專利名稱：一種多肽生長因子共聚物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程領域的生長因子共聚物及其制備方法與應用，特別是涉及長半衰期多肽生長因子共聚物及其制備方法與應用。
背景技術：
組織工程是應用工程學和生命科學的原理和方法，形成和再生有生命的組織，以重建人體病變及缺損組織或器官的科學。組織工程依靠生物醫(yī)用材料提供組織再生的構架，生物醫(yī)用材料則通過組織工程的應用而具有生命力。兩者結合為實現(xiàn)有生命的人體“部件”的構建，進而設計和構建完整的人體器官提供了可能性。
多肽生長因子是生物體胚胎發(fā)生、發(fā)育、分化以及人體各種組織損傷后再生修復過程中起重要作用的一系列具有生物活性的多肽。人體組織損傷后的修復依賴于多肽生長因子群體的營養(yǎng)和支持作用。一般地說，多肽生長因子與細胞相互作用時，生長因子作為配體與相應的受體相結合形成復合體。該復合體凝聚在細胞膜表面，而后囊泡化進入細胞內，因溶酶體的存在而分解，因而造成細胞因子在體內半衰期極短。目前，一般是將游離的多肽生長因子埋入高分子凝膠等材料中，使之呈緩釋狀態(tài)，以延長其作用時間。
人體各種組織損傷造成局部缺損的組織再生或組織與器官的克隆形成均需要載體支架的支持。特別表現(xiàn)在再生能力較差的組織器官，例如，中樞神經系統(tǒng)的腦和脊髓等。因此如何解決載體支架的問題是醫(yī)學上的一個難點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一類多肽生長因子共聚物，這類物質在提供長半衰期多肽生長因子的同時，還為缺損組織的再生提供必要的載體支架。
本發(fā)明所提供的多肽生長因子共聚物，是多肽生長因子通過共價鍵或烴鏈與生物醫(yī)用高分子載體物質連接在一起而形成的共聚物。
本發(fā)明中，所述生物醫(yī)用高分子載體物質為帶有羥基或氨基或既帶羥基又帶氨基的物質，其中優(yōu)選的是殼聚糖、層粘連蛋白(laminin)、L-多聚賴氨酸、聚乙烯醇、膠元、明膠、聚乳酸、透明質酸；所述烴鏈為甲叉二胺或乙叉二胺。
本發(fā)明中，所述多肽生長因子可以是神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、神經營養(yǎng)素-3(NT-3)、神經營養(yǎng)素-4(NT-4)、神經營養(yǎng)素-5(NT-5)、神經營養(yǎng)素-6(NT-6)、堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、酸性成纖維細胞生長因子(a-FGF)、表皮生長因子(EGF)、紅細胞生成素(EPO)、膠質細胞株源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)、睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF)、運動神經元營養(yǎng)因子-1(MNTF-1)、運動神經元營養(yǎng)因子-2(MNTF-2)、骨形成蛋白(MBP)、Nogo的抗體和硫酸軟骨素的抗體。
這種長半衰期多肽生長因子共聚物中的多肽生長因子通過共價鍵或烴鏈與生物醫(yī)用高分子載體物質連接在一起。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備上述長半衰期多肽生長因子共聚物的方法。
本發(fā)明的這一目的，可以通過四種方法實現(xiàn)，其中，制備多肽生長因子通過共價鍵與生物醫(yī)用高分子載體物質連接在一起形成長半衰期多肽生長因子共聚物的方法，可以是以下3種，第一種方法基本上包括以下步驟(1)活化高分子載體向表面含有羥基的生物醫(yī)用高分子材料中加入氧化劑，優(yōu)選的是加入溴化氰，在pH7-10條件下，反應5-15分鐘；(2)向上述溶液中加入多肽生長因子；(3)室溫輕度振蕩30-60分鐘，0-8℃過夜；(4)用緩沖液沖洗所得產物，并用封閉液封閉未交聯(lián)的高分子材料中的活化基團；(5)離心沖洗、抽干，得到產品，優(yōu)選用抽濾漏斗抽干。
