專利名稱：使用衍生自ap205外殼蛋白的病毒樣顆粒的分子抗原陣列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學、免疫學、病毒學和分子生物學領域。
背景技術：
接種提供了抵抗感染性疾病的最有效途徑之一，并且在上個世紀對公眾健康產(chǎn)生了最重要的益處。早期接種方案使用活的、減毒的或滅活的病原體作為免疫原。公眾和官方在安全性方面的關注一直以來促進了對更確定的和更安全的疫苗的探索。
該探索促進了新的研究方向，其中單個抗原被分離或重組表達，并且作為免疫原進行注射。這些研究的例子包括亞單元疫苗的開發(fā)和利用。然而，因為分離的蛋白質通常沒有足以導致保護性免疫應答的免疫原性，所以這種疫苗常常需要添加佐劑以產(chǎn)生足夠抵抗抗原的免疫應答。盡管已知幾種強的佐劑，諸如弗氏完全佐劑，但是它們通常是有毒的，并且不能在人類中使用。因此，大量的努力被投入到新佐劑的探索中。
最近，對免疫系統(tǒng)區(qū)分自我和外來物的原理的研究已經(jīng)表明病毒表面上抗原的組織程度和重復性是抗原作為外來物被識別的非常強的信號(Bachmann & Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。在基于病毒樣顆粒(VLP)的新疫苗設計中利用了病毒結構的這種特性，該新疫苗聯(lián)合了病毒結構的免疫原性和非復制疫苗改進的安全性。在這些疫苗中，抗原融合或化學附著(chemical attachment)于病毒樣顆粒上，所述化學附著是共價或非共價的。這樣，通過連接抗原和病毒樣顆粒，病毒結構的免疫原特性被轉移給抗原。
各種VLP已經(jīng)用于附著抗原。例如，WO 00/32227描述了乙型肝炎病毒核心抗原在一些類型疫苗的生產(chǎn)中的用途。
WO 03/056905中公開了一類新的高度可表達的并具有高度免疫原性的VLP，這里將這篇文獻整體并入為參考文獻。這些VLP由RNA噬菌體的外殼蛋白組成。該外殼蛋白在細菌中重組表達，并且VLP不含有噬菌體RNA基因組，因此不能復制。
最近鑒定了新RNA噬菌體，AP205(Klovins，J.，等，J Gen.Virol.831523-33(2002).)。AP205 RNA噬菌體(Taxonomy ID154784)是單鏈、正鏈RNA(沒有DNA階段)病毒，其屬于輕小病毒科(Leviviridae)，輕小病毒屬(Levivirus Genus)，未分類的輕小病毒(Unclassified Levivirus)亞組。該亞組的其它成員是RNA噬菌體BO1，fr1，TW19和PP7。兩種已描述的輕小病毒亞組包括下列RNA噬菌體fr，JP501，f2，M12，MS2和R17(亞組I)和BZ13，JP34，TH1，GA和KU1(亞組II)。AP205基因組長4267核苷酸(nt)。全長基因組序列登錄號AF334111，NC-002700。AP205噬菌體的天然宿主是不動桿菌屬種(Acinetobacter Spp.)(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205噬菌體基因組包含3個大的開放讀框(ORFs)，其編碼成熟蛋白、外殼蛋白和復制酶蛋白質。此外，在5，末端還存在兩個小ORF，位于成熟蛋白基因之前。這些ORFs編碼的蛋白質的功能未知。推測這些ORF之一可能編碼裂解蛋白質(Klovins，J.，等，J.Gen.ViroL.831523-33(2002))。

發(fā)明內容
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明載體，可以在細菌中重組表達AP205外殼蛋白。我們也已經(jīng)研究出了AP205病毒樣顆粒的純化方法。而且，正如電子顯微鏡術(EM)和免疫擴散所證明的，本發(fā)明方法產(chǎn)生的AP205外殼蛋白自發(fā)地形成衣殼，因此在大腸桿菌(E.coli)中，外殼蛋白單獨與RNA一起就足以裝配衣殼。這排除了兩種未知功能ORFs編碼的蛋白質的任何作用。本發(fā)明令人驚奇的特征是在結構已闡明的其它RNA噬菌體外殼蛋白和AP205外殼蛋白之間不存在序列同源性，但是當在電子顯微鏡(EM)下觀察時，AP205外殼蛋白形成的衣殼和這些RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼具有幾乎是不能區(qū)分的結構特征。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AP205 VLP具高度免疫原性，并且其可以連接有機分子以產(chǎn)生疫苗構建體，從而展示出以重復方式定向的有機分子。針對此展示的有機分子已經(jīng)誘導了高效價，這表明結合的有機分子可以被抗體分子接近以發(fā)生相互作用，并且具有免疫原性。
本發(fā)明提供了重組表達的病毒樣顆粒(VLP)，其從至少一種大腸桿菌中重組表達的噬菌體AP205外殼蛋白自發(fā)裝配而成。在相關的方面，本發(fā)明提供了能夠裝配的突變形式的AP205 VLP，其包括在氨基酸5位具有脯氨酸到蘇氨酸置換的AP205外殼蛋白(SEQ ID NO3)。這些VLP，來源于天然來源的AP205 VLP(SEQ ID NO1)或AP205病毒顆粒，可以結合至少一種有機分子以產(chǎn)生有機分子的有序重復陣列。本發(fā)明的有機分子包括抗原和抗原決定簇、變應原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及小的有機分子諸如濫用的藥物，如煙堿和它們的衍生物。利用本發(fā)明提供的抗原-AP205 VLP綴合物或含有這種綴合物的組合物進行動物免疫接種，可以誘導抗所展示的抗原的強免疫應答。因此，本發(fā)明的VLP可以用于分子(特別是抗原)的附著和展示。從而，本發(fā)明的綴合物、組合物和方法可以用于刺激抗各種展示抗原的免疫應答，因此可用于在動物中使用。
在第一方面，本發(fā)明提供了病毒樣顆粒，其包含或者備選地或優(yōu)選地其基本組成為或者備選地或優(yōu)選地其組成為至少一種選自以下的蛋白質(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(b)具有SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的蛋白質；(c)所述(a)或(b)蛋白質的突變蛋白質。優(yōu)選地，所述蛋白質是重組蛋白。因此，本發(fā)明提供了由至少一種選自以下的蛋白質形成的衣殼(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白質；(c)所述(a)或(b)蛋白質的突變蛋白質。在優(yōu)選的實施方式中，所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。在另一優(yōu)選實施方式中，所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQID NO3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQID NO3的至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個，優(yōu)選地2個置換是保守性置換。在另一個優(yōu)選實施方式中，所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
在第二方面，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突變蛋白質。做為可替代方案，本發(fā)明提供了SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的重組蛋白質的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
在另一方面，本發(fā)明提供了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重組蛋白質的突變蛋白質，其中缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個，優(yōu)選地2個置換是保守性置換。做為可替代方案，本發(fā)明提供了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重組蛋白質的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的載體，其序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的序列至少80％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，甚至更優(yōu)選地99％相同。做為可替代方案，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生重組蛋白質的載體，該重組蛋白質包含與選自以下的蛋白質融合的多肽(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白質；和(c)所述(a)或(b)多肽的突變蛋白質。
在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a)提供核酸，該核酸包含與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，甚至更優(yōu)選地100％相同的核苷酸序列，或者提供載體，該載體包含與SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，甚至更優(yōu)選地99％相同的核苷酸序列；(b)將所述核酸或載體引入到宿主細胞中；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列，以獲得能形成AP205病毒樣顆粒的蛋白質或突變蛋白質。優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌。
在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a)提供編碼至少一種選自以下的蛋白質的核酸或載體(i)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(ii)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白質；(iii)所述(i)或(ii)蛋白質的突變蛋白質；(b)將所述核酸或所述載體引入到宿主細胞中；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列，以獲得能形成AP205病毒樣顆粒的所述蛋白質或所述突變蛋白質。優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌。上面已經(jīng)指出了(i)和(ii)下所述的蛋白質和突變蛋白質的優(yōu)選實施方式。
在第一實施方式中，本發(fā)明提供了包含一種或多種RNA噬菌體AP205重組VLP或其突變體的組合物。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了包含一種或多種AP205 VLP和一種或多種有機分子的組合物，其中所述分子附著、連接、偶聯(lián)或融合，即，結合于AP205 VLP上。在另一個實施方式中，有機分子是抗原。
在一些其它實施方式中，有機分子選自(a)適于誘導抗癌細胞的免疫應答的有機分子；(b)適于誘導抗感染性疾病的免疫應答的有機分子；(c)適于誘導抗變應原的免疫應答的有機分子；(d)適于誘導改進的抗自身抗原的應答的有機分子；(e)適于在農畜或寵物中誘導免疫應答的有機分子；和(f)適于誘導抗藥物、激素或有毒化合物的應答的有機分子和(g)(a)-(f)中所述任何分子的片段(例如表位或抗原結構域)。
在另一個實施方式中，有機分子是一種或多種抗原。在一個這樣的實施方式中，抗原是重組多肽。在另一個實施方式中，從天然來源諸如花粉、蜂、病原體或腫瘤提取抗原。而在另一個實施方式中，抗原選自(a)適于誘導抗癌細胞的免疫應答的多肽；(b)適于誘導抗感染性疾病的免疫應答的多肽；(c)適于誘導抗變應原的免疫應答的多肽；(d)適于誘導抗自身抗體的免疫應答的多肽；和(e)適于在農畜或寵物中誘導免疫應答的多肽。
在特別的實施方式中，抗原包含細胞毒性T細胞或輔助T細胞的表位。在相關實施方式中，抗原包含B細胞表位。
在相關方面，本發(fā)明提供了用于將有機分子附著，即結合到AP205VLP上的方法。在一些實施方式中，有機分子以定向方式結合到AP205VLP上。
在本發(fā)明另一個實施方式中，在免疫動物的方法中使用本發(fā)明綴合物或組合物，其中通過皮下、肌內、鼻內、真皮內、靜脈內、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、口服方式將綴合物或組合物引入到動物體中或者直接引入到淋巴結中。在另一個實施方式中，在想要免疫接種以進行抵抗的腫瘤或局部病毒儲庫(reservoir)的附近，局部地施用組合物。
本發(fā)明也涉及包含免疫學有效量的本發(fā)明組合物和藥物學可接受稀釋劑、載體或賦形劑的疫苗。在進一步實施方式中，該疫苗進一步包含至少一種佐劑，諸如明礬或弗氏不完全佐劑。本發(fā)明也提供了免疫和/或治療動物的方法，該方法包括向動物施用免疫學有效量的本發(fā)明綴合物、組合物或疫苗。
AP205 VLP綴合物或組合物可以用于接種以抵抗例如腫瘤、病毒疾病、自身分子或非肽小分子。接種可以用于預防或治療目的，或者同時用于這兩種目的。AP205 VLP綴合物或組合物還可以用于抗變態(tài)反應接種，以誘導適于變態(tài)反應治療或預防的抗變應原的免疫偏離和/或抗體應答。
本發(fā)明也提供了通過施用包含或可替代地基本組成為與有機分子結合的AP205 VLP的組合物，治療或預防個體或一群個體中的疾病、身體病癥或狀況的方法。在相關的方面，抗該組合物產(chǎn)生的免疫分子或抗體，如抗體，可以用于疾病、狀況或病癥的治療、預防或診斷。
在本發(fā)明另一個方面，以試劑盒形式提供包含與有機分子結合的AP205 VLP的組合物。在本發(fā)明另一方面，還以試劑盒形式提供了包含免疫分子或抗體的組合物，其中所述的免疫分子和抗體是利用結合有機分子的AP205 VLP分離的。這種試劑盒可以用于各種目的，包括但不限于檢測與VLP上呈遞的有機分子反應的免疫分子或抗體，檢測有機分子，篩選免疫分子或抗體；和/或診斷通過免疫分子或抗體的存在或不存在表征的狀況。在一些相關實施方式中，本發(fā)明試劑盒可以包含一種或多種額外的成分諸如緩沖液、載體、賦形劑、佐劑和檢測試劑等。
在另一方面，本發(fā)明也提供了用于表達RNA噬菌體AP205的外殼蛋白從而形成病毒樣顆粒的載體和宿主細胞。宿主細胞包括原核生物，包括大腸桿菌；和真核生物，包括酵母、動物、細胞系等。
在另一方面，本發(fā)明提供了表達RNA噬菌體AP205及其病毒樣顆粒的外殼蛋白的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了純化和分離噬菌體AP205病毒樣顆粒的方法。
根據(jù)本領域的現(xiàn)有技術、下面附圖和本發(fā)明說明書及權利要求書，本發(fā)明的其它實施方式對本領域普通技術人員顯而易見。


圖1A-B顯示了AP205病毒樣顆粒和AP205噬菌體顆粒相比較的電子顯微照片，其中所述AP205病毒樣顆粒自大腸桿菌表達并純化的重組蛋白質自發(fā)裝配而成。圖1A顯示AP205噬菌體顆粒的電子顯微照片，而圖1B所示是重組AP205 VLP的自裝配顆粒的電子顯微照片。
圖2顯示AP205 VLP和Qβ VLP與Derp1.2肽的偶聯(lián)反應的SDS-PAGE分析。在16％Tris-甘氨酸凝膠上，在還原條件下電泳樣品。泳道1是蛋白質標記物，具有凝膠左側邊緣標明的相應分子量；泳道2，衍生的Qβ衣殼蛋白；泳道3，Qβ衣殼蛋白和Derp1.2肽的偶聯(lián)反應的上清液；泳道4，Qβ衣殼蛋白和Derp1.2肽的偶聯(lián)反應的沉淀；泳道5，衍生的AP205 VLP；泳道6AP205 VLP和Derp1.2肽的偶聯(lián)反應的上清液；泳道7，AP205 VLP和Derp1.2肽的偶聯(lián)反應的沉淀。在圖中，箭頭標示對應于每個單體與1，2，3，4或5個肽偶聯(lián)的偶聯(lián)產(chǎn)物。與Qβ衣殼蛋白比較，更大數(shù)量的表位可以與AP205 VLP偶聯(lián)。
圖3顯示在免疫小鼠血清中“Derp1.2”特異的IgG抗體的ELISA分析，其中該小鼠用分別與AP205 VLP或Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Derp1.2肽免疫。測定了總IgG效價和IgG亞型效價。針對每種IgG亞型分析了免疫前血清，在所有分析的免疫前血清中均未能檢測到Derp1.2特異的抗體。該圖顯示對于AP205和Qβ，誘導了Th1免疫應答典型的抗體亞型，因為IgG2a效價比IgG1效價高得多。用偶聯(lián)VLP的肽獲得了強的特異性抗肽免疫應答。通過ELISA也測定了對載體特異的抗體，并且對兩種載體，這些是相當?shù)摹?br> 圖4A-4C顯示所用不同真核生物表達載體的部分序列。僅示出了修飾的序列。圖4ApCep-Xa-Fc*顯示了從BamHI位點起的序列，在翻譯序列(SEQ ID NO103和SEQ ID NO104)上方顯示了不同特征。箭頭指示因子Xa蛋白酶的切割位點。圖4BpCep-EK-Fc*顯示了從BamHI位點起的序列，在翻譯序列(SEQ ID NO105和SEQ ID NO106)上方顯示了不同特征。箭頭指示腸激酶的切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所示序列相同。圖4CpCep-SP-EK-Fc*顯示從信號肽起始的序列，翻譯序列(SEQ ID NO107和SEQ ID NO108)上方顯示了不同特征。用粗體表示信號肽酶切割的信號肽序列。箭頭指示腸激酶切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所述序列相同。
圖5A-B顯示rMIF構建體，和表示rMIF構建體的表達和純化的SDS-PAGE，該構建體用于與AP205 VLP偶聯(lián)。圖5A顯示MIF構建體的示意圖，該構建體具有添加的包含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭。圖5B顯示在還原條件下電泳并且用考馬斯亮藍染色的純化MIF構建體的SDS-PAGE分析。圖5A中，凝膠上的加樣是純化的大鼠構建體rMIF-C1(SEQ ID NO114)，rMIF-C2(SEQ ID NO115)和rMIF-C3(SEQ ID NO117)。
圖6顯示rMIF-C1與AP205 VLP偶聯(lián)反應的結果。泳道1分子標記物。泳道2AP205 VLP。泳道3衍生的AP205 VLP。泳道4經(jīng)透析的衍生的AP205 VLP。泳道5經(jīng)透析的衍生的AP205 VLP。泳道6rMIF-C1與AP205 VLP的偶聯(lián)反應。在圖中用箭頭標明了偶聯(lián)產(chǎn)物。在凝膠左側邊緣標出了標記物蛋白質的分子量。
圖7顯示在用偶聯(lián)AP205 VLP的rMIF-C1免疫的小鼠的血清中，對rMIF-C1特異的IgG免疫應答的ELISA分析。
圖8顯示在0和14天免疫的3只小鼠(1-3)的血清中Angio I肽特異的IgG抗體的ELISA分析，其中小鼠用與AP205 VLP偶聯(lián)的Angio I肽免疫。在第21天血清中測定總IgG效價。
發(fā)明詳述定義下面的定義是對相關領域普通技術人員通常理解的概念的總結，提供這些定義旨在用于理解下面的公開，但是不意味著其限制本公開。
氨基酸接頭如這里所使用的，本說明書中“氨基酸接頭”，或也稱為“接頭”在于連接第二附著位點與抗原或抗原決定簇，或者更優(yōu)選地，其已經(jīng)包含或含有第二附著位點，通常，但不是必需地，該位點為一個氨基酸殘基，優(yōu)選地為半胱氨酸殘基。然而，即使由氨基酸殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，但是這里使用的術語“氨基酸接頭”并沒有意指這種氨基酸接頭專門地由氨基酸殘基組成。氨基酸接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物組成。然而，包含具有巰基或半胱氨酸殘基的分子的氨基酸接頭也包括在本發(fā)明中。這種分子優(yōu)選地包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分。然而，除了氨基酸接頭外，優(yōu)選地包含C1-C6烷基-、環(huán)烷基-(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分并且無任何氨基酸的接頭也包括在本發(fā)明范圍內。抗原或抗原決定簇或可選地第二附著位點和氨基酸接頭之間的連接優(yōu)選地通過至少一個共價鍵，更優(yōu)選地通過至少一個肽鍵進行。
動物這里使用的術語“動物”意在包括例如人類、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳動物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物。
抗體這里所用術語“抗體”指能結合表位或抗原決定簇的分子。該術語意在包括整個抗體和其抗原結合片段，包括單鏈抗體。這些抗體包括人抗原結合抗體片段，并且包括，但不限于Fab，F(xiàn)ab′和F(ab′)2，F(xiàn)d，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的Fvs(sdFV)及含有VL或VH結構域的片段?？贵w可以來源于任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。優(yōu)選地，抗體來自哺乳動物，例如人類、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬等等或者其它適合的動物例如雞。這里所用術語“人”抗體包括具有人類免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，并包括從人類免疫球蛋白文庫分離的抗體或者從具有一種或多種人類免疫球蛋白基因并且不表達內源免疫球蛋白的動物分離的抗體，例如，參見美國專利號5,939,598中所述，這里整體將該文獻并入為參考文獻。
抗原這里所用術語“抗原”指能被抗體結合或者在被MHC分子呈遞后能被T細胞受體(TCR)結合的分子。這里所用術語“抗原”也包括T-細胞表位。在MHC I類(存在于除了紅細胞以外的所用身體細胞上)背景中，或者MHC II類(存在于免疫細胞上，并且特別是抗原呈遞細胞上)背景中，T細胞受體識別T-細胞表位。該識別事件引起了T細胞和隨后效應機制的激活，諸如T細胞增殖、細胞因子分泌、穿孔素分泌等?？乖€能被免疫系統(tǒng)識別和/或能誘導引起B(yǎng)-和/或T-淋巴細胞激活的體液免疫應答和/或細胞免疫應答。然而，這可能要求，至少在一些情況下，抗原含有或連接TH細胞表位，并且以在佐劑中的形式給出。抗原可以有一種或多種表位(B-和T-表位)。上述特異性反應意思是指抗原典型地以高度選擇性方式優(yōu)先地與其相應抗體或TCR反應，并且不與可能由其它抗原激發(fā)的大量其它抗體或TCR反應。這里所用抗原也可以是幾種單獨抗原的混合物。這里所用抗原包括但不限于變應原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及有機小分子諸如濫用的藥物(象煙堿)及其片段和衍生物。而且，用于本發(fā)明的抗原可以是肽、蛋白質、結構域、碳水化合物、生物堿、脂質或小分子諸如，類固醇激素和其片段和衍生物。
抗原決定簇這里所用術語“抗原決定簇”意指B或T淋巴細胞特異地識別的抗原部分。B-淋巴細胞通過抗體產(chǎn)生對外源抗原決定簇應答，而T淋巴細胞是細胞免疫的介導者。因此，抗原決定簇或表位是被抗體識別的或者在MHC背景中被T細胞受體識別的那些抗原部分?？乖瓫Q定簇含有一個或多個表位。在脊椎動物中，變應原也起到抗原作用。
變應原這里所用術語“變應原”指與變態(tài)反應有關的抗原。變態(tài)反應以釋放炎性因子，特別是組胺，及在個體中導致病理學炎癥為特征。變態(tài)反應通常也與抗變應原的IgE抗體有關。這里所用術語“變應原”也包括“變應原提取物”和“變應原性表位”。變應原的例子包括但不限于花粉(例如，草、豚草、樺樹和雪松(mountain cedar))；屋塵螨和塵螨；哺乳動物表皮變應原和動物毛發(fā)皮屑；霉菌和真菌；昆蟲身體和昆蟲毒液；羽毛；食物；和藥物(例如，青霉素)。
AP205病毒樣顆?；駻P205 VLP這里所用術語“AP205病毒樣顆粒”或“AP205 VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地并優(yōu)選地組成為至少一種噬菌體AP205蛋白質或外殼蛋白質，或其片段或突變蛋白質，其中所述至少一種外殼蛋白或其片段或突變蛋白質典型地并優(yōu)選地能裝配形成病毒樣顆粒。在可替代和優(yōu)選的實施方式中，這里所用術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205 VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種噬菌體AP205蛋白質或外殼蛋白或其突變蛋白質，其中所述至少一種噬菌體AP205外殼蛋白或所述其突變蛋白質能裝配形成病毒樣顆粒。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的噬菌體AP205外殼蛋白，其中典型地且優(yōu)選地，所述至少一種外殼蛋白能裝配成病毒樣顆粒或衣殼。在本發(fā)明另一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205 VLP”指組合物，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地且優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的噬菌體AP205外殼蛋白的突變蛋白質，其中所述至少一種所述外殼蛋白的突變蛋白質能裝配成病毒樣顆粒。在本發(fā)明另一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地且優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO1中或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的噬菌體AP205外殼蛋白的突變蛋白質，其中所述至少一種所述蛋白質的突變蛋白質能裝配成病毒樣顆粒。在本發(fā)明另一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆粒”或“AP205 VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。在本發(fā)明再一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205 VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突變蛋白質，其中缺失或置換了至少1個半胱氨酸殘基、優(yōu)選地3個半胱氨酸殘基、更優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。在本發(fā)明另一個可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205 VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO1中所述或SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。隨著本說明書的描述，AP205 VLP的其它優(yōu)選的實施方式將顯而易見。組成AP205 VLP的AP205亞單位每一個均可以通過二硫鍵與顆粒中的其它亞單位連接，或者做為替代方案，大多數(shù)AP205 VLP亞單位通過二硫鍵與顆粒中的其它AP205 VLP亞單位連接。在一些實施方式中，少數(shù)或沒有一個AP205 VLP亞單位通過二硫鍵與顆粒中其它AP205 VLP亞單位連接。
