專利名稱：Alr多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝再生增強因子(ALR)多肽。本發(fā)明也涉及這些多肽的應(yīng)用，特別是用于治療疾病狀態(tài)。
背景技術(shù)：
已知肝臟具有驚人的再生能力，肝生長和再生需要多種特異性和非特異性的激素以及其它生長因子。非特異性肝刺激物包括胰島素、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子I(IGF-1)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)。一種肝特異性肝營養(yǎng)(hepatotrophic)生長因子是肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration or ALR)(也稱為肝細胞生長素(HPO))。起初，ALR被鑒定并從大鼠肝刺激物質(zhì)(HSS)中純化得到(Hagiya等.，1994)。
在體內(nèi)和體外研究中，已顯示ALR能增加40％肝部分切除術(shù)(PH)或門腔靜脈分流術(shù)(PCS)所誘導的增殖反應(yīng)。使用?？睡?Eck fistula)試驗獲得了類似的結(jié)果，其中肝門內(nèi)注射ALR所激發(fā)的增殖反應(yīng)勝于門腔靜脈分流術(shù)所引起的輕度肝細胞增生(Polimeno等.，1999)。ALR也能刺激體內(nèi)肝細胞中DNA合成，且已發(fā)現(xiàn)其具有FAD-巰基氧化酶活性，類似于酵母同系物ERV1p，可提供ALR在線粒體基因表達中所起的作用。此外，已顯示ALR特異性受體存在于所有正常和異常的肝細胞中，其是刺激肝細胞增殖所必需的(Wang等.，1997)。
在相當長的一段時間內(nèi)都很清楚，用于包括暴發(fā)性肝功能衰竭的肝病治療的ALR所可能具有的臨床含義(Francavilla等.，1994)。此外，ALR似乎是一種具有重要生理特性的蛋白質(zhì)，并不僅限于肝再生，其作用與存在于活性再生細胞中的細胞核和線粒體轉(zhuǎn)錄物的合成或穩(wěn)定性有關(guān)，特別是與睪丸生殖細胞有關(guān)(Giorda等，1996)。
已從人胎兒肝文庫中分離并克隆出編碼人ALR的cDNA(Giorda等.，1996；Yang等.，1997a)。該cDNA編碼的ALR與大鼠ALR具有87％氨基酸序列同一性，與酵母ERV具有42％氨基酸序列同一性。編碼全長人ALR(hALR)的基因包括一個157個核苷酸的5’非翻譯區(qū)、一個1570個核苷酸的編碼區(qū)和一個86個核苷酸的3’非翻譯區(qū)(Giorda等.，1996；Cheng等.，2000)。HALR包含125個氨基酸，預計分子量為15.1kDa(見圖1)。體外和體內(nèi)研究已顯示重組hALR能刺激肝細胞和肝細胞瘤細胞增殖，還能促進肝細胞的再生和損傷恢復(Yang等.，1997b).
業(yè)已顯示在原核(E.coli)和真核(COS細胞和S.cerevisiae)細胞中重組hALR的表達具有與純化的天然hALR相當?shù)幕钚?。Francavilla等。(美國專利號5,811,397)已報道了另一種人ALR基因(稱為HPO-205)的克隆和表達，該基因編碼205個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有與hALR類似的活性，但在N-末端包含額外的80個氨基酸。
迄今為止，不同肝細胞生長因子的混合物已被用于治療肝病。由于已表明在肝再生和恢復中hALR是一種重要的生長因子，因此特別需要開發(fā)hALR作為一種可行的治療劑或藥物。
本發(fā)明是基于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與其天然型相比，在hALR多肽的N和/或C-末端存在額外的組氨酸殘基能改善hALR的功能特性、特異性和生物活性。這些額外的殘基也對重組hALR的生產(chǎn)特性產(chǎn)生有利的改善，由此開啟了用于治療劑或藥物開發(fā)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種純化的ALR多肽，其中所述多肽包括位于N和/或C末端的一個或多個組氨酸殘基。
在一個實施方案中，所述多肽包括位于N和/或C末端的3-18個組氨酸殘基。所述多肽可包括位于N和/或C末端的12個組氨酸殘基。在一個實施方案中，所述多肽包括位于C末端的12個組氨酸殘基。所述多肽可包含如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，和/或為如SEQ ID NO6所示的核苷酸序列所編碼。
在另一個實施方案中，所述多肽可包括位于N和/或C末端的18個組氨酸殘基，例如位于C末端的18個組氨酸殘基。所述多肽可包含如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列，和/或為如SEQ ID NO8所示的核苷酸序列所編碼。
還在另一個實施方案中，所述多肽可包括位于C末端的6個組氨酸殘基，位于N末端的6個組氨酸殘基和6個位于C末端的組氨酸殘基，或位于N末端的3個組氨酸殘基和位于C末端的9個組氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種純化的ALR多肽，包含如SEQID NOs1或3所示氨基酸序列，或一種包括對如SEQ ID NOs1或3所示序列進行一個或多個取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，其中所述ALR多肽通過在N和/或C末端添加一個或多個組氨酸得到修飾。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種編碼第一或第二方面的多肽的分離的核酸分子。所述核酸分子可包含如SEQ ID NO2或4所示的核苷酸序列，并包括位于5’和/或3’末端的一個或多個組氨酸編碼密碼子。
所述核酸分子可包括位于3’末端的12個組氨酸編碼密碼子。
所述核酸分子可包括位于3’末端的18個組氨酸編碼密碼子。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種包含第三方面的核酸的載體。
任選地，所述核酸能可操作地連接到一個或多個調(diào)節(jié)序列上。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種包含第三方面的核酸或第四方面的載體的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達第一或第二方面的多肽的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了一種選擇性結(jié)合第一或第二方面的多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種用于治療患者的方法，包括給予所述患者治療有效量的第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體、第五或第六方面的宿主細胞或第七方面的抗體的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了一種用于治療或預防患者肝病的方法，其中所述方法包括給予所述患者治療有效量的第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體或第五或第六方面的宿主細胞。
所述肝病可與肝衰竭相關(guān)。
所述肝病可選自包含對乙酰氨基酚毒性(acetaminophentoxicity)、脂肪肝、肝硬化、病毒性肝炎、癌、黃疸、腹水、肝病性口臭、凝血失敗(failure of coagulation)、纖維化、重度肝炎(包括急性肝炎、亞急性肝炎、慢性肝炎)、重度慢性肝炎、非重度肝炎或任何其它類型的肝損傷、肝衰竭或肝病。
根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體或第五或第六方面的宿主細胞在制備用于治療或預防肝病的藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了一種用于刺激患者肝再生的方法，其中所述方法包含給予所述患者治療有效量的第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體或第五或第六方面的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了一種用于刺激肝細胞增殖的方法，其中所述方法包括將一個或多個肝細胞暴露于治療有效量的第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體或第五或第六方面的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，提供了一種用于治療或預防患者肝病的方法，其中所述病癥與ALR升高的水平相關(guān)，且其中所述方法包括給予所述患者治療有效量的第七方面的ALR抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了一種用于抑制肝細胞增殖的方法，其中所述方法包括將一個或多個肝細胞暴露于治療有效量的第七方面的ALR抗體。
根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，提供了一種藥物組合物，包含第一或第二方面的多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體、第五或第六方面的宿主細胞或第七方面抗體。
所述藥物組合物可包含一種或多種添加劑。所述一種或多種添加劑可選自胰島素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-α。通常，所述組合物也包含一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或佐劑。
根據(jù)本發(fā)明的第十六方面，提供了一種用于治療或預防患者生育疾病的方法，其中所述方法包括給予所述患者治療有效量的第一或第二方面的ALR多肽、第三方面的核酸、第四方面的載體或第五或第六方面的宿主細胞。
根據(jù)本發(fā)明的第十七方面，提供了一種用于產(chǎn)生重組ALR的方法，所述方法包括步驟(a)用一個或多個組氨酸編碼密碼子在N-和/或C-末端人工改造ALR編碼多核苷酸；(b)將ALR編碼多核苷酸導入合適的宿主細胞中并在以便在N-和/或C-末端包含一個或多個組氨酸的ALR多肽表達的條件下培養(yǎng)細胞，和(c)純化所述ALR多肽。
通常，當與未修飾的多肽相比時，如此產(chǎn)生修飾的ALR多肽顯示了一種或多種改良的特性。所述特性可選自產(chǎn)量、穩(wěn)定性、溶解性、純度或生物活性，和制備過程中不需要解折疊(變性)和隨后重折疊(復性)；兼且其它方法所獲得的改良的特性，例如其它安基酸修飾或其它方法所獲得的改良的特性。
根據(jù)本發(fā)明的第十八方面，也提供了一種根據(jù)第十七方面的方法所生產(chǎn)的ALR多肽。
根據(jù)本發(fā)明的第十九方面，還提供了一種聚乙二醇(PEG)-修飾的多肽，包含一種如第一、第二或第十八方面所限定的多肽。
根據(jù)本發(fā)明的第二十方面，又提供了一種融合蛋白，包含一種如第一、第二或第十八方面所限定的多肽。
所屬融合蛋白可包含如第一、第二或第十八方面所限定的多肽，其共價連接到另一個多肽，例如白蛋白。
本發(fā)明也涉及根據(jù)上述方面和實施方案的ALR多肽和核酸的變體、衍生物、同系物、類似物和片段。
根據(jù)上述方面和實施方案，所述ALR多肽和核酸可源自任何動物，可利用重組核酸技術(shù)產(chǎn)生。通常，所述ALR是一種哺乳動物ALR，例如，是靈長類、綿羊、牛、犬、貓、豬、馬或鼠源的。優(yōu)選地，所述哺乳動物ALR是人ALR。


本發(fā)明的實施方案現(xiàn)將得到描述，就附圖而言僅作為例證。為了描述連接在ALR每一末端的組氨酸殘基數(shù)目，使用了一種命名法，在此位于N-末端的組氨酸殘基數(shù)目的后面是術(shù)語“ALR”，接著繼之以位于C-末端的組氨酸殘基數(shù)目。舉例來說，0ALR0指一種在N或C末端都沒有組氨酸連接的ALR分子(為ALR的天然型)，以及0ALRl2指一種在N末端沒有組氨酸連接而在C末端連接有12個組氨酸的ALR分子。
