regeneration byrecombinant human bone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradablecarrier in a rabbit ulnar defect model.Biomaterials 24，1643-51(2003))。由于目前市場(chǎng)上BMP2很昂貴，僅sigma公司用于實(shí)驗(yàn)研究的BMP2，每10μg售價(jià)達(dá)500美元，國(guó)內(nèi)病人很少能負(fù)擔(dān)起B(yǎng)MP2的使用費(fèi)用，另外，幾毫克的BMP2，相當(dāng)于從一頭牛抽提的BMP2總和，而且這樣大量地使用BMP2，安全性也很令人擔(dān)憂。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活化的膠原骨修復(fù)材料及其專用融合活性骨修復(fù)因子。
本發(fā)明所提供的專用融合活性骨修復(fù)因子，是在修復(fù)因子的氨基端(N端)或羧基端(C端)融合vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(collagen binding domain，CBD)得到的融合蛋白；所述vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由10-30個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1。
所述修復(fù)因子可為BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4等可以誘導(dǎo)組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的因子，優(yōu)選為BMP2。
序列表中的SEQ ID №1由10個(gè)氨基酸殘基組成。
其中，在BMP2的N端融合vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域得到的融合活性骨修復(fù)因子可具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQ ID №2由162個(gè)氨基酸殘基組成，其vWF因子膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守序列為自氨基端第22-31位氨基酸殘基；編碼此融合活性骨修復(fù)因子的DNA序列為序列表中的SEQ ID №3，序列表中的SEQ ID №3由486個(gè)堿基組成。
上述融合蛋白可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種活化的膠原骨修復(fù)材料。
本發(fā)明所提供的活化的膠原骨修復(fù)材料，是加載有上述專用融合活性骨修復(fù)因子的膠原蛋白。
所述專用融合活性骨修復(fù)因子的加載量為1-4000pmol蛋白/mg膠原蛋白。
本發(fā)明提供了一種活化的膠原骨修復(fù)材料及其專用融合活性骨修復(fù)因子。該專用融合活性骨修復(fù)因子是通過(guò)基因工程的方法在BMP2等修復(fù)因子的氨基端或羧基端融合膠原結(jié)合區(qū)CBD，以加強(qiáng)修復(fù)因子與膠原的結(jié)合，在修復(fù)因子與膠原蛋白之間建立一種較強(qiáng)的物理化學(xué)力，即可將BMP2等修復(fù)因子固定在膠原蛋白支架上，從而顯著提高骨損傷的修復(fù)能力，同時(shí)也可以大大減少BMP2等修復(fù)因子的用量，并降低了使用風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并將在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域特別是骨損傷的修復(fù)中發(fā)揮巨大作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為對(duì)經(jīng)純化的表達(dá)蛋白的15％SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖2為對(duì)經(jīng)純化后復(fù)性的表達(dá)蛋白的15％SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖3為濃度逐漸遞增的天然BMP2及專用融合活性骨修復(fù)因子rhBMP2-v與膠原蛋白結(jié)合量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖4為專用融合活性骨修復(fù)因子rhBMP2-v的細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果圖5為用天然BMP2及專用融合活性骨修復(fù)因子rhBMP2-v進(jìn)行的異位骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組包埋物的大體觀察結(jié)果圖6為用天然BMP2及專用融合活性骨修復(fù)因子rhBMP2-v進(jìn)行的異位骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠植入材料的組織學(xué)切片觀察結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、專用融合活性骨修復(fù)因子的制備及其活性鑒定一、專用融合活性骨修復(fù)因子的制備1、專用融合活性骨修復(fù)因子原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)已知的人BMP2(hBMP2)的cDNA序列(GenBank號(hào)為650)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并在正向引物中引入vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)“WREPSFCALS”(序列表中的SEQ ID №1)的編碼序列，引物序列如下hBMP2F15’-TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC-3’hBMP2F25’-CGCCATATGTGGCGTGAACCGAGCTTCATGGCTCTGAGCGGTACCGGTAGC-3’hBMP2R5’-CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3’以人BMP2 cDNA全長(zhǎng)為模板，在引物hBMP2F1和hBMP2R的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，30μl PCR反應(yīng)體系為正、反向引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶3ul；PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度約400bp的DNA片段。