締合(association)這里所用術語“締合”當用于第一和第二附著位點時，指第一和第二附著位點的結合，優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵結合。締合的性質可以是共價的、離子的、疏水的、極性的或它們的任何組合，優(yōu)選地締合的性質是共價的。
第一附著位點這里所用短語“第一附著位點”指非天然或天然來源的元件，位于抗原或抗原決定簇上的第二附著位點可以與其締合。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的聯(lián)合或者它們的化學反應基團。通常地和優(yōu)選地，第一附著位點位于核心顆粒諸如，優(yōu)選地病毒樣顆粒的表面上。多個第一附著位點通常以重復構型存在于核心或病毒樣顆粒的表面上。
第二附著位點這里所用短語“第二附著位點”指與抗原或抗原決定簇連接的元件，位于核心顆?；虿《緲宇w粒表面上的第一附著位點可以與其締合?？乖蚩乖瓫Q定簇的第二附著位點可以是蛋白質、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的聯(lián)合或者它們的化學反應基團。至少一個第二附著位點存在于抗原或抗原決定簇上。因此，術語“具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇”指包含至少該抗原或抗原決定簇和該第二附著位點的抗原或抗原性構建體。然而，特別是對于非天然來源，即，不天然出現(xiàn)在抗原或抗原決定簇中的第二附著位點，這些抗原或抗原性構建體包含“氨基酸接頭”。
結合這里所用術語“結合”指可以是例如通過化學偶聯(lián)的共價的結合或附著，或者可以是通過例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等的非共價的結合或附著。共價鍵可以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等等。術語“結合”更廣義，并且包括術語諸如“偶聯(lián)”、“融合”和“附著”。
外殼蛋白這里所用術語“外殼蛋白”指能在噬菌體或RNA噬菌體衣殼裝配中摻入的噬菌體或RNA噬菌體蛋白質。外殼蛋白也稱為CP。在本發(fā)明中，該術語更常指RNA噬菌體AP205的外殼蛋白。
核心顆粒這里所用術語“核心顆?！敝妇哂泄逃兄貜徒M織的剛性結構。這里所用核心顆粒可以是合成過程的產(chǎn)物或者是生物學過程的產(chǎn)物。
疾病(disease)、病癥(disorder)，狀況(condition)這里所用術語“疾病”或“病癥”指個體的任何不利狀態(tài)，包括腫瘤、癌癥、變態(tài)反應、成癮、自身免疫性、中毒或最佳的精神或身體功能的受損。這里所用“狀況”包括疾病和病癥，但是也指生理狀態(tài)。例如，生育力是生理狀態(tài)而不是疾病或病癥。因此，將適于通過降低生育力預防懷孕的本發(fā)明組合物描述為對狀況(生育力)的治療，而不是對病癥或疾病的治療。本領域技術人員明了其它的狀況。
表位這里所用術語“表位”指由單個抗體或T細胞受體識別的基本元件或最小單位，因此也指抗體或T細胞受體結合的特定結構域、區(qū)域或分子結構?？乖梢杂纱罅勘砦唤M成，而半抗原通常具有很少的表位。
免疫應答這里所用術語“免疫應答”指個體免疫系統(tǒng)針對分子或化合物(諸如抗原)的任何行動。在哺乳動物中，免疫應答包括細胞的活動和可溶分子諸如細胞因子和抗體的產(chǎn)生。因此，該術語包括體液免疫應答和/或引起B(yǎng)和/或T-淋巴細胞激活或增殖的細胞免疫應答。然而，在一些情況下，免疫應答可能具有低的強度，只有當使用至少一種本發(fā)明物質時才可檢測?！懊庖咴缘摹敝赣糜诖碳せ钌矬w的免疫系統(tǒng)的試劑，這種刺激使得免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增強，并且定向于該免疫原性劑?！懊庖咴远嚯摹笔窃谧魟┐嬖诨虿淮嬖诘那闆r下，單獨地或是與載體連接時能激發(fā)細胞和/或體液免疫應答的多肽。
“免疫偏離”這里所用術語免疫偏離指刺激與預先存在的免疫應答具有不同性質的免疫應答。例如，可以通過本發(fā)明實施方式，誘導具有對抗變應原的TH2免疫應答(這樣一旦暴露于變應原將產(chǎn)生IgE抗體)的個體，產(chǎn)生抗變應原的TH1免疫應答。這種TH1應答將抵消誘導變態(tài)反應的TH2應答，由此緩解變應性疾病。
免疫治療這里所用術語“免疫治療”指用于疾病、病癥或狀況治療的組合物。更具體地，該術語用于指通過接種引起有益的免疫應答的治療方法。
免疫有效量這里所用術語“免疫有效量”指當引入個體中時足以在個體中誘導免疫應答的組合物的量。達到免疫有效所必需的組合物的量根據(jù)許多因素而變化，這些因素包括組合物，組合物中其它成分的存在(例如，佐劑)，抗原，免疫途徑，個體，以前的免疫或生理狀態(tài)等。
個體這里所用術語“個體”指多細胞生物體，并且包括植物和動物。優(yōu)選地多細胞生物體是動物，更優(yōu)選地是脊椎動物，甚至更優(yōu)選地是哺乳動物，最優(yōu)選地是人類。
低或不可檢測的這里所用短語“低或不可檢測的”當用于基因表達水平時指表達水平顯著低于最大限度地誘導基因時所觀察到的表達水平(例如，至少低5倍)，或者該表達水平通過本文實施例中所用方法不容易檢測到。
模擬表位(mimotope)這里所用術語“模擬表位”指誘導對抗原或抗原決定簇的免疫應答的物質。一般地，與特定抗原相關聯(lián)使用術語模擬表位。例如，激發(fā)抗磷脂酶A2(PLA2)抗體產(chǎn)生的肽是與該抗體結合的抗原決定簇的模擬表位。模擬表位可以與誘導的免疫應答所針對的抗原或抗原決定簇有或沒有相似的實質結構或共有結構特性。本領域已知并且在本文其它地方也描述了產(chǎn)生和鑒定誘導針對特定抗原或抗原決定簇的免疫應答的模擬表位的方法。
突變蛋白質這里所用術語“突變蛋白質”指有一個或多個氨基酸不同于給定的參照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白質或多肽，其中這種差異由至少一個氨基酸的添加、置換或缺失或它們的聯(lián)合引起。優(yōu)選的實施方式包括由至少一個氨基酸置換引起的突變，優(yōu)選地由至少一個氨基酸的保守性置換引起的突變。保守性置換包括同構置換(isostericsubstitution)，在該置換中維持氨基酸的電荷、極性、芳香族、脂肪族或疏水性質。例如，用絲氨酸殘基置換半胱氨酸殘基是保守性置換。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，術語“突變蛋白質”指有3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸不同于給定參照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白質或多肽，其中這種差異由添加、置換或缺失或它們的聯(lián)合引起。在本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方式中，術語“突變蛋白質”指有3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸不同于給定參照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白質或多肽，其中這種差異來源于3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸的置換，優(yōu)選地來源于3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸的保守性置換。
天然來源這里所用術語“天然來源”意指物質的整體或其部分不是合成的，而是在自然界中存在或產(chǎn)生的。優(yōu)選地，這里所用術語“天然來源”意指就整體而言不是合成的，而是在自然界中存在和產(chǎn)生的。
非天然的一般地，這里用該術語指非來源于自然界，更具體地，該術語指來源于人工。
非天然來源的這里所用術語“非天然來源的”一般指合成的，或非來源于自然界的；更具體地指來源于人工的。
有序和重復的抗原或抗原決定簇陣列這里所用術語“有序重復的抗原或抗原決定簇陣列”一般地指抗原或抗原決定簇的重復模式，其特征在于抗原或抗原決定簇相對于核心顆?；虿《緲宇w粒的一種典型地且優(yōu)選地一致的空間排列。在本發(fā)明一個實施方式中，重復模式可以是幾何學模式。適宜的有序重復抗原或抗原決定簇陣列的典型和優(yōu)選例子是具有嚴格重復的抗原或抗原決定簇次晶晶序的陣列，優(yōu)選地具有1到30納米晶面間距(spacing)，優(yōu)選地5到15納米晶面間距。
有機分子如這里所用術語“有機分子”或本發(fā)明提到的“有機分子”優(yōu)選地包括抗原和抗原決定簇、變應原、自身抗原、半抗原、癌癥抗原和感染性疾病抗原及有機小分子諸如濫用的藥物(如煙堿)及它們的片段和衍生物。
多肽這里所用術語“多肽”指由氨基酸殘基，一般地天然氨基酸殘基，通過肽鍵連接在一起形成的聚合物。多肽不必限定大小，并且包括蛋白質和肽。肽是大小為通常約5到約50個氨基酸或者該通常范圍內的任何數(shù)量氨基酸的多肽。然而，肽也可以具有更長的長度，例如達到120-150個氨基酸。
蛋白質這里所用術語蛋白質指通常具有大于約5個或更多個，10個或20個以上或更多個，25個或更多個，50個或更多個，75個或更多個，100個或更多個，200個或更多個，500個或更多個，1000個或更多個，2000個或更多個氨基酸的多肽。盡管蛋白質不一定有確定的三維結構，但是蛋白質通常具有確定的并常常稱為折疊的三維結構，這與常常不具有確定三維結構而是采用大量不同的構象并且稱為未折疊的肽和多肽不同。然而，肽也可以具有確定的三維結構。
純化的如這里所用，當術語“純化的”用于指分子時，它意指被純化的分子相對于在該分子的天然環(huán)境中或者在產(chǎn)生、發(fā)現(xiàn)或合成該分子的環(huán)境中與該分子相關的分子，其濃度已經(jīng)得以增加。天然相關分子包括蛋白質、核酸、脂質和糖，但是一般不包括為維持被純化分子的完整性或有利于該分子的純化而添加的水、緩沖液和試劑。例如，即使在寡dT柱層析期間mRNA被水性溶劑稀釋，但如果天然相關核酸和其它生物學分子不結合柱子并且與所述mRNA分子分離，那么通過該層析亦純化了mRNA分子。根據(jù)該定義，當相對于雜質考慮時，物質可以是5％或以上，10％或以上，20％或以上，30％或以上，40％或以上，50％或以上，60％或以上，70％或以上，80％或以上，90％或以上，95％或以上，98％或以上，99％或以上或100％純度。
受體這里所用術語“受體”指能與稱為配體的另一分子相互作用的蛋白質、糖蛋白或其片段。該配體可以屬于任何類型的生物化學或化學化合物。受體不需要一定是結合膜的蛋白質。可溶蛋白質，象麥芽糖結合蛋白質或視黃醇結合蛋白質也是受體。
殘基這里所用術語“殘基”意指多肽主鏈或側鏈中的具體氨基酸。
重組宿主細胞這里所用術語“重組宿主細胞”指其中已經(jīng)引入本發(fā)明一種或多種核酸分子的宿主細胞。宿主細胞包括真核生物，包括例如哺乳動物、昆蟲、植物、鳥類、酵母；和原核生物例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)等。
RNA噬菌體這里所用術語“RNA噬菌體”指感染細菌的RNA病毒，更具體地指感染細菌的單鏈正義RNA病毒。
自身抗原這里所用術語“自身抗原”指能被宿主DNA編碼的分子或化合物。這種自身抗原包括肽、蛋白質、碳水化合物、核酸、脂質和其它生物分子。更通常地和優(yōu)選地，術語“自身抗原”指宿主DNA編碼的多肽或蛋白質。通過宿主DNA編碼的蛋白質或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物也定義為自身的。通過翻譯后修飾和蛋白酶解加工或通過自身基因產(chǎn)物可變剪接修飾的蛋白質也定義為自身的。通過宿主DNA編碼的蛋白質或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物被定義為自身的。此外，由2種或幾種自身分子聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質，或者代表自身分子的一部分的蛋白質，和與上述自身分子具有高度同源性(＞95％，優(yōu)選地＞97％，更優(yōu)選地＞99％，)的蛋白質也可以考慮是自身的。
載體這里所用術語“載體”指用于向宿主細胞傳送遺傳材料的工具(例如質?；虿《?。載體可以由DNA或RNA組成。
病毒樣顆粒(VLP)這里所用術語“病毒樣顆粒”指類似病毒顆粒的結構。而且，本發(fā)明病毒樣顆粒由于缺少所有或部分病毒基因組，特別是病毒基因組中的復制和感染元件，所以它是非復制和非感染性的。本發(fā)明病毒樣顆?？梢院胁煌谄浠蚪M的核酸。本發(fā)明病毒樣顆粒的典型和優(yōu)選的實施方式是病毒衣殼，諸如病毒，噬菌體或RNA噬菌體的病毒衣殼。這里可交換地使用的術語“病毒衣殼”和“衣殼”指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配物。典型并優(yōu)選地，病毒蛋白質亞單位裝配成病毒衣殼或衣殼，所述衣殼具有固有的重復組織的結構，其中所述結構通常是球形或管狀。例如，RNA噬菌體的衣殼具有二十面對稱的球形。這里所用術語“衣殼樣結構”指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配物，其形態(tài)類似上述意義的衣殼，但是偏離典型的對稱裝配，而是維持了足夠程度的有序和重復性。
噬菌體的病毒樣顆粒這里所用術語“噬菌體的病毒樣顆粒”指類似噬菌體結構的病毒樣顆粒，其是非復制和非感染性的，并且缺少至少一種或多種編碼噬菌體復制機器的基因，并且典型地也缺少一種或多種編碼負責病毒附著或進入到宿主中的蛋白質的基因。然而，該定義也應該包括這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一種或多種基因仍舊存在但是已失活，因此也導致非復制和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。
病毒顆粒這里所用術語“病毒顆?！敝覆《镜男螒B(tài)學形式。在一些病毒類型中，它包括蛋白質衣殼環(huán)繞的基因組；其它病毒還具有另外的結構(例如，包膜，尾等)。
一個/一種除非另有說明，當在本公開中使用術語“一個/一種”時，它們意指“至少一個/一種”或者“一個/一種或多個/多種”。
如這里所用，當指任何數(shù)值時，術語“約”意指所述值±10％的值(例如，“約50℃”包括從45℃到55℃的溫度范圍，包含45℃和55℃在內；類似地，“約100mM”包括從90mM到110mM的濃度范圍，包含90mM和110mM在內)。
概述我們已經(jīng)公開了利用本發(fā)明載體可以在細菌中表達重組的AP205外殼蛋白，并且獲得其純化形式。在細菌中，重組AP205外殼蛋白自發(fā)地自裝配為AP205病毒樣顆粒。本發(fā)明提供了適于AP205 VLP表達的宿主細胞和載體，和能裝配的AP205外殼蛋白變異體形式。這些表達的VLP、來源于天然來源的AP205 VLP或AP205病毒顆粒可以結合有機分子以產(chǎn)生有序重復的有機分子陣列。本發(fā)明的有機分子包括抗原、變應原、自身抗原、半抗原、癌癥抗原和感染性疾病抗原。在一個實施方式中，有機分子是多肽或蛋白質。
通過附著、連接、融合或其它結合方式(包括共價和非共價鍵)可以形成本發(fā)明綴合物，即，有機分子與VLP結合。在一個實施方式中，VLP含有第一附著位點，有機分子含有第二附著位點?？梢酝ㄟ^直接地或者利用第三分子，典型地且優(yōu)選地借助于交聯(lián)劑，連接第一和第二附著位點，從而實現(xiàn)與有機分子間的締合。附著位點可以天然存在或者可以引入。在優(yōu)選的實施方式中，該結合包含至少一個共價鍵，優(yōu)選地包含肽鍵或者可替代地和優(yōu)選地包含非肽鍵。
用本發(fā)明提供的AP205 VLP綴合物或用包含這種綴合物的組合物免疫動物，可以誘導抗所展示的有機分子的強免疫應答。因此，本發(fā)明綴合物和組合物可以用于刺激抗各種展示的抗原的免疫應答，因此可以用于動物中使用。本發(fā)明也涉及一種疫苗，該疫苗包含免疫有效量的具有本發(fā)明一種或多種綴合物的組合物及藥物學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。AP205 VLP可以用于接種以抵抗例如半抗原、變應原、腫瘤、病毒疾病或自身分子或非肽小分子。接種可以用于預防或治療目的，或者這兩種目的。在相關方面，抗這種組合物產(chǎn)生的免疫分子或抗體，諸如抗體，可以用于疾病、狀況或病癥的治療、預防或診斷。本發(fā)明的這種抗體和組合物也可以以試劑盒形式使用。
AP205噬菌體外殼蛋白的克隆AP205基因組由成熟蛋白質、外殼蛋白、復制酶及在相關噬菌體中不存在的兩個開放讀框(一個裂解基因和一個開放讀框在成熟基因的翻譯中起作用)組成(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。在本發(fā)明的一個方面，利用本領域已知的方法，通過AP205噬菌體RNA的逆轉錄，之后通過PCR分離外殼蛋白質cDNA。將包含外殼蛋白基因上游的核糖體結合位點的外殼蛋白cDNA克隆到載體pQb10(Kozlovska，T.M.，等，Gene137133-37(1993))中。在另一個方法中，AP205外殼蛋白cDNA可以克隆到載體pQb185中，置換噬菌體Qβ外殼蛋白基因，并由此位于載體中的核糖體結合位點下游。這兩種方法都引起了蛋白質的表達和衣殼的形成。因此，在本發(fā)明中，可以從含有核糖體結合位點的載體表達外殼蛋白，其中該核糖體結合位點不是AP205核糖體結合位點，而是諸如載體pQb185中的核糖體結合位點。
載體pQb10和pQb185是來源于pGEM載體的載體，在這些載體中trp啟動子控制克隆基因的表達(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993))。pAP283-58(SEQ ID NO.2)在下面序列中包含推定的AP205核糖體結合位點，其位于XbaI位點下游和AP205外殼蛋白ATG起始密碼子的緊上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO5)。載體pQb185包含位于XbaI位點下游和起始密碼子上游的SD(Shine Delagarno)序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO6)，下劃線的是SD序列)，其也存在于載體pAP281-32(SEQ ID No.4)中。本領域已知的其它載體包括，例如pKK223.3，pET載體家族，pBR322(Sutcliffe，J.G.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.43 Pt 177-90(1979))，pUC18，pUC19，如本領域技術人員所認識到的，如果這些載體不存在啟動子和核糖體結合位點或者不適于外殼蛋白的表達和隨后病毒樣顆粒的形成，則可以對所有這些載體進行修飾以包含適宜的啟動子和核糖體結合位點。來源于前述載體的其它載體和適于在大腸桿菌或者本領域技術人員已知的其它宿主中表達蛋白質的其它載體，和一般地適于在大腸桿菌或者其它宿主中表達蛋白質的任何載體均適于實施本發(fā)明，條件是它們允許外殼蛋白表達和隨后形成病毒樣顆粒。在本發(fā)明的一個方面，將用于AP205外殼蛋白基因表達的載體轉染到大腸桿菌中。適合的大腸桿菌菌株包括，但不限于大腸桿菌K802，JM109，RR1。本領域普通技術人員已知其它大腸桿菌菌株，并且通過SDS-PAGE檢測外殼蛋白的表達，及通過可選地首先凝膠過濾純化衣殼，隨后在免疫擴散試驗(Ouchterlony試驗)或電子顯微鏡術(Kozlovska，T.M.，等，Gene 137133-37(1993))中檢測衣殼來測試衣殼的形成和裝配，可以鑒定載體和菌株的適宜聯(lián)合。
由于在大腸桿菌胞質中加工，從載體pAP283-58和pAP281-32表達的AP205外殼蛋白可以無起始的甲硫氨酸氨基酸。切除了甲硫氨酸的多肽，特別是切除了甲硫氨酸的SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的多肽，及產(chǎn)生本發(fā)明AP205 VLP的未切割形式的AP205多肽，或者產(chǎn)生本發(fā)明AP205VLP的以上多肽的混合物均是本發(fā)明實施方式，并且在本發(fā)明范圍內。
AP205病毒樣顆粒在一個實施方式中，本發(fā)明提供了形成衣殼的AP205外殼蛋白。這種蛋白質通過重組方式表達或從天然來源制備。能裝配為VLP的重組AP205外殼蛋白片段也是本發(fā)明的實施方式。通過外殼蛋白的內部或者末端缺失可以產(chǎn)生這些片段。與裝配為VLP相容的在外殼蛋白序列中的插入或與外殼蛋白序列的融合也是本發(fā)明的實施方式?？梢酝ㄟ^電子顯微鏡術檢測外殼蛋白序列的插入、缺失和融合的結果、及其是否與裝配為VLP相容。
本發(fā)明提供了重組AP205外殼蛋白的純化方法。利用沉淀分級分離步驟和凝膠過濾純化步驟的聯(lián)合，可以以純化形式分離由AP205外殼蛋白形成的顆粒。分離病毒樣顆粒的其它方法是本領域已知的，并且可以用于分離噬菌體AP205的病毒樣顆粒(VLP)。例如，美國專利號4,918,166中描述了超離心用于分離酵母逆轉錄轉座子Ty的VLP的用途，這里將這篇文獻整體并入為參考文獻。除了凝膠過濾外，也可以使用其它層析步驟諸如離子交換、疏水相互作用或者親和層析。
重組AP205外殼蛋白的表達引起病毒樣顆粒的裝配，當通過電子顯微鏡術分析時，該病毒樣顆粒和噬菌體顆粒具有相同外觀和大小?？梢约兓@些VLP是本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了新的VLP，該VLP可以以高數(shù)量純化形式獲得。
大腸桿菌中自裝配的AP205 VLP與AP205噬菌體顆粒具有相同的外觀和大小。與針對其它VLP所證明的一樣(多瘤病毒VP1 VLP和乳頭瘤病毒L1 VLPS，Chackerian B.等，PNAS 962373-2378(1999))，實驗條件的操作或表位與VLP的融合可以導致具有不同裝配狀態(tài)的VLP。例如，可以獲得比野生型或主要顆粒形式具有低的三角劃分數(shù)的顆粒。因此，比AP205噬菌體顆粒更小尺寸的AP205 VLP，或者與AP205噬菌體顆粒相比同樣尺寸的AP205 VLP和更小尺寸的AP205 VLP的混合物也是本發(fā)明的實施方式。
如WO03/024481的實施例17中所述，在非還原性PAGE中分析時比在還原性PAGE中分析時，AP205 VLP亞單位電泳具有更高表觀分子量，表明這些亞單位通過二硫鍵締合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了含有適于AP205病毒樣顆粒產(chǎn)生的開放讀框的載體，所述載體還包含額外的核酸，這樣，由此得到的載體能產(chǎn)生包含所述額外核酸編碼的氨基酸的重組AP205病毒樣顆粒。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有適于AP205病毒樣顆粒產(chǎn)生的開放讀框的載體，所述載體還包含適于引入額外核酸的限制酶位點，這樣由此得到的載體能產(chǎn)生包含所述額外核酸編碼的氨基酸的重組病毒樣顆粒。
有機分子，半抗原和抗原本發(fā)明方法、綴合物和組合物中使用的有機分子包括任何抗原、半抗原、有機分子或其片段。本發(fā)明分子包括本身(即，不結合AP205病毒或病毒樣顆粒)在動物中不能誘導免疫應答的半抗原、有機分子和抗原片段。有機分子包括例如(a)適于誘導抗癌細胞的免疫應答的有機分子；(b)適于誘導抗感染性疾病的免疫應答的有機分子；(c)適于誘導抗變應原的免疫應答的有機分子；(d)適于誘導抗自身抗原的免疫應答的有機分子；(e)適于誘導抗藥物、激素或毒素，特別是濫用的藥物的免疫應答的抗原或半抗原；和(f)(a)-(e)中所述任何有機分子、抗原或半抗原的片段(例如，結構域)。
感染性疾病在本發(fā)明一個特別實施方式中，有機分子、抗原或抗原決定簇可以用于感染性疾病的預防。這種治療方法可以用于治療影響廣泛宿主，例如人類、母牛、綿羊、豬、狗、貓、其它哺乳動物物種及非哺乳動物物種的廣泛種類的感染性疾病。這種疫苗可以預防地用于防止個體或群體中的傳染，或者治療地用于減輕正在發(fā)生的感染。已知存在疫苗的或期望使用疫苗的感染性疾病是本領域技術人員已知的，所述感染性疾病例如包括病毒病因學的感染，諸如HIV，流感、皰疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰質炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等；細菌病因學的感染諸如肺炎、結核病、梅毒、Lyme氏疏螺旋體病、霍亂、沙門氏菌病、腦膜炎、膿毒等；或者寄生蟲病因學的感染，諸如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、毛滴蟲病、阿米巴病等。本發(fā)明綴合物、組合物和方法中可以使用的抗原或抗原決定簇是相關領域普通技術人員已知的?？乖蚩乖瓫Q定簇的例子包括HIV抗原gp140和gp160；流感病毒抗原血凝素，M2蛋白質和神經(jīng)氨酸酶、乙型肝炎表面抗原和瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。
在本發(fā)明一個這種實施方式中，抗原或抗原決定簇選自(a)重組HIV蛋白質，(b)重組流感病毒蛋白質(例如流感病毒M2蛋白質或其片段)，(c)重組丙型肝炎病毒蛋白質，(d)重組弓形體屬(Toxoplasma)蛋白質，(e)重組惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)蛋白質，(f)重組間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)蛋白質，(g)重組卵形瘧原蟲(Plasmodium oval)蛋白質，(h)重組三日瘧原蟲(Plasmodium Malariae)蛋白質，(i)重組衣原體(Chlamydia)蛋白質和(j)(a)-(i)中所述任何蛋白質的片段。
在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及疫苗組合物，該疫苗組合物包含至少一種流感病毒核酸編碼的抗原或抗原決定簇；并涉及這種疫苗組合物激發(fā)免疫應答的用途。在特定的這種實施方式中，流感抗原或抗原決定簇是M2蛋白質(例如，具有GenBank登錄號P06821，PIR登錄號MFIV62中所示氨基酸的M2蛋白質或其片段(例如，從約2到約24位的氨基酸))。適于本發(fā)明使用的引起免疫應答的M2蛋白質部分及其它蛋白質包括長度為任何數(shù)量氨基酸的肽，但是一般為至少6個氨基酸長度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或97個氨基酸長度的肽)。
激素、毒素和藥物，特別是濫用的藥物在另一個方面，本發(fā)明提供了適于刺激抗半抗原的免疫應答的組合物。這些半抗原包括，但不限于激素、藥物和有毒化合物?？垢鞣N藥物、激素和有毒化合物的免疫應答可以用于保護有危險暴露于這種化合物的個體，用于治療已暴露于這種化合物的個體，或者用于預防或治療對這種化合物的成癮性。
代表性的有毒化合物包括但不限于有毒植物、動物和微生物的天然產(chǎn)物。這種產(chǎn)物包括黃曲霉毒素、ciguautera毒素和河豚毒素。人工或作為代謝結果產(chǎn)生的其它代表性有毒化合物包括抗生素(例如，萬古霉素)，抗癌化合物(例如，長春花堿)和化學戰(zhàn)試劑(例如，沙林，芥子氣，VX)。本發(fā)明的一個方面包括產(chǎn)生抗體，以抵抗通常所用的藥劑的有毒代謝物；由此個體可以繼續(xù)接受藥劑的有益效果，而不出現(xiàn)與有毒代謝物有關的副作用。因此，在優(yōu)選的實施方式中，毒素是個體身體中產(chǎn)生的代謝物，其中所述代謝物是藥劑的代謝物。在進一步優(yōu)選的實施方式中，毒素是化學戰(zhàn)試劑。