圖.1.人肝再生增強因子(ALR)的核苷酸序列(SEQ ID NO2)和氨基酸序列(SEQ ID NO1)。氨基酸序列排列在DNA序列下。
圖.2.含有ALR的表達質(zhì)粒pAED-ALR/0ALR0的構(gòu)建。具有T7啟動子的表達載體pAED4被選作為表達系統(tǒng)。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將NdeI和HindIII限制酶切位點添加到ALR基因的5’和3’末端。接著，將純化的PCR產(chǎn)物連接到pAED4載體的多克隆位點中(NdeI和HindIII)。對所構(gòu)建的質(zhì)粒測序以確證基因序列。
圖.3.0ALR0的PCR產(chǎn)物。用Taq聚合酶試劑盒從人肝5’-stretch plus cDNA文庫中擴增出人ALR(0ALR0)。使用PCR將NdeI和HindIII的限制酶切位點分別添加到N’和C’末端。然后，通過1％瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。泳道M，標記，泳道1，5μl的PCR產(chǎn)物反應(yīng)。觀察到具有-387bp的條帶，表明0ALR0得到成功擴增。
圖.4.多組氨酸標記的ALR衍生物在通過鎳親和層析柱純化后的洗脫圖。將在大腸桿菌宿主BL21(DE3)pLysS中表達的多組氨酸標記的ALR裂解，并通過鎳親和層析柱純化可溶蛋白。在多組氨酸標記的ALR的洗脫圖中觀察到三個峰。第一個峰是用于樣品注射后柱洗滌的起始緩沖液的洗脫液。第二個峰顯示的是在約0.1M咪唑處洗脫的可溶蛋白的非特異性結(jié)合。第三個峰顯示的是多組氨酸標記的ALR的洗脫液。(a)0ALR6，在0.2M咪唑處洗脫出；(b)3ALR9，在0.42M咪唑處洗脫出；(c)6ALR6，在0.45M咪唑處洗脫出；(d)0ALR12，在0.42M咪唑處洗脫出。
圖.5.多組氨酸標記的ALR的SDS-PAGE分析。從200ml培養(yǎng)液中表達蛋白質(zhì)并通過鎳親和層析柱純化。在12％還原SDS-PAGE上加載并分析純化的級分。泳道M，標記，BC，在被加載到S100HR柱上之前的可溶蛋白；FT，穿過，是洗脫圖上第一個峰的洗脫液。(a)0ALR6，3-10級分3-10；(b)3ALR9，3-22級分3-22；(c)6ALR6，3-26級分3-26；(d)0ALR12，3-24級分3-24。約15kDa的條帶是多組氨酸標記的ALR。
圖.6.鎳柱純化后0ALR12的SDS-PAGE分析。在不同緩沖液下，在12％非還原SDS-PAGE中0ALR12的分析。泳道1和3，標記，泳道2，存在于洗脫緩沖液(0.5M NaCl，0.02M磷酸鈉，0.5M咪唑，pH 7.4)中的0ALR12。發(fā)現(xiàn)四種異構(gòu)體15kDa單體，30kDa二聚體，45kDa三聚體，60kDa四聚體。泳道4，按照泳道2，但添加了還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。
圖.7.多組氨酸標記的0ALR6和0ALR12的質(zhì)譜分析(ESI-MS)。(a)0ALR6具有兩個峰，分別是分子量為15848Da和31695Da的單體和二聚體。(b)0ALR12具有分子量分別是16718Da和33436Da的單體和二聚體。這些測量值與計算值相似，對于0ALR6而言相對偏差＜0.02％，對于0ALR12而言＜0.3％。
圖.8.二級結(jié)構(gòu)測定。使用Jasco 810旋光光度計通過圓二色光譜(CD)預測重組ALR的二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)在pH 7.0磷酸鉀中進行緩沖液交換，濃度為0.25μg/ml-0.5μg/ml。通過在波長190nm-250nm范圍內(nèi)進行測量從而測定了光譜。0ALR6和0ALR12的光譜類似于0ALR0，表明這三種蛋白質(zhì)都具有類似的二級結(jié)構(gòu)。
圖.9.多組氨酸標記的ALR的等電聚焦。純化的0ALR0、0ALR6和0ALR12(數(shù)據(jù)未顯示)在水中進行緩沖液交換。然后，在含有兩性電解質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠上進行等電聚焦(IEF)。聚焦完畢，用考馬斯藍G-250對凝膠染色過夜并在7％乙酸中脫色1小時。泳道C，廣范圍校準物，顯示了列于圖中的一些校準蛋白質(zhì)和它們的pI；泳道1，0ALR0；泳道2，0ALR6；泳道3，牛血清白蛋白(BSA)。
圖.10.純化的多組氨酸標記的ALR的光譜。測量350nm-550nm范圍內(nèi)的吸光度。光譜標記如圖所示。該ALR光譜具有FAD部分的特征，但顯示了與游離FAD不同的差異。在360nm和450nm處的兩個最大值是FAD分子吸光度所特有的。對于蛋白質(zhì)樣品而言，該吸光度最大值在450nm范圍內(nèi)漂移約10nm。虛線表示游離FAD最大值的位置。所使用的溶于水中的FAD濃度為7.5μM。
圖.11.0ALR12的FAD含量測定。通過蛋白質(zhì)變性測量結(jié)合FAD的蛋白質(zhì)。通過Bradford測定法測定0ALR12的濃度。將蛋白質(zhì)煮沸30分鐘并添加15％TCA以解離FAD。然后通過離心除去變性蛋白。接著測量解離的FAD在350nm-550nm范圍內(nèi)的光譜。借助于游離FAD標準物，從最高峰的OD值計算得到FAD含量。該結(jié)果顯示每單體單位的蛋白質(zhì)存在約0.8個FAD分子，由此認為每單體單位存在一個FAD分子。
圖.12.ALR的劑量依賴性巰基氧化酶活性。將不同濃度的二硫蘇糖醇和0ALR12溫育。在添加20μM DTNB后，通過在所列時間點利用分光設(shè)備在412nm處檢測消光的減少來測量巰基的氧化作用。對照值標記為(□)。使用的濃度為2pmol(■)；5pmol(▲)；10pmol(*)；20pmol(◇)；40pmol(●)。籍此更高的蛋白質(zhì)濃度、更快的硫醇含量減少，觀察到了濃度劑量效應(yīng)。
圖.13.重組多組氨酸標記的ALR的體外巰基氧化酶活性。將二硫蘇糖醇與10pmol ALR溫育。在添加20μM DTNB后，通過在所列時間點利用分光設(shè)備在412nm處檢測消光的減少來測量巰基的氧化作用。0ALR0，0ALR6和0ALR12值分別標記為(*)，(◇)和(▲)。在相同條件下溫育不含蛋白質(zhì)的相同樣本(◆)或僅含相等量的純FAD(□)。0ALR12的活性類似于0ALR0。相比之下，觀察到0ALR6只具有0ALR12一半的活性。
圖.14.多組氨酸標記的ALR的增殖活性。如圖所示，將HepG2肝細胞與不同濃度的ALR蛋白溫育。溫育2天后，進行MTS測定。相對增殖活性為ALR蛋白與對照物吸光度(即未處理的細胞)的比率。觀察到ALR蛋白具有增殖活性，0ALR12具有最高的活性。
圖.15.0ALR12對HepG2的增殖活性。如圖所示，將HepG2肝細胞與不同濃度的0ALR12溫育。溫育2天后，進行MTS測定。相對增殖活性為ALR蛋白與對照物吸光度(即未處理的細胞)的比率。除0ALR12之外，pHGF也用于比較。一種陰性對照物，BLIP，也示于圖中。
圖.16.0ALR12對MCF7的增殖活性。如圖所示，將MCF7細胞與不同濃度的0ALR12溫育。溫育2天后，進行MTS測定。相對增殖活性為ALR蛋白與對照物吸光度(即未處理的細胞)的比率。除0ALR12之外，pHGF也用于比較。一種陰性對照物，BLIP，也示于圖中。
圖.17.產(chǎn)生0ALR12菌株的發(fā)酵圖。0ALR12在大腸桿菌宿主BL21(DE3)pLysS中表達。監(jiān)測幾個參數(shù)，包括溫度(□)，pH(▲)，攪拌速度(◇)和PO2(○)。隨著發(fā)酵的進行，溫度和pH值趨于穩(wěn)定，分別為37℃和pH 7.0。當PO2開始從85％減少到70％時，攪拌速度從400rpm逐漸增加以便保持PO2(下限為20％)。
圖.18.發(fā)酵產(chǎn)生0ALR12菌株的生長曲線。通過OD600(◆)和生物量(▲)來表示培養(yǎng)生長。通過酶葡萄糖分析儀測定葡萄糖濃度(●)，當細菌細胞進入生長期時，葡萄糖濃度呈指數(shù)式減少。向系統(tǒng)中添加0.5mM IPTG用于誘導ALR表達，當OD600達到13.0時，向系統(tǒng)提供額外的葡萄糖。
圖.19.2升0ALR12發(fā)酵液的洗脫圖。裂解大腸桿菌，通過鎳親和柱純化可溶蛋白。從洗脫圖中觀察到兩個峰。第一個峰顯示的是在約0.1M咪唑處洗脫出來的非特異性可溶蛋白。第二個峰顯示的是含有0ALR12蛋白的洗脫液。
圖.20.通過鎳親和柱純化后0ALR18的洗脫圖。從洗脫圖中觀察到兩個峰。第一個峰是用于樣品注射后洗柱的起始緩沖液的洗脫液。第二個峰顯示的是在約0.1M咪唑處洗脫出來的非特異性結(jié)合的可溶蛋白。
圖21.0ALR18的溶解性分析。通過12％SDS-PAGE分析0ALR18的不同部分以研究其溶解性。泳道M，標記；TP，包括不溶和可溶部分的總蛋白；I，細胞裂解的不溶蛋白；BC，在加載到鎳柱前的可溶蛋白；FT，穿過液，其是洗脫圖中第一個峰的洗脫液；F2，級分2，在約0.1M咪唑處洗脫出來的非特異性結(jié)合的可溶蛋白；10-17，級分10-17。約15kDa的條帶是0ALR18。
定義本文使用的術(shù)語“多肽”指一種由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成的聚合物，并包括其片段或類似物。在本文中，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，雖然對于本發(fā)明來說，“多肽”可構(gòu)成全長蛋白質(zhì)的一部分。
本文使用的術(shù)語“核酸分子”指一種脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基、天然核苷酸的已知類似物或它們的混合物的單或雙鏈聚合物。除非另有指明，該術(shù)語包括所涉及的特定序列及其互補序列。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”可在本文中互換使用。應(yīng)當理解的是，本文使用的與核酸分子相關(guān)的“5’末端”相應(yīng)于編碼多肽N-末端的核酸分子，而“3’末端”相應(yīng)于編碼多肽的C-末端。
術(shù)語“純化的”指所討論的物質(zhì)已離開其自然環(huán)境或宿主，及相關(guān)的雜質(zhì)減少或消除使得所討論的分子是存在的占優(yōu)勢物種。因此，實質(zhì)上，術(shù)語“純化的”指目的物種是存在的占優(yōu)勢物種(即.，在摩爾基礎(chǔ)上，在組合物中其較任何其它單獨物種為更多)，且優(yōu)選地，基本上純化的級分是一種組合物，其中所述目的物種包含至少約30％(在摩爾基礎(chǔ)上)的所有存在的大分子物種。一般來說，基本上純的組合物應(yīng)包含大于約80-90％的所有存在于組合物中的大分子物種。最優(yōu)選地，目的物種被純化至基本同種(通過常規(guī)檢測方法無法檢測到組合物中的污染物種)，其中組合物基本上由單一大分子物種組成。術(shù)語“純化的”和“分離的”可互換使用。
本文使用的術(shù)語“變體”指基本上相似的序列。通常，多肽或多核苷酸序列變體共同具有定性的生物活性。此外，這些多肽或多核苷酸序列變體可共有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。也包括于該術(shù)語“變體”含義內(nèi)的是本發(fā)明多肽或多核苷酸的同系物。同系物通常是來自不同物種的多肽或多核苷酸，但基本上與于此所公開的相應(yīng)的多肽或多核苷酸共有相同的生物功能或活性。
因此，本文使用的術(shù)語“變體”可指由編碼ALR核酸所產(chǎn)生的多肽，但不同于野生型ALR，是由于其經(jīng)過不同的加工過程以致于具有改變的氨基酸序列。例如，可通過產(chǎn)生野生型ALR的初級RNA轉(zhuǎn)錄物的選擇剪接以產(chǎn)生變體。
