專利名稱：一種連續(xù)中壓柱層析制備高純度egcg的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物化學領域，特別是涉及一種連續(xù)中壓柱層析制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG的方法。
背景技術：
表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG是從茶葉中提取的一種生物活性成分。流行病學和動物學實驗研究表明具有抗氧化活性的EGCG可以防治多種癌癥如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等等。層粘蛋白(laminin，LN)是細胞外基質(zhì)中重要的一種糖蛋白，具有很強的介導細胞粘附和受體結(jié)合的特性。最新研究表明，EGCG能夠與層粘蛋白受體(67-kDa laminin receptor，67LR)作用，抑制67LR與層粘蛋白的結(jié)合，而腫瘤細胞通過67LR與LN的粘附作用，分泌多種蛋白水解酶，使貼近腫瘤表面的有限區(qū)域的基質(zhì)降解，從而促使腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，形成腫瘤細胞轉(zhuǎn)移通路。同時，EGCG能夠直接抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的水解活性，抑制腫瘤血管生成。因此，EGCG的開發(fā)和應用已受到廣泛關注。
由于茶葉中各種多酚組分的化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)十分相近，極性強，一般方法很難達到對其單體的分離。目前，根據(jù)已公開的專利，EGCG的純化工藝有如下幾種公開號為CN1367171A的專利介紹了一種高含量EGCG兒茶素的提取方法，該法以普通的黃色茶多酚為原料，在室溫、壓力范圍為0.1～1.0MPa的條件下，經(jīng)過一系列的無害惰性有機溶劑多步逆流萃取后，調(diào)整溶液的pH值在2.5～7.5之間，進行二價或三價金屬鹽沉淀反應，沉淀經(jīng)過濾、熱水洗滌和酸溶后，用乙酸乙酯萃取，萃取的有機溶劑相再進行水洗脫酸、減壓濃縮、重結(jié)晶，養(yǎng)晶后的結(jié)晶物經(jīng)過濾、冷凍雙重水洗滌，最后進行冷凍干燥而成。該工藝得到EGCG有效含量為90％產(chǎn)品。但該工藝過程較復雜，即有大量有機溶劑的萃取，又有金屬鹽沉淀反應，并且還涉及重結(jié)晶等過程。所需溶劑量大，處理量較小，難以工業(yè)化生產(chǎn)。
公開號為CN1277068A的專利介紹了一種高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，它包括配制構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系；使逆流色譜儀柱子中充滿固定相；然后使其主機轉(zhuǎn)動，再將流動相泵入柱內(nèi)；由進樣閥進樣；根據(jù)檢測器譜圖接收目標成分，所用溶劑體系可以是脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮，水；或者是烷烴，脂肪酯，水所構(gòu)成的兩相溶劑體系，以上相為固定相，下相為流動相。目前的逆流色譜技術難以得到含量大于98％的產(chǎn)品，且一次分離樣品量小，分離時間長，目前僅處于研究階段。
公開號為CN1319597A的專利介紹了一種茶多酚中兒茶素類化合物的分離方法，使茶多酚通過1.5米高度的葡聚糖Sephadex LH-20填充柱，用丙酮含量在10～30％之間的丙酮——乙醇二元混合溶劑洗脫，流速每小時5～30毫升，分離出表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，表兒茶素沒食子酸酯(ECG)兒茶素單體，純度為90％，少量可達95％。但該工藝使用1.5米高度的葡聚糖Sephadex LH-20填充柱，價格昂貴，且茶多酚處理量較少，每次1.5g左右，并且產(chǎn)品的得率較低。
公開號為CN1470510A的專利本發(fā)明公開了一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG單體制備方法。它包括綠茶提取物加水使之溶解，加入氯化鈉，鹽析，過濾除雜，濾液用等體積乙酸乙酯萃取，活性炭脫色，減壓回收乙酸乙酯至干，加入90％乙醇水溶液溶解后，上Sephadex LH-20柱層析(綠茶提取物重與吸附劑重量比為1∶15)，用90％乙醇水溶液作為洗脫劑洗脫，根據(jù)紫外檢測結(jié)果，收集表沒食子兒茶素沒食子酸酯流份，減壓回收乙醇至干，再加適量水溶解，于10℃以下結(jié)晶，EGCG純度可達98％以上。但該工藝復雜，包括鹽析、溶劑萃取、活性炭脫色、葡聚糖Sephadex LH-20柱層析、重結(jié)晶等過程。成本高，不易于工業(yè)化生產(chǎn)。
公開號為CN1465572A的專利將1g茶葉提取物，加入3～4ml的溶解溶劑，過濾，得紅棕色溶液，在4～6℃低溫下慢慢加入18～32ml的結(jié)晶溶劑，待兒茶素析出完全，攪拌使結(jié)塊沉淀分散，放置，充氮真空抽濾，取濾渣加入與上述等體積的溶解溶劑溶解，等體積的結(jié)晶溶劑沉淀，充氮真空抽濾，取濾渣。如此重復不少于7次，濾渣用蒸餾水溶解制成濃度為15％的溶液，過葡聚糖凝膠LH-20柱，用洗脫溶劑洗脫，收集EGCG流分，綠色條帶出盡后收集，40℃減壓真空回收洗脫溶劑，冰凍干燥，即可?？色@純度大于98％的產(chǎn)品。但該工藝較復雜，涉及多步結(jié)晶，甚至重復達9次之多，并且結(jié)合葡聚糖凝膠LH-20柱層析，價格昂貴，不利于實現(xiàn)。