適于在治療藥物成癮，特別是消遣性藥物成癮的綴合物、組合物和方法中使用的有機分子，抗原或抗原決定簇是相關領域普通技術人員已知的。有機分子、抗原或抗原決定簇的代表性例子包括，例如阿片樣物質和嗎啡衍生物諸如可待因、芬太尼、海洛因、嗎啡和鴉片；興奮劑諸如苯丙胺、可卡因、MDMA(甲烯二氧甲苯丙胺)、甲基苯丙胺，哌醋甲酯和煙堿；致幻劑諸如LSD、三甲氧苯乙胺和叔胺吲哚磷酯；Cannabinoids諸如大麻粉和大麻；其它成癮性藥物或化合物；和這些化合物的衍生物，副產(chǎn)物，變異體和復合物。
變態(tài)反應和癌癥在相關實施方式中，本發(fā)明提供了適于作為免疫療法用于變態(tài)反應或癌癥的治療或預防的組合物。
適于在治療或預防變態(tài)反應的綴合物、組合物和方法中使用的抗原或抗原決定簇將是相關領域普通技術人員已知的。這種抗原或抗原決定簇的代表性例子包括蜂毒磷脂酶A2、Bet v I(樺樹花粉變應原)、5 Dol m V(white faced hornet毒液變應原)、Mellitin和Der p I(屋塵螨變應原)、谷蛋白、麥醇溶蛋白、貝類變應原、蟑螂變應原、花生和其它堅果變應原、豚草和其它花粉變應原，銀樺屬(Grevillea)變應原，及其可以用于激發(fā)免疫應答的片段。在本發(fā)明特定的實施方式中，變應原選自(a)重組蜂螫刺變態(tài)反應蛋白質，(b)重組堅果變態(tài)反應蛋白質，(c)重組食物變態(tài)反應蛋白質，(d)重組哮喘蛋白質，(e)重組衣原體(Chlamydia)蛋白質和(f)(a)到(e)任何變應原的片段。
如上所述，適于本發(fā)明綴合物、組合物或方法中使用的抗原或抗原決定簇是Der p I。Der p I是在屋塵螨糞粒中發(fā)現(xiàn)的25kD蛋白酶，并且是屋塵螨的主要變應原。因此，80％螨變應性患者具有抗Der p I IgE抗體。特別地，已知其中Der p I肽p52-72和p117-133(SEQ ID NO64)包含天然Der p I特異性抗體所識別的表位。在針對整個抗原的多克隆應答中產(chǎn)生的IgE抗體以高親和力結合肽區(qū)域59-94(L.Pierson-Mullany等.(2000)Molecular Immunology)。其它區(qū)域也以高親和力結合IgE。肽p117-133在其N末端包含可以作為本發(fā)明第二附著位點的半胱氨酸。3D模建將肽p52-72和p117-133分配至整個蛋白質的表面(Jeannin，P.等，MolecularImmunology 301511-1518(1993))。然而，Der p I蛋白質的其它片段也可能包含適用于本發(fā)明的B細胞表位。
在本發(fā)明組合物的優(yōu)選實施方式中，抗原或抗原決定簇是Der p I肽，其中具有所述第二附著位點的所述Der p I肽有選自a)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(SEQ ID NO97)；和b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA(SEQ ID NO64)的氨基酸序列。
在另外實施方式中，本發(fā)明提供了適于在預防和/或減弱變應性反應(諸如引起過敏反應的變應性反應)的方法中使用的疫苗組合物。如本文其它地方所公開的，變應性反應的特征在于引起IgE抗體出現(xiàn)的抵抗抗原的TH2應答。TH1免疫應答的刺激和IgG抗體的產(chǎn)生可以緩解變應性疾病。因此，本發(fā)明疫苗組合物包括引起如下抗體產(chǎn)生的組合物，該抗體可以預防和/或減弱變應性反應。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包括激發(fā)抗變應原的免疫應答的組合物。這種變應原的例子包括磷脂酶諸如意大利蜜蜂(Apis Mellifera)(GenBank記錄號443189，GenBank記錄號229378)，大蜜蜂(Apis dorsata)(GenBank記錄號B59055)，中華蜜蜂(Apis cerana)(GenBank記錄號A59055)，Bombus Pennsylvanicus(GenBank記錄號B56338)和鈍尾毒蜥(Heloderma Suspectum)(GenBank記錄號P80003；GenBank記錄號S 14764；GenBank記錄號226711)磷脂酶A2(PLA2)蛋白質。
利用意大利蜜(Apis Mellifea)的PLA2蛋白質氨基酸序列(GenBank記錄號443189，GenBank記錄號229378)做為示例，構成整個PLA2序列中的任何一個部分的長至少約60個氨基酸的肽也可以用在組合物中以預防和/或減弱變應性反應。這種肽的例子包括含有氨基酸1-60，氨基酸1-70，氨基酸10-70，氨基酸20-80，氨基酸30-90，氨基酸40-100，氨基酸47-99，氨基酸50-110，氨基酸60-120，氨基酸70-130或氨基酸90-134的肽，以及其它PLA2蛋白質(例如上述PLA2蛋白質)的相應部分。這種肽的進一步例子包括包含氨基酸1-10，氨基酸5-15，氨基酸10-20，氨基酸20-30，氨基酸30-40，氨基酸40-50，氨基酸50-60，氨基酸60-70，氨基酸70-80，氨基酸80-90，氨基酸90-100，氨基酸100-110，氨基酸110-120或者氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白質(例如上述PLA2蛋白質)的相應部分。
適于本發(fā)明使用的引起免疫應答的PLA2部分及其它蛋白質部分可以包含一般地至少6個氨基酸長度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100個氨基酸長度的肽)，或者可替代由上述肽組成。
PLA2肽(例如上述全長PLA2蛋白質及每個蛋白的子部分)也可以與允許有序和重復抗原陣列形成的任何物質(例如，AP205衣殼蛋白或其片段)偶聯(lián)。
對于在治療癌癥的組合物和方法中使用的抗原或抗原決定簇，其選擇將是相關領域普通技術人員已知的。在本發(fā)明特定的實施方式中，抗原或抗原決定簇選自(a)重組乳腺癌細胞蛋白質；(b)重組腎癌細胞蛋白質；(c)重組前列腺癌細胞蛋白質；(d)重組皮膚癌細胞蛋白質；(e)重組大腦癌細胞蛋白質；(f)重組白血病癌細胞蛋白質；(g)重組profiling；和(h)(a)-(g)中所述任何蛋白質的片段。
這種類型的抗原或抗原決定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)，GD2(成神經(jīng)細胞瘤)，EGF-R(惡性成膠質細胞瘤)，CEA(甲狀腺髓樣癌)，和CD52(白血病)，人黑素瘤蛋白質gp100，人黑素瘤蛋白質melan-A/MART-1，酪氨酸酶，NA17-A nt蛋白質，MAGE-3蛋白質，p53蛋白質和HPV16 E7蛋白質，及可以用于激發(fā)免疫應答的這些蛋白質之每一個的片段。可以用于癌癥治療組合物和方法的另外抗原決定簇是參與血管生成的分子和抗原決定簇。血管生成，即新血管的形成，在生理學和病理生理學過程諸如傷口愈合和實體腫瘤生長中起到必需的作用(Folkman，J.(1995)Nat.Medicine 1，27-31；Folkman，J.，和Klagsbum，M.(1987)Science 235，442-446；Martiny-Baron，G.，和Marmé，D.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6，675-680；Risau，W.(1997)Nature 386，671-674)?？焖偕L的腫瘤起始并依賴于血管的形成以提供所需的血液供應。因此，認為抗血管生成藥劑作為抗癌療法是有效的。
在已經(jīng)鑒定的幾種推定的血管生成因子中，血管內皮生長因子(VEGF)是有效的內皮細胞特異性促細胞分裂劑和許多實體腫瘤血管形成的主要刺激劑。因此，VEGF作用的阻斷可以作為干擾腫瘤誘導的血管生成的靶標，成為一種阻斷內皮而不是腫瘤的抗腫瘤策略(Millauer，B.等.(1994)Nature367，576-579；KIM，J等.(1993)Nature 362，841-844)。
已經(jīng)公開了抗VEGFR-II抗體(IMC-1C11)和抗VEGF抗體(Lu，D.等.(2000)J.Biol Chem.275，14321-14330；Presta，L.G，等(1997)Cancer Res.47，4593-4599)。前者，中和性單克隆抗VEGFR-2抗體識別已經(jīng)鑒定為推定的VEGF/VEGFR-II結合位點的表位(Piossek，C.等.(1999)J Biol Chem.274，5612-5619)。
因此，在本發(fā)明一個實施方式中，本發(fā)明綴合物、組合物或方法中使用的抗原或抗原決定簇是來源于VEGFR-II接觸位點的肽。這提供了具有用于癌癥治療的抗血管生成特性的本發(fā)明組合物和疫苗組合物。在小鼠中，利用對VEGFR-2特異的血清，已經(jīng)證明了對腫瘤生長的抑制作用(Wei，YQ等.(2000)Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，適于抗血管生成的本發(fā)明組合物和本發(fā)明疫苗組合物的其它抗原決定簇包括具有氨基酸序列CTARTELNVGI DFNWEYPSSKHQHKK(SEQ ID NO99)的VEGFR-II衍生肽，和/或具有氨基酸序列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK(SEQ ID NO113)的鼠VEGFR-II衍生肽，和/或VEGFR-II的相關細胞外球狀結構域1-3。
自身抗原在特定實施方式中，本發(fā)明提供了適于在預防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物(例如，腫瘤壞死因子)引起或加重的疾病或狀況的方法中使用的疫苗組合物。通常通過常規(guī)接種誘導對自身分子的抗體應答，即使可能，也是困難的。本發(fā)明通過利用抗原與AP205 VLP的結合，增加待用于免疫的抗原的重復程度，提供了一種提高接種效率的方法。
不同于分離的蛋白質，在有和無T細胞輔助，不存在任何佐劑的情況下，病毒均能誘導迅速和有效的免疫應答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。盡管病毒常常由少數(shù)蛋白質組成，但是它們能比它們的分離的成分引起強得多的免疫應答。對于B細胞應答，已知病毒免疫原性的一個至關重要的因素是表面表位的重復性和次序。許多病毒顯示了準晶體表面，該表面展示出一個有規(guī)則的表位陣列，該表位陣列可以與B細胞上的表位特異性免疫球蛋白有效交聯(lián)(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。B細胞上表面免疫球蛋白的這種交聯(lián)是強激活信號，其直接誘導細胞周期進程和IgM抗體的產(chǎn)生。而且，這種觸發(fā)的B細胞能激活T輔助細胞，這接著可以誘導B細胞中IgM產(chǎn)生向IgG抗體產(chǎn)生的轉換和長壽記憶B細胞的形成——任何接種的目的(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。在自身免疫疾病中，甚至可以將病毒結構與抗-抗體的產(chǎn)生聯(lián)系起來，作為針對病原體的天然應答的一部分(參見，F(xiàn)ehr，T.等，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。這樣，通過高度有組織的病毒表面呈遞的抗體能誘導強的抗-抗體應答。
免疫系統(tǒng)通常不能產(chǎn)生抵抗來源于自身的結構的抗體。對于低濃度存在的可溶抗原而言，這是由Th細胞水平上的耐受性所致。在這些條件下，將自身抗原與可以遞送T輔助作用的載體偶聯(lián)可以破壞耐受性。對于高濃度存在的可溶蛋白質或低濃度的膜相關蛋白質，B和TH細胞可以是耐受性的。然而，B細胞的耐受性可能是可逆的(無變應性)，并且可以通過施用偶聯(lián)外源載體的高度有組織形式的抗原來破壞(Bachmann &Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。
因此，本發(fā)明疫苗組合物包括引起抗體產(chǎn)生的綴合物、組合物和方法，其中該抗體可以預防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的疾病或狀況。這種疾病或狀況的例子包括移植物抗宿主病、IgE介導的變應性反應，過敏反應，成人呼吸窘迫綜合征，局限性回腸炎、變應性哮喘、急性成淋巴細胞白血病(ALL)，糖尿病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性甲狀腺腫，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，炎性自身免疫性疾病，重癥肌無力，免疫增生性疾病淋巴結病(IPL)，血管免疫增生性淋巴結病(AIL)，免疫母細胞性淋巴結病(IBL)，類風濕性關節(jié)炎，糖尿病，多發(fā)性硬化，阿爾茨海默氏病，骨質疏松癥，和與一些感染有關的自身免疫狀況包括風濕熱、猩紅熱、Lyme氏疏螺旋體病和傳染性多關節(jié)炎。
對于在治療與自身抗原相關的其它疾病或狀況的綴合物、組合物和方法中使用的抗原或抗原決定簇，其選擇也是相關領域普通技術人員已知的。這種抗原或抗原決定簇的代表性例子是，例如淋巴毒素(例如，淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))，和淋巴毒素受體，核因子κB受體活化因子配體(RANKL)，血管內皮生長因子(VEGF)，血管內皮生長因子受體(VEGF-R)，白細胞介素-5，白細胞介素-17，白細胞介素-13，CCL21，CXCL12，SDF-1，MCP-1，Endoglin，抵抗素，GHRH，LHRH，TRH，MIF，Eotaxin，緩激肽，BLC，腫瘤壞死因子α和淀粉樣β肽(Aβ1-42)，以及其可以用于激發(fā)免疫應答的片段。
在一個實施方式中，抗原決定簇是淀粉樣β肽(Aβ1-42)(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO7)，或其片段。Aβ肽在阿爾茨海默氏病的神經(jīng)病理學中具有重要作用。Aβ肽的區(qū)域特異性細胞外積累伴隨著小神經(jīng)膠質細胞增生(microgliosis)，細胞骨架改變，營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎和突觸損失。據(jù)認為這些病理學改變與定義這種疾病的認知下降有關。
在阿爾茨海默氏病小鼠模型中，通過基因工程改造產(chǎn)生Aβ1-42的轉基因動物(PDAPP-小鼠)在大腦中出現(xiàn)了斑塊和神經(jīng)元損害。最近的工作表明利用Aβ1-42免疫年青的PDAPP小鼠引起了對斑塊形成和相關營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎的抑制作用(Schenk，D.等，Nature 400173-77(1999))。
而且，對已經(jīng)患有AD樣神經(jīng)病的老年PDAPP小鼠的免疫也降低了神經(jīng)病理學的程度和進展。在另一個研究中，外周施用抗Aβ1-42產(chǎn)生的抗體能誘導對預先存在的淀粉狀蛋白的清除(Bard，F(xiàn).等，Nature Medicine 6916-19(2000))。該研究利用了抗Aβ1-42的多克隆抗體或抗來源于Aβ不同區(qū)域的合成片段的單克隆抗體。因此，利用本發(fā)明綴合物，組合物和方法誘導抗Aβ抗體可以被認為是阿爾茨海默氏病的潛在治療方法。
公認單獨施用純的蛋白質通常不足以引發(fā)強的免疫應答；一般地，分離的抗原必須與稱為佐劑的輔助物質一起施用。這些佐劑保護施用的抗原免受快速降解，并且佐劑可以實現(xiàn)抗原的低水平長期釋放。在本發(fā)明中，Aβ肽或其片段通過結合AP205 VLP而獲得免疫原性，因此不一定需要佐劑。
如所表明的，阿爾茨海默氏(AD)的一個關鍵事件是淀粉狀蛋白沉積為不溶性纖維塊(amyloidogenesis)，引起細胞外神經(jīng)炎斑和在腦血管壁周圍的沉積物(綜述參見Selkoe，D.J.(1999)Nature.399，A23-31)。神經(jīng)炎斑和嗜剛果紅血管病的主要組分是淀粉狀蛋白β(Aβ)，盡管這些沉積物也含有其它蛋白質諸如糖胺聚糖和載脂蛋白。Aβ從稱為淀粉樣前體蛋白(APPs)的大得多的糖蛋白蛋白酶解切割產(chǎn)生，該前體蛋白包括具有單一疏水跨膜區(qū)域的695-770個氨基酸的同種型。Aβ形成不超過43個氨基酸長度的一組肽，這些肽顯示了相當大的氨基和羧基末端異質性(截短)及修飾(Roher，A.E.等，(1988)J.Cell Biol.107，2703-2716.Roher，A.E.等(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。重要的同種型是Aβ1-40和1-42。它具有形成β-片層以聚集為原纖維的高度傾向，這最終導致淀粉狀蛋白。最近的研究已經(jīng)表明接種誘導的大腦淀粉狀沉積物的減少引起了認知的改進(Schenk，D.等.(1999)Nature.400，173-177)。因此，適于產(chǎn)生本發(fā)明疫苗的Aβ片段包括，但是不限于Aβ1-15，Aβ1-27和Aβ33-42。如本文其它地方所述，可以利用氨基酸接頭與Aβ或Aβ片段的氨基酸序列融合以實現(xiàn)和AP205 VLP偶聯(lián)。適于與Aβ或Aβ片段的N末端融合的氨基酸接頭包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。適于與Aβ或Aβ片段的C末端融合的接頭包括但不限于序列GGC。在一個實施方式中，當接頭與Aβ或Aβ片段的C末端融合時，酰胺化C末端半胱氨酸。Aβ片段1-15與氨基酸接頭融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQGGC-NH2(SEQ ID NO8)，其中用C末端“NH2”表示酰胺化C末端半胱氨酸。Aβ片段1-27與氨基酸接頭融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC-NH2(SEQ ID NO9)。Aβ片段33-42與氨基酸接頭融合，并且具有序列CGHGNKSGLMVGGVVIA(SEQ ID NO10)。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原或抗原決定簇包含，或者優(yōu)選地是血管緊張肽或其片段。這里所用術語“血管緊張肽”包括含有血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管緊張肽II的序列或其任何片段的任何肽。血管緊張肽與高血壓有關(Gardiner等，Br.J.Pharm.1291178(2000))。因此，適于降低血管緊張肽水平的本發(fā)明綴合物、組合物和方法適于治療高血壓。在一個實施方式中，綴合物或組合物包含至少一種血管緊張肽。一些實施方式中肽的氨基酸序列如下血管緊張肽原DRVYIHPFHLVIHN (SEQ IDNO11)；血管緊張肽IDRVYIHPFHL(SEQ ID NO12)；血管緊張肽IIDRVYIHPF(SEQ ID NO13)。通常地，在血管緊張肽序列的C和/或N末端添加一個或多個額外的氨基酸。這些額外氨基酸對于定向和有序地締合AP205病毒樣顆粒特別有價值。此血管緊張肽序列對應于與鼠源序列相同的人類序列。因此，用包含這種血管緊張肽作為抗原或抗原決定簇的本發(fā)明疫苗或組合物免疫人類或小鼠是抗自身抗原的免疫接種。在一些實施方式中，帶有所述第二附著位點的血管緊張肽具有選自如下的氨基酸序列a)CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO14)氨基酸序列；b)CGGDRVYIHPFHL(SEQ ID NO15)氨基酸序列；c)DRVYIHPFHLGGC(SEQ ID NO16)氨基酸序列；和d)CDRVYIHPFH(SEQ ID NO98)氨基酸序列。
在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是RANKL(NFkB受體活化因子配體)。RANKL也稱為TRANCE(TNF-相關的激活誘導細胞因子)，ODF(破骨細胞分化因子)或OPGL(骨保護素(Osteoprotegerin)配體)。在EMBL數(shù)據(jù)庫保藏RANKL人類TrEMBLO14788中顯示了人類RANKL細胞外部分的氨基酸序列。分別在EMBL數(shù)據(jù)庫保藏RANKL_小鼠Tr EMBLO35235中和在RANKL_小鼠剪接形式TrEMBLQ9JJK8和TrEMBLQ9JJK9中示出了鼠源RANKL及同種型的細胞外部分氨基酸序列。
已經(jīng)證明RANKL是破骨細胞形成(osteoclastogenesis)中的必需因子。抑制RANKL與其受體RANK的相互作用可以引起破骨細胞形成受抑，因此提供了阻止骨質疏松癥和其它狀況中所觀察到的過度骨吸收的方法。通過RANK-Fc融合蛋白或稱為骨保護素(OPG)的RANKL可溶性誘餌受體可以抑制RANKL/RANK相互作用。
在骨骼中，RANKL在基質細胞或成骨細胞上表達，而RANK在破骨細胞前體上表達。RANK和RANKL的相互作用對于破骨細胞前體發(fā)育為成熟的破骨細胞至關重要。通過OPG可以阻斷該相互作用。OPG缺陷的小鼠患有通過重組OPG注射可以救助的骨質疏松癥，表明OPG能逆轉骨質疏松癥。因此，通過提供適宜的本發(fā)明綴合物、組合物和方法(例如，RANKL-AP205 VLP綴合物)抑制RANK-RANKL相互作用在逆轉或預防骨質疏松癥方面是有效的。
此外，在剔除OPG的小鼠中觀察到了可以通過OPG注射逆轉的動脈鈣化(Min等，J.Exp.Med.4463(2000))。在佐劑誘導的關節(jié)炎模型中，OPG注射能防止骨丟失和軟骨破壞，但是不能防止炎癥(爪腫脹)。推測活化的T細胞可以引起RANKL介導的破骨細胞形成和骨丟失的增加。OPG抑制小鼠骨中前列腺癌誘導的破骨細胞形成并防止前列腺腫瘤生長。OPG減少了小鼠中晚期骨癌的疼痛。
RANKL是屬于TNF超家族的245個氨基酸的跨膜蛋白質?？梢酝ㄟ^TACE樣蛋白酶切下部分細胞外區(qū)域(178個氨基酸)(Lum等，J Biol Chen.27413613(1999))。此外，已經(jīng)描述了缺少跨膜結構域的剪接變異體(Ikeda等，Endocrinology l421419(2001))。切割的細胞外部分含有與可溶性TNF-α高度同源的結構域，并且形成如在TNF-α中所觀察到的同源三聚體。C末端看似參加了三聚體的接觸位點。在序列的這個區(qū)域中存在一個半胱氨酸。
我們已經(jīng)建立了RANKL相應區(qū)域的3維結構模型，并且發(fā)現(xiàn)在折疊結構中天然存在的半胱氨酸不可能接近以用于與本發(fā)明載體上第一附著位點相互作用。N末端是適于附著包含第二附著位點的氨基酸接頭(其具有額外半胱氨酸殘基)的一個位點。具有融合了N末端氨基酸接頭(含有半胱氨酸殘基)的RANKL細胞外部分的人類RANKL構建體，是本發(fā)明一個實施方式。然而，含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點并且融合在RANKL序列C末端或者RANKL細胞外部分上的氨基酸接頭也是本發(fā)明的實施方式。
可以根據(jù)這里公開的教導產(chǎn)生人類RANKL構建體，并且本領域普通技術人員能在氨基酸序列比對中比較鼠和人的RANKL序列以鑒定載體中要克隆的人RANKL序列部分。含有氨基酸138-317并且對應于人類RANKL細胞外結構域C末端區(qū)域的片段為本發(fā)明一個實施方式，并且可以按本發(fā)明教導根據(jù)需要修飾該片段以便偶聯(lián)AP205 VLP。本發(fā)明也包括適用于在下述適宜宿主中表達的其它載體。本發(fā)明范圍中意欲包括的其它人RANKL構建體包括包含可以被TACE樣蛋白酶釋放的部分細胞外區(qū)域(178個氨基酸)或其片段(Lum等，J Biol Chem.27413613(1999))的人類RANKL構建體，或者該人類RANKL構建體可以包含對應于缺少跨膜結構域的可變剪接變異體的序列，以及其保守性片段。包含氨基酸165-317的人RANKL的C末端片段也是本發(fā)明實施方式。包含整個細胞外區(qū)域(氨基酸71-317)并可以根據(jù)需要按本發(fā)明教導進行修飾以偶聯(lián)AP205 VLP的RANKL片段也在本發(fā)明范圍內。
已經(jīng)在不同系統(tǒng)中(例如，大腸桿菌，昆蟲細胞，哺乳動物細胞)表達了RANKL，并且已經(jīng)證明這些RANKL是活性的。因此，幾種表達系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生組合物中適宜的RANKL抗原。在使蛋白質表達定向于大腸桿菌周質的情況下，可以用細菌信號肽置換RANKL或RANKL構建體(由蛋白質的細胞外部分組成)的信號肽，該RANKL或RANKL構建體可以經(jīng)修飾包含本發(fā)明的第二附著位點。對于在大腸桿菌胞質中表達蛋白質，RANKL構建體無需信號肽。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是MIF或其片段。MIF是起巨噬細胞移動抑制劑作用的細胞因子。它也被稱作延遲早期應答蛋白質6(delayed early response protein 6，DER6)、糖基化抑制因子或苯丙酮酸互變異構酶。
已經(jīng)證明MIF涉及多種狀況。在結核菌素誘導的遲發(fā)型超敏(DTH)反應中MIF(mRNA和蛋白質)被上調，并且抗MIF抗體抑制該DTH反應。在腎臟同種異體移植排斥中MIF也被上調。在眼睛自身免疫病模型中(實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(EAU))，抗MIF治療引起了EAU發(fā)展的延遲。患者血清中MIF增加，該增加也出現(xiàn)在貝赫切特病患者和患有虹膜睫狀體炎的患者中。抗MIF的免疫可以提供抗類風濕性關節(jié)炎的治療方法。因此適于引起抗MIF免疫或適于降低血清MIF的本發(fā)明綴合物、組合物和方法可以用于治療或預防與MIF超量產(chǎn)生有關的這些疾病、病癥和狀況。
在特應性皮炎患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高血清MIF濃度。在皮膚損傷中，MIF彌散性表達，而在對照中MIF存在于基細胞層中。類固醇治療后，MIF濃度降低，這與炎癥中MIF的作用一致。也發(fā)現(xiàn)MIF有助于腎小球腎炎的確立。用抗MIF抗體治療的動物顯示了顯著降低的腎小球腎炎。MIF是垂體來源的并在例如受到LPS刺激時分泌，并且其增強內毒素血癥。因此，抗MIF mAb抑制內毒素血癥和膿毒性休克，而重組MIF顯著地增加腹膜炎的致死率。MIF也是糖皮質激素誘導的、可以調節(jié)細胞因子產(chǎn)生的物質，并且其促進炎癥。
T細胞(TH2)也產(chǎn)生MIF，并且MIF可以支持T細胞增殖，而抗MIF治療降低T細胞增殖和IgG水平。在多發(fā)性硬化和神經(jīng)貝赫切特病(neuro-Behcets disease)患者的腦脊髓液中存在增加的MIF濃度。在患有長期銀屑病的患者的血清中也發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。在潰瘍性結腸炎患者而不是局限性回腸炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。