術(shù)語“片段”指多肽或編碼組分的多核苷酸分子或是本發(fā)明多肽或多核苷酸或其變體的組分。通常片段具有與其所組成的多肽或多核苷酸相同的定性生物活性。肽片段長度可為約5至約150個氨基酸，約5至約100個氨基酸，約5至約50個氨基酸，約5至約25個氨基酸?；蛘?，肽片段長度可為約5至約15個氨基酸。因此，術(shù)語“片段”指組成全長ALR多肽并具有與全長ALR多肽相同的定性生物活性的多肽分子。所述片段可源自全長ALR多肽或通過一些其它方法合成得到，例如化學合成法。
因此，術(shù)語“片段”也可以指編碼組分的核酸分子或是本發(fā)明多核苷酸的組分。多核苷酸片段并不一定需要編碼保留生物活性的多肽。例如，片段亦可用作為雜交探針或PCR引物。片段可源自本發(fā)明的多核苷酸或通過一些其它方法得到合成，例如化學合成法。使用本領(lǐng)域公知技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸及其片段也可用于制備反義分子。
本文使用的與多肽相關(guān)的術(shù)語“類似物”指一種多肽，其是本發(fā)明多肽的衍生物，該衍生物包含一個或多個氨基酸的添加、缺失、取代，如此以致該多肽基本上保持與上述鑒定的ALR多肽相同的功能。
本文使用的術(shù)語“保守的氨基酸取代”指多肽鏈(蛋白質(zhì)的一級序列)中一個氨基酸為另一個具有相似性質(zhì)的氨基酸所取代或置換。例如，帶電荷的氨基酸谷氨酸(Glu)為相似的帶電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)所取代應(yīng)為保守的氨基酸取代。
本文使用的術(shù)語“基本上”指大多數(shù)但未必是全部，并因此對于一種修飾的多肽“基本上”缺少相應(yīng)的野生型多肽的組成區(qū)域而言，該修飾的多肽可保留部分該組成區(qū)域。例如，“基本上”缺少相應(yīng)野生型多肽的組成區(qū)域的修飾的多肽可保留約50％或更少的所述組成區(qū)域的序列，盡管由于省略了該區(qū)域序列的部分而通常使得該組成區(qū)域在結(jié)構(gòu)上和/或功能上失活。
本文使用的術(shù)語“治療”指無論以何種方式醫(yī)治疾病狀態(tài)或癥狀、預防疾病產(chǎn)生或相反地預防、阻礙、延遲或逆轉(zhuǎn)疾病進展或其它不希望的癥狀的任何或所有的用法。
本文使用的術(shù)語“治療有效量”包括于其含義中的是提供所需治療效果的藥劑或化合物的非毒性但足夠的量。所需的確切量可依患者而不同，取決于象被治療的物種、患者的年齡和一般狀況、被治療病癥的嚴重程度、要給予的某種藥劑以及給藥方式等這樣的因素。因此，不可能確定精確的“有效量”。但是，對于任何特定的病例而言，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)的實驗方法就能確定合適的“有效量”。
在該說明書上下文中，術(shù)語“包含”指“大體上包括，但無需完全包括”。此外，術(shù)語“包含(comprising)”的變體，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”也具有相應(yīng)變化的含義。
具體實施例方式
本發(fā)明是基于令人驚奇和意料不到的發(fā)現(xiàn)，即與ALR天然型相比，存在額外的組氨酸殘基顯著改善了其功能特性、特異性和生物活性。
根據(jù)與FAD依賴型巰基氧化酶Erv2p的序列同源性，發(fā)明人確定了ALR的N-末端和C-末端都位于表面并因此暴露，適合于進行潛在的修飾。因此，發(fā)明人將多組氨酸(-His)殘基添加至兩個暴露末端的任一端上，看來似乎并不引起ALR多肽結(jié)構(gòu)和/或功能的破壞。更重要的是，組氨酸側(cè)鏈是極性且親水的，因此將多組氨酸殘基添加到ALR增加了重組表達的ALR蛋白的溶解性，減少了包涵體的形成并提高了ALR的穩(wěn)定性和生物活性。
因此，本發(fā)明提供了純化的ALR多肽，其中所述多肽包括一個或多個位于N和/或C末端的組氨酸殘基。在ALR多肽的一個實施方案中，包含SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。在另一個實施方案中，ALR多肽包含SEQ ID NO7所示的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供了純化的ALR多肽，包含SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列或包含對SEQ ID NO1或3所示的序列進行一個或多個取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，其中ALR多肽通過在N和/或C末端添加一個或多個組氨酸殘基而得到修飾。
本發(fā)明進一步提供了分離的編碼上述ALR多肽的核酸分子。所述核酸分子可包含SEQ ID NO2或4所示的核苷酸序列并在5’和/或3’末端包括一個或多個組氨酸編碼密碼子，相應(yīng)于在所編碼多肽的N和/或C末端添加一個或多個組氨酸殘基。例如，在C末端包含12個組氨酸殘基的本發(fā)明的ALR多肽可為包含SEQ ID NO6所示序列的多核苷酸所編碼?；蛘撸贑末端包含18個組氨酸殘基的本發(fā)明的ALR多肽可為包含SEQ ID NO8所示序列的多核苷酸所編碼。
此外，本發(fā)明提供了包含上述核酸分子的載體和宿主細胞，提供了表達上述ALR多肽的宿主細胞，以及提供了選擇性結(jié)合上述ALR多肽的抗體。
本發(fā)明也提供了用于制備修飾的重組ALR多肽的方法，包括步驟(a)用一個或多個組氨酸編碼密碼子在N-和/或C-末端人工改造ALR編碼多核苷酸；(b)將ALR編碼多核苷酸導入合適的宿主細胞中并在以便在N-和/或C-末端包含一個或多個組氨酸的ALR多肽表達的條件下培養(yǎng)細胞；和(c)純化修飾的重組ALR多肽。
通常，當與未修飾多肽相比時，這樣所制備的修飾ALR多肽顯示了一種或多種改良的特性。所述特性可選自產(chǎn)量、穩(wěn)定性、溶解性、純度或生物活性。
本發(fā)明也提供了根據(jù)上述方法制備的ALR多肽。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過添加多組氨酸所修飾的重組ALR較天然ALR和未修飾的重組ALR具有許多優(yōu)點。例如，根據(jù)本發(fā)明實施方案修飾的ALR較天然ALR具有改良的功能特性、特異性及生物活性。而且，這些額外的殘基對重組ALR的制備特性也產(chǎn)生了有利的改善，因此開辟了用于治療劑開發(fā)的方法。具體而言，添加組氨酸殘基至ALR的N和/或C末端，利于使用金屬親和柱層析法進行親和純化，從而增加了重組ALR的回收率和純度。如本文所例證，該方法使重組ALR的回收達到約98％的純度。與其天然型相比，多組氨酸殘基也有利于ALR的功能特性、特異性和生物活性，純化后組氨酸標記無需去除。此外，添加多組氨酸殘基至ALR也是避免表達的ALR多肽解折疊(變性)和隨后重折疊(復性)的必要條件。
而且，根據(jù)本發(fā)明實施方案修飾的ALR在表達時是穩(wěn)定的，因此構(gòu)象完整性和生物活性得到保留。也已顯示多組氨酸殘基能增加重組ALR溶解性。其對于已報道的無組氨酸標記的ALR蛋白在大腸桿菌中不溶解，即形成包涵體，具有明顯優(yōu)勢。此外，多組氨酸殘基并不干擾ALR的分泌且?guī)缀鯚o免疫原性，因此該方法所制備的重組ALR可被使用而無需事先去除多組氨酸殘基。
與其天然型相比，本發(fā)明ALR多肽所改善的功能特性、特異性和生物活性以及重組ALR制備方法的改良，為ALR治療劑的開發(fā)鋪平了道路。
多肽如本文所公開，本發(fā)明涉及ALR多肽，與相應(yīng)的野生型ALR多肽相比包含一個或多個組氨酸添加物。例如，所述多肽在N和/或C-末端可包含1-20、2-18、4-16或6-14個組氨酸殘基。優(yōu)選地，在N和/或C末端所述組氨酸添加物包含3-18個組氨酸殘基，更優(yōu)選地，在N和/或C末端所述組氨酸添加物包含12-18個組氨酸殘基，以及最優(yōu)選地，在N和/或C末端所述組氨酸添加物包含12或18個組氨酸殘基。優(yōu)選地，所述野生型ALR是來源自真核生物的任何ALR多肽，更優(yōu)選地為哺乳動物ALR，最優(yōu)選地為人ALR。野生型人ALR的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。編碼野生型ALR的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，或為顯示足夠的序列同一性并與SEQ ID NO2序列雜交的序列。本文使用的涉及ALR多肽的術(shù)語“野生型”包括以其天然型存在的多肽。
可選地，野生型ALR多肽為HPO-205型ALR，包含如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。HPO-205型野生型ALR的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，或為顯示足夠的序列同一性并與SEQ ID NO4序列雜交的序列。
如本文所公開，本發(fā)明的ALR多肽可包含其片段、類似物或變體，包含一個或多個氨基酸插入、缺失或取代。因此，通過在N-和/或C-末端添加、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基所修飾的ALR多肽也落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的重組DNA和分子生物學標準技術(shù)制備ALR多肽。技術(shù)指導可獲得自，例如，象Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York，1989和Ausubel等.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences，1992這樣的權(quán)威教科書。A可通過利用一種或多種諸如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶的蛋白酶消化多肽制備ALR肽?？赏ㄟ^如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)來純化所消化的肽片段。
本發(fā)明的ALR多肽及其片段、類似物和變體也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的液相或固相化學標準方法合成得到。例如，上述分子可用Steward和Young的固相化學方法合成(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis.(第2版.)Pierce ChemicalCo.，Illinois，USA(1984)。
一般而言，這樣的合成方法包含依次添加一個或多個氨基酸或合適的保護的氨基酸至生長的肽鏈上。優(yōu)選地，第一個氨基酸的氨基或羧基基團為合適的保護基團所保護。然后，通過添加具有進行了合適地保護的互補(氨基或羧基)基團的序列中下一個氨基酸并在適于形成酰胺鍵的條件下，將所保護的氨基酸連接到惰性載體上或應(yīng)用于溶液中。然后，從新添加氨基酸殘基上除去保護基團并添加下一個(保護的)氨基酸，等等。在所有所需氨基酸都已連接后，依次或同時除去任何殘留的保護基團以及必要時的任何載體以制備目的多肽。
可通過相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)實現(xiàn)ALR多肽的氨基酸改變。例如，可通過核苷酸置換技術(shù)實現(xiàn)氨基酸改變，該技術(shù)包括核苷酸(保守和/或非保守)添加、缺失或取代，附帶條件是要保持正確的閱讀框。例證性的技術(shù)包括隨機誘變、定向誘變、寡核苷酸介導或多核苷酸介導的誘變、通過使用現(xiàn)有的或人工改造的限制性內(nèi)切酶位點進行的選擇區(qū)域的缺失，以及聚合酶鏈反應(yīng)。
多核苷酸本發(fā)明的實施方案提供了分離的編碼上述ALR多肽的多核苷酸，以及該多核苷酸的變體和片段。如上所述，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多核苷酸在各種治療應(yīng)用中的用途。
