專利名稱：鮑肽素及其制備方法和在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種鮑肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)及其制備方法和在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1、關(guān)于老年癡呆老年癡呆是老年人腦循環(huán)障礙、腦功能失調(diào)的一種表現(xiàn)，是以智力衰退和行為及人格異常變化為特征的一種病癥。臨床表現(xiàn)主要有記憶力、抽象思維及定向力障礙等。目前該病主要分為阿爾茨海默氏病(Alzheimer disease AD)、血管性癡呆(Vascular dementia VD)及混合性癡呆3型。阿爾茨海默氏病的發(fā)病機(jī)制目前尚不甚明了；血管性癡呆多是由于長(zhǎng)期的慢性缺血或急性的腦卒中所致。我國(guó)老年癡呆發(fā)病率為2％～18％，65歲以上癡呆發(fā)病率為3.9％，其中血管性癡呆占68.5％，居癡呆患者的首位，并呈隨年齡增長(zhǎng)而上升的趨勢(shì)。西醫(yī)對(duì)血管性癡呆的治療，大都以調(diào)節(jié)大腦代謝藥、緩解精神癥狀藥、抗凝血、溶栓藥、擴(kuò)張血管藥等對(duì)癥處理之。近年來(lái)，應(yīng)用中醫(yī)藥防治老年癡呆的進(jìn)展較快，其優(yōu)勢(shì)業(yè)已初露端倪，日益受到廣泛的重視。
2、關(guān)于失眠和神經(jīng)衰弱腦力勞動(dòng)過(guò)度、精神壓力過(guò)大、長(zhǎng)期緊張疲勞、人體生物鐘紊亂、臟腑功能失平衡都可導(dǎo)致失眠和神經(jīng)衰弱。失眠是最常見的一種睡眠障礙，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，約有35％以上的人患失眠，其中17％為長(zhǎng)期深度失眠，老年人占60％。睡眠不足和神經(jīng)衰弱，可導(dǎo)致精神萎糜、疲乏無(wú)力、頭昏腦脹、注意力減低、植物神經(jīng)功能紊亂，最終縮短生命周期。長(zhǎng)期服用化學(xué)合成的安眠藥、鎮(zhèn)靜藥，有可能削弱記憶能力、誘發(fā)老年癡呆、形成藥物依賴。
3、關(guān)于營(yíng)養(yǎng)性貧血營(yíng)養(yǎng)性貧血是常見的營(yíng)養(yǎng)缺乏病。據(jù)WHO資料顯示，小兒發(fā)病率高達(dá)52％，男性成人約為10％，女性20％以上，孕婦約40％。復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院經(jīng)城市1042名初生至13歲小兒的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)3月組發(fā)病率13.2％，6月組42.2％，1～2歲組31.8％，2歲以上較低，7～13歲組15.1％；據(jù)復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院資料，在非妊娠育齡女工中的Hb＜110g/L發(fā)病率為11.39％，妊娠女工中Hb＜100g/L為19.28％。營(yíng)養(yǎng)性貧血的治療，常施以口服二價(jià)鐵劑、注射鐵劑，或在膳食中應(yīng)用鐵強(qiáng)化食品，但是，長(zhǎng)期進(jìn)食鐵補(bǔ)充劑后是否引起鐵中毒的問(wèn)題尚未得到充分的答案。
4、關(guān)于皮膚干褶WHO的健康定義中包含皮膚健康，可見，皮膚健康屬于人體健康的一個(gè)重要方面。皮膚的健康與否由外觀、濕度、彈性、張力、色澤、細(xì)度等鑒別。內(nèi)在睡眠不足、營(yíng)養(yǎng)缺乏、血液循環(huán)不良，外在不注意清潔、護(hù)膚，都有可能引發(fā)皮膚干褶。外用涂抹化學(xué)護(hù)膚品，有一定保養(yǎng)作用。但皮膚最外層的表皮中沒(méi)有血管，其吸收作用有限，皮膚的營(yíng)養(yǎng)主要來(lái)自真皮的血液供應(yīng)，故一般的外用化學(xué)護(hù)膚品很難持久、深透；還有，不同的季節(jié)、不同的氣溫、不同的濕度、不同的汗液酸堿度，都有可能對(duì)涂抹在皮膚上的化學(xué)護(hù)膚品產(chǎn)生一些影響。