在支氣管哮喘患者的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。在類風濕性關節(jié)炎患者的滑液中MIF也被上調。在小鼠和大鼠模型中，抗MIF治療有效地降低類風濕性關節(jié)炎(Mikulowska等，J.Immunol.1585514-7(1997)；Leech等，Arthritis Rheum.41910-7(1998)，Leech等.Arthritis Rheum.43827-33(2000)，Santos等，Clin.Exp.Immunol.123309-14(2001))。因此，利用包含MIF作為抗原決定簇的組合物定向抑制MIF活性的治療將有益于上述狀況。
如MIF大鼠SEQ ID NO120，MIF小鼠SEQ ID NO121和MIF人類SEQ ID NO119 SwissProt中所示，來源于小鼠、大鼠和人類的MIF由114個氨基酸組成，并且含有3個保守性半胱氨酸。3個亞基形成沒有通過二硫鍵穩(wěn)定的同源三聚體。X射線結構已經(jīng)解析，顯示了3個自由半胱氨酸(Sun等，PNAS 935191-96(1996))，而一些文獻數(shù)據(jù)聲稱存在二硫鍵。盡管如此，沒有一個半胱氨酸被足夠暴露以致可以與載體上存在的可能的第一附著位點最佳地相互作用。因此，在本發(fā)明該實施方式中，一方面，含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭被添加到蛋白質的C末端(因為在三聚體結構中蛋白質C末端是暴露的)用于產(chǎn)生第二附著位點。在小鼠和大鼠MIF之間只有一個氨基酸改變，相似地，在人類和大鼠MIF或人類和小鼠MIF之間也具有非常高的序列同源性(約90％序列同一性)。本發(fā)明包括含有與AP205 VLP締合的人類和小鼠MIF構建體的綴合物、組合物和方法。
在MIF序列N末端添加含有半胱氨酸的氨基酸接頭也是本發(fā)明的實施方式。在大腸桿菌中已經(jīng)表達、純化了MIF，并且已證明其具有完全的功能性的(Bernhagen等，Biochemistry 3314144-14155(1994)。因此，可以在大腸桿菌中表達MIF以產(chǎn)生本發(fā)明有用的實施方式。
如果不從構建體切下起始甲硫氨酸，那么MIF的互變異構酶活性將受到抑制。大腸桿菌中表達的MIF構建體顯示了互變異構酶活性。切割了起始甲硫氨酸并且在該序列中正好位于起始甲硫氨酸后的脯氨酸殘基被突變?yōu)楸彼岬腗IF突變體也不顯示互變異構酶活性，其代表了本發(fā)明進一步的實施方式，并且意欲包括在本發(fā)明范圍內。在一個具體實施方式
中，AP205綴合無互變異構酶活性的MIF突變體。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原或抗原決定簇是白細胞介素-17(IL-17)。人類IL-17是具有可變糖基化的32kDa、二硫鍵連接的同源二聚體蛋白質(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995)；Fossiez，F(xiàn).等，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。該蛋白質包含155個氨基酸，并且包含19-23個殘基的N末端分泌信號序列。IL-17的氨基酸序列只與皰疹病毒(Herpesvirus)蛋白質(HSV13)相似，并且與其它細胞因子或已知蛋白質不相似。在GenBank記錄號#AAC50341中給出了人類IL-17氨基酸序列。在GenBank記錄號#AAA37490中給出了小鼠蛋白質序列。在評估的大量組織和細胞系中，僅在活化的T細胞和佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸/離子霉素刺激的外周血單核細胞中檢測到了編碼IL-17的mRNA轉錄物(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995)，F(xiàn)ossiez，F(xiàn).等，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。人類和小鼠序列都含有6個半胱氨酸殘基。
IL-17的受體在許多組織和細胞類型中廣泛地表達(Yao，Z.等，Cytokine 9794-800(1997))。盡管人類IL-17受體的氨基酸序列(866個氨基酸)預測為具有單跨膜結構域和一個525個氨基酸的長細胞內結構域的蛋白質，但是該受體序列是獨特的，與來自細胞因子/生長因子受體家族的任何受體均不相似。這點和IL-17本身與其它已知蛋白質缺少相似性聯(lián)系在一起，表明IL-17和其受體可能是新信號傳遞蛋白質和受體家族的一部分。臨床研究表明IL-17可能與許多炎性疾病有關。類風濕性關節(jié)炎患者的滑液T細胞分泌IL-17，并且IL-17刺激炎性介質產(chǎn)生(Chabaud，M.等，J.Immunol.161409-414(1998)；Chabaud，M.等，Arthritis Rheum.42963-970(1999))。在類風濕性關節(jié)炎患者中已經(jīng)報道了高水平IL-17(Ziolkowska M.等，J Immunol.1642832-8(2000))。
已經(jīng)證明白細胞介素17對鼠膝關節(jié)中蛋白聚糖的降解具有作用(Dudler J.等，Ann Rheum Dis.59529-32(2000))，并且有助于滑膜基質的破壞(Chabaud M.等，Cytokine.121092-9；(2000))?，F(xiàn)已存在檢測抗IL-17免疫作用的相關關節(jié)炎動物模型(Chabaud M.等，Cvtokine.121092-9；(2000))。在來源于多發(fā)性硬化患者的單核的細胞中已發(fā)現(xiàn)了升高水平的IL-17mRNA(Matusevicius，D.等，Mult.Scler.5101-104(1999))。在患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中觀察到了升高的IL-17血清水平(Wong C.K.等，Lupus 9589-93(2000))。此外，在分離自損傷的銀屑病皮膚的T細胞中IL-17 mRNA水平增加(Teunissen，M.B.等，J.Invest.Dermatol，111645-649(1998))。
也已經(jīng)證實了IL-17參與腎臟移植排斥(Fossiez F.等，Int.Rev.Immunol.16541-51(1998))。Antonysamy等(J.Immunol.162577-84(1999))也已經(jīng)提出了器官同種異體移植排斥中IL-17作用的證據(jù)，他證明IL-17促進樹突細胞祖先細胞的功能性分化。他們的發(fā)現(xiàn)提示了在同種異體T細胞增殖中IL-17的作用，其中可能部分地通過對DCs的成熟誘導作用來介導該T細胞增殖。而且，該研究小組還報道了(Tang J.L.等，Transplantation 72348-50(2001))IL-17在急性血管性排斥的免疫發(fā)病機理中的作用，其中白細胞介素17拮抗作用可以抑制急性而不是慢性血管性排斥。IL-17看似有潛力作為同種異體移植排斥干預性治療的新靶標。
抗IL-17單克隆抗體mAb5(Schering-Plough Research Institute)能完全抑制類風濕性關節(jié)炎(RA)滑膜上清液中通過50ng/ml IL-17誘導的IL-6產(chǎn)生。在該測定中，不相關的mAb MX1沒有作用。mAb5是用人類rIL-17(r＝重組蛋白)免疫后獲得的小鼠IgG1。在此測定系統(tǒng)中，1μg/ml濃度的mAb5能完全抑制IL-6產(chǎn)生(Chabaud，M.等，J.Immunol.161409-414(1998))。因此，抗IL-17免疫為上述各種狀況提供了治療方法。
因此，在本發(fā)明一個實施方式中，組合物包含與重組IL-17C末端融合的接頭，該接頭含有第二附著位點。在進一步實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭與加工后的蛋白質的序列的N末端融合，或者插入到信號肽C末端，即成熟蛋白質序列的N末端。對于真核生物表達系統(tǒng)，與這里所述的其它自身抗原一樣，IL-17基因的信號肽可以用例如來源于特定真核生物表達載體的另一個信號肽置換。對于在細菌中表達，可以用指導在周質中可溶性表達的細菌信號肽置換該信號肽。對于在細胞質中表達，構建體不帶有信號肽。在一些實施方式中，無信號肽的人類IL-17構建體將包含殘基24-155，22-155，21-155或20-155。在一些實施方式中，無信號肽的小鼠IL-17構建體將包含殘基26-158，25-158，24-158或27-155。可以在CV1/EBNA細胞中表達人類IL-17；已經(jīng)證明重組hIL-17可以以糖基化和非糖基化兩種形式分泌(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995))。IL-17也可以表達為hIL-17/Fc融合蛋白，隨后從融合蛋白切割IL-17蛋白質。也可以在酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達IL-17(Murphy K.P.等，Protein Expr Purif.12208-14(1998))。也可以在大腸桿菌中表達人類IL-17。當使大腸桿菌中IL-17的表達定向于周質時，可以用細菌信號肽置換IL-17信號肽。在一個實施方式中，IL-17構建體無信號肽以便該蛋白質在大腸桿菌細胞質中表達。
在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是白細胞介素13(IL-13)。IL-13是活化的T淋巴細胞分泌的細胞因子，其主要影響單核細胞、巨噬細胞和B細胞。前體蛋白質的頭20個氨基酸對應于信號肽，并且在加工后的蛋白質中不存在。已經(jīng)描述了小鼠序列(Brown K.D.等，J.Immunol.142679-687(1989))。根據(jù)表達宿主，IL-13構建體將含有(例如對于在真核生物宿主中表達和分泌)前體蛋白質的序列，或者(例如對于在大腸桿菌中細胞質表達)由成熟蛋白質組成。為了在大腸桿菌周質中表達，可以用細菌信號肽置換IL-13信號肽。
IL-13是最近發(fā)現(xiàn)涉及變應性氣道應答(哮喘)的T輔助細胞2來源的細胞因子(象IL-4，IL-5)。在許多腫瘤類型(例如，霍奇金淋巴瘤)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-13和IL-13受體被上調。白細胞介素13可以由霍奇金和里-斯細胞分泌并且刺激這些細胞的生長(Kapp U.等，J Exp Med.1891939-46(1999))。因此，抗IL-13免疫提供了治療諸如上述狀況，如哮喘或霍奇金淋巴瘤的方法。
在一個實施方式中，組合物包含含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，該接頭融合到成熟IL-13序列的N或C末端以在蛋白質中引入第二附著位點。在其它實施方式中，因為根據(jù)IL-13的NMR結構，成熟形式的IL-13的N端可以自由接近，所以將含有半胱氨酸的氨基酸接頭添加到成熟形式蛋白質的N末端(Eisenmesser，E.Z.等，J.Mol.Biol.310231(2001))。在其它實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端。在其它實施方式中，將含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭添加到蛋白質的C-末端。
可以在大腸桿菌(Eisenmesser E.Z.等，Protein Expr.Purf.20186-95(2000))中或在NS-0細胞(真核細胞系)(Cannon-Carlson S.等，Protein Expr.Purf.12239-48(1998))中表達IL-13。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是白細胞介素-5(IL-5)。IL-5是促嗜酸性粒細胞生成的譜系特異性細胞因子，在與增加數(shù)量的嗜酸性粒細胞有關的疾病，諸如哮喘中起重要作用。
在幾個研究中已經(jīng)證明了IL-5的生物學功能(Coffman R.L.等，Science 245308-10(1989)；Kopf等，Immunity 415-24(1996))，其中指出在嗜酸性粒細胞介導的疾病中抑制IL-5功能的有益作用。因此，對IL-5作用的抑制提供了治療與嗜酸性粒細胞有關的哮喘和其它疾病的方法。
IL-5形成通過二硫鍵共價連接的二聚體。已經(jīng)報道了單鏈(sc)構建體，其中通過肽接頭連接IL-5的兩個單體。
在本發(fā)明一個實施方式中，在加工形式的IL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的肽接頭。也設想在加工形式的scIL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的接頭。在其它實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式的蛋白質序列的N末端。
在其它實施方式中，含有半胱氨酸的接頭融合到IL-5序列的C末端，或者融合到scIL-5序列的C末端。
已經(jīng)描述了用于IL-5的大量表達系統(tǒng)，并且可以在制備本發(fā)明組合物時使用這些表達系統(tǒng)。Proudfoot等(Biochem J.270357-61(1990))描述了利用大腸桿菌的細菌表達系統(tǒng)。在大腸桿菌胞質中表達IL-5的情況下，IL-5構建體無信號肽。昆蟲細胞也可以用于產(chǎn)生用于制備本發(fā)明組合物的IL-5構建體(Pierrot C.等，Biochem.Biophys.Res.Comm un.253756-60(1998))。同樣地，也可以使用桿狀病毒表達系統(tǒng)(sf9細胞；Ingley E.等，Eur.J Biochem.196623-9(1991)和Brown P.M.等，Protein Expr.Purif.663-71(1995))。最后，也已報道了哺乳動物表達系統(tǒng)(CHO細胞)，并且在制備本發(fā)明組合物時也可以使用這些表達系統(tǒng)(Kodama S等，J.Biochem.(Tokyo)110693-701(1991))。
也已經(jīng)描述了用于小鼠IL-5的桿狀病毒表達系統(tǒng)(Mitchell等，Biochem.Soc.Trans.21332S(1993)，Kunimoto DY等，Cytokine 3224-30(1991))和利用CHO細胞的哺乳動物表達系統(tǒng)(Kodama S等，Glycobiology2419-27(1992))。
其中IL-5序列在其N末端融合了包含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的鼠IL-5構建體的表達適于IL-5偶聯(lián)AP205 VLP。根據(jù)這里的教導可以產(chǎn)生人類構建體，得到適于偶聯(lián)AP205 VLP的蛋白質人C-IL-5-E、人C-IL-5-F和人C-IL-5-S，其為本發(fā)明的其它實施方式。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是CCL-21，CCL-21是CC亞家族的趨化因子，也稱為小誘導型細胞因子A21，exodus-2，SLD(次級淋巴細胞細胞因子)，TCA4(胸腺來源的趨化劑4)或6Ckine。
CCL21抑制血細胞生成，并且刺激胸腺細胞的趨化性，激活T細胞和樹突細胞，但是不激活B細胞、巨噬細胞或嗜中性粒細胞。它顯示了對幼稚T細胞優(yōu)先的活性。它也是有效的腎小球系膜細胞(mesangia cell)化學引誘物。(根據(jù)物種)CCL21結合趨化因子受體CCR7和CXCR3。在生理學剪切下，它可以觸發(fā)快速的依賴于整聯(lián)蛋白的淋巴細胞滾動抑制作用，并且其被高內皮小靜脈(high endothelial venules)高度地表達。
在人肺癌SCID小鼠模型(Arenberg等，Cancer Immunol.Immunother.49587-92(2001))和小鼠結腸癌腫瘤模型中(Vicari等，J.Immunol.1651992-2000(2001))，鼠CCL21抑制腫瘤生長和血管生成。在大鼠角膜微囊試驗中也檢測到鼠CCL21的angiostatic活性(Soto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958205-10(1998)。
也證明在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4被上調，并且在代表乳腺癌轉移的第一目的地的器官中高度表達CCL21和CXCL12及各自的配體(Müller等.(Nature 41050-6(2001))。體外，通過中和性抗CCL21抗體可以阻斷CCL21介導的趨化性，同樣地CXCR4介導的趨化性也可以被相應抗體阻斷。因此，抗CCL21免疫提供了治療癌癥，更特別是乳腺癌中瘤轉移擴散的方法。
在小鼠和人類中分泌的CCL21分別具有110或111個氨基酸。在SwissprotSY21人類中和在SwissprotSY21_小鼠中示出了各自的序列。與其它CC細胞因子不同，CCL21確實在C末端延伸區(qū)域中多包含2個半胱氨酸。推測所有半胱氨酸都參與了二硫鍵。
在下文中，描述了用于制備包含CCL21抗原決定簇的本發(fā)明組合物的構建體和表達系統(tǒng)。在同源蛋白質Eotaxin的NMR結構中，N和C末端都暴露于溶劑。在一些實施方式中，在蛋白質C末端添加包含作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭。已經(jīng)表達了(在CCL21的C末端)與堿性磷酸酶融合的蛋白質，并且證明其是功能性的，表明在CCL21的C末端的融合與受體結合相容。在具體實施方式
中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端。
已經(jīng)描述了用于CCL21產(chǎn)生的幾種表達系統(tǒng)(例如，Hedrick等，J.Immunol.1591589-93(1997))。例如，可以在桿狀病毒系統(tǒng)中表達CCL21(Nagira等，J.Biol.Chem.27219518-24(1997))。
在相關實施方式中，抗原決定簇是基質來源的因子1(SDF-1)，現(xiàn)在稱為CXCL12。CXCL12是骨髓基質細胞產(chǎn)生的趨化因子，并且最初被鑒定為前B細胞的刺激因子。
如上所述，已經(jīng)證明在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4上調，并且在代表乳腺癌轉移的第一個目的地的器官中高度表達CCL21和SDF-1及各自的配體(Müller等.Nature 41050-6(2001))。體外，通過中和性抗SDF-1和抗CXCR4抗體，可以抑制SDF-1/CXCR-4介導的趨化性。
在利用人MDA-MB-231乳腺癌細胞系的SCID小鼠乳腺癌轉移模型中，當用抗CXCR4抗體治療小鼠時觀察到了顯著減少的肺轉移。在引流淋巴結中，觀察到了向腹股溝淋巴結和腋淋巴結轉移的減少(38％而不是在對照中的100％的轉移)。因此，抗CXCL12免疫提供了抗癌，更具體地抗乳腺癌轉移的治療方法。
已經(jīng)證明SDF-1/CXCR4趨化因子-受體對可以增加更原始的造血祖先細胞歸巢成為骨髓的效力。此外，推測CXCR4和SDF-1影響慢性淋巴細胞性白血病細胞的分布。這些細胞總是浸潤患者的骨髓，并且證明這些細胞在骨髓中的遷移是CXCR4依賴性的。如果慢性淋巴細胞性白血病細胞不與基質細胞共培養(yǎng)，它們將出現(xiàn)細胞程序死亡。SDF-1阻斷性抗體可以抑制基質細胞的這種保護性作用(Burger等，Blood 962655-63(2000))。因此，抗CXCL12免疫提供了抗慢性淋巴細胞性白血病的治療方法。
已經(jīng)證明CXCR4是HIV進入到T細胞的共同受體。SDF-1抑制X4(依賴于CXCR4)HIV株系對CD4+細胞的感染(Oberlin等，Nature 382833-5(1996)；Bleul等，Nature 382829-33(1996)，Rusconi等，Antivir.Ther.5199-204(2000))。已經(jīng)證明SDF-1的合成肽類似物有效地抑制HIV-1借助于CXCR受體的進入和感染(WO059928A1)。因此，抗CXCL12免疫提供了阻斷HIV進入T細胞的方法和由此治療AIDS的方法。
也報道了SDF-1-CXCR4相互作用在類風濕性關節(jié)炎滑膜內CD4+T細胞聚積中起重要作用(Nanki等，2000)。因此，抗SDF-1免疫提供了抗類風濕性關節(jié)炎的治療方法。
已知人和鼠SDF-1通過單基因的不同剪接，以兩種形式SDF-1α和SDF-1β出現(xiàn)。它們有4個C末端氨基酸不同，SDF-1β(74個氨基酸)中存在這4個C末端氨基酸，而SDF-1α(70個氨基酸)中不存在這4個C未端氨基酸。在SwissprotSDF1_人類中示出了人類SDF-1序列，在SwissprotSDF1_小鼠中示出了小鼠SDF-1序列。SDF-1含有形成2個分子內二硫鍵的4個保守性半胱氨酸。SDF晶體結構顯示非共價連接的二聚體(Dealwis等，PNAS 956941-46(1998))。SDF-1結構也顯示了長N末端延伸。
丙氨酸掃描誘變被用于鑒定SDF-1上的受體結合位點(部分)(Ohnishi等，J Interferon Cytokine Res.20691-700(2000))，Elisseeva等.(J.Biol.Chem.27526799-805(2000))和Heveker等.(Curr.Biol.8369-76(1998))描述了抑制受體結合(和HIV進入)的SDF-1衍生肽。
在下文中，描述了適于產(chǎn)生與SDF-1有關的本發(fā)明組合物的構建體和表達系統(tǒng)。SDF-1的N和C末端均暴露于溶劑。因此，在具體實施方式
中，含有作為第二附著位點的半胱氨酸的氨基酸接頭融合到蛋白質序列C末端，而在其它具體實施方式
中，含有作為第二附著位點的半胱氨酸的氨基酸接頭融合到蛋白質序列N末端。含有半胱氨酸的氨基酸接頭可以融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端?？梢栽谶m宜的表達載體中克隆編碼這些特異構建體的基因。
已經(jīng)描述了SDF-1在雞胚成纖維細胞中在仙臺病毒系統(tǒng)中的表達(Moriya等，F(xiàn)EBS Lett.425105-11(1998))，此外大腸桿菌中(Holmes等，Prot.Expr.Purif.21367-77(2001))SDF-1的表達，和SDF-1的化學合成(Dealwis等，PNAS 956941-46(2001))也已有描述。
在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是B淋巴細胞化學引誘物(BLC，CXCL13)。BLC在脾臟、淋巴集結和淋巴結中表達(Gunn等，1998)。在生發(fā)中心中其表達最強，B細胞在此經(jīng)受體細胞突變和親和力成熟。BLC屬于CXC趨化因子家族，并且它的最接近同系物是GROα(Gunn等，Nature 391799-803(1998))。人BLC與鼠BLC具有64％同源性。它的受體是CXCR5。BLC也與IL-8有同源性。在次級淋巴器官諸如脾臟和淋巴集結中，BLC向濾泡募集B細胞。BLC對于向富含濾泡樹空細胞(FDCs)的淋巴結區(qū)室募集B細胞也是必需的(Ansel等，Nature 406309-314(2000))。BLC也誘導在募集的B細胞上增加的淋巴毒素α1β2(LTα1β2)表達。由于LTα1β2促進BLC表達，這就提供了正反饋循環(huán)(Ansel等，Nature 406309-314(2000))。也已證明BLC能誘導淋巴新生(Lymphoidneogenesis)(Luther等，Immunity 12471-481(2000))?？雌饋鞦DCs也表達BLC。因此，抗BLC免疫可以提供涉及淋巴新生的自身免疫病諸如類風濕性滑膜炎和類風濕性關節(jié)炎或I型糖尿病的治療方法。已經(jīng)描述了具有C末端His標簽的BLC構建體，并且該構建體是功能性的(Ansel，K.M.等，J.Exp.Med.1901123-1134(1999))。
在本發(fā)明一個實施方式中，組合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的接頭，并且該接頭融合在BLC序列的C末端。
在與BLC同源的IL-8中，N和C末端都是游離的。含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭和BLC的N末端融合產(chǎn)生了本發(fā)明的一個實施方式。
在本發(fā)明其它實施方式中，組合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且該接頭融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端?？梢栽谶m宜表達載體中克隆和相應地表達編碼這些特定構建體的基因。在記錄號NP_006410中示出了人類BLC序列。該序列的氨基酸1-22是信號肽。在記錄號NP_061354中示出了小鼠序列。氨基酸1-21是信號肽。在一些實施方式中，具有BLC做為抗原決定簇的本發(fā)明組合物利用了成熟形式的蛋白質來產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。
在另一個具體實施方式
中，抗原決定簇是Eotaxin。Eotaxin是對嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和Th2細胞上存在的趨化因子受體3特異的趨化因子。然而，看起來Eotaxin對嗜酸性粒細胞具有高度特異性(ZimmermanJ.Immunol.1655839-46(2000))。盡管在剔除Eotaxin-1的小鼠中，嗜酸性粒細胞遷移減少70％，但是其還可以發(fā)生嗜酸性粒細胞增多(Rothenberg等，J.Exp.Med 185785-90(1997))。IL-5看起來負責嗜酸性粒細胞從骨髓向血液的遷移，而Eotaxin與組織中的局部遷移有關(Humbles等，J.Exp.Med.186601-12(1997))。
人類基因組含有3種Eotaxin基因，Eotaxin1-3。它們相互有30％同源性。目前在小鼠中已知2種基因Eotaxin1和Eotaxin2(Zimmerman等，J.Immunol.1655839-46(2000))。它們有38％同源性。鼠Eotaxin2與人Eotaxin2有59％同源性。在小鼠中，看起來Eotaxin1在胃腸道中普遍地表達，而Eotaxin2似乎主要在空腸中表達(Zimmerman等，J.Immunol.1655839-46(2000))。Eotaxin1存在于支氣管肺泡液中(Teixeira等，J.Clin.Invest.1001657-66(1997))。Eotaxin具有8.3kDa的MW。在多種條件下，它在單體和二聚體之間保持平衡，在37℃具有估算的1.3mM Kd(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。然而，單體形式是主要的。通過NMR光譜學已經(jīng)闡述了Eotaxin的結構。與受體CCR3的結合位點在N末端，并且第一個半胱氨酸之前的區(qū)域是至關重要的(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。結合Eotaxin的趨化因子受體肽證實了該發(fā)現(xiàn)。Eotaxin具有形成2個二硫鍵的4個半胱氨酸。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，并且在一個實施方式中，該接頭融合到Eotaxin序列C末端。在另外的實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端?？梢栽谶m宜的表達載體中克隆編碼這些特定構建體的基因。