本發(fā)明也涉及基于本發(fā)明多核苷酸序列的寡核苷酸或片段，其用作為引物或探針。寡核苷酸是適用于諸如PCR的核酸擴增反應(yīng)的核苷酸殘基的一段短序列，優(yōu)選地，長度為至少約10個核苷酸至約50個核苷酸，更優(yōu)選地，長度為約15個核苷酸至約30個核苷酸。探針是可變長度的核苷酸序列，例如在約10個核苷酸至幾千個核苷酸之間，通常是通過雜交用于檢測同源序列。序列間同源性(序列同一性)的水平主要是通過雜交條件的嚴格性得到確定。特別是用作為探針的核苷酸序列可在低嚴格條件、中等嚴格條件或高嚴格條件下與本文所公開的多核苷酸的同源物或其它變體雜交。低嚴格雜交條件相應(yīng)于雜交在50℃下于2xSSC中進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知許多可用于改變雜交嚴格性的條件和因素。舉例來說，要被雜交至給定核酸的核酸的長度和性質(zhì)(DNA，RNA，堿基組成)；鹽濃度和其它成分，例如甲酰胺、葡聚糖硫酸酯、聚乙二醇等存在與否；以及雜交和/或洗滌步驟的溫度改變。例如，雜交濾紙可在2X SSC、0.5％SDS中，并在至少55℃(低嚴格性)、至少60℃(中等嚴格性)、至少65℃(中等/高嚴格性)、至少70℃(高嚴格性)或至少75℃(非常高嚴格性)下洗滌兩次，每次30分鐘。
在具體的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可被克隆入載體中。所述載體可以是質(zhì)粒載體、病毒載體和/或表達載體或任何其它適用于外源序列插入、導入宿主細胞和表達所導入序列的合適載體。通常，所述載體是真核表達載體，可包括表達控制和加工序列，例如啟動子、增強子、核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列。
抗體本發(fā)明提供了選擇性結(jié)合本發(fā)明ALR多肽的抗體及其片段和類似物。合適的抗體包括，但不限于多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和Fab表達文庫。本發(fā)明的抗體可作為ALR多肽或其片段、變體或類似物的激動劑和拮抗物。
優(yōu)選地，抗體制備自本發(fā)明ALR多肽的不連續(xù)區(qū)域或片段，具體而言是涉及給予治療活性和/或配體或底物結(jié)合的那些。抗原性ALR多肽包含至少約5個，優(yōu)選至少約10個氨基酸。
制備合適抗體的方法可為本領(lǐng)域技術(shù)人員所容易意識到。例如，一種抗-ALR單克隆抗體，通常包含F(xiàn)ab部分，可使用Antibodies-ALaboratory Manual，Harlow和Lane，編.，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.(1988)中所描述的雜交瘤技術(shù)制備。
實質(zhì)上，在制備抗本發(fā)明ALR多肽及其片段、變體或類似物的單克隆抗體過程中，任何提供用于通過培養(yǎng)傳代細胞系制備抗體分子的技術(shù)皆可使用。這些技術(shù)包括最初由Kohler等.，Nature，256495-497(1975)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及三源雜交瘤技術(shù)、人B-細胞雜交瘤技術(shù)[Kozbor等，Immunology Today，472(1983)]和用于制備人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)[Cole等.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.，(1985)]。永生的、抗體產(chǎn)生細胞系可通過除了融合之外的技術(shù)進行創(chuàng)建，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞或用EB病毒轉(zhuǎn)染。參見，如.，M.Schreier等.，″Hybridoma Techniques″(1980)；Hammerling等.，″MonoclonalAntibodies and T-cell Hybridomas″(1981)；Kennett等.，″Monoclonal Antibodies″(1980)。
總之，對于制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的方法而言，將骨髓瘤或自持(self-perpetuating)細胞系與獲得自哺乳動物脾的淋巴細胞融合，所述淋巴細胞為其識別因子結(jié)合部分、或識別因子或其復制起點特異性DNA結(jié)合部分所超免疫。產(chǎn)生用于實施本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤通過其與本發(fā)明識別因子進行免疫反應(yīng)的能力以及其抑制靶細胞中特定的轉(zhuǎn)錄活性的能力而得到鑒定。
用于實施本發(fā)明的單克隆抗體可通過啟動單克隆雜交瘤培養(yǎng)得到制備，所述培養(yǎng)物包含營養(yǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有分泌具有合適的抗原特異性的抗體分子的雜交瘤。培養(yǎng)維持在足以使得雜交瘤將抗體分子分泌入培養(yǎng)基的條件和時間下。然后收集含有抗體的培養(yǎng)基。接著通過眾所周知的技術(shù)進一步分離抗體分子。
同樣地，本領(lǐng)域已知的多種方法也可用于制備抗本發(fā)明ALR多肽或其片段或類似物的多克隆抗體。為了制備ALR多克隆抗體，可通過注射ALR多肽或其片段、變體或類似物免疫各種宿主動物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。此外，ALR多肽或其片段、變體或類似物可偶聯(lián)至免疫原性載體，如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(KLH)。并且，可使用各種佐劑來增加免疫應(yīng)答，包括但不限于福氏佐劑(完全和不完全)、諸如氫氧化鋁的礦物凝膠、諸如溶血卵磷脂的表面活性物質(zhì)、復合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐劑，例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)。
也可通過多種本領(lǐng)域已知技術(shù)篩選所需抗體。用于免疫特異性結(jié)合抗體的測定法可包括，但不限于，放射免疫測定、ELISAs(酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀試驗、免疫擴散試驗、原位免疫測定、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、補體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A試驗和免疫電泳測定等等(參見，例如Ausubel等.，編，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，New York)。利用位于一級抗ALR抗體上的可檢測的標記可進行抗體結(jié)合檢測?；蛘撸闷渑c二級抗體或進行適當?shù)貥擞浀脑噭┙Y(jié)合可檢測抗ALR抗體。多種本領(lǐng)域已知用于檢測免疫測定中結(jié)合的方法落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的抗體可用于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的定性或定量檢測體液或組織的診斷方法和試劑盒中，或抗體可用于治療各種疾病、失調(diào)和病癥的方法和組合物中。
所述抗體(或其片段)提高了其抗本發(fā)明ALR多肽或其片段、變體或類似物的能力，其對于ALR具有結(jié)合親和力。優(yōu)選地，所述抗體(或其片段)具有大于約105M-1的結(jié)合親和力或親合力，更優(yōu)選地大于約106M-1，還更優(yōu)選地大于約107M-1，以及最優(yōu)選地大于約108M-1。
根據(jù)本發(fā)明抗體要獲得的合適的量，一種使用無血清培養(yǎng)基的分批發(fā)酵方法可用于制備抗體。在發(fā)酵后，可通過多步操作純化抗體，包括層析和病毒失活/去除步驟。例如，抗體可首先通過蛋白A親和層析分離，然后用溶劑/去污劑處理以失活所有的脂質(zhì)包膜病毒。進一步的純化，通常是通過陰離子和陽離子交換層析，可用于除去殘留的蛋白質(zhì)、溶劑/去污劑和核酸。所純化的抗體使用凝膠過濾柱可進一步得到純化并在0.9％鹽水中進行配制。然后，將所配制的批量制備物滅菌、過濾病毒并配藥。
組合物和給藥途徑本發(fā)明ALR多肽和多核苷酸可用作為治療劑。例如，通過給予患者治療有效量的上述分子可發(fā)現(xiàn)這些分子在治療或預防患者疾病或病癥中的應(yīng)用。例如，上述疾病和病癥可包括肝衰竭。具體而言，所述疾病和病癥可選自包含對乙酰氨基酚毒性(acetaminophen toxicity)、脂肪肝、肝硬化、病毒性肝炎、癌、黃疸、腹水、肝病性口臭、凝血失敗(failure of coagulation)、纖維化、重度肝炎(包括急性肝炎、亞急性肝炎、慢性肝炎)、重度慢性肝炎、非重度肝炎或任何其它類型的肝損傷、肝衰竭或肝病?；蛘撸鲜黾膊『筒“Y可包括不育疾病。例如，所述生育疾病可與異常的干細胞合成、削弱或異常的精子發(fā)生、削弱的細胞溶質(zhì)Fe/S蛋白生物合成或性無能相關(guān)。
因此，本發(fā)明提供了用于刺激患者肝再生和/或肝細胞增殖的方法，其中所述方法包含給予患者治療有效量的上述ALR多肽、核酸、載體或宿主細胞。
本發(fā)明還提供了上述ALR多肽、ALR核酸、載體或宿主細胞在制備用于治療或預防肝病的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明提供了包含上述ALR多肽、ALR核酸、載體、宿主細胞或抗體的藥物組合物。所述藥物組合物可包含一種或多種添加劑。所述一種或多種添加劑可選自包含胰島素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-α的組。典型地，所述組合物也可包含一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或佐劑。
因此，涉及了包含ALR多肽和多核苷酸的藥學上有用的組合物用于治療或預防疾病和病癥。
本發(fā)明ALR多肽的激動劑和拮抗劑，包括抗ALR抗體，也可用作為治療劑。因此，本發(fā)明也涉及使用上述激動劑和拮抗劑以及包含其的藥物組合物的治療方法。
一般而言，適用于本發(fā)明方法的組合物可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法和程序進行制備，相應(yīng)地可包括藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
可通過標準途徑給予組合物。一般而言，可通過腸胃外(如靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi))、口服或局部途徑給予所述組合物。給藥可以是全身、區(qū)域或局部給藥。在任何特定情況下所要使用的具體給藥途徑取決于許多因素，包括所要治療的病癥的特性、病癥的嚴重程度、要被遞送的具體化合物的所需劑量以及化合物可能的副作用。
一般而言，可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備合適的組合物，所述組合物包括藥學上可接受的稀釋劑、佐劑和/或賦形劑。所述稀釋劑、佐劑和賦形劑應(yīng)為“可接受的”，即為與組合物的其它成分相容，且對其受者無害。