該種方法的反應機理如下式 第二種方法基本上包括以下步驟(1)向表面含有氨基的生物醫(yī)用高分子材料中加入雙活性試劑，優(yōu)選的是加入0.5％-15％的戊二醛或0.5-10％的多聚甲醛，2-8℃充分振蕩混勻22-26小時；(2)向上述溶液中加入多肽生長因子；(3)2-8℃下振蕩30-120分鐘，0-4℃過夜；(4)緩沖液沖洗數(shù)次，優(yōu)選為磷酸緩沖液；(5)抽干、得到產品。
該種方法的反應機理如下式 第3種方法基本上包括以下步驟，利用這種方法可以制備含有糖鏈的長半衰期多肽生長因子共聚物(1)在酸性條件下，含有糖鏈的多肽生長因子與過碘酸鹽反應，其中優(yōu)選的是過碘酸納；(2)加入含有氨基的生物醫(yī)用高分子材料；(3)加入還原劑，優(yōu)選的是NaBH4；(4)抽干、得到產品，優(yōu)選用抽濾漏斗抽干。
該種方法的反應機理如下式 制備多肽生長因子通過烴鏈與生物醫(yī)用高分子材料載體物質連接在一起形成長半衰期多肽生長因子共聚物的方法，基本上包括以下步驟；(1)活化高分子載體向表面含有羥基的生物醫(yī)用高分子材料中加入氧化劑，優(yōu)選的是加入溴化氰，在pH7-10條件下，反應5-15分鐘；(2)在弱堿性條件下，向上述溶液中加入烴鏈物質，其中優(yōu)選的是甲叉二胺或乙叉二胺；(3)加入多肽生長因子，脫水反應；(4)抽干、得到產品，優(yōu)選用抽濾漏斗抽干。
該種方法的反應機理如下式
本發(fā)明對使用的生物材料的表面進行分子設計，將一種或多種多肽生長因子以共價鍵的形式固定在生物醫(yī)用高分子材料的表面。多肽生長因子與細胞表面的受體結合后，不隨血液或組織液流走，并且由于共聚物體積較大，不易被細胞吞嗜和消化，穩(wěn)定地在局部起作用，使其半衰期延長，制成有特殊功能的“智能”材料。以此充當種子細胞、基質或可容性因子的配體或受體，使表面形成一個能與生物活性相適應的過渡層。同時生物醫(yī)用高分子材料還起到了用于誘導組織或器官再生的基本活性基質載體的作用，為再生物質提供了據(jù)以附著的骨架。從理論上來說，無論哪種多肽生長因子都可以用本發(fā)明的方法與生物醫(yī)用高分子材料載體物質進行連接。
由于有時發(fā)生多肽生長因子與生物醫(yī)用高分子材料結合后，多肽生長因子受生物醫(yī)用高分子材料的空間位阻影響，不能與細胞的受體充分結合，影響多肽生長因子的作用。在多肽生長因子與生物醫(yī)用高分子材料載體之間增設一烴鏈“手臂”，解決了由于載體的空間位阻關系，使細胞的受體不能直接接觸到多肽生長因子，而造成的結合在載體表面的小分子蛋白質或肽類/激素等可能產生的無效作用，“手臂”可以減少空間位阻、增加配基的活動度。如圖2所示，載體4上結合的多肽生長因子配基5當加上“手臂”6后，活動度明顯增強，使配基5能夠有效克服空間位阻，與靶細胞7的受體部位8有效結合。
本發(fā)明的長半衰期多肽生長因子共聚物可以在重建動物體病變或缺損組織或器官，制造重建動物體病變或缺損組織或器官的藥物中得到廣泛應用。


圖1為雞胚背根神經節(jié)(DRG)在結合有神經生長因子(NGF)生物醫(yī)用材料載體的作用下生長的神經纖維(顯微鏡照片)圖2為共聚物引入“手臂”原理示意3為大鼠腦損傷的修復圖4為猴神經損傷的修復，示新生的脊髓神經纖維具體實施方式
實施例1神經生長因子與殼聚糖結合形成的長半衰期神經生長因子共聚物神經生長因子(NGF)是神經系統(tǒng)最重要的生物活性物質之一，也是最早發(fā)現(xiàn)和最典型的神經營養(yǎng)因子。它影響外周和中樞神經系統(tǒng)某些神經元的存活和分化。近年來的實驗證明，成年人或動物中樞神經系統(tǒng)(大腦皮層和脊髓)的細胞損傷后可以再生。將本發(fā)明具有神經營養(yǎng)活性的共聚物應用于中樞神經系統(tǒng)損傷局部的活性基質，起到再生支架和促進再生作用。例如，腦外傷及脊髓損傷。
長半衰期神經生長因子共聚物的生產方法，包括以下步驟