可以化學合成Eotaxin(Clark-Lewis等，Biochemistry 303128-3135(1991))。已經(jīng)描述了大腸桿菌細胞質中Eotaxin1的表達(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。也已描述了大腸桿菌中Eotaxin2作為包函體的表達，及隨后的重折疊(Mayer等，Biochemistry 39；8382-95(2000))，和Eotaxin2的昆蟲細胞表達(Forssmann等，J.Exp.Med.1852171-6(1997))，并且這些可以用于達到本發(fā)明具體的實施方式。
在本發(fā)明另一個具體實施方式
中，抗原決定簇是巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-1是巨噬細胞和其骨髓祖先細胞增殖、分化和生存的調節(jié)物。M-CSF的受體是原癌基因cFMS編碼的細胞表面酪氨酸激酶受體。M-CSF和其受體升高的表達與幾種上皮癌(諸如乳腺癌、子宮癌和卵巢癌)中的不良預后有關。在由易患乳腺癌的轉基因小鼠(PyMT)和含有csf-1基因隱性無效突變的小鼠雜交得到的小鼠株系中，研究了腫瘤進展。這些小鼠與PyMT小鼠比較顯示了減弱的晚期侵入性癌和肺轉移(Lin等，J.Exp.Med.193727-739(2001))。原因看起來是缺少向腫瘤組織募集巨噬細胞。在csf.1無效小鼠中Lewis肺癌的表下生長也受損。推測腫瘤生長的巨噬細胞增強機理是通過巨噬細胞產(chǎn)生的血管生成因子、生長因子和蛋白酶實現(xiàn)的。
可以得到M-CSF可溶形式的結構數(shù)據(jù)(晶體結構Pandit等，Scoence2581358-62(1992))，并且表明蛋白質N和C末端是可以接近的。然而，N末端接近與受體相互作用的位點。此外，M-CSF以可溶和細胞表面形式存在，其中跨膜區(qū)域在其C末端。因此，本發(fā)明的一些實施方式包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且在一個實施方式中，該接頭添加在M-CSF或其片段的C末端、可溶形式M-CSF的C末端。在其它實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質或可溶形式的蛋白質的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質或可溶形式蛋白質序列的N末端。M-CSF是二聚體，其中兩個單體通過鏈間二硫鍵連接。
已經(jīng)描述了用于M-CSF N末端149個氨基酸(功能性)片段的大腸桿菌表達系統(tǒng)(Koths等，Mol.Reprod.Dev.4631-37(1997))。按上述進行修飾的這個M-CSF片段代表根據(jù)本發(fā)明實施方式的一個抗原決定簇。在記錄號NP_000748中示出了人類序列。本發(fā)明其它抗原決定簇包含對應于可溶形式受體的、由上述序列的殘基33-181或33-185組成的N末端片段。
在記錄號NP_031804中示出了小鼠序列。成熟序列在氨基酸33開始。因此，本發(fā)明一個抗原決定簇包含氨基酸33-181或33-185。
在一個實施方式中，抗原決定簇是抵抗素(Res)。用兔多克隆抗體進行被動免疫研究，其中該多克隆抗體抗細菌中表達的GST與小鼠抵抗素(mRes)的融合蛋白質而產(chǎn)生。該被動免疫在肥胖癥/II型糖尿病動物模型中導致改進的葡萄糖攝取(Steppan等，Nature 409307-12(2001))。
抵抗素(Res)是約12KD的114個氨基酸的肽激素。它含有11個半胱氨酸，其中已證明最N端的半胱氨酸負責蛋白質的二聚化，而其它10個半胱氨酸被認為參與分子內二硫鍵形成(Banerjee和Lazar，J.Biol.Chem.27625970-3(2001))。第一個半胱氨酸突變?yōu)楸彼釋U止mRes的二聚化。
動物模型中，在其C末端具有FLAG標簽的mRes保留了活性(Steppan等，Nature 409307-12(2001))。相似地，C末端HA標記(血凝素標簽)的抵抗素在組織培養(yǎng)測定中也顯示了活性(Kim等，J.Biol.Chem.27611252-6(2001))。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，并且該接頭融合在抵抗素序列的C末端。在另一個實施方式中，包含半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應于加工后的蛋白質序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質序列的N末端。
在本發(fā)明一個實施方式中，MRes或huRes也可以表達為Fc融合分子(其中在構建體的抵抗素和Fc部分之間插入蛋白酶切割位點)，諸如C末端為真核生物表達系統(tǒng)中融合蛋白的Fc部分的鉸鏈區(qū)之一個或多個半胱氨酸殘基，或者諸如這里所述的融合方式。切割融合蛋白可以釋放抵抗素，此時抵抗素還包含含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭或者融合蛋白Fc部分的全部或部分鉸鏈區(qū)(其在C末端包含適于偶聯(lián)AP205 VLP的半胱氨酸殘基)。在記錄號AF323081中示出了人類抵抗素序列。在記錄號AF323080中示出了鼠序列。本發(fā)明有利的實施方式是在其C末端融合了包含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的人抵抗素蛋白質?？梢愿鶕?jù)這里公開的教導產(chǎn)生人抵抗素構建體，并且通過在蛋白質序列比對中比較鼠和人抵抗素序列可以鑒定將要克隆到這里所述載體或其它適合表達載體中的人抵抗素序列部分。適于產(chǎn)生本發(fā)明組合物的人抵抗素構建體的例子是人抵抗素-C-Xa，人抵抗素-C-EK和人抵抗素-C。
這樣產(chǎn)生的人抵抗素構建體是本發(fā)明的一個實施方式。因此，利用本發(fā)明上述組合物接種以對抗抵抗素，可以提供治療II型糖尿病和肥胖癥的方法。
在另一個實施方式中，抗原決定簇是淋巴毒素-β，抗淋巴毒素-β免疫可以用于治療朊病毒介導的疾病。朊病毒是在大多數(shù)哺乳動物物種中存在的細胞蛋白質。朊病毒蛋白質以兩種形式存在，通常存在于健康個體中的正常折疊形式(PrPc)和引起疾病的錯誤折疊形式(PrPSc)。目前朊病毒假說假設錯誤折疊的朊病毒PrPSc能催化健康朊病毒PrPc重折疊為引起疾病的PrPSc(A.Aguzzi，Haematologica 85，3-10(2000))。在一些罕見的例子中，這種轉換也可以自發(fā)出現(xiàn)，在人類中引起經(jīng)典的CJD。PrPc中一些突變與這種自發(fā)轉換的增加有關，從而引起各種形式的家族性CJD。然而，PrPSc也可以具有傳染性，可以通過輸血或通過食物鏈傳遞。后一種形式的朊病毒介導的疾病稱為庫魯病(Kuru Kuru)，過去該病出現(xiàn)在食人者中。然而，因為以自己個體為食的物種不多，所以這種通過口傳遞的疾病形式太罕見以致于沒有有關其它物種的文獻記載。
整個歐洲用牛肉產(chǎn)品大量飼養(yǎng)奶牛改變了受PrPSc可傳染形式感染(引起B(yǎng)SE)的奶牛的狀況和數(shù)量，最近幾年奶牛感染數(shù)量急劇增加，幾十萬奶牛受到這種感染。這種大量BSE患病奶牛的突然出現(xiàn)在人群中引起了可以在人類中誘導相似疾病的極大恐慌。實際上，在1996年，已報道了第一例變異形式的CJD，其由食用PrPSc感染的牛肉引起。到現(xiàn)在，這種恐慌繼續(xù)增加，因為在接下來的幾年里受感染的人的數(shù)量持繼地增加，并且沒有治愈前景。而且，因為綿羊會死于稱為瘙癢病的朊病毒介導的疾病，且因為其它哺乳動物物種也可以受PrPSc感染，所以BSE樣疾病也可能在其它物種中發(fā)生。
據(jù)認為瘙癢病(朊病毒介導的疾病)因子的復制主要發(fā)生在淋巴組織中，并且已證明其依賴于表達朊病毒-蛋白質的濾泡樹空細胞(FDCs)(Brown等，Nature Med 111308-1312(1999))。已經(jīng)很詳細地研究了朊病毒傳遞的機制。現(xiàn)在清楚朊病毒首先在感染的小鼠的淋巴器官中復制，隨后向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉運。已證明在缺少功能性濾泡樹空細胞的小鼠中，朊病毒在脾臟中的復制會受損且神經(jīng)侵入出現(xiàn)(小)延遲(Montrasio等，Science 2881257-1259(2000))。這通過用可溶性淋巴毒素β受體-Fc-融合蛋白(LTβR-Fc)注射小鼠而達到。該可溶性受體構建體通過干擾T，B或NK細胞上的淋巴毒素β和FDC前體細胞上的淋巴毒素β受體的重要相互作用，可以抑制FDCs發(fā)育。FDC是很少研究的細胞類型，但是現(xiàn)在清楚它們的發(fā)育依賴于B細胞產(chǎn)生的淋巴毒素和/或TNF(F.Mackay，J.L.Browning，Nature 395，26-27(1998))。實際上，淋巴毒素缺陷的小鼠不顯示FDCs(M.S.Matsumoto等，Science 264，703-707(1996))。除了FDCs外，抗體也可以在疾病的進展中起作用(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23(1999))。
因此，從淋巴器官消除FDCs的抗淋巴毒素β(也稱為TNFγ)，LTα或LTβ受體的接種可以提供用于治療或預防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導的疾病，諸如牛海綿狀腦病(BSE)的疫苗，并且由此預防朊病毒的復制和神經(jīng)侵入。
抗淋巴毒素β的免疫也可以提供治療糖尿病的方法。非肥胖型糖尿病NOD小鼠中可溶性LTβR-Fc融合蛋白的轉基因表達阻斷了糖尿病發(fā)生而不阻斷胰島炎(Ettinger等，J.Exp.Med.1931333-40K(2001))。Wu等.(J.Exp.Med.1931327-32(2001))也利用NOD小鼠研究了淋巴毒素β的參與，但是代替利用轉基因動物，他們在試驗中注射LTβR-Fc融合蛋白。他們觀察到對糖尿病發(fā)生的強抑制和對胰島炎的抑制。最有趣地，通過融合蛋白治療，他們甚至逆轉了先前存在的胰島炎。因此，在胰腺中，可以逆轉淋巴濾泡結構的形成。因此，抗淋巴毒素β的接種可以提供抗I型糖尿病的治療方法。
在一個實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且該接頭被添加到對應于加工形式的淋巴毒素β的序列的N末端，或者插入到對應于成熟形式蛋白質的序列的N末端和信號肽之間，即信號肽C末端。在本發(fā)明相關實施方式中，淋巴毒素β的細胞外部分表達為融合蛋白，其中該融合蛋白具有在淋巴毒素β的N端融合的谷胱甘肽-S-轉移酶，或者該融合蛋白具有在淋巴毒素β細胞外部分的N端融合的6個組氨酸標簽及隨后的myc標簽。含有蛋白酶切割位點的氨基酸間隔區(qū)及含有作為附著位點的半胱氨酸的接頭序列(蛋白酶切割位點C端)融合到淋巴毒素β細胞外部分序列的N末端。在一個實施方式中，淋巴毒素β細胞外部分由對應于淋巴毒素β氨基酸49-306或126-306的片段組成?？梢栽趐CEP-Pu真核載體中克隆和表達本發(fā)明的這些特定的組合物。在一些實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有適于作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，并且該接頭融合到淋巴毒素β或淋巴毒素β片段的C末端。在特別有利的實施方式中，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接頭ACGG，該接頭本身含有用于偶聯(lián)AP205 VLP的半胱氨酸殘基，將該氨基酸序列融合到淋巴毒素β細胞外部分或淋巴毒素β細胞外部分的片段的N末端，用腸激酶切割在載體pCEP-SP-GST-EK或載體pCP-SP-his-myc-EK中表達的相應融合蛋白后，產(chǎn)生人C-LTβ49-306和人C-LTβ126-306蛋白質。
在一個實施方式中，抗原或抗原決定簇是朊病毒蛋白，其片段，特別是朊病毒蛋白的肽。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗原決定簇是朊病毒蛋白或其片段?？闺貌《镜鞍椎拿庖呖梢蕴峁┲委熁蝾A防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導的疾病的方法。對應于鼠朊病毒蛋白片段和序列CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(SEQ ID NO17)(″cprplong″)和CGNDWEDRYYRENMYR(″cprpshort″)(SEQ ID NO18)的鼠肽包含用于化學偶聯(lián)AP205 VLP的添加的N末端半胱氨酸殘基，并且產(chǎn)生了本發(fā)明一個實施方式。在一個實施方式中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋白。在整個申請中給出了如何修飾人朊病毒蛋白以連接AP205 VLP的指導。公開了小鼠朊病毒蛋白構建體，并且也可以制備人朊病毒蛋白構建體。包括整個人朊病毒蛋白序列和人朊病毒蛋白的其它片段的其它構建體也是本發(fā)明的組合物?？闺貌《镜鞍椎拿庖呖梢蕴峁┲委熁蝾A防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導的疾病的方法。利用包含朊病毒蛋白的本發(fā)明組合物進行免疫也可以提供治療其他動物中朊病毒介導的疾病的方法。對應于上述鼠肽和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(″人類cprplong″)(SEQ ID NO19)和CGSDYEDRYYRENMHR(″人類cprpshort″)(SEQ ID NO20)的人朊病毒蛋白肽產(chǎn)生了本發(fā)明的實施方式。這些肽包含被添加用于偶聯(lián)AP205 VLP的N末端半胱氨酸殘基。相應的牛和綿羊肽是CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(″牛cprplong″)(SEQ ID NO21)和CGNDYEDRYYRENMHR(″牛cprpshort″)(SEQ ID NO22)和CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(″綿羊cprplong″)(SEQ ID NO23)和CGNDYEDRYYRENMYR(″綿羊cprpshort″)(SEQ ID NO24)，所用這些都構成本發(fā)明實施方式。
在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是腫瘤壞死因子(TNF-α)，其片段或TNF-α肽。特別地，通過用分別包含本發(fā)明的這種肽或片段的疫苗和組合物免疫人和動物，TNF-α肽或片段可以用于誘導抗整個蛋白質的自身特異性免疫應答。下面的鼠肽是人肽的鼠源同系物，已經(jīng)證明該肽可以與中和TNF-α活性的抗體結合(Yone等.J.Biol.Chem.27019509-19515)，并且在本發(fā)明另一個實施方式中，該肽用半胱氨酸殘基修飾以便與AP205 VLP偶聯(lián)。
MuTNFα肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸殘基22-32組成的表位的N末端添加序列CGG，產(chǎn)生了序列CGGVEEQLEWLSQR(SEQ ID NO25)。
3’TNFII肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸殘基4-22組成的表位的C末端融合序列GGC，并且將谷氨酰胺21突變?yōu)楦拾彼?。由此得到的肽序列是SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC(SEQ ID NO26)。
5’TNFII肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸殘基4-22組成的表位的N末端融合半胱氨酸殘基，并且將谷氨酰胺21突變?yōu)楦拾彼?。由此得到的肽序列是CSSQNSSDKPVAHVVANHGV(SEQ ID NO27)。
與4-22表位對應的人類序列是SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ ID NO28)。對于鼠源序列，在一個實施方式中，半胱氨酸融合在該表位N末端或者序列GGC融合在該表位C末端以便共價偶聯(lián)本發(fā)明AP205 VLP。然而，將含有半胱氨酸的其它序列融合在表位的N或C末端，也在本發(fā)明范圍內。一般地，在一個實施方式中，將一個或兩個甘氨酸殘基插在添加的半胱氨酸殘基和表位序列之間。然而，也可以插入其它氨基酸而不是甘氨酸，并且這些氨基酸殘基包括小氨基酸，諸如絲氨酸。
在本發(fā)明組合物的其它優(yōu)選實施方式中，抗原或抗原決定簇是腫瘤壞死因子(TNF-α)、其片段或突變蛋白質，或者TNF-α肽或其片段或突變蛋白質的肽，其中具有所述第二附著位點的所述抗原或抗原決定簇具有選自如下的氨基酸序列a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ IDNO100)氨基酸序列；b)SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGC(SEQID NO101)氨基酸序列；和c)CGGQLQWLNRRANA(SEQ ID NO102)氨基酸片列。
對應于氨基酸殘基22-32的人類序列是QLQWLNRRANA(SEQ IDNO29)。在一個相關實施方式中，序列CGG融合在該表位N末端以便共價偶聯(lián)本發(fā)明AP205 VLP。適于本發(fā)明中使用的其它TNF-α表位也已經(jīng)例如，由Yone等.(J.Biol.Chem.27019509-19515)描述和公開。本發(fā)明還包括含有這里所述的抗原或抗原決定簇的模擬表位的組合物。
本發(fā)明的一個特定組合物包含呈遞在病毒樣顆粒上用于誘導抗抗體免疫應答的抗體或抗體片段。在一個實施方式中，選擇淋巴瘤細胞產(chǎn)生的抗體或抗體片段，將其和用于免疫的病毒樣顆粒附著，以便誘導抗淋巴瘤的保護性免疫應答。
在其它進一步實施方式中，將模擬抗原的抗體或抗體片段附著在AP205 VLP上。這些模擬抗體或抗體片段可以通過免疫及隨后分離此模擬抗體或抗體片段，或者通過本領域任何已知的方法諸如雜交瘤技術(Gherardi，E.等，J.Immunol.Methods 12661-68(1990))，噬菌體展示(Harrison等，Methods Enzymol.26783-109(1996))，核糖體展示(Hanes，J.等，Nat.Biotechnol.181287-1292(2000)，酵母雙雜交(Visintin，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611723-11728(1999))，酵母表面展示(Boder，ET.& Wittrup，KD.Methods.Enzym.328430-444(2000))，細菌表面展示(Daugherty，PS.等，Protein Eng.12613-621(1999))產(chǎn)生。也可以利用本領域已知的方法從抗體文庫或幼稚抗體文庫( antibody library)分離模擬抗體。
在進一步實施方式中，使用識別另一個抗體的結合位點的抗體，即，抗獨特型抗體，也稱為免疫性抗體(immunizing antibody)?？躬毺匦涂贵w識別的抗體也稱為中和抗體。因此，通過免疫以抵抗抗獨特型抗體，可以在原位產(chǎn)生具有中和抗體特異性的分子；我們也將這些產(chǎn)生的抗體稱為誘導型抗體。在另一個實施方式中，選擇免疫性抗體使它與免疫作用所要對抗的靶分子的配體分子相互作用。配體分子可以是與靶分子相互作用的任何分子，但是在一個實施方式中，優(yōu)選地，配體分子與這樣的靶分子位點相互作用，其中為了抑制該靶分子的功能而產(chǎn)生的抗體應針對該靶分子位點。配體分子可以是靶分子的天然配體或者可以是具有適宜結合特性的基因工程改造的、設計的或分離的任何配體。
免疫性抗體可以來自于人，諸如從幼稚或免疫人類抗體文庫分離，或者可以從產(chǎn)生自其它動物來源，例如鼠源的文庫分離。
通過暴露的二硫鍵(例如，F(xiàn)ab片段中CH1和Cκ或Cλ之間的鏈間二硫鍵)的有限還原，或者在另一個實施方式中，通過在抗體或抗體片段C末端融合含有半胱氨酸殘基的接頭，實現(xiàn)抗體或抗體片段與AP205 VLP的偶聯(lián)。在另一實施方式中，含有半胱氨酸殘基的接頭融合到抗體或抗體片段的N末端以附著VLP或菌毛蛋白質。
如同產(chǎn)生和鑒定特定表位的模擬表位的方法，利用模擬表位的大量疫苗組合物也是本領域已知的。例如，Arnon等，Immunology 101555-562(2000)(這里將整個公開文獻并入為參考文獻)描述了抗曼氏裂體吸蟲(Schistosoma Mansoni)的基于模擬表位肽的疫苗。這些疫苗中使用的模擬表位通過篩選固相8mer隨機肽文庫以鑒定抗曼氏裂體吸蟲保護性單克隆抗體識別的表位的模擬表位而獲得。相似地，Olszewska等，Virology 27298-105(2000)(這里將整個公開文獻并入為參考文獻)描述了f小鼠。此外，Zuercher等，Eur.J.Immunol.30128-135(2000)(這里將整個公開文獻并入為參考文獻)描述了利用表位展示噬菌體進行口服抗IgE免疫的組合物和方法。具體地，表位展示M13噬菌體用做口服抗IgE疫苗的載體。試驗的疫苗組合物含有單克隆抗IgE抗體BSW17的模擬表位和表位。
本發(fā)明的實施方式包括含有引發(fā)針對特定抗原的免疫應答的模擬表位的疫苗組合物，及組成這些疫苗組合物的單個模擬表位/AP205 VLP綴合物，及這些疫苗組合物在引發(fā)抗特定抗原或抗原決定簇的免疫應答中的用途。模擬表位也可以是多肽，諸如抗獨特型抗體。因此，在本發(fā)明另一實施方式中，抗原或抗原決定簇是抗獨特型抗體或抗獨特型抗體片段。
本發(fā)明還包括含有這里所述的抗原或抗原決定簇的模擬表位的組合物?？梢酝ㄟ^大量方法(包括篩選隨機肽噬菌體展示文庫(參見，例如WO 97/31948，這里將整個公開文獻并入為參考文獻))產(chǎn)生和鑒定特定抗原的模擬表位。常常會進行這種文庫的篩選以鑒定結合一種或多種對特定抗原具有特異性的抗體的肽。
適于用在本發(fā)明疫苗組合物中的模擬表位可以是線性或環(huán)狀肽。線性或環(huán)狀肽模擬表位可以通過非肽鍵連接非天然分子支架或核心顆?；騐LP。
如上所述，已經(jīng)鑒定了可以引發(fā)抗人IgE分子的免疫應答的大量人IgE模擬表位和表位(參見，例如WO 97/31948)。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明疫苗組合物包括引發(fā)抗免疫球蛋白分子(例如，IgE分子)的免疫應答的組合物。
可以用于激發(fā)這種免疫應答的肽包括蛋白質、蛋白質亞基、IgE分子結構域和能激發(fā)對IgE分子具有特異性的抗體產(chǎn)生的模擬表位。一般地，用于制備疫苗組合物的IgE分子部分將來源于組合物將要施用的物種的IgE分子。例如，打算給予人類的疫苗組合物將常常含有人類IgE分子的一個或多個部分，和/或能激發(fā)抗人類IgE分子的免疫應答的一種或多種模擬表位。
在
具體實施例方式
中，施用給人類的本發(fā)明疫苗組合物將含有記錄號AAB59424中所述IgE重鏈恒定區(qū)的至少一部分。在更具體實施方式
中，用于制備本發(fā)明疫苗組合物的IgE肽包含或者可替代地其組成為具有下面氨基酸序列的肽CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO30)。
在其它特定實施方式中，本發(fā)明疫苗組合物將含有至少一種能激發(fā)免疫應答從而導致對特定抗原具有特異性的抗體產(chǎn)生的模擬表位。適于在本發(fā)明疫苗組合物制備中使用的IgE模擬表位的例子包括具有下面氨基酸序列的肽

疫苗和免疫原的制備噬菌體AP205 VLP可以用于產(chǎn)生疫苗構建體，并且使與其附著的抗原具有高度免疫原性。本發(fā)明提供了將抗原附著于AP205 VLP上的方法。在一個實施方式中，利用異雙官能交聯(lián)劑，通過化學交聯(lián)的方法，將抗原附著于VLP上。本領域已知幾種異雙官能交聯(lián)劑。在一些實施方式中，異雙官能交聯(lián)劑含有可以與VLP賴氨酸殘基側鏈氨基反應的官能基團和可以與抗原上的半胱氨酸殘基反應的官能基團，其中半胱氨酸殘基或天然存在或可以通過還原用于反應，或者通過基因工程改造而存在并任選地通過還原而可以用于反應。該方法的第一步驟稱為衍生化，是VLP和交聯(lián)劑的反應。該反應的產(chǎn)物是活化的VLP，也稱為活化的載體。在第二步驟中，利用常用方法諸如凝膠過濾或透析除去未反應的交聯(lián)劑。在第三步驟中，抗原與活化的VLP反應，并且該步驟稱為偶聯(lián)步驟?？蛇x地，在第四步驟中除去未反應的抗原。本領域已知幾種異雙官能交聯(lián)劑。這些異雙官能交聯(lián)劑包括交聯(lián)劑SMPH(Pierce)，磺基-MBS，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-SIAB，磺基-SMPB，磺基-SMCC，SVSB，SIA和可來源于PierceChemical Company(Rockford，IL，USA)并且具有對氨基具有活性的一個官能基團和對半胱氨酸殘基具有活性的一個官能基團的其它交聯(lián)劑。上述所有交聯(lián)劑都引起了硫醚鍵的形成。適于在本發(fā)明實踐中使用的另一類交聯(lián)劑的特征在于一旦偶聯(lián)就在抗原和VLP之間引入二硫鍵。屬于該類的交聯(lián)劑包括，例如SPDP和磺基-LC-SPDP(Pierce)?；谟袡C化學領域中的反應理論，眾所周知VLP被交聯(lián)劑衍化的程度受變化的試驗條件(諸如每種反應成分的濃度，一種試劑相對于另一種試劑的過量，pH，溫度和離子強度)的影響?？梢酝ㄟ^改變上述試驗條件調整偶聯(lián)的程度，即每亞單位AP205 VLP的抗原量，以滿足疫苗的要求?？乖娜芙舛瓤赡軐γ總€亞單位上可以偶聯(lián)的抗原量產(chǎn)生限制，并且當所獲疫苗是不溶的時，降低每個亞單位的抗原量是有益的。
抗原與AP205 VLP附著的一個方法是AP205 VLP表面上的賴氨酸殘基和抗原上的半胱氨酸殘基連接。在一些實施方式中，需要用含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭改造抗原以便偶聯(lián)AP205 VLP。做為可替代方案，可以通過插入或突變在抗原內引入半胱氨酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，組合物包含氨基酸接頭。優(yōu)選地，所述氨基酸接頭通過至少一個共價鍵和至少一個抗原、抗原決定簇和有機分子結合。氨基酸接頭的選擇將取決于抗原的性質、它的生物化學特性諸如pI，電荷分布或糖基化。一般地，柔性氨基酸接頭是有利的實施方式。氨基酸接頭的例子是免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，甘氨酸絲氨酸接頭(GGGGS)n(SEQID NO49)，和甘氨酸接頭(G)n，所有這些接頭都還包含作為第二附著位點的半胱氨酸殘基和可選地甘氨酸殘基。(下面是這種氨基酸接頭的例子N-末端γ1CGDKTHTSPP(SEQ ID NO50)C-末端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO51)M-末端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO52)C-末端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO53)N-末端甘氨酸接頭GCGGGG(SEQ ID NO54)