5、關(guān)于海洋生物——鮑魚海洋是生命的發(fā)源地，地球上生命30多億年的發(fā)展史，其中85％以上的時(shí)間是完全在海洋中度過(guò)的。海洋與陸地相比具有很大的特殊性，尤其是深海的強(qiáng)大壓力和黑暗無(wú)光，使海洋動(dòng)物、細(xì)菌等在外部和內(nèi)部形態(tài)上的多樣性和特殊性十分明顯。這些特征和活性成份，陸棲生物是無(wú)法完全替代的。
鮑魚為馳名海珍品，早在西漢初年《黃帝內(nèi)經(jīng)》醫(yī)書中，就有用海洋生物鮑魚汁治血枯病的記載。有學(xué)者(彭汶鐸等.柳珊瑚酸及其衍生物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1996，17<3>215-218)從海南柳珊瑚中分離到一種類似中樞擬膽堿化學(xué)藥的成份——柳珊瑚酸，后者主要用于治療阿爾茨海默氏病(AD)。對(duì)于位居我國(guó)老年癡呆發(fā)病率首位的血管性癡呆治療，檢索尚未見任何有關(guān)海洋生物的有效應(yīng)用；對(duì)于鮑肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)及其制備方法和在生物醫(yī)藥中應(yīng)用，本發(fā)明申請(qǐng)人在檢索過(guò)程中及經(jīng)衛(wèi)生部上海市醫(yī)學(xué)科技查新委員會(huì)國(guó)內(nèi)外檢索報(bào)告(報(bào)告書編號(hào)2004126)，也未發(fā)現(xiàn)任何有關(guān)報(bào)道。本發(fā)明，不采用依化學(xué)合成藥結(jié)構(gòu)去尋找海洋生物替代品的模式操作，而尋徑從醫(yī)到藥、從人到物、從整體到局部、從已有記載的經(jīng)典方劑中去高通量篩選有效成分的中藥制藥思路，并為我們制備合成鮑肽素及其片段提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是公開一種具有改善大腦和皮膚血液循環(huán)、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、提高睡眠質(zhì)量、緩解神經(jīng)衰弱、防治皮膚干褶作用的鮑肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，同時(shí)公開其制備方法和在防治老年癡呆、記憶減退、長(zhǎng)期失眠、神經(jīng)衰弱、營(yíng)養(yǎng)性貧血、皮膚干褶的藥物和保健食品(食品)、化妝品中的應(yīng)用。
鮑肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，是本發(fā)明人首次從海洋生物鮑魚中提取分離的一種單鏈多肽，分子量＜105。其一級(jí)結(jié)構(gòu)中組成為丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、色氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、天冬氨酸。
本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將活體鮑魚放入凈水暫養(yǎng)池，使其排出體內(nèi)排泄物后移至流水池，剝?nèi)ネ鈿?，取出整個(gè)鮑魚內(nèi)臟團(tuán)組織，棄其水份，放入立式粉碎機(jī)中粉碎后，再放入組織勻漿器中研磨成勻漿，將內(nèi)臟團(tuán)勻漿置于容器中，逐次加入適量醫(yī)用乙醇、苯甲酸鈉、硫酸鋁鉀，經(jīng)混合、攪拌再加入適量鹽酸，致pH值為4,4000r/min離心15min，去上清，沉淀部分加入適量醫(yī)用乙醇攪拌，濾除乙醇?xì)堃海糜诓ＡЦ稍锲髦?，真空干燥后即得。分子量測(cè)定用十二烷基磺酸納一聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法，氨基酸測(cè)定用高速氨基酸自動(dòng)分析儀，純度測(cè)定用高效液相色譜(HPLC)法。