藥學上可接受的載體或稀釋劑的實例是軟化水或蒸餾水；鹽溶液；植物基礎(chǔ)油例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅樹脂；礦物油例如液體石蠟、軟石蠟或低凝點高級潤滑油；纖維素衍生物例如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級鏈烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳烷基環(huán)己醇(lower aralkanols)；低級聚烷撐二醇或低級烷撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸酯，例如棕櫚酸異丙酯、十四酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍膠或阿拉伯樹膠以及石油凝膠。通常，按重量計算載體占組合物的10％到99.9％。
本發(fā)明的組合物可以一種適于通過注射給藥的形式存在，以一種適于口服劑型的形式存在(例如膠囊劑，片劑，囊片，酏劑)，以一種適于局部給藥的軟膏，乳膏或洗劑的形式存在，以一種適于作為滴眼劑遞送的形式存在，以一種適于通過吸入給藥的氣溶膠形式存在，例如通過鼻內(nèi)吸入或口服吸入，以一種適于腸胃外給藥的形式存在，即皮下注射肌內(nèi)注射或靜脈注射。
作為一種用于給藥的可注射溶液或混懸液，無毒的注射可接受稀釋劑或載體可包括，林格氏(Ringer′s)溶液，等滲鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水，乙醇和1，2丙二醇。
用于口服使用的合適的載體、稀釋劑、賦形劑和輔劑的一些實例包括花生油，液體石蠟羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，海藻酸鈉，阿拉伯樹膠，黃蓍膠，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，白明膠和卵磷脂。此外這些口服劑型可包含合適的調(diào)味劑和顏料。當在膠囊劑中使用時，膠囊可包被有能延遲崩解的化合物，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
輔劑通常包括軟化劑，乳化劑，增稠劑，防腐劑，殺菌劑和緩沖劑。
口服給藥的固體劑型可包含人畜制藥實踐中可接受的粘合劑，甜味劑，崩解劑，稀釋劑，調(diào)味劑，包衣劑，防腐劑，潤滑劑和/或延時劑(time delay agents)。合適的粘合劑包括阿拉伯樹膠，白明膠，玉米淀粉，黃耆膠，海藻酸鈉，羥甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括蔗糖，乳糖，葡萄糖，阿斯巴甜糖或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉，甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，瓜爾膠，黃原膠，膨潤土，褐藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖，山梨醇，甘露醇，葡萄糖，高嶺土，纖維素，碳酸鈣，硅酸鈣或磷酸二鈣。合適的調(diào)味劑包括薄荷油，冬青油，櫻桃，橙或覆盆子調(diào)味劑。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯的聚合物或高聚物，蠟，脂肪醇，玉米蛋白，蟲膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯甲酸鈉，維生素E，α-生育酚，抗壞血酸，羥基苯甲酸甲酯，羥苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤滑劑包括硬脂酸鎂，硬脂酸，油酸鈉，氯化鈉或滑石。合適的延時劑包括單硬脂酸甘油酯或甘油基二硬脂酸酯。
除上述試劑外，用于口服給藥的液體劑型可包含液體載體。合適的液體載體包括水，油例如橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、花生油、椰子油，液體石蠟，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，異丙醇，甘油，脂肪醇，三酸甘油酯或其混合物。
用于口服給藥的混懸液可進一步包含分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉或乙?；掖?acetyl alcohol)。合適的分散劑包括卵磷脂、諸如硬脂酸的脂肪酸的聚氧化乙烯酯，聚氧化乙烯山梨糖醇單或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯，聚氧化乙烯山梨聚糖單或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等等。
用于口服給藥的乳劑可進一步包含一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括如上所例證的分散劑或諸如瓜爾膠、阿拉伯樹膠或黃耆膠的天然樹膠。
用于制備腸胃外給藥組合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，更多細節(jié)描述于，例如，Remington′s PharmaceuticalScience，第15版.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，在此并入作為參考。
本發(fā)明的局部劑型包含活性成分和一種或多種可接受的載體，以及任選地任何其它治療成分。適于局部給藥的劑型包括適于滲透入皮膚至需要治療部位的流體或半流體制備物，例如搽劑、洗劑、乳膏、軟膏或糊劑，以及適于眼、耳或鼻給藥的滴劑。
本發(fā)明的滴劑可包含無菌水溶液或油性溶液或懸浮液。這些溶液可通過將活性成分溶解在殺細菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其它合適的防腐劑的水溶液中得到制備，以及任選地包含表面活性劑。然后，通過過濾澄清所得到的溶液，將其轉(zhuǎn)移至合適的容器中并滅菌。滅菌可通過高壓滅菌或在90℃-100℃保持半小時或通過過濾來進行，接著通過無菌技術(shù)將溶液轉(zhuǎn)移至容器中。適合于包含在滴劑中的殺細菌劑和殺真菌劑的實例為硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯銨(0.01％)及醋酸洗必泰(0.01％)。適合用于制備油性溶液的溶劑包括甘油、稀醇及丙二醇。
本發(fā)明的洗劑包括那些適用于皮膚或眼的洗劑。洗眼劑可包含無菌水溶液，任選地包含殺細菌劑，且可通過類似于上述那些與滴劑制備相關(guān)的方法進行制備。應(yīng)用于皮膚的洗劑或搽劑也可包括加速干燥并及冷卻皮膚的試劑，例如乙醇或丙酮，和/或諸如甘油的濕潤劑(moisturiser)，或諸如蓖麻油或花生油的油類。
本發(fā)明的乳膏、軟膏或糊劑是用于外敷的活性成分的半固體劑型。它們可通過將磨碎的或粉末狀活性成分混合而制得，所述活性成分單獨存在或在溶液中或懸浮于水溶液或非水液體中，所述非水液體具有含脂或不合脂的主要成分。所述主要成分可包含碳氫化合物，例如硬、軟或液體石蠟、甘油，蜂蠟，金屬皂，粘漿劑，天然來源的油類，例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸，以及醇類，例如丙二醇或聚乙二醇。
所述組合物可摻入任何一種合適的表面活性劑，例如陰離子型、陽離子型或諸如山梨坦酯或其聚氧乙烯衍生物的非離子型表面活性劑。也可包含諸如天然樹膠的懸浮劑、纖維素衍生物或諸如硅石(silicaceoussilicas)的無機材料，以及其它成分如羊毛脂。
所述組合物也可以脂質(zhì)體的形式給予。脂質(zhì)體通常來源于磷脂或其它脂類物質(zhì)，由分散在水介質(zhì)中的單或多層含水液晶形成。任何能形成脂質(zhì)體的無毒、生理學上可接受及可代謝的脂類可被利用。脂質(zhì)體中組合物可包含穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等等。優(yōu)選的脂類是天然或合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。制備脂質(zhì)體的方法為本領(lǐng)域所已知，相關(guān)的具體參考文獻為Prescott，編.，Methods in Cell Biology，第14卷，Academic Pres s，New York，N.Y.(1976)，第33頁以及下列等等，其內(nèi)容在此并入作為參考。
為了達到本發(fā)明目的，分子或試劑可以治療性或預防性組合物形式來給予患者。在治療應(yīng)用中，將組合物以足以治愈或至少部分阻止疾病及其并發(fā)癥的量給予已患病的患者。所述組合物應(yīng)提供分子或試劑足以有效治療患者的量。
所述用于任何具體患者的治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括被治療的病癥及該病癥的嚴重程度，所使用的分子或試劑的活性，所使用的組合物，患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食，給藥時間、給藥途徑，分子或試劑的螯合速率，治療所持續(xù)的時間，與該治療聯(lián)合或同時使用的藥物，以及其它醫(yī)藥領(lǐng)域眾所周知的相關(guān)因素。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能通過常規(guī)實驗來確定治療適應(yīng)癥所必需的試劑或化合物有效、無毒的量。
一般而言，有效劑量范圍應(yīng)在約0.0001毫克至約1000毫克/公斤體重/24小時；優(yōu)選地，約0.001毫克至約750毫克/公斤體重/24小時；約0.01毫克至約500毫克/公斤體重/24小時；約0.1毫克至約500毫克/公斤體重/24小時；約0.1毫克至約250毫克/公斤體重/24小時；約1.0毫克至約250毫克/公斤體重/24小時。更優(yōu)選地，有效劑量范圍應(yīng)在約1.0毫克至約200毫克/公斤體重/24小時；約1.0毫克至約100毫克/公斤體重/24小時；約1.0毫克至約50毫克/公斤體重/24小時；約1.0毫克至約25毫克/公斤體重/24小時；約5.0毫克至約50毫克/公斤體重/24小時；約5.0毫克至約20毫克/公斤體重/24小時；約5.0毫克至約15毫克/公斤體重/24小時。
或者，有效劑量可高達約500毫克/平方米。一般而言，有效劑量范圍應(yīng)在約25至約500毫克/平方米，優(yōu)選地約25至約350毫克/平方米，更優(yōu)選地約25至約300毫克/平方米，還更優(yōu)選地約25至約250毫克/平方米，甚至更優(yōu)選地約50至約250毫克/平方米，最優(yōu)選地約75至約150毫克/平方米。
通常，在治療應(yīng)用中，在病狀的持續(xù)時間內(nèi)應(yīng)給予治療。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當清楚個體劑量的最佳數(shù)量和間隔應(yīng)取決于正治療的病狀的特性和程度，給藥的形式、途徑和部位，以及正治療的特殊個體的特性。同樣地，上述最佳條件也可取決于常規(guī)方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當清楚最佳療程，例如對于規(guī)定天數(shù)而言，每天所給的組合物的劑量數(shù)量可為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用常規(guī)的療程測定試驗所確定。
本發(fā)明的實施方案也涉及編碼ALR的多核苷酸的給予。在這種情況下，多核苷酸通?？刹僮鞯剡B接到啟動子上使得將該多核苷酸給予患者后產(chǎn)生合適的多肽序列。所述多核苷酸可在載體中以給予患者。所述載體可以是一種質(zhì)粒載體、病毒載體、表達載體或任何適宜于插入外源序列的合適載體，它們導入真核細胞中并表達所導入的序列。一般而言，載體是一種真核表達載體并可包括表達控制和加工序列，例如啟動子、增強子、核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列。要被給予的核酸構(gòu)建體可包含裸DNA或可與一種或多種藥學上可接受的載體以組合物的形式存在。
本發(fā)明現(xiàn)將根據(jù)特定的實施例加以描述，其不應(yīng)視為以任何方式來限制發(fā)明范圍。