C-末端甘氨酸接頭GGGGCG(SEQ ID NO55)C-末端甘氨酸-賴氨酸接頭GGKKGC(SEQ ID NO56)N-末端甘氨酸-賴氨酸接頭CGKKGG(SEQ ID NO57)。
對于肽，已經(jīng)證明在肽C末端的GGCG(SEQ ID NO58)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)接頭，或N末端CGG是有用的。在一些實施方式中，將甘氨酸殘基插入到大的氨基酸和將要用做第二附著位點的半胱氨酸之間。
氨基酸接頭的優(yōu)選實施方式選自(a)CGG；(b)N-末端γ1接頭；(c)N-末端γ3接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO93)；(g)N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO94)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接頭；(m)C-末端γ3接頭；(n)C-末端甘氨酸接頭；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO95)；(p)C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，和o＝0-8(SEQ ID NO96)。
在一些實施方式中，抗原或抗原決定簇包含能與AP205 VLP或VLP亞單位上的第一附著位點締合的單一第二附著位點或單一反應性附著位點。這確保了至少一個，但是通常一個以上，優(yōu)選地10，20，40，80，120個以上的抗原與AP205 VLP發(fā)生確定和均一的結合或締合。因此，抗原上單一第二附著位點或單一反應性附著位點的提供將確保單一且一致的結合或締合，從而產(chǎn)生高度有序和重復的陣列。例如，如果通過賴氨酸(做為第一附著位點)和半胱氨酸(做為第二附著位點)相互作用的方式實現(xiàn)結合和締合，則根據(jù)本發(fā)明這種優(yōu)選的實施方式，將確保每個抗原只有一個半胱氨酸殘基能結合或締合AP205 VLP或AP205 VLP的第一附著位點，而且這與這個半胱氨酸殘基是天然還是非天然存在于抗原上無關。
抗原上存在的半胱氨酸殘基必須處于還原狀態(tài)以便與活化的VLP上的異雙官能交聯(lián)劑反應，即，必須可獲得游離的半胱氨酸或者具有游離巰基的半胱氨酸殘基。在起第二附著位點作用的半胱氨酸殘基是氧化形式的情況下，例如，如果它形成二硫鍵的情況下，需要用例如DTT，TCEP或β-巰基乙醇還原該二硫鍵。
根據(jù)上述方法通過利用異雙官能交聯(lián)劑使抗原和AP205 VLP附著，將允許抗原以定向方式偶聯(lián)在AP205 VLP上。使抗原和AP205 VLP締合的其它方法包括利用碳化二亞胺EDC和NHS，使抗原與AP205 VLP交聯(lián)?？乖蚩乖瓫Q定簇也可以首先通過與例如SATA，SATP或iminothiolane反應而硫醇化。如下所述，然后抗原或抗原決定簇(如果需要在脫保護后)可以偶聯(lián)AP205 VLP。分離過量硫醇化試劑后，抗原或抗原決定簇與先已用異雙官能交聯(lián)劑活化的AP205 VLP反應，該異雙官能交聯(lián)劑包含半胱氨酸活性部分并且由此展示出對半胱氨酸殘基具有活性的至少一個或幾個官能基團，而硫醇化的抗原或抗原決定簇可以與該官能基團反應(如上所述)?？蛇x地，反應混合物中包含低量的還原試劑。在其它方法中，利用同雙官能交聯(lián)劑諸如戊二醛，DSG，BM[PEO]4，BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或具有對AP205 VLP的氨基或羧基具有活性的官能基團的其它已知同雙官能交聯(lián)劑，將抗原附著于AP205 VLP上。
在另一實施方式中，通過修飾糖基化抗原或抗原決定簇上存在的碳水化合物部分，并且隨后與AP205 VLP反應，使抗原或抗原決定簇結合AP205 VLP。在一個實施方式中，在碳水化合物部分的溫和氧化反應中，使糖基化抗原或抗原決定簇與高碘酸鈉反應，產(chǎn)生具有一個或多個醛官能基團的活化抗原或抗原決定簇。從過量高碘酸鈉分離這種活化的抗原或抗原決定簇，并且進一步與AP205 VLP反應，其中AP205 VLP或至少一個AP205 VLP亞單位的賴氨酸殘基與抗原或抗原決定簇上先已形成的醛官能基團反應，例如，按Hermanson，G.T.《Bioconjugate Techniques》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA所述反應。如前述公開出版物中所述，可以通過調節(jié)pH控制活化抗原或抗原決定簇的自聚合。優(yōu)選地，用氰基硼氫鈉進一步還原形成的席夫堿，隨后用凝膠過濾或透析除去氰基硼氫鈉。做為可替代方案，AP205 VLP或至少一個AP205 VLP亞單位的羧基可以與EDC和二酰肼(dihydrazyde)，諸如己二酸二酰肼反應，以產(chǎn)生可用于與活化抗原或抗原決定簇上存在的一個或多個醛官能基團反應的酰肼部分。用氰基硼氫鈉可以進一步還原這樣形成的腙。做為可替代方案，具有一個或多個醛官能基團的活化抗原或抗原決定簇與半胱胺反應，在抗原或抗原決定簇中引入半胱氨酸基團。在Hermanson，G.T.《Bioconjugate Techniques》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA中可以找到適于使抗原或抗原決定簇與AP205 VLP結合的其它交聯(lián)方法和交聯(lián)劑，和關于如何進行偶聯(lián)反應及應用化學交聯(lián)劑和化學交聯(lián)方法的指導。
使VLP與抗原結合的其它方法包括生物素?；疺LP并且將抗原表達為鏈霉抗生物素蛋白融合蛋白的方法，或者生物素?；乖蚔LP兩者的方法。在這種情況下，抗原可以首先結合鏈霉抗生物素蛋白或親和素，其中，通過調節(jié)抗原和鏈霉抗生物素蛋白的比率，使得自由結合位點仍舊可以獲得用于與下一步驟添加的VIP結合。做為可替代方案，可以在“一個容器”反應中混合所有成分。其它配體-受體對也可以用作結合試劑用于抗原和VIP的結合，其中可得到該受體和配體的可溶形式，并且它們能與VLP或抗原交聯(lián)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述第一和/或所述第二附著位點選自(a)抗原和其抗體或抗體片段；(b)生物素和親和素；鏈霉抗生物素蛋白和生物素；(c)受體和其配體；(d)結合配體的蛋白質和其配體；(e)相互作用的亮氨酸拉鏈多肽；(f)氨基和對其有反應性的化學基團；(g)羧基和對其有反應性的化學基團；(h)巰基和對其有反應性的化學基團；和(i)它們的聯(lián)合。
免疫應答免疫應答的性質或類型不是本公開的限制因素。根據(jù)本領域熟知的原理，治療或預防性免疫應答所期望的結果可以根據(jù)疾病而變化。例如，抗感染物的免疫應答可以完全防止感染物的定居和復制，從而實現(xiàn)“無菌免疫”和消除任何疾狀況狀。然而，如果抗傳染物的疫苗減少了癥狀的數(shù)量、嚴重性或持繼期；如果它減少了具有這種癥狀的群體中的個體數(shù)量；或者減少了感染物的傳遞，則可以認為這種疫苗是有效的。類似地，抗癌癥、變應原或自身抗原的免疫應答可以完全治愈疾病，可以減緩癥狀，或者可以是全面的抗疾病治療干預方案的一個方面。例如，可以將刺激抗癌癥免疫應答與手術、化學治療、放射性、激素和其它免疫學方法聯(lián)合以實現(xiàn)治療。
而且，可能期望根據(jù)疾病和本領域已知的原理刺激不同類型的免疫應答。例如，熟知一些免疫應答比其它免疫應答更適合于特定抗原。實際上，一些免疫應答是不適當?shù)?，并且可能引起病態(tài)，諸如對感染、變態(tài)反應和自身免疫疾病應答的病理炎癥，這里對這些做了進一步描述。盡管不要求特定的免疫應答，但是本發(fā)明可以針對治療或預防目的刺激免疫應答。本發(fā)明另一特定的實施方式包括產(chǎn)生能對抗病理免疫應答作用的免疫應答。
可以通過抗原性質、引入到體內的途徑、劑量、給藥方案、抗原重復的性質、宿主背景和免疫系統(tǒng)的信號傳遞因子影響免疫應答的性質。這種知識是本領域所熟知的。同樣地，可以通過本領域已知理論和常規(guī)試驗的應用調整免疫應答。
盡管不希望受理論束縛，本發(fā)明作為產(chǎn)生免疫應答的藥物組合物成分，特別是作為疫苗，提供了特別新和令人驚奇的優(yōu)點。
首先，本領域已知的其它載體包括BSA、匙孔戚血藍蛋白、破傷風類毒素、細菌外膜蛋白質、霍亂毒素、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A和細菌菌毛可能不適于用在個體中，特別是人中。前述載體可以誘導變應性反應，或者刺激病理免疫應答(例如，霍亂毒素，KLH，BSA)。前述載體可能要求諸如完全弗氏佐劑等現(xiàn)在認為不適于人類的佐劑存在。大量載體可能是目前疫苗的成分(例如，破傷風類毒素、霍亂毒素、外毒素A)，或者代表通常所遇到的抗原(例如，細菌菌毛、外毒素A、外膜蛋白質)。因此，個體可能對這些載體具有高水平先已存在的免疫性，這樣用抗原-載體綴合物免疫將誘導比對新抗原更大的對載體的免疫應答。因為這些原因(單獨或做為整體地)，AP205做為載體蛋白質的用途可以代表對目前載體蛋白質有用的改進。不用完全弗氏佐劑，也沒有病理免疫應答的跡象，AP205-DerP1綴合物組合物能刺激抗DerP1的免疫應答。
在AP205做為載體蛋白質的應用中，抗原呈遞細胞可以攝取綴合AP205的抗原，即AP205-抗原，并由此刺激T輔助細胞以誘導免疫應答。而且，正常地無免疫原性的半抗原也可以偶聯(lián)AP205，由此產(chǎn)生抗這種半抗原的免疫應答。
本發(fā)明另一個有利的特征是抗原可以以規(guī)則、重復陣列形式呈遞在VLP表面，該陣列能在有或無T細胞輔助下誘導有效的免疫應答。本發(fā)明的這個特征是特別有利的。
因此，通過增加將要用于免疫的抗原的重復程度(通過抗原結合AP205VLP)，本發(fā)明提供了改進特別是抗自身抗原的接種效力的方法。
組合物、疫苗及其給藥和治療方法本發(fā)明提供了可以用于預防和/或減輕疾病或狀況的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了用于預防和/或減輕個體中的疾病或狀況的接種方法。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于預防多種物種，特別是哺乳動物物種諸如人類、猴子、奶牛、狗、貓、馬、豬等的感染性疾病的疫苗?？梢栽O計疫苗以治療病毒病因學的感染諸如HIV，流感、皰疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰質炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等；或細菌病因學的感染，諸如肺炎、結核病、梅毒等；或者寄生蟲病因學的感染，諸如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、滴蟲病、阿米巴病等。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于預防和治療多種物種，特別是哺乳動物物種諸如人類、猴子、奶牛、狗、貓、馬、豬等的癌癥的疫苗?？梢栽O計疫苗以治療所有類型癌癥淋巴瘤、癌、肉瘤、黑素瘤等。
在本發(fā)明另一個實施方式中，本發(fā)明的綴合物、組合物和方法可以用于設計治療變態(tài)反應的疫苗。IgE同種型抗體是變應性反應的重要成分。肥大細胞在其表面上結合IgE抗體，并且一旦特異性抗原與在肥大細胞表面上結合的IgE分子結合，那么該肥大細胞就釋放組胺和其它變態(tài)反應介質。因此，抑制IgE抗體產(chǎn)生是防止變態(tài)反應的有希望的靶。通過獲得期望的T輔助細胞應答，應該可以達到這個目的。T輔助細胞應答可以分成類型1(TH1)和類型2(TH2)T輔助細胞應答(Romagnani，Immunol.Today18263-266(1997))。TH1細胞分泌干擾素γ和其它細胞因子。相反，TH2細胞產(chǎn)生的至關重要的細胞因子是IL-4，其驅動B細胞產(chǎn)生IgE。在許多實驗系統(tǒng)中，TH1和TH2應答的發(fā)展相互排斥，因為TH1細胞抑制TH2細胞的誘導，反之亦然。因此，觸發(fā)強TH1應答的抗原同時將抑制TH2應答的發(fā)展和由此的IgE抗體產(chǎn)生。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)AP205 VLP誘導TH1型免疫應答。因此，通過利用本發(fā)明的方法，可以用各種變應原修飾AP205VLP，并且用于免疫。由于變應原和AP205 VLP的偶聯(lián)，將激發(fā)TH1應答，產(chǎn)生“保護性”IgG抗體，阻止引起變應性反應的IgE抗體的產(chǎn)生。因為變應原由VLP呈遞，而識別VLP的輔助T細胞群與識別變應原的輔助T細胞群不同，所以，即使在含有先已存在的變應原特異性TH2細胞的變應性個體中，也可能將誘導變應原特異的IgG抗體。高濃度IgG抗體的存在可以阻止變應原與結合肥大細胞的IgE結合，由此抑制組胺的釋放。因此，IgG抗體的存在可以防止IgE介導的變應性反應。引起變態(tài)反應的通常物質包括但不限于花粉(例如，草、豚草、樺樹和雪松)、屋塵和塵螨、哺乳動物表皮變應原和動物毛皮屑、霉菌和真菌、昆蟲身體和昆蟲毒液、毛發(fā)、唾液、血清、羽毛、食物或藥物(例如，青霉素)，參見，例如Shough，H.等，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，19版，(82章)，Mack Publishing Company，Mack PublishingGroup，Easton，Pennsylvania(1995)，這里將其整個內容并入為參考文獻。
在具體實施方式
中，本發(fā)明提供了預防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物(例如，腫瘤壞死因子)，即此處所用的“自身抗原”，引起或加重的疾病或狀況的方法。在相關實施方式中，本發(fā)明提供了用于在個體中誘導免疫應答的方法，該免疫應答導致可以預防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的疾病或狀況的抗體產(chǎn)生。這種疾病或狀況的例子包括移植物抗宿主病、IgE介導的變應性反應，過敏反應，成人呼吸窘迫綜合征，局限性回腸炎、變應性哮喘、急性成淋巴細胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性甲狀腺腫，炎性自身免疫性疾病，重癥肌無力，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，免疫增生性疾病淋巴結病(IPL)，血管免疫增生性淋巴結病(AIL)，免疫母細胞性淋巴結病(IBL)，類風濕性關節(jié)炎，糖尿病，多發(fā)性硬化，骨質疏松癥和阿爾茨海默氏病。
如本領域普通技術人員將理解的，當將本發(fā)明組合物給予個體時，它們可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或期望用于改進組合物效力的其它物質的組合物。在大量文獻，包括REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES(Osol，A，編輯，Mack Publishing Co.，(1990))中提供了適用于制備藥物組合物的材料例子。
如果接受個體能耐受本發(fā)明組合物給藥，那么就將它們說成是“藥物學上可接受的”。而且，本發(fā)明組合物將以“治療有效量”(即，產(chǎn)生期望生理學效果的量)給藥。
可以通過本領域已知的各種方法施用本發(fā)明組合物，但是通常通過注射、輸注、吸入、口服給藥或其它適合的物理方法給藥。可替代地，可以肌內、靜脈內、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮或皮下給藥組合物。用于給藥的組合物的成分包括無菌水性(例如，生理鹽水)或非水性溶液和懸浮液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和可注射的有機酯類諸如油酸乙酯。載體或封閉敷料可以用于增加皮膚穿透性和增強抗原吸收。
本發(fā)明其它實施方式包括本發(fā)明組合物的生產(chǎn)方法和利用這些組合物的藥物治療方法。應理解，前述一般性描述和下面詳細描述都僅僅是示例說明性的，旨在對權利要求的發(fā)明提供進一步解釋。
除了疫苗技術，本發(fā)明其它實施方式涉及癌癥和變態(tài)反應的藥物治療方法，和由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的疾病或狀況的治療方法。
將這里提到的所有專利和出版物整體并入為參考文獻。
試劑盒在其它實施方式中，本發(fā)明組合物可以組裝成試劑盒，用于試驗或工業(yè)設置的測定中，用于診斷或檢測疾病、狀況或病癥。根據(jù)本發(fā)明的這種試劑盒可以包括至少一個容器含有一種或多種上述綴合物或組合物，包括AP205綴合物和抗這種綴合物的免疫分子和抗體?？蛇x地，本發(fā)明試劑盒還可以包含至少另外一個容器，該容器可以含有例如一種或多種抗原、一種或多種半抗原、一種或多種核心顆粒、一種或多種本發(fā)明綴合物/組合物、一種或多種藥物學上可接受的載體或賦形劑、一種或多種緩沖液、一種或多種蛋白質、一種或多種核酸分子等。
相關領域的普通技術人員將理解，對這里所述的方法和應用的其它適宜修飾和調整將是顯而易見的，并且可以進行這樣的修飾和調整而不背離本發(fā)明或其任何實施方式的范圍?，F(xiàn)在已經(jīng)詳細地描述了本發(fā)明，通過參考下面實施例將可以更清楚地理解本發(fā)明，這里所包括的實施例僅僅是用于示例的目的，不意味著限制本發(fā)明。
實施例實施例1AP205外殼蛋白基因的克隆利用逆轉錄PCR技術并且在商購質粒pCR 4-TOPO中克隆用于測序，從產(chǎn)生于噬菌體AP205 RNA的2個cDNA片段裝配了AP205外殼蛋白(CP)cDNA。逆轉錄技術是相關領域普通技術人員所熟知的。第一個片段包含在質粒p205-246中，含有CP序列上游269個核苷酸和編碼CP最初24個N末端氨基酸的74個核苷酸。第二個片段包含在質粒p205-262中，含有編碼CP氨基酸12-131的364個核苷酸和CP序列下游的額外162個核苷酸。
為了將來源于質粒p205-246和p205-262的兩個CP片段融合為一條全條CP序列，通過兩步PCR設計質粒283-58。利用含有用于克隆到質粒pQb185中的NcoI位點的上游引物p1.44，或者含有用于克隆到質粒pQb10中的XbaI位點的p1.45，和含有HindIII限制位點的下游引物p1.46(下劃線是限制酶識別序列)p1.44 5’-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3’(SEQ ID NO59)
p1.45 5’-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3’(SEQ ID NO60)p1.46 5’-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3’(SEQ IDNO61)在第一次PCR中利用兩個額外引物，p1.47和p1.48擴增片段，其中p1.47在p205-262所含片段的5’末端退火，p1.48在質粒p205-246所含片段的3’末端退火。引物p1.47和p1.48互相互補。
p1.475’-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3’(SEQ ID NO62)p1.485’-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3’(SEQ ID NO63)在這頭兩個PCR反應中，產(chǎn)生兩個片段。用引物p1.45和p1.48和模板p205-246產(chǎn)生第一片段。用引物p1.47和p1.46和模板p205-262產(chǎn)生第二片段。將這兩個片段用做第二次PCR反應的模板，用引物聯(lián)合p1.45和p1.46或者p1.44和p1.46，進行拼接重疊延伸。分別用XbaI或NcoI和HindIII消化這兩個第二步PCR反應的產(chǎn)物，用相同限制位點分別克隆到兩個pGEM來源的表達載體pQb10或pQb185中，位于大腸桿菌色氨酸操縱子啟動子控制下。
獲得兩個質粒，pAP283-58(SEQ ID NO.2)(其在pQb10中含有編碼野生型AP205 CP(SEQ ID NO1)的基因)，和pAP281-32(SEQ ID NO4)。(其在pQb185中含有SEQ ID NO125核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有從Pro5到Thr突變的突變蛋白質，該突變蛋白質具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列)。通過DNA測序證實了外殼蛋白序列。PAP283-58含有位于CP的ATG密碼子上游及XbaI位點下游的49個核苷酸，并且含有外殼蛋白mRNA的推定原始核糖體結合位點。
實施例2重組AP205 VLP的表達和純化A.重組AP205 VLP的表達用質粒pAP283-58轉化大腸桿菌JM109。用單個菌落接種5ml含有20μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，并且在37℃溫育16-24小時，不振蕩。
在100-300ml含有20μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中1∶100稀釋制備的接種物，并且在37℃溫育過夜，不振蕩。在含有0.2％葡萄糖和磷酸緩沖鹽的2TY培養(yǎng)基中1∶50稀釋由此獲得的第二接種物，在37℃振蕩器上溫育過夜。通過離心收集細胞，并且在-80℃冷凍。
B.重組AP205 VLP的純化溶液和緩沖液1.裂解緩沖液含有5mM EDTA、0.1％Triton X 100和5μg/ml PMSF的50mM Tris-HCl pH8.02.SAS水中飽和的硫酸銨3.緩沖液NET含有5mM EDTA和150mM NaCl的20mM Tris-HCl pH7.84.PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000裂解以2ml/g細胞在裂解緩沖液中重懸浮冷凍的細胞。用22kH超聲處理混合物5次，15秒，同時中間具有1分鐘間隔以在冰上冷卻溶液。利用F34-6-38轉子(Ependorf)，以12000rpm離心裂解液20分鐘。除了另外說明外，利用相同轉子進行所有下述離心步驟。在4℃貯藏上清液，而用裂解緩沖液洗細胞殘渣2次。離心后，將裂解物上清液和洗滌級分合并。
可以進一步利用硫酸銨沉淀純化AP205 VLP。在第一步驟中，選擇AP205 VLP不沉淀的硫酸銨濃度。棄去所得到的沉淀。在下一步驟中，選擇AP205 VLP定量沉淀的硫酸銨濃度，并且通過離心(14000rpm，20分鐘)從該沉淀步驟的沉淀分離AP205 VLP。在NET緩沖液中溶解所得沉淀。
層析在Sepharose 4B柱子(2.8×70cm)上加樣來自于合并的上清液的外殼蛋白，并且以4ml/小時/級分，用NET緩沖液洗脫該外殼蛋白。收集級分28-40，并且用60％飽和度的硫酸銨沉淀。沉淀前，用對AP205 VLP外殼蛋白特異的抗血清，通過SDS-PAGE和Western印跡分析級分。在NET緩沖液中再溶解通過離心分離的沉淀，并且將其加樣到Sepharose 2B柱子(2.3×65cm)上，并且以3ml/小時/級分洗脫。通過SDS-PAGE分析級分，并且收集、合并和用60％飽和度的硫酸銨沉淀級分44-50。在NET緩沖液中再溶解通過離心分離的沉淀，并且在Sepharose 6B柱子(2.5×47cm)上純化，以3ml/小時/級分洗脫。通過SDS-PAGE分析級分。收集級分23-27，將鹽濃度調節(jié)到0.5M，并且用PEG 6000(添加水中的40％母液，使得終濃度達到13.3％)沉淀。在NET緩沖液中再溶解通過離心分離的沉淀，并且將其加樣到上述相同的Sepharose 2B柱子上，用相同的方式洗脫。通過SDS-PAGE分析級分。收集級分43-53，并且用60％飽和度的硫酸銨沉淀。在水中再溶解通過離心分離的沉淀，利用大量水透析所獲得的蛋白質溶液。每克細胞大約可以分離10mg純化的蛋白質。通過SDS-PAGE和Western印跡分析，可以顯示AP205 VLP的純化。可以在還原條件下進行銀染色SDS-PAGE電泳，并用對AP205 VLP外殼蛋白特異的抗血清進行Western印跡，以顯示第一個Sepharose 4B層析步驟和最后一個Sepharose 2B層析步驟的重組Ap205 VLP級分。
在電子顯微鏡術中對病毒樣顆粒的檢查表明它們與噬菌體顆粒相同(圖1A和1B)。
圖1A顯示AP205噬菌體顆粒的EM圖片，而圖1B中示出了重組AP205 VLP自裝配顆粒的EM圖片。
為了簡便起見，實施例部分中所用術語“AP205病毒樣顆?！焙托g語“AP205 VLP”指如實施例2中所述表達和純化的病毒樣顆粒，其由具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的外殼蛋白組成。
實施例3Derp1.2和Flag肽抗原與AP205 VLP的偶聯(lián)，及用偶聯(lián)有AP205 VLP的Derp1.2肽免疫小鼠A.Derp1.2肽和Flag肽與重組AP205 VLP的偶聯(lián)根據(jù)本領域已知的方法，化學合成肽Derp1.2(序列CQIYPPNANKIREALAQTHSA″Der p 1 p117″；氨基酸117-137(SEQ IDNO64))和Flag(序列CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO65))。如實施例2中所述表達和純化的AP205 VLP再溶解于20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4緩沖液(HBS緩沖液)中。然后，在室溫(RT)下，再溶解的AP205VLP以2mg/ml的濃度(在Bradford測定法中測定的)與2.85mM SMPH(Pierce)反應30分鐘。然后，利用HBS緩沖液透析反應混合物，之后與0.714mM Derp 1.2或Flag(從DMSO中的50mM母液稀釋在反應混合物中)反應。在15℃，進行偶聯(lián)反應2小時，并利用1000倍體積的HBS透析反應混合物2×2小時，在液氮中等份試樣急驟冷凍，使用前在-80℃貯藏。
融化該等份貯藏物，通過SDS-PAGE估測抗原與AP205亞單位的偶聯(lián)，并且在Bradford測定法中測定蛋白質濃度。圖2中示出了Derp 1.2和AP205 VLP偶聯(lián)反應的結果。AP205 VLP單體亞單位分子量是14kDa。除了單體形式亞單位外，SDS-PAGE中還檢測到用交聯(lián)劑衍生化AP205VLP后，交聯(lián)產(chǎn)生的二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體。
圖2表示AP205 VLP和Qβ VLP與Derp 1.2肽偶聯(lián)反應的SDS-PAGE分析。在16％Tris-甘氨酸凝膠上，在還原條件下電泳這些樣品。泳道1是蛋白質標記物，具有在凝膠左側邊緣標明的相應分子量；泳道2，衍生的Qβ衣殼蛋白；泳道3，Qβ衣殼蛋白和Derp1.2肽偶聯(lián)反應的上清液；泳道4，Qβ衣殼蛋白和Derp1.2肽偶聯(lián)反應的沉淀；泳道5，衍生的AP205VLP；泳道6AP205 VLP和Derp1.2肽偶聯(lián)反應的上清液；泳道7，AP205VLP和Derp1.2肽偶聯(lián)反應的沉淀。在圖中，用箭頭標明了對應于每個單體與1，2，3，4或5個肽偶聯(lián)的偶聯(lián)產(chǎn)物。與Qβ衣殼蛋白比較，更多數(shù)量的表位可能以AP205 VLP偶聯(lián)。