對(duì)該片段進(jìn)行回收并純化后，作為第二次PCR的模板，再在引物hBMP2F2和hBMP2R的引導(dǎo)下進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果得到一條長(zhǎng)度約430bp的條帶，對(duì)其進(jìn)行回收并純化后，用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的原核表達(dá)載體pET-28a(Novagen)在16℃下，用T4DNA連接酶連接12-24小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，對(duì)該表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)區(qū)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果插入序列與預(yù)期序列相符，具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由486個(gè)堿基組成，編碼序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，包括CBD區(qū)，linker區(qū)和hBMP2成熟肽編碼區(qū)，在插入?yún)^(qū)前還融合一段組氨酸親和標(biāo)簽，其CBD區(qū)的保守序列為序列表中SEQ ID №2白氨基端第22-31位氨基酸殘基，linker區(qū)為自氨基端第34-46位氨基酸殘基，hBMP2成熟肽為自氨基端第49-162位氨基酸殘基，表明得到了正確的含有專用融合活性骨修復(fù)因子編碼序列的重組質(zhì)粒，命名為pET-28a-BMP2-v。
2、專用融合活性骨修復(fù)因子的原核表達(dá)將步驟1構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a-BMP2-v轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將篩選到的陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，再以2％接種比例轉(zhuǎn)接于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時(shí)至OD600值達(dá)到0.8，加入終濃度為1mM的IPTG，相同條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，用PBS洗滌后再次離心收集菌體，用10mL PBS重懸菌體，超聲破碎菌體，對(duì)裂解液進(jìn)行15％ SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明得到了蛋白粗提液，表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在。
3、專用融合活性骨修復(fù)因子的純化和復(fù)性首先將步驟2經(jīng)超聲破碎的菌體離心收集包涵體。將稀釋復(fù)性得到的蛋白溶液進(jìn)行超濾濃縮處理，然后將蛋白質(zhì)溶劑體系用50mM MES緩沖液(購(gòu)自GIBCO公司)置換，冷凍干燥后低溫保存。對(duì)經(jīng)純化和復(fù)性的表達(dá)蛋白進(jìn)行15％ SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(泳道M為Marker，泳道1為作為陰性對(duì)照的大腸桿菌BL21(DE3)的全菌蛋白，泳道2和泳道3分別為轉(zhuǎn)化有載體pET-28a-BMP2和pET-28a-BMP2-v的轉(zhuǎn)化子的全菌蛋白，泳道4和泳道5分別為經(jīng)純化的pET-28a-BMP2和pET-28a-BMP2-v轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物(還原條件下))，泳道4和泳道5的純化結(jié)果表明表達(dá)的目的蛋白已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)純度。重組蛋白的復(fù)性效果如圖2所示(泳道1為純化后經(jīng)復(fù)性的pET-28a-BMP2-v轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)物)，由于BMP2的活性形式是通過(guò)一對(duì)二硫鍵形成的二聚體形式，在非還原條件下可看到其二聚體條帶，圖2的檢測(cè)結(jié)果表明復(fù)性形成的二聚體已達(dá)到30％，將此經(jīng)純化的專用融合活性骨修復(fù)因子命名為rhBMP2-v。
二、專用融合活性骨修復(fù)因子的膠原結(jié)合活性鑒定檢測(cè)等量膠原對(duì)不同量天然BMP2及專用融合活性骨修復(fù)因子的結(jié)合量，具體方法為將濃度逐漸遞增的天然BMP2及步驟一制備的專用融合活性骨修復(fù)因子加載在用等量的膠原材料制備的膠原膜上，充分吸附后，經(jīng)PBS洗滌掉不能結(jié)合的蛋白，通過(guò)測(cè)定與融合標(biāo)簽結(jié)合的抗體所產(chǎn)生的特異可定量的顏色反應(yīng)得到蛋白結(jié)合量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3所示(橫坐標(biāo)為蛋白加載量，縱坐標(biāo)為在405納米測(cè)定的吸光值)，在相同的蛋白加載量情況下，經(jīng)改造得到的rhBMP2-v的保留量明顯高于天然BMP2(rhBMP-2)，即前者的結(jié)合效率明顯高于后者。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)改造的BMP2對(duì)膠原的結(jié)合能力比天然BMP2顯著增強(qiáng)。