實施例實施例1-重組人ALR的制備1.1人ALR的擴增為了分離人ALR基因(本文中稱為0ALR0)，設(shè)計正向(Arg15’-AATTACATATGCGGACGCAGCAG-3’)(SEQ ID NO9)和反向(Arg25’-AATTAAAGCTTCTAGTCACAGGAGCC-3’)(SEQ ID NO10)引物并用于擴增0ALR0 cDNA，該擴增使用了Taq聚合酶試劑盒(Roche)。引物Arg1含有NdeI限制性內(nèi)切酶識別位點，引物Arg2含有HindIII位點。將這兩種引物(終濃度分別為300nM)和DNA聚合酶(2.0單位)、脫氧核糖核苷酸(終濃度分別為200μM)、反應(yīng)緩沖液以及ddH2O一起添加到含有5μl人肝5’-stretch plus cDNA文庫(clontech)的0.2ml的微型管中。使用下列條件進行PCRPCR前(94℃，5分鐘)，25PCR循環(huán)(94℃，1分鐘；57℃，1分鐘；72℃，1分鐘)和PCR后(72℃，7分鐘)。在瓊脂糖凝膠電泳后，在250bp和500bp之間觀察到一條帶(圖.3)。
1.2表達質(zhì)粒的構(gòu)建為了在大腸桿菌中表達擴增的0ALR0 cDNA，使用pAED4作為表達質(zhì)粒載體。如圖2所示，用NdeI和HindIII消化PCR產(chǎn)物后，使用快速連接試劑盒(Rapid Ligation Kit)(Roche)將其插入pAED4相應(yīng)的多克隆位點中。通過DNA測序(Tech Dragon Limited)證實含有人ALR的重組質(zhì)粒。具有正確序列的質(zhì)粒DNA稱為pAED-ALR。
1.3重組人ALR(0ALR0)的過表達通過標準的CaCl2磷酸鹽轉(zhuǎn)化方法將pAED-ALR轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株中。然后在含有0.1mg/ml氨芐青霉素(USB)及34μg/ml氯霉素(USB)的5ml 2xTY培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含有16g胰蛋白棟，10g酵母提取物和5g NaCl)中接種轉(zhuǎn)化的細胞T，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以280rpm于37℃溫育10小時。然后，將2ml擴大培養(yǎng)基(expanded culture)在含0.1mg/ml氨芐青霉素的200ml 2xTY培養(yǎng)基中溫育。在0.8的光密度(OD600)下，用0.2mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，USB)進行蛋白表達誘導。誘導4小時后，通過在6,000g下離心20分鐘收獲細菌并在純化前貯藏在-80℃下。
1.4重組人ALR(0ALR0)的不溶蛋白純化為純化0ALR0，將收獲的細胞重懸于裂解緩沖液(50mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH 8.0)中，濃度為10g細胞/100ml及15μg/ml溶菌酶(Sigma)。將懸液體于30℃溫育1小時，接著在冰上用超聲處理約3分鐘。于4℃以10,000rpm離心超聲處理得到的細胞懸液1小時，棄去上清液。為了除去非ALR蛋白質(zhì)，將含有包涵體的細胞沉淀重懸于4M脲(溶于100mM Tris-Cl，pH 8.0)中，濃度為20g/100ml。在室溫下攪拌懸液120分鐘并以10,000rpm離心30分鐘。收集含有包涵體的細胞沉淀并用100mM Tris-Cl，pH 8.0洗滌。
接著，將包涵體重懸于8M脲(溶于100mM Tris-Cl，pH 8.0)和1％巰基乙醇中，濃度為20g/100ml以便解折疊蛋白質(zhì)。在室溫下攪拌懸液過夜并接著以10,000rpm離心30分鐘，收集上清液。為了重折疊蛋白質(zhì)，使用100mM Tris pH 8.0將脲濃度從8M稀釋到2M。隨后，添加0.2mM氧化型谷胱甘肽及1mM還原型谷胱甘肽并在4℃下保持10小時。重折疊后，透析蛋白質(zhì)以除去脲。
實施例2-包含不同組氨酸序列的pAED-ALR衍生物的制備2.1多組氨酸標記的ALR的制備通過PCR合成幾種具有6組氨酸和12組氨酸的ALR衍生物。用于多組氨酸標記的ALR制備的引物列于表1中。每種5’末端引物包含一個NdeI限制性內(nèi)切酶識別位點及每種3’末端引物包含一個HindIII識別位點。使用這些識別識別位點，多組氨酸標記的ALR衍生物可被克隆入表達載體pAED4相應(yīng)的限制性位點中。
天然的人ALR(0ALR0)被用作為模板用于多組氨酸標記的ALR衍生物的制備。使用高保真度Taq聚合酶試劑盒(Roche)進行PCR，反應(yīng)條件如下PCR前(95℃，5分鐘)，25個PCR循環(huán)(95℃；30秒；50℃，30秒；72℃，40秒)及PCR后(72℃，10分鐘)。
表1用于多組氨酸標記的ALR制備的引物

2.2重組多組氨酸標記的ALR衍生物的構(gòu)建使用快速連接試劑盒(Roche)，將多組氨酸標記的ALR衍生物的PCR產(chǎn)物克隆入pAED4表達載體的NdeI和HindIII限制性位點中。通過DNA測序(Tech Dragon Limited)確認重組質(zhì)粒。所構(gòu)建質(zhì)粒的指定名稱見表2。
表2所構(gòu)建質(zhì)粒的指定名稱

2.3多組氨酸標記的ALR衍生物的表達和純化使用大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌株進行蛋白質(zhì)表達，方法與如上pAED-ALR所用的方法相同。融合至蛋白的組氨酸標記的存在允許使用KTAFPLC(Amersham Pharmacia)利用鎳瓊脂糖柱進行快速ALR純化。將所收獲的細胞以10g/100ml重懸于含有15μg/ml溶菌酶(Sigma)的增溶緩沖液(50mM Tris，0.1M NaCl)。在30℃下溫育懸液1小時，接著在冰上用超聲處理約3分鐘。然后于4℃以10,000rpm離心超聲處理所得的細胞懸液1小時。收集上清液并進行蛋白純化。制備鎳柱并用結(jié)合緩沖液(0.5M NaCl，0.02M磷酸鈉，pH 7.4)平衡。超聲處理后，在上鎳柱前通過0.45μm過濾器過濾澄清提取物。在洗脫液流過柱后，通過添加5倍床體積的洗滌緩沖液(0.5M NaCl，0.02M磷酸鈉，pH 7.4)洗滌基質(zhì)。使用洗脫緩沖液(0.5M NaCl，0.02M磷酸鈉，0.5M咪唑，pH 7.4)以0-100％梯度洗脫組氨酸標記的蛋白。然后，通過SDS-PAGE分析全部的洗脫液以估計產(chǎn)量和純度，并將含有所需蛋白的級分集中用于進一步的研究。
圖.4顯示了不同的多組氨酸標記的ALR多肽的洗脫圖，在所有圖中都觀察到2個峰。結(jié)合SDS-PAGE分析(圖.5)，后一個峰被認為是表達的ALR蛋白。比較每種His-標記的ALR蛋白，表明那些在更高的咪唑濃度下從柱上洗脫出的具有更多組氨酸殘基的蛋白具有更高的純度，OALR12具有大于95％的純度。
接著，使用Bradford測定法(Bio-Rad)測定蛋白濃度。多組氨酸標記的ALR的表達水平列于表3中。數(shù)據(jù)表明3ALR9和0ALR12的表達水平較6ALR6更高，雖然它們都包含總共12個His-標記(表3)。應(yīng)注意6ALR6給出了低表達水平。
表.3多組氨酸標記的ALRs的表達水平

實施例3-多組氨酸標記的ALR的結(jié)構(gòu)分析3.1質(zhì)譜分析在質(zhì)譜分析前，使用Amicon Ultra-4離心過濾器設(shè)備(截留分子量＝10,000Da；Millipore，USA)在20mM碳酸氫銨中對樣品進行脫鹽。然后，在配備有Masslynx 3.5軟件的Q-TOF2質(zhì)譜儀(Micromass，UK)上進行電噴霧電離質(zhì)譜試驗。開始將含有0.2％甲酸的等分乙腈添加到蛋白溶液中以制備含有乙腈∶緩沖液50∶50(v/v)和0.1％甲酸的最終溶液。使用注射泵(Cole Parmer，74900系列)以300μl/h流速將最終蛋白溶液注射入質(zhì)譜儀中。對于所有的試驗而言，毛細管電壓設(shè)定為2.5KV，錐體(cone)電壓維持在30V。使用馬心肌紅蛋白(MW＝16950.5)外部校準質(zhì)量中心軸線(mass axis)。通過掃描600-2000m/z質(zhì)量范圍獲得多電荷譜(multiply charged spectra)，并通過包含在MassLynx 3.5軟件包中的最大熵(Maximum Entropyed)程序?qū)Χ嚯姾勺V進行去卷積。
質(zhì)譜分析證實了0ALR6(圖.7a)和0ALR12(圖.7b)單體和二聚體的分子量。測量值分別為15848Da和16718Da(單體)以及31695Da和33436Da(二聚體)。
表4也比較了0ALR6和0ALR12的測量值和理論值。0ALR6的每一測量值與計算(理論)值相比具有＜0.02％相對偏差。相應(yīng)地，0ALR12具有＜0.3％相對偏差。這些數(shù)值與前述研究(Li等.(2002))所報道的那些數(shù)值相同。除主峰外，一些小峰也是很明顯的。這些小峰可能是由于存留在ALR多肽表面的鹽存在之故。
表40ALR6和0ALR12測量值和理論計算值的比較結(jié)果

從圖7中，可看出二聚體的峰較單體高很多，因此表明重組人OALR6和OALR12以同型二聚體形式而非單體形式天然存在，為圖6中的變性SDS/PAGE電泳結(jié)果所進一步證實。
3.2圓二色性光譜利用Jasco 810分光旋光計測量多組氨酸標記的ALR衍生物的圓二色性(CD)光譜，該旋光計使用了具有徑長為1.0mm的帶水套的圓柱池。由連接有MTP-6溫度程控器的Neslab RTE-211循環(huán)式水浴鍋提供溫度控制。將蛋白樣品溶解在10mM磷酸鉀(pH 7.0)中，濃度范圍為0.25mg/ml-0.5mg/ml。通過測量190nm-250nm的遠紫外克分子橢圓率來監(jiān)測ALR的熱變性。收集數(shù)據(jù)并用J810 1.0軟件分析，使用Yang作為參考的CD。
Jasco 810分光旋光計測量的CD譜顯示了多組氨酸標記的ALR衍生物具有與天然ALR類似的譜圖(圖.8)。借助于Yang氏參考分析得到的二級結(jié)構(gòu)列于表5中。ALR及其衍生物之間的α-螺旋和β-折疊在二級結(jié)構(gòu)中的百分比是相似的。這些結(jié)果表明添加組氨酸標記并不影響ALR二級結(jié)構(gòu)的折疊。
表5分析二級結(jié)構(gòu)

3.3等電聚焦通過使用等電聚焦(IEF)測定ALR蛋白的等電點(pI)。首先將樣品與水進行緩沖液交換并在使用前貯藏在4℃。然后，在含有兩性電解質(zhì)(Pharmalyte，寬范圍pH3-10，Amersham)的聚丙烯酰胺凝膠中進行等電聚焦(IEF)，使用了Model 111迷你型-IEF槽(Bio-Rad)，根據(jù)廠商說明書指導使用寬范圍標記物(Broad pI試劑盒，pH 3.5-9.3，Amersham)。BSA作為對照。IEF凝膠分3步來跑

電泳后，使用考馬斯藍G-250對凝膠染色，“快染”過夜無需振蕩，接著在7％(v/v)乙酸中脫色1小時用于增強和保存。
圖9顯示了0ALR0和0ALR6的IEF結(jié)果。根據(jù)寬范圍的校準值，繪制出條帶與染料前沿距離對pI點的標準曲線。接著根據(jù)標準曲線計算蛋白的等電點。表6列出了0ALR0(pI 7.17)、0ALR6(pI 7.16)和0ALR12(pI 7.093)的計算(理論)等電點。每種ALR之間相似的等電點表明組氨酸標記的存在并不影響蛋白的等電點。
表.6組氨酸標記的ALR多肽的計算(理論)等電點

3.4測量非共價結(jié)合的FAD為鑒定被結(jié)合的FAD，使用Lambda 35UV/VIS分光計(PerkinElmer)直接記錄組氨酸標記的ALR衍生物的可見光譜，接著使用UVWinLab 2.85.04版軟件進行分析。吸光度范圍為350nm-550nm。在相同條件下，包含了7.5μM純FAD(Sigma)的參考樣品也進行了測量。
圖.10顯示了每種多組氨酸標記ALR衍生物具有FAD部分但顯示了與游離FAD不同的性質(zhì)。游離FAD的最大吸光度為449.08nm。0ALR6顯示了約5nm的位移(455.71nm)，0ALR12具有約4nm的位移(453.96nm)以及0ALR0具有約3nm的位移(452.79nm)。峰的肩部(在480nm)也位移，與游離FAD光譜相比似乎更明顯。位移的吸光度暗示FAD與這些ALR蛋白結(jié)合。