1、向100ml 20％殼聚糖中加入5％的溴化氰溶液10ml，在pH7條件下反應15分鐘，使殼聚糖表面的羥基活化；2、向上述溶液中加入300ug神經生長因子(NGF)；3、室溫輕度振蕩40分鐘，4℃過液；4、0.1M交聯(lián)緩沖液(0.1MNaHCO3及0.5MNaCl)沖洗掉未交聯(lián)的多肽生長因子；5、在pH8.0條件下，用0.1MTris-HCl(或1M elhanolamint)封閉液封閉未交聯(lián)的被活化了的殼聚糖的羥基；6、沖洗掉封閉液，用抽濾漏斗抽干，得到產品。
在該實施例中，可使用的生物醫(yī)用材料載體還可以是聚乙烯醇、聚乳酸、層粘連蛋白(laminin)、明膠、膠元、L-多聚賴氨酸和透明質酸等表面具有羥基的物質。而神經營養(yǎng)素類的腦源性神經營養(yǎng)因子、神經營養(yǎng)素-3等均可用上述方法進行共聚偶聯(lián)。
實施例2堿性成纖維細胞生長因子與殼聚糖結合形成的帶有“手臂”的長半衰期堿性成纖維細胞生長因子共聚物堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可促進創(chuàng)面愈合，用于燒傷創(chuàng)面、慢性創(chuàng)面、體表潰瘍、褥瘡、和新鮮創(chuàng)面(包括外傷，供皮區(qū)創(chuàng)面，手術創(chuàng)傷等)。并且已經作為基因工程藥物在臨床應用。
帶“手臂”的長半衰期堿性成纖維細胞生長因子共聚物的生產方法，包括以下步驟1、在pH8.5的條件下，向100ml 20％殼聚糖溶液中加入5％的溴化氰溶液10ml，反應10分鐘，使殼聚糖的羥基活化；2、在pH8.5的條件下，向上述溶液中加入10％甲叉二胺3ml，使之進行脫水反應，甲叉二胺即為所要連接的“手臂”；3、加入500ug堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，使之進行脫水反應。
4、用抽濾漏斗抽干，得到產品。
在該實施例中，可以用加入脂族二胺分子的烴鏈長短來控制插入“手臂”的長短，可以用乙叉二胺等多種物質。
實施例3表皮生長因子與殼聚糖結合形成的長半衰期表皮生長因子共聚物表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)的生物學作用十分廣泛，它對多種組織來源的上皮細胞都有很強的促分裂作用。提示它可能會作為一種創(chuàng)傷愈合因子。另外，EGF還刺激各種間質細胞的增殖，包括，角膜內皮細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等，這又為上皮細胞，包括整個表皮的生長提供了所需的物質基礎。例如，Brown等人的實驗證明了其在切割傷和燒傷愈合中的作用。
長半衰期表皮生長因子共聚物的生產方法，包括以下步驟1、向表面含有氨基的100ml 30％殼聚糖溶液中加入1ml 15％的戊二醛，反應23小時；2、蒸餾水多次沖洗后，加入500ug表皮生長因子(EGF)；3、4℃下振蕩60分鐘，4℃過夜；4、磷酸緩沖液沖洗3次；5、抽濾漏斗抽干、得到產品。
在該實施例中，只要是表面含有氨基的生物醫(yī)用材料即可用此法，所偶聯(lián)的多肽生長因子是多樣的。
實施例4、紅細胞生成素與膠元結合形成的長半衰期共聚物紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種糖蛋白質。臨床治療部分貧血有較好的療效?，F(xiàn)已作為藥物用于臨床。
長半衰期紅細胞生成素共聚物的生產方法，包括以下步驟1、在pH6.0條件下，向含有糖鏈的300ug紅細胞生成素中加入5％過碘酸鈉100ml；2、向上述溶液中加入含有氨基的膠元0.1mg，反應2小時；3、加入2％NaBH45ml，生成穩(wěn)定的終產物；4、抽濾漏斗抽干，得到產品。
在該實施例中，只要是多肽生長因子含有糖鏈，生物醫(yī)用材料含有氨基，即可用該法。
實施例5本發(fā)明長半衰期共聚物的功能驗證1、采用體外細胞培養(yǎng)的方法檢測實施例1產品誘導雞胚背根神經節(jié)(DRG)神經纖維生長的作用。