綜上所述，上述諸多提純方法雖然可以達到較高的純度，但存在的諸多問題限制了它在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案包括使用含量不低于50％EGCG的茶多酚為原料，制備純度高于98％的EGCG產(chǎn)品。使用中壓硅膠填充柱，將層析硅膠用烴溶劑分散后裝柱，酯溶劑溶樣，烴溶劑與酯溶劑和甲酸的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，濃縮物加去離子水溶解后噴霧干燥得純度高于98％EGCG產(chǎn)品，低純度組分作為層析原料再次純化。回收的洗脫劑經(jīng)薄層層析、pH校正后重復使用。使用后的層析柱用酯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。
中壓層析硅膠填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～100cm，填充層析硅膠粒徑為200～800目，柱壓為0.1～5MPa。
洗脫劑為酯溶劑∶烴溶劑∶甲酸(v/v/v)＝4∶7∶1～9∶7∶1的混合溶液。
所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、石油醚，酯溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，甲酸為含水甲酸，含量88％。
EGCG原料溶解于酯溶劑中，質(zhì)量濃度為20～80％。每次分離所用原料質(zhì)量與柱中層析硅膠質(zhì)量之比在1∶15～1∶100之間。
分段收集的流分含量高于97％的進入噴霧干燥過程，含量低于97％的按照上述分離方法重新上樣分離。
洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑做為薄層展開劑，將EGCG對照品點于薄層層析板上展開，根據(jù)展開的Rf值，添加烴溶劑或酯溶劑使與原始配比的Rf值相近，甲酸的配比根據(jù)pH調(diào)節(jié)。
再生劑用量為2～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、整個工藝生產(chǎn)周期短，只需8～12h，溶劑用量少。
2、本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，本法的層析柱可重復使用，使用次數(shù)達30次以上，降低了成本，大大提高了生產(chǎn)效率。
3、純化過程無污染，所有溶劑均可回收使用，便于工業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面對本發(fā)明實施作進一步詳細描述使用含量不低于50％EGCG的茶多酚為原料，制備純度高于98％的EGCG產(chǎn)品。使用中壓硅膠填充柱，將層析硅膠用烴溶劑分散后裝柱，酯溶劑溶樣，烴溶劑與酯溶劑和甲酸的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，濃縮物加去離子水溶解后噴霧干燥得純度高于98％EGCG產(chǎn)品，低純度組分作為層析原料再次純化?；厥盏南疵搫┙?jīng)薄層層析、pH校正后重復使用。使用后的層析柱用酯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。中壓層析硅膠填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～100cm，填充層析硅膠粒徑為200～800目，柱壓為0.1～5MPa。
洗脫劑為酯溶劑∶烴溶劑∶甲酸(v/v/v)＝4∶7∶1～9∶7∶1的混合溶液。
所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、石油醚，酯溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，甲酸為含水甲酸，含量88％。
EGCG原料溶解于酯溶劑中，質(zhì)量濃度為20～80％。每次分離所用原料質(zhì)量與柱中層析硅膠質(zhì)量之比在1∶15～1∶100之間。
分段收集的流分含量高于97％的進入噴霧干燥過程，含量低于97％的按照上述分離方法重新上樣分離。
洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑作為薄層展開劑，將EGCG對照品點于薄層層析板上展開，根據(jù)展開的Rf值，添加烴溶劑或酯溶劑使與原始配比的Rf值相近，甲酸的配比根據(jù)pH調(diào)節(jié)。
再生劑用量為2～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
實施例1將活度為II級的300～500目層析硅膠3kg用石油醚勻漿濕法裝于內(nèi)徑為8cm的玻璃層析柱中，洗脫劑為乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1，100g 65％含量的EGCG粗品加入上述洗脫劑溶解，濾除不溶物后用柱塞式溶劑泵上于柱頭，然后泵入洗脫劑洗脫，分段收集流分，TLC和HPLC檢測，合并含量97％以上的流出液，減壓回收洗脫劑后得濃縮物，加入100ml去離子水溶解，噴霧干燥得EGCG 45g，純度98.2％，含量低于97％的減壓回收洗脫劑后作為下次柱層析的原料。回收的洗脫劑經(jīng)薄層層析和pH校正后下次重復使用，洗脫后的層析硅膠柱泵入10L乙酸乙酯再生，然后再泵入15L石油醚平衡，平衡后的層析硅膠柱待下次直接使用。EGCG總回收率95.3％。