蛋白的FAD含量可通過蛋白變性進行計算。在使用Bradford測定法測定蛋白濃度后，將蛋白煮沸30分鐘，添加15％四氯酸(TCA)將FAD分子從蛋白上解離下來。然后，通過光譜測定解離的FAD。在熱變性后觀察到蛋白光譜的峰從454nm位移至445nm，由此表明除去了所有的變性蛋白，僅存在解離的FAD(圖.11)。
接著使用游離FAD作為標準根據(jù)最高峰的0D值計算FAD含量。該結(jié)果表明在所有三種ALR蛋白0ALR0、0ALR6和0ALR12中，每蛋白單體單位存在約0.8個FAD分子。該數(shù)值暗示每個單體單位存在一個FAD分子。該發(fā)現(xiàn)類似于對Ervlp(17)的測定結(jié)果。
實施例4-人ALR衍生物之間酶活性比較4.1巰基氧化酶活性測定通過使用巰基氧化酶測定法測試人多組氨酸標記的ALR蛋白活性。將50pmol純化的ALR蛋白稀釋于1ml測量緩沖液(2M脲，溶于100mM磷酸鉀，1mM EDTA，pH 7.5)及1，4-二巰基-2，3-丁二醇(DTT)中，相當于50nmol還原的硫醇基。從收集自1ml樣品中的200μl等分試樣中測定最初的硫醇含量。在不同時間間隔收集額外的200μl等分試樣并測定硫醇含量。
通過將200μl樣品稀釋在790μl測量緩沖液中，然后添加10μlDTNB(Ellman氏試劑)至終濃度為10μM以測定硫醇含量。2分鐘后，測定412nm處消光并計算蛋白所使用的硫醇基。
圖.12表明了OALR12的劑量依賴性巰基氧化酶活性。蛋白數(shù)量更多，就有更多的硫醇基被使用，因此所觀察到的硫醇百分比就相應(yīng)地更低。該結(jié)果暗示ALR的巰基氧化酶活性取決于蛋白的濃度。
3種組氨酸標記的ALRs的巰基氧化酶活性示于圖13中。與對照及FAD(陰性對照)相比，在ALR中硫醇含量減少。該結(jié)果表明ALR蛋白在添加組氨酸后仍有功能。使用相同蛋白濃度對3種ALR蛋白的比較表明約15％的硫醇基被0ALR12在30分鐘內(nèi)用完。該結(jié)果表明0ALR12的活性與0ALR0相似，而0ALR6硫醇活性較低。因此，添加12個組氨酸標記至ALR并不影響ALR CXXC結(jié)合位點。另一方面，從0ALR6與0ALR0相比巰基氧化酶活性相對減少來看，添加6個組氨酸標記至ALR可能影響ALRCXXC結(jié)合位點。
已知ALR氧化還原狀態(tài)對于包括增殖和凋亡在內(nèi)的多種細胞功能的控制起主要作用(Wu等.(2003))，且ALR還能刺激細胞增殖和再生(Lu 等.(2002)，Polimeno 等.(1999))，ALR巰基氧化酶活性的存在也與肝細胞增殖相關(guān)。
4.2重組ALR生物活性測試幾種細胞系被用于測試重組ALR的生物活性。將細胞置于96孔培養(yǎng)平板(IWAKI)上，3000個細胞/孔，孔中有Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco)，其包含10％牛胎兒血清(Gibco)，在5％CO2和30％O2空氣中于37℃培養(yǎng)。24小時后，使用無血清DMEM使細胞受餓。1天后，添加不同濃度的重組人ALR，EGF和pHGF作為陽性對照，β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白(BLIP)作為陰性對照。溫育時間為48小時，接著根據(jù)廠商說明書(Bio-gene)指導進行MTS測定。
ALR對細胞增殖的生物活性示于圖14中。所有的多組氨酸標記的ALR蛋白都顯示出對HepG2肝細胞的增殖活性。也發(fā)現(xiàn)0ALR6和0ALR12具有劑量依賴性結(jié)果。根據(jù)對3種ALR蛋白的比較結(jié)果，0ALR12被認為對HepG2具有較好效果，在100pM和500pM濃度處觀察到增殖活性。而這樣的活性在0ALR0和0ALR6中并沒有觀察到。
為了測定ALR蛋白是否具有足夠的潛在療效，一種已知為Wei Jia(pHGF)的商品藥物被用于對比研究中。Wei Jia是一種從商業(yè)渠道可獲得的產(chǎn)品，其對肝治療具有明顯效果。圖15顯示了0ALR12甚至在低到1pM處仍具有相對增殖活性，具有顯而易見的劑量依賴效應(yīng)，直至100pM濃度才飽和。該對比研究表明71nM pHGF與100pM 0ALR12具有類似的增殖效果。該結(jié)果表明重組0ALR12的增殖效果是十分明顯的。
圖.14和15顯示了0ALR12的相對增殖活性。在增殖效果中所觀察到的差異有可能是因為所使用的緩沖液不同之故。圖14中樣品在TrispH 8.0中緩沖，而圖15中樣品與pH 7.0的緩沖液進行緩沖液交換，據(jù)信能穩(wěn)定該藥物。由于ALR蛋白在Tris緩沖液中較低的溶解性，因此當與pH 7.0的緩沖液交換的樣品相比時增殖效果可能較低.。
為了證實ALR特異性，使用了另一種細胞系MCF7(人乳腺細胞系統(tǒng))。圖16顯示了0ALR12對MCF7細胞的增殖活性結(jié)果。該數(shù)據(jù)表明對MCF7細胞沒有明顯的增殖效果，因此暗示ALR僅對肝細胞具有特異性。
實施例5-多組氨酸標記的ALR的總結(jié)合成了5種不同的多組氨酸標記的ALR分子，即0ALR6、6ALR6、3ALR9、0ALR12和0ALR18。表7顯示了這5種ALR蛋白與天然ALR(0ALR0)的比較結(jié)果。
表7五種接受測試的新的ALR蛋白(0ALR6、6ALR6、3ALR9、0ALR12和0ALR18)與天然ALR(0ALR0)的比較結(jié)果

在4種被測試的可溶性新的ALR蛋白中，除6ALR6外其它都具有高的表達水平。但是，在鎳親和柱純化后，對6個組氨酸標記的純度的效果不如對12個組氨酸標記的效果好。0ALR12具有十分高的純度(高于95％)。
基于表達水平和純度，6ALR6和3ALR9被排除在進一步研究之外。對0ALR6和0ALR12進行功能研究。巰基氧化酶活性測定顯示0ALR12的活性類似于天然0ALR0。此外，細胞增殖測定也顯示0ALR12較0ALR6具有更好的生物效應(yīng)。而且，證實了0ALR12與商業(yè)渠道可獲得的肝病藥物Wei Jia(pHGF)具有可比較的生物效應(yīng)。
實施例6-大規(guī)模制備0ALR126.1發(fā)酵將501所制備菌株(BL21(DE3)pLysS中pAEDALR12質(zhì)粒)的甘油原液接種在錐形燒瓶中，燒瓶中含有200ml 2xTY培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有10μM核黃素、0.1mg/ml氨芐青霉素和0.2％葡萄糖，并在37℃下于旋轉(zhuǎn)振蕩器上以280rpm溫育10小時。然后，在湍流槽生物反應(yīng)器(B.Braun，Biostat B)中將100ml擴大培養(yǎng)物稀釋到最終體積為2L，該反應(yīng)器配備有溫度、攪拌速率、pH和氧壓的在線檢測設(shè)備。通氣量設(shè)定在11升/分鐘，溫度為37℃以及通過添加2.5M氫氧化鈉將pH控制在6.95-7.04之間。攪拌速率設(shè)定在400rpm，溶解氧的最小閾值為70％(并具有20％的空氣飽和最小閾值)。
圖.17和18分別顯示了發(fā)酵運行圖和生長曲線。培養(yǎng)過程開始在配料階段具有最小的攪拌速率為400rpm及80％的PO2。PO2和葡萄糖含量以高濃度保留直至細胞到達生長階段。在該生長階段，光密度、細胞生物量和葡萄糖消耗率呈指數(shù)式增加。達到13.0-14.0的O.D.600。添加0.5mM終濃度的IPTG或28mM乳糖用于誘導。蛋白表達啟動及細胞生長速率減緩為O.D.600及細胞生物量所指示。接著，將額外的30g葡萄糖注入系統(tǒng)中并在37℃下再培養(yǎng)4小時或在20℃下培養(yǎng)過夜。然后，通過在4℃下7000g離心20分鐘收獲細胞，并在蛋白純化前貯藏于-80℃。
6.2純化為了純化0ALR12，所采用的方法類似于小規(guī)模純化的方法，但進行了一些修改。將收獲的細胞以10g/100ml重懸于增溶緩沖液(50mMTris，0.1M NaCl)中，通過APV-1000高壓實驗室均質(zhì)器(APV Far EastLtd)進行細胞裂解。然后，使用1500U/L DNase I并在37℃下溫育1小時進行DNA消化。在4℃下將超聲處理的細胞懸液以10,000rpm離心1小時。收集上清液并使用裝備有20ml鎳瓊脂糖柱的KTAFPLC(Amersham Pharmacia)進行蛋白純化。
0ALR12大規(guī)模純化的洗脫圖譜是小規(guī)模純化的放大(圖.19)。非特異性蛋白在開始被洗脫下來，0ALR12的主要級分在約0.35M咪唑濃度處被洗脫下來。在2升發(fā)酵運行中，通常得到約300mg-400mg 0ALR12蛋白。然后，將所收集的級分用于進一步的研究和分析。
6.3分析方法使用酶葡萄糖分析儀(Yellow Springs Instrument，Ohio，USA)測定葡萄糖水平。通過使用牛血清白蛋白作為標準物的Bradford測定法測定蛋白質(zhì)含量。
實施例7-0ALR18的過表達在大腸桿菌中構(gòu)建并表達0ALR18多肽的方法類似于那些描述用于0ALR12的方法。包含0ALR0的質(zhì)粒用作為模板，兩個寡核苷酸(Arg15’-AATTACATATGCGGACGCAGCAG-3’(SEQ ID NO9)；KAR30，5’-AATTAAAGCTTCTAGTGGTGATGGTGGTGATGGTGGTGGTGGTGGTGGTATGATGGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGATGGTGGTCACAGGAGCCATCCTTCCA-3’)(SEQ ID NO16)用作為引物。接著確認質(zhì)粒序列(Tech Dragon Ltd)并在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中表達。用于0ALR18表達的方法與所描述的用于其它多組氨酸標記的ALR蛋白的方法相同。收集表達的蛋白并使用KTAFPLC(Amersham Pharmacia)及鎳瓊脂糖柱純化。
圖.20顯示了可溶性0ALR18蛋白的純化圖，顯示沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于0ALR18的峰。該結(jié)果表明0ALR18并不存在于可溶性蛋白部分中。已知還觀察到了非特異性結(jié)合峰，因此可溶性0ALR18的不存在不太可能是因為不適當?shù)募毎呀馑隆?br> 接著通過12％SDS-PAGE分析0ALR18的不同部分以研究0ALR18的溶解性。結(jié)果(圖.21)顯示幾乎100％的0ALR18以不溶蛋白表達。因此，0ALR18的溶解性遠低于0ALR12，其被證實含有約50％的可溶性蛋白。不同多組氨酸標記的ALR蛋白溶解性比較的結(jié)果表明0ALR6和0ALR12溶解性相似但0ALR18完全不溶。
實施例8-組合物本發(fā)明的分子和試劑以及那些為本發(fā)明方法所鑒定的可用于治療或預防各種病狀或病癥。上述分子和試劑可單獨給予，雖然更常見的是作為藥物組合物給予。
根據(jù)本文所提供的實施本發(fā)明的最佳方式，具體優(yōu)選的組合物概述如下。下列內(nèi)容僅作為組合物的例證性實例而不以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。
8.1用于腸胃外給藥的組合物可制備一種用于肌內(nèi)注射的組合物以含有1mL無菌緩沖水和1mg合適的試劑或分子。
同樣地，一種用于靜脈輸注的組合物可包含250ml無菌林格氏(Ringer′s)溶液和15mg合適的試劑或分子。
8.2可注射的腸胃外給藥組合物一種適于注射給藥的組合物可通過將1％(重量)的合適的試劑或分子與10％(體積)丙二醇和水混合制備得到。通過過濾對該溶液滅菌。
8.3膠囊組合物一種以膠囊形式存在的合適的試劑或分子的組合物可通過將50mg粉末狀試劑或分子、100mg乳糖、35mg滑石和10mg硬脂酸鎂填入標準的兩片式硬膠囊中制備得到。
8.4滴眼劑組合物一種作為滴眼劑用于給藥的代表性組合物概述如下適合的試劑或化合物 0.3g羥基苯甲酸甲酯 0.005g羥基苯甲酸丙酯 0.06g純水約至100.00ml.