用實施例1的產品進行重復細胞培養(yǎng)實驗取雞胚背根神經節(jié)(DRG)置于含有無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將上述共聚物加入到培養(yǎng)皿中，12-72小時后，可見DRG周圍有大量的神經纖維長出，重復上述實驗，將第一次培養(yǎng)皿中的共聚物無菌操作取出，放入第二次含有DRG的培養(yǎng)皿中，對照組則采用相同劑量的NGF(10-30ng/ml)。結果表明，沒有偶聯(lián)載體的神經生長因子在重復培養(yǎng)中失效，而本產品作用時間大大延長，可重復培養(yǎng)3-5次。如圖1所示，培養(yǎng)12-72小時后，雞胚背根神經節(jié)(DRG)3在含有神經生長因子(NGF)的載體2的作用下，DRG的神經纖維1己沿著載體2所搭建的支架為依托生長。
2、實施例1的產品對大鼠腦損傷的修復以wistar大鼠制作的腦損傷模型進行修復實驗，將大鼠大腦皮層運動區(qū)制作成為直徑1mm，深1mm的損傷區(qū)，將生物活性載體移植并填滿損傷區(qū)。手術后1、3、6、12個月進行病理切片觀察。結果表明，加入本發(fā)明神經生長因子(NGF)與殼聚糖或膠元結合形成的共聚物，6周后融合，無明顯排斥反應，載體支架內部有神經纖維長入并形成網絡聯(lián)系，而對照組仍為空洞(如圖3所示)。
3、實施例1的產品對大鼠和猴脊髓損傷的修復以wistar大鼠和高等靈長類動物-猴制作的脊髓損傷模型，將生物活性載體裝入人工神經導管并移植到損傷局部，實驗結果表明依據(jù)本發(fā)明制作的長半衰期多肽生長因子共聚物可以誘導脊髓組織結構的再生、生理機能的重建和行為障礙的恢復。移植12個月后，實驗組動物的脊髓損傷部位已經有新生的脊髓神經纖維形成(如圖4所示)，而對照組單純的人工神經導管和單純損傷組則無神經纖維束的再生。
4、實施例2的產品對燒傷的治療作用利用該產品以不與載體相偶聯(lián)的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)為對照在人和動物模型的燒傷和褥瘡上證明了其對創(chuàng)面愈合的速度快于對照組。臨床試驗II度燒傷病人10例，含有100AU/CM2載體細顆粒涂在患處，用紗布覆蓋，7日后基本愈合；最終使用量為100AU，而相同條件下，對照組病人使用bFGF粉劑，每日1次換藥，100AU/CM2，用紗布涂于患處，最終使用量為700AU，而愈合程度卻低于實驗組。說明bFGF與材料載體結合后有效期延長，減少了bFGF的用量。
5、實施例3的產品對褥瘡的治療作用利用該產品以不與載體相偶聯(lián)的表皮生長因子(EGF)為對照，在皮膚損傷人和動物模型上證明了其對創(chuàng)面愈合的速度快于對照組。臨床試驗褥瘡病人6例，將含有300AU/CM2載體細顆粒涂在患處，用紗布覆蓋，15日后基本愈合，中間換藥1次。最終使用量為600AU，而相同條件下，對照組病人使用EGF粉劑，每日1次換藥，300AU/CM2，用紗布涂于患處，最終使用藥量為2100AU，而愈合程度低于實驗組。說明EGF與材料載體結合后有效期延長，并減少了EGF的用量。
6、實施例4的產品對貧血動物模型的治療作用將實施例4的產品按照常規(guī)方法制成注射液。以苯肼誘發(fā)的貧血小鼠為模型(貧血小鼠模型的血紅蛋白，Hb≤30g/L血液)，實驗組和對照組各10只。經尾靜脈給藥十日，每日的用量為0.5％EPO(0.2ml)。取血化驗證明，實驗組被檢測血樣Hb的量升高至120g/L)，而對照組每日給予同樣劑量，被檢測血樣Hb的量升高至80g/L。說明膠元與EPO連接后其在體內的半衰期已經延長，提高了療效。
權利要求
1.長半衰期多肽生長因子共聚物，是多肽生長因子通過共價鍵或烴鏈與生物醫(yī)用高分子載體物質連在一起而形成的共聚物。
2.根據(jù)權利要求1所述的多肽生長因子共聚物，其特征在于所述生物醫(yī)用高分子材料載體物質為帶有羥基或氨基或既帶羥基又帶氨基的物質。