實施例2100g 65％含量的EGCG粗品加入乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1洗脫劑溶解后泵入實施例1已平衡好的層析硅膠柱，依實施例1方法操作，得精品EGCG 47.1g，純度98.5％。EGCG總回收率96.1％。
實施例3實施例1方法得到的75％含量EGCG 85g加入乙酸乙酯∶石油醚∶甲酸(v/v/v)＝5.8∶7∶1洗脫劑溶解后泵入實施例1已平衡好的層析硅膠柱，依實施例1方法操作，得精品EGCG 44.6g，純度98.1％。EGCG總回收率96.5％。
實施例4將活度為II級的300～500目層析硅膠3kg用石油醚勻漿濕法裝于內(nèi)徑為8cm的玻璃層析柱中，洗脫劑為乙酸甲酯∶正己烷∶甲酸(v/v/v)＝4.5∶7∶1，100g 65％含量的EGCG粗品加入上述洗脫劑溶解，濾除不溶物后用柱塞式溶劑泵上于柱頭，然后泵入洗脫劑洗脫，分段收集流分，TLC和HPLC檢測，合并含量97％以上的流出液，減壓回收洗脫劑后得濃縮物，加入100ml去離子水溶解，噴霧干燥得EGCG 48g，純度98.6％，含量低于97％的減壓回收洗脫劑后作為下次柱層析的原料。回收的洗脫劑經(jīng)薄層層析和pH校正后下次重復使用，洗脫后的層析硅膠柱泵入10L乙酸甲酯再生，然后再泵入15L正己烷平衡，平衡后的層析硅膠柱待下次直接使用。EGCG總回收率95.2％。
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，使用含量不低于50％EGCG的茶多酚為原料，制備純度高于98％的EGCG產(chǎn)品，使用中壓硅膠填充柱，將層析硅膠用烴溶劑分散后裝柱，酯溶劑溶樣，烴溶劑與酯溶劑和甲酸的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，濃縮物加去離子水溶解后噴霧干燥得純度高于98％EGCG產(chǎn)品，低純度組分作為層析原料再次純化，回收的洗脫劑經(jīng)薄層層析、pH校正后重復使用，使用后的層析柱用酯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用。
2.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于中壓層析硅膠填充柱柱長30～350cm，柱直徑5～100cm，填充層析硅膠粒徑為200～800目，柱壓為0.1～5MPa。
3.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于洗脫劑為酯溶劑∶烴溶劑∶甲酸(v/v/v)＝4∶7∶1～9∶7∶1的混合溶液。
4.按照權(quán)利要求1和3所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于所用的烴溶劑為正己烷、正庚烷、環(huán)己烷、石油醚，酯溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，甲酸為含水甲酸，含量88％。
5.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于EGCG原料溶解于酯溶劑中，質(zhì)量濃度為20～80％。
6.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于每次分離所用原料質(zhì)量與柱中層析硅膠質(zhì)量之比在1∶15～1∶100之間。
7.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于分段收集的流分含量高于97％的進入噴霧干燥過程，含量低于97％的按照上述分離方法重新上樣分離。
8.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于洗脫劑的薄層層析校正是將回收的洗脫劑作為薄層展開劑，將EGCG對照品點于薄層層析板上展開，根據(jù)展開的Rf值，添加烴溶劑或酯溶劑使與原始配比的Rf值相近，甲酸的配比根據(jù)pH調(diào)節(jié)。
9.按照權(quán)利要求1所述的連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，其特征在于再生劑用量為2～10Bv，平衡劑用量為5～20Bv。
全文摘要
一種連續(xù)中壓柱層析制備高純度EGCG的方法，使用含量不低于50％EGCG的茶多酚為原料，制備純度高于98％的EGCG產(chǎn)品。使用中壓硅膠填充柱，將層析硅膠用烴溶劑分散后裝柱，酯溶劑溶樣，烴溶劑與酯溶劑和甲酸的混合液為洗脫劑，柱塞式溶劑泵進液，洗脫后的流分分段收集，減壓濃縮回收洗脫劑，濃縮物加去離子水溶解后噴霧干燥得純度高于98％EGCG產(chǎn)品，低純度組分作為層析原料再次純化?；厥盏南疵搫┙?jīng)薄層層析、pH校正后重復使用。使用后的層析柱用酯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重復使用，使用次數(shù)達30次以上。本方法的主要特點為純化過程無污染，所有溶劑均可回收使用，便于工業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)。
文檔編號C07D311/00GK1724530SQ20051001017
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者祖元剛, 楊磊, 高彥華, 祖柏實, 李慶勇, 付玉杰, 張玉紅 申請人:東北林業(yè)大學, 祖元剛