用本發(fā)明制成的生物醫(yī)藥產(chǎn)品，能提高擬血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和血紅蛋白含量，改善右利手老年血管性癡呆患者的體征，減緩中老年人的神經(jīng)衰弱和失眠狀態(tài)，使長(zhǎng)白豬皮膚代謝活躍、彈性纖維增加。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。取活體鮑魚，放入凈水暫養(yǎng)池，使其排出體內(nèi)排泄物，再移至流水池，剝?nèi)ヵU魚外殼，取出整個(gè)鮑魚內(nèi)臟團(tuán)組織，棄其水份，放入立式粉碎機(jī)中粉碎后，再放入組織勻漿器中研磨成勻漿，將內(nèi)臟團(tuán)勻漿置于容器中，逐次加入適量醫(yī)用乙醇、20％苯甲酸鈉、10％硫酸鋁鉀，配制比例為鮑魚內(nèi)臟團(tuán)勻漿∶乙醇∶20％苯甲酸鈉∶10％硫酸鋁鉀＝45∶35∶0.8∶1.2，經(jīng)混合、攪拌再加入適量鹽酸，致pH值為4,4000r/min離心15min，去除上清，沉淀部分加入適量醫(yī)用乙醇攪拌，經(jīng)清洗消毒后再過(guò)濾除去乙醇?xì)堃?，放入干燥器中，?jīng)真空冷凍干燥器真空干燥后即得到鮑魚鮑肽素干粉，于無(wú)菌操作室中將該干粉按劑量裝入無(wú)菌容器中密封備用。
1、擬血管性癡呆大鼠實(shí)驗(yàn)潔凈級(jí)雄性SD大鼠，體重321±29.43g，隨機(jī)分為4組。第1、2、3組為造模+鮑肽素組(小劑量、中劑量、大劑量組)，總數(shù)為54只(以造模2/3成功率計(jì))；第4組12只，為空白對(duì)照組。于造模后第60d處死。
模型制備實(shí)驗(yàn)組，10％水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉，臥位固定在帶電熱痰的手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用1號(hào)絲線結(jié)扎，切口撒青霉素粉適量，縫合切口?？瞻讓?duì)照組麻醉、手術(shù)過(guò)程與實(shí)驗(yàn)組同，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈。整個(gè)手術(shù)過(guò)程用肛表觀察肛溫，保持肛溫在37+0.5℃。
行為檢測(cè)各組在術(shù)后60d進(jìn)行Morris水迷宮癡呆檢測(cè)。定位航行檢測(cè)連續(xù)訓(xùn)練4.5d，分am和pm時(shí)段，分別記錄為1am、1pm，2am、2pm，3am、3pm，4am、4pm，5am，每個(gè)時(shí)段再各分為4次。每次均隨機(jī)順序從不同等分水池的4個(gè)起點(diǎn)將大白鼠面向池壁投入水池中，記錄大白鼠從水中找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間，該時(shí)間定義為逃避潛伏期。讓大白鼠在平臺(tái)上休息100s后再進(jìn)行下一次檢測(cè)，如果在120s內(nèi)大白鼠仍未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)到平臺(tái)，此時(shí)逃避潛伏期記為最高值120s。每一時(shí)間段內(nèi)4次逃避潛伏期的平均值即為這時(shí)段的成績(jī)?？臻g探索檢測(cè)第5d的pm，撤去平臺(tái)，在水池隨機(jī)任意點(diǎn)將大白鼠投入水池中，記錄大白鼠在2min內(nèi)穿過(guò)原先平臺(tái)所在位置的次數(shù)。
癡呆標(biāo)準(zhǔn)以對(duì)照組逃避潛伏期均值為參照，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組大白鼠各鼠各時(shí)段的平均逃避潛伏期值與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期值的比值，此比值＞35％定為癡呆。
給藥途徑及方法灌胃給藥，分別為1.0ml/100g、1.5ml/100g、2.0ml/100g，每日2次。
學(xué)習(xí)與記憶能力檢測(cè)采用Y型迷宮法測(cè)試。Y型迷宮為三等分120°輻射封閉式三條箱臂。箱臂底板為銅柵，銅柵通電后可產(chǎn)生0.6-0.8mA強(qiáng)度的電流。三條箱臂近端相通，每條箱臂遠(yuǎn)端設(shè)有信號(hào)燈，當(dāng)某一箱臂信號(hào)燈亮?xí)r，該箱臂的銅柵就不通電，因此，信號(hào)燈亮的箱臂為安全區(qū)。安全區(qū)箱臂隨機(jī)更替。經(jīng)學(xué)習(xí)3分鐘后測(cè)試，若大鼠直接進(jìn)入安全區(qū)記5分，反之不記分。結(jié)果見表1。
血液檢測(cè)指標(biāo)為紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(Hb)。結(jié)果見表2。
表1. 血液檢測(cè)結(jié)果

表2. Y型迷宮法測(cè)試結(jié)果