三、專用融合活性骨修復(fù)因子的細(xì)胞活性檢測(cè)BMP2對(duì)細(xì)胞的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Hiraki通過(guò)體細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMP2對(duì)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1有強(qiáng)烈刺激作用，用100ng/mL BMP2能使這種細(xì)胞的ALPase(堿性磷酸酶)活性增加5-20倍(Hiraki，Y.et al.Bone morphogeneticproteins(BMP-2 and BMP-3)promote growth and expression of the differentiatedphenotype of rabbit chondrocytes and osteoblastic MC3T3-E1 cells in vitro.J Bone Miner Res 6，1373-85(1991).)，此外，其對(duì)成肌細(xì)胞C2C12也具有強(qiáng)烈地轉(zhuǎn)分化作用，可以抑制其向肌細(xì)胞方向分化轉(zhuǎn)而向成骨細(xì)胞方向分化?，F(xiàn)使用小鼠成肌細(xì)胞系C2C12(購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù))對(duì)步驟一制備的專用融合活性骨修復(fù)因子的體外活性進(jìn)行檢測(cè)，方法為用不同濃度的rhBMP2-v刺激C2C12細(xì)胞，作用三天后檢測(cè)ALPase的活性，陽(yáng)性對(duì)照組采用的是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的rhBMP-2(購(gòu)自Sigma公司)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組是不帶有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然BMP2(rhBMP-2)，結(jié)果如圖4所示(橫坐標(biāo)為蛋白濃度，縱坐標(biāo)為ALPase活性)，隨著rhBMP2-v濃度劑量的升高，ALPase活性也隨之升高，顯示出劑量依賴效應(yīng)，且經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組都存在極顯著差異(P＜0.05)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)稀釋復(fù)性的專用融合活性骨修復(fù)因子具有較高的生物活性。
實(shí)施例2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)—異位骨誘導(dǎo)體內(nèi)檢測(cè)BMP2誘骨活性大多采用經(jīng)典的異位成骨的方法，即將BMP2植入骨組織以外的異位組織中，植入后不同時(shí)間做組織學(xué)切片、X-線照相等檢查，觀察其在該組織中的誘骨活性(Wozney，J.M.et al.Novel regulators of bone formationmolecular clones and activities.Science 242，1528-34(1988).；Urist，M.R.Boneformation by autoinduction.1965.Clin Orthop Relat Res，4-10(2002).)。
本實(shí)施例采用上述相同的方法對(duì)天然BMP2及實(shí)施例1制備的專用融合活性骨修復(fù)因子的進(jìn)行活性測(cè)定，具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下首先取牛骨，剔除軟組織，經(jīng)脫脂脫鈣后將其制成1cm×0.5cm×0.5cm的立方體，再經(jīng)酸及酶處理，冷凍干燥后備用。
實(shí)驗(yàn)分三組天然BMP2(rhBMP-2)組、專用融合活性骨修復(fù)因子rhBMP2-v組和對(duì)照組。取上述冷凍干燥后的脫鈣骨膠原材料，每mg膠原加載200pmol蛋白，對(duì)照組不加載任何蛋白，冷凍干燥后備用。
選用成年雄性SD大鼠，背部皮下包埋制備好的上述加載不同蛋白的膠原材料塊。包埋4周后，取出包埋物，切片并進(jìn)行HE染色，大體觀察結(jié)果如圖5所示(比例尺5毫米)，圖5中的A圖是沒(méi)有加載任何蛋白的對(duì)照組植入的植入的膠原材料塊，可見(jiàn)包埋物已部分降解，整體變薄變軟；B圖是實(shí)驗(yàn)組植入的加載天然BMP2的膠原材料塊，由于rhBMP-2本身具有異位誘骨能力，將其加載在膠原材料上，通過(guò)膠原結(jié)構(gòu)在一定程度上阻止了rhBMP-2成分地?cái)U(kuò)散，啟動(dòng)了一定的骨化過(guò)程，誘導(dǎo)了少量間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞分化，因而分泌出少量膠原基質(zhì)和鈣離子沉積于材料之上，表觀的表現(xiàn)是包埋物比陰性對(duì)照組厚，其降解速度也變慢；C圖是實(shí)驗(yàn)組植入的加載rhBMP2-v的膠原材料塊，改造過(guò)的rhBMP2-v與膠原有特異的結(jié)合作用，作用力較強(qiáng)，植入體內(nèi)不易擴(kuò)散稀釋，始終在作用位點(diǎn)保持較高的濃度，誘導(dǎo)大量間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞分化，分化形成的骨系細(xì)胞又可以分泌出大量新的膠原基質(zhì)和鈣離子沉積在原有膠原材料上，原有膠原材料降解釋放出的rhBMP2-v又有部分可能結(jié)合在新形成的膠原上，其表觀表現(xiàn)是材料塊的降解速度變慢，大小變化不明顯。而且由于大量鈣離子的沉積作用，材料更硬。上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)組植入材料的組織學(xué)切片觀察結(jié)果如圖6所示，圖6中的A圖是沒(méi)有加載任何蛋白的對(duì)照，沒(méi)有任何骨形成的跡象，只是膠原材料的形態(tài)特征；B圖是加載天然BMP2的實(shí)驗(yàn)組，成骨效果亦不明顯；C、D圖(比例尺50μm)是加載rhBMP2-v的實(shí)驗(yàn)組，可見(jiàn)在膠原材料的邊緣開(kāi)始有骨組織形成，箭頭所指為新生成骨組織結(jié)構(gòu)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加載專用融合活性骨修復(fù)因子的經(jīng)活化的膠原材料的異位誘骨效果明顯優(yōu)于對(duì)照。