B.用偶聯(lián)重組AP205 VLP的Derp1.2肽免疫小鼠，免疫應答分析和IgG亞型測定在第0和14天給小鼠皮下注射偶聯(lián)Derp1.2肽的AP205 VLP或偶聯(lián)Derp1.2肽的Qβ VLP(每次3只小鼠)。利用與A中所述用于偶聯(lián)AP205VLP的相同條件，使Derp1.2肽偶聯(lián)Qβ衣殼蛋白。用在PBS中稀釋到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠。在第20天，從小鼠眼眶后取血，并且在抗Derp1.2肽的ELISA中測定對Derp1.2肽特異的抗體效價。利用化學交聯(lián)劑磺基-SPDP，使Der pI肽“Der p I p 52”偶聯(lián)牛RNA酶A。用偶聯(lián)的RNA酶制備物，以10μg/ml的濃度包被ELISA板。封閉板，然后將其與系列稀釋的小鼠血清溫育。用對各亞型特異的酶學標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也檢測了相同小鼠免疫前的血清(未示出數(shù)據(jù))。在圖3中示出了這些結果。
圖3顯示對免疫小鼠血清中“Derp1.2”特異的IgG抗體的ELISA分析，其中分別用與AP205 VLP或Qβ衣殼蛋白偶聯(lián)的Derp1.2肽免疫小鼠。測定了總IgG效價和IgG亞型效價。在分析了每種IgG亞型的任何一個免疫前血清中均沒有檢測到對Derp1.2特異的抗體。該圖表明對于AP205和Qβ，均誘導了Th1免疫應答典型的抗體亞型，因為IgG2a效價比IgG1效價高得多。用偶聯(lián)兩種VLP的肽獲得了強的特異性抗肽免疫應答。通過ELISA也測定了對載體特異的抗體，并且對兩種載體，這些抗體相當。
實施例4用于抗原和VLP偶聯(lián)的模塊化真核生物表達系統(tǒng)產(chǎn)生該系統(tǒng)以向抗原添加含有半胱氨酸殘基的各種氨基酸接頭序列以便化學偶聯(lián)VLP。
A.編碼含有半胱氨酸的氨基酸接頭和可切割的Fc標簽的EBNA衍生表達系統(tǒng)的構建用KpnI和Bam HI消化pCep-Pu(Wuttke等.J.Biol.Chem.27636839-48(2001))，并且用退火的寡核苷酸PH37和PH38引入新的多克隆位點，產(chǎn)生pCep-MCS。
如下，產(chǎn)生含有以幾個甘氨酸、蛋白酶切割位點和人IgG1恒定區(qū)為側翼的游離半胱氨酸的模塊系統(tǒng)。用Bsp120I和HindIII消化pSec2/Hygro B(Invitrogen目錄號.V910-20)，并且與退火的寡核苷酸SU7和SU8連接，產(chǎn)生構建體pSec-B-MCS。然后，用NheI和HindIII消化pSec-B-MCS，并且與退火的寡核苷酸PH29和PH30連接，產(chǎn)生構建體pSec 29/30。通過下面片段的3片段連接產(chǎn)生構建體pSec-FL-EK-Fc*用Eco RI和Hind III消化的pSec 29/30，退火的寡核苷酸PH31和PH32，和含有修飾形式的人IgG1恒定區(qū)的質粒(PSP-FC*-C1)的Bgl I/EcoRI片段(人IgG1序列的詳細情況參見最終構建體pCep-Xa-Fc*的序列(圖4A-4C))。由此得到的構建體命名為pSec-FL-EK-Fc*。通過Nhe I，Pme I消化，從該質粒切下接頭區(qū)和人IgG1 Fc部分，并且克隆到用Nhe I和Pme I消化的pCep-MCS中，產(chǎn)生構建體pCep-FL-EK-Fc*。由此產(chǎn)生了模塊化載體，其中用退火的寡核苷酸可以容易地交換該載體中位于NheI和HindIII位點之間的接頭序列和蛋白酶切割位點。為了產(chǎn)生可切割的融合蛋白，用NheI和HindIII消化pCep-FL-EK-Fc*，并且用退火的寡核苷酸PH35和PH36引入具有氨基酸GGGGCG(SEQ ID NO55)N末端側翼的因子Xa切割位點，并用退火的寡核苷酸PH39和PH40引入具有GGGGCG(SEQ ID NO55)N末端側翼的腸激酶位點，分別產(chǎn)生構建體pCep-Xa-Fc*(圖4A，如SEQ ID NO103中所述核苷酸序列，如SEQ ID NO104中所述氨基酸序列)和pCep-EK-Fc*(圖4B，如SEQ ID NO105中所述核苷酸序列，如SEQ IDNO106中所述氨基酸序列)。通過KpnI/BamHI消化的pCep-EK-Fc*、退火的寡PH41和PH42和退火的寡PH43和PH44三個片段的連接產(chǎn)生還含有真核生物信號肽的構建體pCep-SP-EK-Fc*(圖4C，如SEQ IDNO107中所述核苷酸序列，如SEQ ID NO108中所述氨基酸序列)。
B.融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)對于不同融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，根據(jù)制造商的說明書，用脂質轉染胺2000試劑(Invitrogen Corporation；Carlsabad，CA)和不同pCep表達質粒轉染293-EBNA細胞(Invitrogen)。轉染后24-36h，在添加有10％FCS的DMEM中，在嘌呤霉素篩選(1μg/ml)下，細胞以1∶3的比率傳代培養(yǎng)。然后，抗性細胞在選擇性培養(yǎng)基中擴大。為了收獲融合蛋白，將抗性細胞群傳代到聚-L-賴氨酸包被的培養(yǎng)皿上。一旦細胞已經(jīng)達到鋪滿，用PBS沖洗它們2次，并且向平板添加無血清培養(yǎng)基(DMEM)。在多達1個月的期間，每2到4天收集組織培養(yǎng)上清液，并且用新鮮DMEM置換。在4℃保存收集的上清液。
C.融合蛋白的純化利用蛋白質A Sepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech AG)，通過親和層析純化重組Fc融合蛋白。簡而言之，用1-3ml蛋白質A樹脂填充層析柱，并且用蠕動泵以0.5-1.5ml/min的流動速率將含有重組蛋白質的組織培養(yǎng)上清液施加到柱子上。然后，用20-50ml PBS洗柱子。根據(jù)融合蛋白質，在柱子上進行蛋白酶切割，或者如下所述洗脫蛋白質。用添加有150mM NaCl的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH3.8)洗脫重組融合蛋白，合并含有蛋白質的級分，用Ultrafrec離心過濾器(Millipore Corporation；Bedford，MA)濃縮。
D.重組融合蛋白的蛋白酶切割(因子Xa，腸激酶)根據(jù)制造商的說明書，利用EKmax系統(tǒng)(Invitrogen)切割含有腸激酶(EK)切割位點的洗脫的重組融合蛋白。通過與蛋白質A溫育除去從融合蛋白切下的Fc部分。然后，根據(jù)制造商的說明書，利用EK-Away系統(tǒng)(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)除去腸激酶。相似地，根據(jù)制造商的說明書，利用限制性蛋白酶因子Xa切割和移除試劑盒(Roche)切割含有因子Xa(Xa)切割位點的融合蛋白。通過與蛋白質A溫育除去切下的Fc部分，并且用該試劑盒提供的鏈霉抗生物素蛋白樹脂除去蛋白酶。
用Ultrafrec離心過濾器(Millipore Corporation；Bedford，MA)濃縮不同融合蛋白質，用UV分光光度法定量，并且用于隨后的偶聯(lián)反應。
圖4A-4C顯示所用的不同真核生物表達載體的部分序列。僅僅示出了修飾的序列。
圖4ApCep-Xa-Fc*表示從BamHI位點起的序列，翻譯序列(SEQID NO103和SEQ ID NO104)上方顯示了不同特征。箭頭表示因子Xa蛋白酶的切割位點。
圖4BpCep-EK-Fc*表示從BamHI位點起的序列，翻譯序列(SEQID NO105和SEQ ID NO106)上方顯示了不同特征。箭頭指示腸激酶的切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所示序列相同。
圖4CpCep-SP-EK-Fc*表示從信號肽起始的序列，翻譯序列(SEQID NO107和SEQ ID NO108)上方顯示了不同特征。用粗體指示信號肽酶切割的信號肽序列。箭頭指示腸激酶切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所述序列相同。
實施例5小鼠抵抗素和AP205 VLP的真核生物表達和偶聯(lián)A.小鼠抵抗素的克隆利用Qiagen RNeasy試劑盒，根據(jù)制造商的說明書，從60mg小鼠脂肪組織分離總RNA。將RNA洗脫在40μl水中。利用ThermoScriptTMRT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)，根據(jù)制造商的說明書，用寡dT引物進行總RNA逆轉錄。在50℃溫育樣品1小時，加熱到85℃5分鐘，在37℃用RNA酶H處理20分鐘。
2μl RT反應物用于小鼠抵抗素的PCR擴增。利用引物PH19和PH20，利用Platinium TAQ(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)根據(jù)制造商的說明書，進行PCR。引物PH19對應于小鼠抵抗素序列位置58-77，引物PH20對應于位置454-435。首先，在94℃，變性PCR混合物2分鐘，然后如下進行35個循環(huán)94℃，30秒；56℃，30秒；72℃，1分鐘，在最后，樣品在72℃放置10分鐘。純化PCR片段，通過TA克隆，亞克隆到pGEMTeasy載體(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)中，產(chǎn)生pGEMT-mRes。為了添加適合的限制位點，利用上述相同的循環(huán)程序，用引物PH21和PH22引物，對pGEMT-mRes進行第二PCR。正向引物PH21含有BamHI位點和小鼠抵抗素序列的核苷酸81-102。反向引物PH22含有XbaI位點和小鼠抵抗素序列的核苷酸426-406。所述位置參照小鼠抵抗素序列基因記錄號AF323080。純化PCR產(chǎn)物，并且用BamHI和XbaI消化，并且亞克隆到用BamHI和XbaI消化的pcmv-Fc*-C1中，產(chǎn)生構建體pcmv-mRes-Fc*。
通過BamHI/XbaI消化，從pcmv-Res-Fc*切下抵抗素開放讀框，并且克隆到用BamHI和NheI消化的pCep-Xa-Fc*和pCep-EK-Fc*(參見實施例4，B部分)中，分別產(chǎn)生構建體pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*。
B.抵抗素的產(chǎn)生、純化和切割然后，pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*構建體用于轉染293-EBNA細胞，以便如實施例4，B部分中所述生產(chǎn)重組蛋白質。如實施例4，C部分中所述純化組織培養(yǎng)物上清液。然后，如實施例4，D部分中所述切割純化的蛋白質。根據(jù)所用的載體，命名所獲得的重組蛋白質為“抵抗素-C-Xa”或“Res-C-Xa”和“抵抗素-C-EK”或“Res-C-EK”。通過SDS PAGE分析純化的蛋白質。凝膠上，對應于純化的抵抗素-C-EK和純化的抵抗素-C-Xa的條帶清楚可見。SEQ ID NO109，SEQ ID NO110，SEQ ID NO111，和SEQ ID NO112顯示用于表達的前體重組小鼠抵抗素蛋白質的序列。在WO 02/056905的圖2A和2B中示出了用于偶聯(lián)的加工后重組小鼠抵抗素，即Res-C-Xa和Res-C-EK。斜體表示由信號肽酶在蛋白質分泌后切割的抵抗素信號序列。粗體表示由信號肽酶和特異性蛋白酶(因子Xa或腸激酶)切割產(chǎn)生的氨基酸序列。
C.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK與AP205 VLP的偶聯(lián)在25℃，在搖擺振蕩器上，0.2ml于20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的2mg/ml AP205 VLP溶液與5.6μl DMSO中的100mM SMPH(Pierce)溶液反應30分鐘。隨后在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.4，透析反應溶液2次，2小時。然后，在25℃，在搖擺振蕩器上，8μl透析的AP205衣殼蛋白反應混合物與32μl抵抗素-C-Xa溶液(產(chǎn)生0.39mg/ml抵抗素終濃度)反應4小時，并且13μl AP205衣殼蛋白反應混合物與27μl抵抗素-C-EK溶液(產(chǎn)生0.67mg/ml抵抗素終濃度)反應4小時。在還原條件下，用SDS-PAGE和Western印跡分析偶聯(lián)的產(chǎn)物。
實施例6鼠淋巴毒素β構建體的表達、純化和與AP205 VLP的偶聯(lián)A.小鼠淋巴毒素β中引入含有cys的接頭，及其表達和純化重組表達小鼠淋巴毒素β(LT-β)的細胞外部分，在其N末端添加CGG氨基酸接頭。該接頭含有用于偶聯(lián)VLP的一個半胱氨酸。長(氨基酸49-306)和短(氨基酸126-306)形式的蛋白質在它們的N末端融合用于純化的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)或組氨酸-myc標簽。插入腸激酶(EK)切割位點用于標簽的切割。
C-LT-β49-306和C-LT-β126-306的構建從插在pFB-LIB中的小鼠脾臟cDNA文庫，利用寡5’-LT-β和3’-LT-β，PCR擴增小鼠LT-β49-306。對于PCR反應，在50μl反應混合物(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每種引物各0.5μg，200ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃，2分鐘，接著94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分鐘)共25個循環(huán)，接著68℃10分鐘。用T4激酶磷酸化PCR產(chǎn)物，并且連接到已經(jīng)用EcoRV切割和去磷酸化的pEntrylA(Life technologies)中。由此得到的質粒命名為pEntrylA-LT-β49-306。
利用pEntrylA-LT-β49-306做為模板，分別用寡5’LT-βlong-NheI和3’LT-βstop-NotI，5’LT-βshort-NheI和3’LT-βstop-NotI進行第二PCR反應。5’LT-βlong-NheI和5’LT-βshort-NheI有內部NheI位點并且包含編碼Cys-Gly-Gly接頭的密碼子，3’LT-βstop-NotI有內部NotI位點并且含有終止密碼子。對于第二PCR反應，在50μl反應混合物(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每種引物各0.5μg，150ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃，2分鐘，接著94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分鐘)共5個循環(huán)，接著94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分鐘)共20個循環(huán)，接著68℃10分鐘。
用NheI和NotI消化PCR產(chǎn)物，并且插入到pCEP-SP-GST-EK或pCEP-SP-his-myc-EK (Wuttke等.J.Biol.Chem.27636839-48(2001))中。由此得到的質粒分別命名為pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β126-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β126-306。GST代表谷胱甘肽S-轉移酶，EK代表腸激酶，his代表6個組氨酸標簽，myc代表抗c-myc表位。C表示含有額外半胱氨酸的CGG接頭。
通過標準分子生物學方法進行所有其它步驟。
寡核苷酸序列5’LT-β5’-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3’(SEQ ID NO66)3’LT-β5’-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3’(SEQ ID NO67)5’LT-βlong-NheI5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3’(SEQ IDNO68)5’LT-βshort-NheI5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGGATT C-3’(SEQ IDNO69)3’LT-βstop-NotI5’-CAA TGA CTG CGG CCG CTTACC CCA CCA TCA CCG-3’(SEQ ID NO70)B.GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306的表達和產(chǎn)生如實施例4中所述，將質粒pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β126-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β126-306轉染到293-EBNA細胞(Invitrogen)中用于蛋白質生產(chǎn)。由此得到的蛋白質命名為GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。從cDNA序列GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306，翻譯LT-β融合蛋白質的蛋白質序列。
在還原條件下，在12％SDS-PAGE凝膠上分析融合蛋白。將凝膠轉印跡到硝酸纖維素膜上。封閉膜，與單克隆小鼠抗myc抗體或者與抗GST抗體溫育。隨后將印跡與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG或辣根過氧化物酶綴合的兔抗山羊IgG溫育?？梢宰C實LT-β融合蛋白的表達。在還原條件下，在12％SDS-PAGE凝膠上分析LT-β融合蛋白。將凝膠轉印跡到硝酸纖維素膜上。封閉膜，與單克隆小鼠抗myc抗體(稀釋度1∶2000)或與抗GST抗體(稀釋度1∶2000)溫育。隨后，印跡與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(稀釋度1∶4000)或辣根過氧化物酶綴合的兔抗山羊IgG(稀釋度1∶4000)溫育。用抗GST抗體可以分別在62kDa和48kDa分子量檢測到GST-EK-C-LT-β49-306和GST-EK-C-LT-β126-306。用抗myc抗體可以分別在40-56kDa和33-39kDa檢測到his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。
C.GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306的純化利用標準純化方法，在谷胱甘肽Sepharose柱子上純化GST-EK-C-LT-β49-306和GST-EK-C-LT-β126-306，并在Ni-NTA Sepharose柱子上純化his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。用腸激酶切割純化的蛋白質，并且在還原條件下，在16％SDS-PAGE凝膠上分析。
D.C-LT-β49-306和C-LT-β126-306與AP205 VLP的偶聯(lián)在25℃，在搖動振蕩器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液與25倍摩爾過量SMPH(Pierce)(從DMSO中的母液稀釋)反應30分鐘。隨后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反應溶液2次，2小時。然后，在25℃，在搖動振蕩器上，透析的AP205 VLP反應混合物與C-LT-β49-306和C-LT-β126-306溶液(終濃度60μM AP205 VLP，60μM C-LT-β49-306和C-LT-β126-306)反應4小時。在還原條件下，通過SDS-PAGE和Western印跡分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
實施例7MIF的克隆、表達、純化和與AP205 VLP的偶聯(lián)
A.在大鼠巨噬細胞移動抑制因子MIF中引入含cys的接頭、及其表達、純化大鼠巨噬細胞移動抑制因子(rMIF)重組地表達，其具有融合在其C末端的3個不同氨基酸接頭C1，C2和C3。每個接頭都含有一個半胱氨酸用于偶聯(lián)VLP。
rMIF-C1，rMIF-C2，rMIF-C3的構建為了將pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改變?yōu)镚TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC(SEQ ID NO71)，用退火的寡聚引物MCS-1F和引物MCS-1R(在15mM Tris HCl，pH 8的緩沖液中退火)置換從NdeI位點到XhoI位點的原始序列。由此得到的質粒稱為pMod00，其在它的MCS中有NdeI，BamHI，NheI，XhoI，PmeI和NotI限制位點。退火對寡核苷酸Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R，及退火對寡核苷酸1F-C-甘氨酸接頭和寡核苷酸1R-C-甘氨酸接頭一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00中，產(chǎn)生pModEC1，其具有N端6個組氨酸標簽、腸激酶切割位點和含有一個半胱氨酸殘基的C端甘氨酸氨基酸接頭。退火對oligo Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R與退火對oligo1F-C-γ1接頭和oligo 1R-C-γ1接頭一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00中，產(chǎn)生pModEC2，其有N端6個組氨酸標簽、腸激酶切割位點和來源于人免疫球蛋白γ1鉸鏈區(qū)且含有一個半胱氨酸殘基的C端γ1接頭。退火對oligo Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R、退火對oligo 1FA-C-γ3接頭和oligo 1RA-C-γ3接頭、和退火對oligo 1FB-C-γ3接頭和oligo1RB-C-γ3接頭一起連接到BamHI-NotI消化的pMod00中，產(chǎn)生pModEC3，其具有N末端6個組氨酸標簽、腸激酶切割位點和來源于小鼠免疫球蛋白γ3鉸鏈區(qū)且含有一個半胱氨酸殘基的C末端γ3接頭。
用oligo rMIF-F和rMIF-Xho-R，通過PCR擴增含有大鼠MIF cDNA的pBS-rMIF。rMIF-F有內部NdeI位點，rMIF-Xho-R有內部XhoI位點。用NdeI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，并且分別地連接到用相同酶消化的pModEC1，pModEC2和pModEC3中。所得質粒分別命名為pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3。
對于這些PCR反應，在50μl反應混合物(2單位PFX聚合酶，0.3mMdNTPs和2mM MgSO4)中使用15pmol每種寡聚物和1ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃，2分鐘，接著94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30秒)共30個循環(huán)，接著68℃，2分鐘。
通過標準分子生物學方法進行所有其它步驟。
寡核苷酸序列引物MCS-1F5’-TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCA T-3’(SEQ ID NO72)引物MCS-1R5’-TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GATCCA-3’(SEQ ID NO73)Bamhis6-EK-Nhe-F5’-GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GATGAC AAA GCG CTA GCC C-3’(SEQ ID NO74)Bamhis6-EK-Nhe-R5’-TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGGTGG TGG TGG TGG TGT G-3’(SEQ ID NO75)oligo 1F-C-甘氨酸接頭5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO76)oligo 1R-C-甘氨酸接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3’(SEQ ID NO77)oligo 1F-C-γ1接頭
5’-TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAGTTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO78)oligo 1R-C-γ1接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGGGTT TTA TCC-3’(SEQ ID NO79)oligo 1FA-C-γ3接頭5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ IDNO80)oligo 1RA-C-γ3接頭5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’(SEQID NO81)oligo 2FB-C-γ3接頭5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQID NO82)oligo 2RB-C-γ3接頭5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQ IDNO83)rMIF-F5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3’(SEQ ID NO84)rMIF-Xho-R5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO85)rMIF-C的表達和純化用質粒pMod-rMIF-C1，pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞。在液體培養(yǎng)基(含有150mM MOPS，pH 7.0，200ug/ml Amp，0.5％葡萄糖的SB)中擴增來源于含有氨芐青霉素(Amp)的瓊脂平板的單菌落，用220rpm振蕩在30℃過夜溫育。然后，用過夜培養(yǎng)物1∶50v/v接種1升SB(150mM MOPS，pH 7.0，200ug/ml Amp)，在30℃，培養(yǎng)到OD600＝2.5。用2mM IPTG誘導表達。過夜培養(yǎng)后收集細胞，在6000rpm離心。在含有0.8mg/ml溶菌酶的裂解緩沖液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％Tween-20)中懸浮細胞沉淀，超聲處理和用benzonase處理。然后，將2ml裂解液過20ml Q XL和20ml SP XL柱子。蛋白質rMIF-C1，rMIF-C2和rMIF-C3直流。