3.根據(jù)權利要求2所述的多肽生長因子共聚物，其特征在于所述生物醫(yī)用高分子材料載體物質為殼聚糖、層粘連蛋白、L-多聚賴氨酸、聚乙烯醇、膠元、明膠、聚乳酸或透明質酸；所述烴鏈為甲叉二胺或乙叉二胺。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的多肽生長因子共聚物，其特征在于所述多肽生長因子為神經生長因子、腦源性神經營養(yǎng)因子、神經營養(yǎng)素-3、神經營養(yǎng)素-4、神經營養(yǎng)素-5、神經營養(yǎng)素-6、堿性成纖維細胞生長因子、酸性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、紅細胞生成素、膠質細胞株源性神經營養(yǎng)因子、睫狀神經營養(yǎng)因子、運動神經元營養(yǎng)因子-1、運動神經元營養(yǎng)因子-2、骨形成蛋白(MBP)、Nogo的抗體和硫酸軟骨素的抗體。
5.一種制備多肽生長因子通過共價鍵與生物醫(yī)用高分子材料載體物質連在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步驟(1)活化高分子載體向表面含有羥基的生物醫(yī)用高分子材料載體中加入氧化劑，優(yōu)選的是加入溴化氰，在pH7-10條件下，反應5-15分鐘；(2)向上述溶液中加入多肽生長因子；(3)室溫輕度振蕩30-60分鐘，0-8℃過夜；(4)用緩沖液沖洗所得物，并用封閉液封閉未交聯(lián)的高分子材料中的活化基團；(5)離心沖洗、抽干，得到產品。
6.一種制備多肽生長因子通過共價鍵與生物醫(yī)用高分子材料載體物質連接在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步驟(1)向表面含有氨基的生物醫(yī)用高分子材料中加入雙活性試劑，優(yōu)選的是加入0.5％-15％的戊二醛或0.5-10％的多聚甲醛，2-8℃充分振蕩混勻22-26小時；(2)向上述溶液中加入多肽生長因子；(3)2-8℃下振蕩30-120分鐘，0-4℃過夜；(4)緩沖液沖洗數(shù)次，優(yōu)選為磷酸緩沖液；(5)抽干、得到產品。
7.一種制備多肽生長因子共聚物通過共價鍵與生物醫(yī)用高分子材料載體物質連接在一起形成含有糖鏈的多肽生長因子共聚物的方法，基本上包括以下步驟(1)在酸性條件下，含有糖鏈的多肽細胞因子與過碘酸鹽反應，其中優(yōu)選的是過碘酸納；(2)加入含有氨基的生物醫(yī)用高分子材料；(3)加入還原劑，優(yōu)選的是NaBH4；(4)抽干、得到產品。
8.一種制備多肽生長因子通過烴鏈與生物醫(yī)用高分子材料載體物質連在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步驟(1)活化高分子載體向表面含有羥基的生物醫(yī)用高分子材料中加入氧化劑，優(yōu)選的是加入溴化氰，在pH7-10條件下，反應5-15分鐘；(2)在弱堿性條件下，向上述溶液中加入烴鏈物質，其中優(yōu)選的是甲叉二胺或乙叉二胺；(3)加入多肽生長因子，脫水反應；(4)抽干、得到產品。
9.權利要求1-4所述的多肽生長因子共聚物在制造重建動物體病變或缺損組織或器官的藥物中的應用。
10.權利要求1-4所述的多肽生長因子共聚物在體外重建動物體病變或缺損組織或器官中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了長半衰期多肽生長因子共聚物及其制備方法與應用，以解決現(xiàn)有多肽生長因子半衰期短，再生組織或器官缺乏支架的問題；本發(fā)明共聚物是多肽生長因子通過共價鍵或烴鏈與生物醫(yī)用高分子載體物質連接在一起而形成的共聚物，制備上述物質的方法有四種。本發(fā)明共聚物在制造重建動物體病變或缺損組織或器官的藥物、新型醫(yī)用材料以及組織工程產品中可以得到廣泛的應用。
文檔編號A61K38/03GK1837239SQ20051005645
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月23日 優(yōu)先權日2005年3月23日
發(fā)明者李曉光 申請人:李曉光