序列表<160>3<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Trp Arg Glu Pro Ser Phe Cys Ala Leu Ser1 5 10<210>2<211>162<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Trp Arg Glu Pro Ser Phe Met Ala Leu Ser Gly20 25 30Thr Gly Thr Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Val Asp35 40 45Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg
50 55 60His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile65 70 75 80Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro85 90 95Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln100 105 110Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val115 120 25Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu130 135 140Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly145 150 155 160Cys Arg<210>3<211>486<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atgtggcgtg aaccgagctt catggctctg agcggtaccg gtagcgcggg cagtgctgcg 120ggttctggcg gtgtcgacca agccaaacac aaacagcgga aacgccttaa gtccagctgt 180aagagacacc ctttgtacgt ggacttcagt gacgtggggt ggaatgactg gattgtggct 240cccccggggt atcacgcctt ttactgccac ggagaatgcc cttttcctct ggctgatcat 300ctgaactcca ctaatcatgc cattgttcag acattggtca actctgttaa ctctaagatt 360cctaaggcat gctgtgtccc gacagaactc agtgctatct cgatgctgta ccttgacgag 420aatgaaaagg ttgtattaaa gaactatcag gacatggttg tggagggttg tggttgtcgt 480taatag48權(quán)利要求
1.專用骨融合活性修復(fù)因子，是在修復(fù)因子的氨基端或羧基端融合vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域得到的融合蛋白；所述vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由10-30個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用融合活性骨修復(fù)因子，其特征在于所述修復(fù)因子為BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的專用融合活性骨修復(fù)因子，其特征在于所述修復(fù)因子為BMP2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的專用融合活性骨修復(fù)因子，其特征在于所述專用融合活性骨修復(fù)因子具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列；編碼此專用融合活性骨修復(fù)因子的DNA序列為序列表中的SEQ ID №3。
5.活化的膠原骨修復(fù)材料，是加載有權(quán)利要求1所述的專用融合活性骨修復(fù)因子的膠原蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活化的膠原骨修復(fù)材料，其特征在于所述專用融合活性骨修復(fù)因子的加載量為1-4000pmol蛋白/mg膠原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了活化的膠原骨修復(fù)材料及其專用融合活性骨修復(fù)因子。該專用融合活性骨修復(fù)因子，是在修復(fù)因子的氨基端或羧基端融合vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域得到的融合蛋白；所述vWF因子的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由10－30個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，其保守序列為序列表中的SEQ ID №1。活化的膠原骨修復(fù)材料，是加載有上述專用融合活性骨修復(fù)因子的膠原蛋白。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是骨損傷的修復(fù)中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C07K14/51GK1807458SQ20051013279
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者陳冰, 戴建武 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司, 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所