于75℃將羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯溶解于70ml純水中，冷卻所獲得的溶液。然后，加入適合的試劑或分子，通過薄膜濾器(0.22μm孔徑)過濾溶液進行殺菌，并在無菌條件下裝入無菌容器中。
8.5用于吸入給藥的組合物對于容量在20-30ml的氣溶膠容器而言將10mg合適的試劑或化合物與0.5-0.8％(重量)的潤滑劑如聚山梨醇酯85或油酸的混合物分散在諸如氟利昂的推進劑中，并裝入適當?shù)臍馊苣z容器中用于鼻內(nèi)或口腔吸入給藥。
8.6軟膏組合物一種作為軟膏用于給藥的代表性組合物包含1.0g合適的試劑或分子，以及白石蠟至100.0g，分散以制備平滑、均質(zhì)的產(chǎn)物。
8.7局部乳膏組合物一種作為局部乳膏用于給藥的代表性組合物概述如下適合的試劑或分子1.0gPolawax GP 200 25.0g無水羊毛脂 3.0g
白蜂蠟 4.5g羥基苯甲酸甲酯 0.1g去離子或無菌水至 100.0g所述非離子乳化蠟(polawax)、蜂蠟和羊毛脂在60℃下一起加熱，添加羥基苯甲酸甲酯溶液并使用高速攪拌器進行均質(zhì)化。然后，降溫至50℃。接著添加試劑或分子并進行整體分散，并使用低速攪拌器冷卻組合物。
8.8局部洗劑組合物一種作為局部洗劑用于給藥的代表性組合物概述如下適合的試劑或分子1.2g月桂山梨坦 0.8g聚山梨醇酯200.7g十八醇十六醇混合物 1.5g甘油7.0g羥基苯甲酸甲酯 0.4g無菌水至100.00ml在75℃下將羥基苯甲酸甲酯和甘油溶解于70ml的水中。將月桂山梨坦、聚山梨醇酯20和十八醇十六醇混合物在75℃下熔化并添加到水溶液中。將所制備的乳狀液均質(zhì)化，用連續(xù)式攪拌器冷卻并將試劑或分子作為懸浮液添加到殘留的水中。攪拌全部懸浮液直至均質(zhì)化。
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<210>4<211>618<212>DNA<213>智人<400>4atggcggcgc ccggcgagcg gggccgcttc cacggcggga acctcttctt cctgccgggg60ggcgcgcgct ccgagatgat ggacgacctg gcgaccgacg cgcggggccg gggcgcgggg120cggagagacg cggccgcctc ggcctcgacg ccagcccagg cgccgacctc cgattctcct180gtcgccgagg acgcctcccg gaggcggccg tgccgggcct gcgtcgactt caagacgtgg240atgcggacgc agcagaagcg ggacaccaag tttagggagg actgcccgcc ggatcgcgag300gaactgggcc gccacagctg ggctgtcctc cacaccctgg ccgcctacta ccccgacctg360cccaccccag aacagcagca agacatggcc cagttcatac atttattttc taagttttac420ccctgtgagg agtgtgctga agacctaaga aaaaggctgt gcaggaacca cccagacacc480cgcacccggg catgcttcac acagtggctg tgccacctgc acaatgaagt gaaccgcaag540ctgggcaagc ctgacttcga ctgctcaaaa gtggatgagc gctggcgcga cggctggaag600gatggctcct gtgactag 618<210>5<211>137<212>PRT<213>人工序列<400>5Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro1 5 10 15Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr20 25 30
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<213>人工序列<400>15aattacatat gcaccaccac catcaccacc ggacgcagca gaag 44<210>16<211>106<212>DNA<213>人工序列<400>16aattaaagct tctagtggtg atggtggtga tggtggtggt ggtggtggta tgatggtgat60ggtgatggtg atggtggtga tggtggtcac aggagccatc cttcca 10權(quán)利要求
1.一種純化的ALR多肽，其中所述多肽包括位于N和/或C末端的一個或多個組氨酸殘基。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括位于C末端的12個組氨酸殘基。
3.權(quán)利要求2的多肽，包含如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括位于C末端的18個組氨酸殘基。
5.權(quán)利要求4的多肽，包含如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括位于C末端的6個組氨酸殘基。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括位于N末端的6個組氨酸殘基和位于C末端的6個組氨酸殘基。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括位于N末端的3個組氨酸殘基和位于C末端的9個組氨酸殘基。
9.一種純化的ALR多肽，包含如SEQ ID NOs1或3所示氨基酸序列或一種包括對如SEQ ID NOs1或3所示序列進行一個或多個取代、缺失和/或添加的氨基酸序列，其中所述多肽通過在N和/或C末端添加一個或多個組氨酸得到修飾。
10.一種編碼ALR多肽的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQ ID NO2或4任一所示核苷酸序列，并包括位于5’和/或3’末端的一個或多個組氨酸編碼密碼子。
11.權(quán)利要求10的核酸分子，其中所述核酸分子包括位于3’末端的12個組氨酸編碼密碼子。
12.權(quán)利要求10的核酸分子，其中所述核酸分子包括位于3’末端的18個組氨酸編碼密碼子。
13.一種包含權(quán)利要求10-12任意一項所述的核酸分子的載體。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述核酸分子可操作地連接到一個或多個調(diào)節(jié)序列上。
15.一種宿主細胞，包含權(quán)利要求10-12任意一項的核酸分子。
16.一種宿主細胞，包含權(quán)利要求13或14的載體。
17.一種宿主細胞，表達權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽。
18.一種抗體，其選擇性結(jié)合至權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽。
19.權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽、權(quán)利要求10-12任意一項的核酸分子、權(quán)利要求13或14的載體或權(quán)利要求15-17任意一項的宿主細胞在制備用于治療或預防肝病的藥物中的應(yīng)用。
20.一種用于刺激肝細胞增殖的方法，其中所述方法包含將一個或多個肝細胞暴露于治療有效量的權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽、權(quán)利要求10-12任意一項的核酸分子、權(quán)利要求13或14的載體或權(quán)利要求15-17任意一項的宿主細胞中。
21.一種用于抑制肝細胞增殖的方法，其中所述方法包含將一個或多個肝細胞暴露于治療有效量的權(quán)利要求18的抗體中。
22.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽、權(quán)利要求10-12任意一項的核酸分子、權(quán)利要求13或14的載體、權(quán)利要求15-17任意一項的宿主細胞或權(quán)利要求18的抗體以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或佐劑。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，包含一種或多種添加劑。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其中所述一種或多種添加劑選自胰島素、表皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-α。
25.一種用于治療或預防患者生育疾病的方法，其中所述方法包含給予患者治療有效量的權(quán)利要求1-9任意一項的ALR多肽、權(quán)利要求10-12任意一項的核酸分子、權(quán)利要求13或14的載體或權(quán)利要求15-17任意一項的宿主細胞。
26.一種用于制備重組修飾的ALR多肽的方法，其中所述方法包含步驟(a)用一個或多個組氨酸編碼密碼子在N-和/或C-末端人工改造ALR編碼多核苷酸；(b)將ALR編碼多核苷酸導入合適的宿主細胞中并在以便在N-和/或C-末端包含一個或多個組氨酸的ALR多肽表達的條件下培養(yǎng)細胞；和(c)純化所述重組修飾的ALR多肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中當與未修飾的多肽相比時如此制備的修飾的ALR多肽顯示了一種或多種改良的特性，所述特性選自產(chǎn)量、穩(wěn)定性、溶解性、純度或生物活性，和制備過程中不需要解折疊(變性)和隨后重折疊(復性)；兼且其它方法所獲得的改良的特性，例如其它安基酸修飾或其它方法所獲得的改良的特性。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求26或27制備的ALR多肽。
29.一種聚乙二醇(PEG)修飾的多肽或聚乙二醇化蛋白，包含權(quán)利要求1-9任意一項的多肽。
30.一種融合蛋白，包含權(quán)利要求1-9任意一項的多肽。
31.權(quán)利要求30所述的融合蛋白，其中所述多肽與白蛋白共價連接。
32.一種通過添加多組氨酸修飾的多肽，其中當與未修飾的多肽相比時所述修飾的多肽顯示了一種或多種改良的特性，所述特性選自產(chǎn)量、穩(wěn)定性、溶解性、純度或生物活性，和制備過程中不需要解折疊(變性)和隨后重折疊(復性)；兼且其它方法所獲得的改良的特性，例如其它安基酸修飾或其它方法所獲得的改良的特性。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝再生增強因子(ALR)多肽。本發(fā)明也涉及這些多肽的應(yīng)用，特別是用于治療疾病狀態(tài)。
文檔編號C07K16/00GK1944460SQ20051013222
公開日2007年4月11日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日
發(fā)明者梁潤松, 勞偉雄, 葉衛(wèi)農(nóng) 申請人:中國生物科技藥物開發(fā)有限公司