2、右利手老年血管性癡呆患者臨床觀察我們持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察了鮑肽素對(duì)31例右利手老年血管性癡呆患者的療效，每日1劑，8.5ml/kg，分3次沖服，90d為1療程，分別在0d、30d、60d、90d行基礎(chǔ)局部腦血流灌注顯像與認(rèn)知激活顯像，在0d、90d行認(rèn)知能力篩查量表(CASI)和跨文化認(rèn)知檢查(CCCE)等認(rèn)知評(píng)定。結(jié)果顯示，治療組基礎(chǔ)局部腦血流灌注顯像與認(rèn)知激活顯像均示額葉、顳葉、基底節(jié)等腦區(qū)血流低灌注有所改善，與對(duì)照組(28例)相比60d差異有顯著性意義(P＜0.05)，90d差異有極顯著性意義(P＜0.01)，90d的CASI和CCCE等積分均有所改善，與自身相比0d差異有極顯著性意義(P＜0.01)，與對(duì)照組相比90d差異亦有極顯著性意義(P＜0.01)。
3、中老年人神經(jīng)衰弱和失眠狀態(tài)臨床觀察我們陸續(xù)觀察了鮑肽素對(duì)29例臨床診斷為神經(jīng)衰弱患者的療效，其中16例為治療組，每日1劑，6.5ml/kg，分3次沖服，60d為1療程，13例使用淀粉安慰劑作為對(duì)照組。治療組年齡49.53±4.75歲，其中9名為女性，6名為男性，對(duì)照組年齡45.91±7.36歲，其中8名為女性，5名為男性。在治療周期始末分別填寫主觀問(wèn)卷和用注意力測(cè)試儀測(cè)試注意力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，治療組的精神萎糜、疲乏無(wú)力、困倦思睡、頭昏腦脹癥狀及植物神經(jīng)功能紊亂癥狀等均有所減輕，而注意力測(cè)試評(píng)分的客觀指標(biāo)明顯提高。
4、長(zhǎng)白豬皮膚實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)白公豬皮膚上做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。20-24天齡長(zhǎng)白公豬，體重43.84±6.73kg，分外敷+內(nèi)服組、外敷組、內(nèi)服組、空白對(duì)照組4組。取鮑肽素干粉與適量滑石粉、氧化鋅、硅酸鋁按5∶3∶1∶1比例調(diào)和拌勻，空白對(duì)照組不放鮑肽素干粉，每天外敷后維持30分鐘，連續(xù)30天，內(nèi)服10ml/kg，每日2次。常規(guī)病理切片、染色，光學(xué)顯微鏡下，可見外敷+內(nèi)服組長(zhǎng)白豬表皮底層的基底細(xì)胞代謝活躍，真皮的毛細(xì)血管與膠原纖維分布廣泛、彈力纖維纏繞增多，與空白對(duì)照組相比差異有極顯著意義，與外敷組和內(nèi)服組相比差異有顯著意義。
權(quán)利要求
1.鮑肽素(Polypetide From Haliotidae，PFH)，其特征是從海洋生物鮑魚內(nèi)臟團(tuán)中分離得到的一種單鏈多肽，分子量＜105。其一級(jí)結(jié)構(gòu)中組成為丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、色氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、天冬氨酸。
2.鮑肽素的制備方法，其特征是取活體鮑魚，流水清洗，剝?nèi)ネ鈿?，將鮑魚內(nèi)臟團(tuán)組織棄水份后置粉碎機(jī)中粉碎、勻漿器中研磨，將勻漿置容器中，逐次加入適量醫(yī)用乙醇、苯甲酸鈉、硫酸鋁鉀，經(jīng)混合、攪拌再加入適量鹽酸，致pH值為4，4000r/min離心15min，去上清，沉淀部分加入適量醫(yī)用乙醇攪拌，去乙醇?xì)堃?，真空干燥后即得?br> 3.鮑肽素作為制備防治老年癡呆、記憶減退、長(zhǎng)期失眠、神經(jīng)衰弱、營(yíng)養(yǎng)性貧血、皮膚干褶的藥物和保健食品(食品)、化妝品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。鮑肽素(PFH)是從鮑魚內(nèi)臟團(tuán)中分離得到的一種單鏈多肽，分子量＜10
文檔編號(hào)C07K14/08GK1690074SQ20041001779
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者萬(wàn)平, 萬(wàn)柔, 賴小儉 申請(qǐng)人:萬(wàn)平, 萬(wàn)柔, 賴小儉