從cDNA序列翻譯rMIF-C的蛋白質序列。
rMIF-C1(SEQ ID NO114；C1是GGGGCG(SEQ ID NO55))rMIF-C2(SEQ ID NO115；C2是PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQID NO116))rMIF-C3(SEQ ID NO117；C3是DKTHTSPPCG(SEQ ID NO118))。
圖5A顯示MIF構建體的示意圖，該構建體具有含有半胱氨酸殘基的添加的氨基酸接頭。MIF可以是來源于任何哺乳動物的蛋白質，包括但不限于人類MIF(SEQ ID NO119)，大鼠MIF(SEQ ID NO120)或小鼠MIF(SEQ ID NO121)。SEQ ID NO122-124中示出了含有C末端氨基酸接頭C1，C2或C3的人類MIF序列。圖5B顯示在還原條件下電泳并且用考馬斯亮藍染色的純化MIF構建體的SDS-PAGE分析。凝膠上的加樣是圖5A中所示純化的大鼠構建體rMIF-C1(SEQ ID NO114)，rMIF-C2(SEQ ID NO115)和rMIF-C3(SEQ ID NO117)。
實施例8RANKL的克隆、表達、純化和偶聯(lián)A.小鼠RANKL中含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的引入，及其表達和純化重組地表達帶有N端接頭的核因子κb受體活化因子配體(RANKL)(其也被命名為破骨細胞分化因子、骨保護素配體和腫瘤壞死因子相關活化誘導細胞因子)，其N末端接頭含有一個半胱氨酸用于偶聯(lián)VLP。
表達質粒的構建用oligo RANKL-UP和RANKL-DOWN，通過PCR擴增RANKL基因的C末端編碼區(qū)。RANKL-UP有內部ApaI位點，RANKL-DOWN有內部XhoI位點。用ApaI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，并且連接到pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。由此得到的質粒命名為pGEX-RANKL。通過標準分子生物學方法進行所有這些步驟，并且驗證該序列。質粒pGEX-RANKL編碼谷胱甘肽S-轉移酶-Prescission切割位點-含有半胱氨酸的氨基酸接頭-RANKL的融合蛋白(GST-PS-C-RANKL)。含有半胱氨酸的氨基酸接頭具有序列GCGGG。該構建體也含有6個組氨酸標簽，該標簽位于含有半胱氨酸的氨基酸接頭和RANKL序列之間。
寡聚物RANKL-UP5’CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO86)RANKL-DOWN5 5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’(SEQ ID NO87)GST-PS-C-RANKL的蛋白質序列和GST-PS-C-RANKL的cDNA序列C-RANKL的表達和純化用質粒pGEX-RANKL轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞。在液體培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，30μg/ml卡那霉素，50μg/ml氯霉素)中擴增來源于含有卡那霉素和氯霉素的瓊脂平板的單菌落，并且在30℃，以220rpm振蕩過夜溫育。然后，用過夜培養(yǎng)物1∶100v/v接種1升LB(含有30μg/ml卡那霉素)，并且在24℃，培養(yǎng)到OD600＝1。用0.4mM IPTG.誘導表達。16小時后收集細胞，并且以5000rpm離心。在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH＝8；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mM DTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4u/ml DNA酶)中懸浮細胞沉淀30分鐘。然后，添加2.5體積緩沖液A(50mM Tris-HCl，pH＝8.0；1％Triton X100；100mM NaCl；0.1％NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，并且在37℃溫育15分鐘。超聲處理細胞，并且以9000rpm沉淀15分鐘。上清液立即用于GST親和層析。
在PBS，pH 7.3(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)中平衡5ml GST-Trap FF柱子(Amersham Pharmacia)。將上清液加樣到5ml GST-Trap FF柱子上，隨后用5柱體積的PBS洗柱子。用含有10mM GSH的50mM Tris-HCl，pH＝8.0洗脫蛋白質GST-PS-C-RANKL。
用蛋白酶PreScission(Amersham Pharmacia)消化純化的GST-PS-C-RANKL蛋白質。利用GST-PS-C-RANKL比PreScission為500/1的摩爾比率，在37℃消化1小時。
而且，利用HiPrep 26/10脫鹽柱(Amersham Pharmacia)交換蛋白酶消化反應物的緩沖液，合并含有蛋白質的級分，并且利用前述相同的條件，立即將其用于另一個GST親和層析步驟。在SDS-PAGE凝膠上分析C-RANKL的純化。用考馬斯亮藍染色凝膠。切割的C-RANKL存在于直流物(未結合級分)中，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的GST-PS和PreScission仍結合柱子。獲得高純度的22kDa期望大小的C-RANKL蛋白質。
凝膠上加樣的樣品如下泳道1低分子量標記物。泳道2和3用0.4mM IPTG誘導16小時后，分別用空載體pGEX6p1和pGEX-RANKL轉化的BL21/DE3細胞的細胞裂解物上清液。泳道4GST-Trap FF柱子后純化的GST-PS-C-RANKL蛋白質。泳道5GST-Trap FF柱子未結合的級分。泳道6用PreScission蛋白酶切割后純化的GST-PS-C-RANKL蛋白質。泳道7加樣有GST-RANKL消化物的GST-Trap FF柱子的未結合的級分，其含有純化的C-RANKL。泳道8加樣有GST-PS-C-RANKL消化物并且用GSH洗脫的GST-Trap FF柱子的結合級分。
B.C-RANKL與AP205 VLP的偶聯(lián)在25℃，在搖邊振蕩器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液與25倍摩爾過量SMPH(Pierce)(從DMSO中的母液稀釋)反應30分鐘。隨后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反應溶液2次2小時。然后，在25℃，在搖動振蕩器上，透析的AP205 VLP反應混合物與C-RANKL溶液(終濃度60μM AP205VLP，60μM C-RANKL)反應4小時。在還原條件下，通過SDS-PAGE和Western印跡分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
實施例9IL-5(具有包含半胱氨酸殘基的N末端氨基酸接頭)的克隆、表達和純化，與VLP的偶聯(lián)和小鼠中免疫應答的引發(fā)A.小鼠His-C-IL-5的克隆和在大腸桿菌中表達為包函體利用下面兩個引物Spelinker3-F1(SEQ ID NO90)和I15StopXho-R(SEQ ID NO91)，通過PCR從ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC號37562)擴增IL-5。該PCR產(chǎn)物用做第二PCR的模板，利用引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO92)和Il5StopXho-R擴增。用SpeI和NotI消化插入片段。將該插入片段連接到先前用NheI和NotI消化的pET載體衍生物(pMODEC3-8載體)中，并且轉化到大腸桿菌TG1細胞中。通過將IL-5克隆到pMODEC3-8中產(chǎn)生的構建體從其N末端起包含6個組氨酸標簽(有利于純化)、腸激酶切割位點、含有半胱氨酸殘基的γ3衍生的氨基酸接頭(N末端側翼為氨基酸ALV，C末端側翼為AS)和編碼成熟形式IL-5蛋白質的DNA。通過DNA測序證實克隆方法的忠實性。通過用腸激酶切割釋放的蛋白質稱為“小鼠C-IL-5-E”。
上述含有IL-5的構建體命名為pMODC6-IL5.2(也稱為pMODC6-IL5)，并且將其轉化到大腸桿菌株系BL21-DE3中。大腸桿菌中表達的重組蛋白質命名為His-C-IL5。
在含有1mg/L氨芐青霉素的5ml LB中過夜培養(yǎng)含有pMODC6-IL5的克隆BL21-DE3細胞。將該培養(yǎng)物的2ml等份試樣稀釋到含有1mg/L氨芐青霉素的100ml Terrific肉湯(TB)中。將該培養(yǎng)物培養(yǎng)到0.7-1.0 OD600的光密度，并且通過添加0.1ml 1.0M異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)母液誘導表達4小時。每2小時取一次樣品。重組His-C-IL5以不溶形式表達，并且位于所誘導細胞的包函體級分中。用下面的方法證實His-C-IL5的表達。誘導后4小時取10ml培養(yǎng)物樣品，并且以4000xg離心10分鐘。在組成為50mM Tris-HCl、2mM EDTA、0.1％Triton X-100(pH 8.0)的0.5ml裂解緩沖液中懸浮沉淀。向懸浮液添加20μl溶菌酶(40mg/ml)，30分鐘后，在4℃超聲處理2分鐘。添加1ml等份的benzonase和100μl等份的50mM MgCl2，并且在室溫下溫育30分鐘。以13000xg離心15分鐘后，棄去上清液，在100μl SDS加樣緩沖液中，在98℃加熱沉淀5分鐘。然后，在還原條件下，通過SDS-PAGE分析此10μl的等份試樣。SDS-PAGE分析證明了對應于IL-5質量的17kDa蛋白質條帶。做為對照，在沒有IPTG的情況下，培養(yǎng)含有pMODC6-IL5的BL21-DE2細胞，并且如上所述，從不溶細胞級分制備提取物。
B.小鼠His-C-IL5的純化和重折疊在BL21-DE3細胞中自克隆pMODC6-IL5大規(guī)模表達IL5，以獲得足夠量的純IL-5用于疫苗生產(chǎn)。過夜培養(yǎng)培養(yǎng)物，并且稀釋到含有1.0mg/L氨芐青霉素的100ml或1L體積的TB培養(yǎng)基中。由此，制備總計3升培養(yǎng)物，并且在37℃培養(yǎng)直到OD600達到0.7，這時添加IPTG至1.0mM的終濃度。4小時孵育后，通過在10000xg離心30分鐘收集細胞。收集后，在PBS中重懸浮沉淀(5.0ml/g濕重)，并且以10000xg離心15分鐘。使用前在-20℃貯藏該洗過的沉淀。
利用Dounce勻漿器，在PBS中懸浮細菌沉淀(2.0ml/g細胞濕重)。向懸浮液添加溶菌酶(0.8mg/ml)，并且在室溫下溫育30分鐘。在冰上超聲處理懸浮液1分鐘，3次，然后添加benzonase和MgCl2(10mM的終濃度)，并且在室溫下溫育30分鐘。添加Triton X-100至1％(w/v)終濃度，混合物在室溫下輕輕攪拌30分鐘。在20000xg離心溶液20分鐘(SS34管)，棄去上清液。利用Dounce勻漿器在洗滌緩沖液(含有2M尿素和1％(w/v)Triton X-100的PBS)中懸浮含有包函體的沉淀(5.0ml/g濕重)，并且攪拌5分鐘。在20000xg離心溶液20分鐘，并且棄去上清液。如上所述，再洗滌和離心沉淀2次。在不存在Triton X-100的情況下，用洗滌緩沖液進行最后的包函體洗滌。
在變性緩沖液(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，6.0M鹽酸胍，pH 8.0)中溶解沉淀的包函體中存在的His-C-IL-5(5.0ml/g細胞濕重)，并且在25℃輕輕攪拌1小時。在20000xg離心懸浮液20分鐘，并且混合上清液和Ni-NTA樹脂(QIAgen，用溶解緩沖液平衡)。在4℃輕輕攪拌3小時后，將漿液傾倒到玻璃柱子(C10/10)中，并且用100ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M鹽酸胍(pH 6.3)洗樹脂。用15ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M鹽酸胍(pH 5.9)進行額外的洗滌步驟。通過施用20ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0 M鹽酸胍(pH 4.5)從樹脂洗脫小鼠His-C-IL-5。通過SDS-PAGE分析純化。
合并從洗脫步驟得到的含有His-C-IL-5的級分，并且在4℃利用10kDa截斷膜，利用包含8.0M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl(pH 8.0)的緩沖液透析。透析后，利用下面公式蛋白質(mg/ml)＝(1.55×A280nm)-(0.76×A260nm)，分光光度法測定蛋白質濃度。用透析緩沖液將蛋白質濃度稀釋到0.2mg/ml。然后，在4℃，利用含有2.0M尿素，50mM NaH2PO4，5mM還原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油的重折疊緩沖液1(pH 8.5)，用3.5kDa膜透析該溶液24小時，并且利用含有50mM NaH2PO4，5mM還原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油的重折疊緩沖液2(pH 8.5)再透析24小時。最后，在4℃，利用PBS，pH8.0透析蛋白質24小時，然后在10000xg離心30分鐘。通過Bradford測定法估測上清液的蛋白質含量。
為了進一步純化His-C-IL5，用Hitrap Q樹脂(Amersham Pharmacia，Uppsala Sweeden)進行陰離子交換。利用Centrifugal Filter (Ultrafree-15Millipore，10kDa截斷值)將His-C-IL5濃縮到1mg/ml，利用50mM磷酸緩沖液，pH 8.4透析14小時。將溶液加樣到Hitrap Q柱子上，并且用50mM磷酸緩沖液，pH 8.4洗滌。通過施用從0-1M的NaCl梯度，從柱子洗脫His-C-IL5。在100mM NaCl從柱上洗脫His-C-IL5。通過SDS-PAGE進行純化分析，并且通過Bradford測定法測定濃度。通過在非還原條件下進行的SDS-PAGE估測蛋白質的四級結構，其表明His-C-IL5以二聚體形式存在于制備物中。
C.疫苗生產(chǎn)His-C-IL5與AP205 VLP的偶聯(lián)可以試驗各種條件以優(yōu)化偶聯(lián)反應的效率。這些條件包括向His-C-IL5添加還原劑(TCEP)和改變偶聯(lián)反應中AP205 VLP亞單位單體和His-C-IL5的摩爾比。如下所述產(chǎn)生AP205-His-C-IL5疫苗。在pH8.0 PBS中，用等摩爾量的TCEP還原純化的His-C-IL5(40μM)1小時。在22℃，在總體積700μl中，還原的IL-5(20μM)與10μM用SMPH衍生的Qβ溫育4小時。利用300kDa截斷透析膜，利用pH8.0的PBS，透析該反應物12小時。用抗His和抗AP205的抗體(多克隆兔抗血清)，通過SDS-PAGE和Western印跡分析偶聯(lián)反應。通過Bradford測定蛋白質濃度。通過對考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE上相應條帶的光密度分析，測定偶聯(lián)效率[即，Qβ-IL5摩爾數(shù)/Qβ單體摩爾數(shù)(總)]。
D.IL-5活性測定B細胞淋巴瘤系BCL1應答鼠IL-5增殖的能力用于檢查重折疊的重組His-C-IL5的生物學活性(Harriman G.R.(1991)Current Protocols inImmunology 6.5.1-6.5.5 John Wiley and Sons Inc)。也可以估測共價偶聯(lián)AP205 VLP的His-C-IL5的增殖活性。重組鼠IL-5(R&D systems，Minneapolis USA)用做對照。在平底96孔板中以每孔2×104BCL1細胞，溫育各種形式的重組IL-5，并且在37℃，5％CO2下溫育24小時。向每個孔添加1μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(Hartmann Analytic，Switzerland)，并且在37℃，5％CO2下溫育平板另外6小時。收獲并洗滌細胞，并且通過用液體閃爍計數(shù)儀計數(shù)β發(fā)射測定胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入。該試驗證明了His-C-IL5是活性的。
E.免疫方案為了產(chǎn)生針對小鼠IL-5的自身反應性抗體，在第0和14天，用200μlPBS中25μg AP205-His-C-IL5疫苗皮下注射4只BalbC小鼠。作為陰性對照，在第0和14天，用PBS中不共價偶聯(lián)的6.4μg AP205 VLP和16μgIL5(AP205+His-C-IL-5)的簡單混合物免疫5只小鼠。免疫前和在免疫方案的第21天從小鼠取血。通過ELISA分析血清。
F.血清分析ELISA在4℃，用50μl純化His-C-IL-5(3μg/ml)包被Maxisorp ELISA板(Nunc)。用PBS洗該板3次，并且在37℃，用PBS中2％BSA封閉該板2小時，然后用PBS洗兩次。在含有2％BSA和0.1％FCS的PBS中添加5倍稀釋的血清，并且在室溫下溫育1小時。隨后，用PBS洗該板3次，并且室溫下與綴合HRP的抗小鼠IgG(1∶1000稀釋度)溫育1小時。用PBS再次洗該板3次，并且添加100μl/孔的顯影溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M檸檬酸，0.032％H2O2，0.4％1，2-苯二胺二鹽酸鹽)。在室溫下反應5分鐘后，用5μl/孔5％H2SO4終止ELISA。在Spectramax分光光度計(Molecular Devices)上，在450nm測定吸光度。
實施例10小鼠朊病毒蛋白的克隆、表達和偶聯(lián)A.截短形式的小鼠朊病毒蛋白中含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的引入，及其表達和純化重組地表達小鼠朊病毒蛋白(稱為mPrPt)的截短形式(氨基酸121-230)，其具有融合在其C末端用于偶聯(lián)AP205 VLP的GGGGCG氨基酸接頭(SEQ ID NO55)。蛋白質與人Fc片段的N端融合以便純化。EK切割位點后引入腸激酶(EK)切割位點以在純化后切下融合蛋白質的Fc部分。
mPrPt-EK-Fc*的構建利用質粒pBPCMVPrP-Fc做為模板，用引物5’PrP-BamHI和3’PrP-NheI，通過PCR擴增小鼠PrPt。pBPCMVPrP-Fc含有小鼠朊病毒蛋白野生型序列。5’PrP-BamHI有內部BamHI位點并含有ATG，3’PrP-NheI有內部NheI位點。
對于PCR反應，在50μl反應混合物(1單位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每種引物各0.5μg和200ng模板DNA。溫度循環(huán)如下94℃，2分鐘，接著94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(45秒)共5個循環(huán)，接著94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45秒)共20個循環(huán)，接著68℃，10分鐘。
用BamHI和NheI消化PCR產(chǎn)物，并且插入到在EK切割序列5’末端含有GGGGCG接頭序列(SEQ ID NO55)的pCEP-SP-EK-Fc*中。由此得到的質粒命名為pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*。
通過標準分子生物學方法進行所有其它步驟。
寡聚物引物5’PrP-BamHI5′-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3′(SEQ IDNO88)引物3’PrP-NheI5′-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3′(SEQ ID NO89)mPrPt-EK-Fc*的表達和純化如實施例4中所述，將質粒pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*轉染到293-EBNA細胞(Invitrogen)中，并且在蛋白質A-Sepharose柱上純化。切割后，mPrPt具有SEQ ID NO324中所標識的序列(在其C末端具有GGGGCG接頭)。用腸激酶切割純化的融合蛋白質mPrPt-EK-Fc*，并且在腸激酶切割前和后，在還原條件下在16％SDS-PAGE上分析。用考馬斯亮藍染色凝膠?？梢詸z測到mPrPt-EK-Fc*融合蛋白為50kDa條帶?？梢詸z測到含有融合在其C末端的GGGGCG氨基酸接頭(SEQ ID NO55)的切割的mPrPt蛋白質，為18至25kDa的寬帶。通過Western印跡證實mPrPt的身份(未示出數(shù)據(jù))。因此，可以表達和純化具有含有半胱氨酸殘基的C末端氨基酸接頭的mPrPt，以用于偶聯(lián)AP205 VLP。
加樣在凝膠上的樣品如下泳道1分子量標記物。泳道2切割前的mPrPt-EK-Fc*。泳道3切割后的mPrPt。
B.mPrPt與AP205 VLP的偶聯(lián)在25℃，在搖動振蕩器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液與25倍摩爾過量SMPH(Pierce)(從DMSO中的母液稀釋)反應30分鐘。隨后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反應溶液2次2小時。然后，在25℃，在搖動振蕩器上，透析的AP205 VLP反應混合物與mPrPt溶液(終濃度60μM AP205 VLP，60μM mPrPt)反應4小時。在還原條件下，通過SDS-PAGE和Western印跡分析偶聯(lián)產(chǎn)物。
實施例11rMIF與AP205 VLP的偶聯(lián)如實施例7中所述表達和純化的RMIF-C1(SEQ ID NO114)在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的0.18mM溶液，在偶聯(lián)反應中使用以前，在室溫下與1摩爾當量的TCEP溫育1小時。在室溫下，2.5mg/ml的1ml AP205 VLP溶液與2.3倍摩爾過量的SMPH反應1小時。利用2升20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2，透析衍生的AP205 VLP 2次，2小時。隨后，在室溫下，820μl透析的衍生AP205 VLP(0.18mM)與上述先已用TCEP處理的820μl 0.18mM rMIF-C1溶液反應3小時。在偶聯(lián)反應最后沒有觀察到沉淀，并且在還原條件下，通過SDS-PAGE分析樣品，用考馬斯亮藍染色凝膠。圖6中示出了偶聯(lián)反應的結果。MIF分子量是，而AP205VLP亞單位分子量是14kDa，而rMIF-C1分子量是13。如圖6中所示，偶聯(lián)產(chǎn)物如所預期的遷移，具有表觀分子量27。
圖6顯示rMIF-C1與AP205 VLP偶聯(lián)反應的結果。泳道1分子標記物。泳道2AP205 VLP。泳道3衍生的AP205 VLP。泳道4透析后衍生的AP205 VLP。泳道5透析后衍生的AP205 VLP。泳道6rMIF-C1與AP205 VLP的偶聯(lián)反應。在圖中用箭頭標明了偶聯(lián)產(chǎn)物。在凝膠左側邊緣標出了標記蛋白質的分子量。
實施例12用偶聯(lián)AP205 VLP的rMIF免疫小鼠和大鼠A.用偶聯(lián)rMIF-C1的AP205 VLP免疫小鼠在第0和14天，給雌性Balb/c小鼠(3只小鼠)皮下注射偶聯(lián)rMIF-C1的AP205 VLP(來源于實施例11)。用在PBS中稀釋到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠。在21天，從小鼠眶后取血，如下所述，在對rMIF-C1特異的ELISA中測定對rMIF-C1特異的抗體效價。
用rMIF-C1以5μg/ml的濃度包被ELISA平板。封閉該板，然后與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶學標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也檢測了相同小鼠免疫前的血清。
用偶聯(lián)AP205 VLP的rMIF-C1免疫導致了抗rMIF-C1的強特異性免疫應答(圖7)，由此，3只小鼠抗rMIF-C1的平均效價是1∶31000(該效價定義為產(chǎn)生半最大OD值的血清稀釋度)。因此rMIF-C1正確地展示在AP205 VLP上，并且可接近免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生強免疫應答。
圖7所示是在用偶聯(lián)AP205 VLP的rMIF-C1免疫的小鼠血清中，通過ELISA對rMIF-C1特異的IgG應答的分析。一式兩份地進行第21天3只小鼠(M1，M2和M3)血清的分析。向孔中施加3倍稀釋度的血清。“preimm”代表隨后用偶聯(lián)AP205 VLP的rMIF-C1免疫的1只小鼠在免疫前的血清。
B.用偶聯(lián)rMIF-C1的AP205 VLP免疫大鼠在沒有佐劑的情況下，在第0和28天，給大鼠(每次3只)皮下注射偶聯(lián)rMIF-C1的AP205 VLP(來源于實施例12)。用在PBS中稀釋到200μl的50μg疫苗免疫每只大鼠。在第42天從大鼠取血，并且如上所述(除了利用酶學標記的抗大鼠IgG第二抗體)，在對rMIF-C1特異的ELISA中測定對rMIF-C1特異的抗體效價。
實施例13Angio I肽與AP205 VLP的偶聯(lián)和小鼠的免疫A.Angio I肽與AP205 VLP的偶聯(lián)化學合成Angio I肽，其具有在其N末端與接頭序列CGG融合的血管緊張肽II序列(DRVYIHPF)(SEQ ID NO13)，該接頭序列含有半胱氨酸殘基用于偶聯(lián)活化的VLP。將按照實施例2中所述表達和純化的AP205VLP重新溶解在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2緩沖液(HBS緩沖液)中。然后，在室溫(RT)下，重溶解的AP205 VLP以2mg/ml的濃度(在Bradford測定法中測定)與1.43mM SMPH(Pierce)反應30分鐘。然后，在4℃，用HBS緩沖液透析反應混合物2次2小時，并且與1.144mM AngioI肽(序列CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO12)，游離的胺和游離的酸)(DMSO中的50mM母液在反應混合物中稀釋)反應。在15℃，使偶聯(lián)反應進行2小時，利用1000倍體積HBS透析反應混合物2×2小時，并且將等份試樣在液氮中急驟冷凍，使用前貯藏在-80℃。
融化等份反應混合物，并且通過SDS-PAGE分析抗原和AP205亞單位的偶聯(lián)，并在Bradford測定法中測定蛋白質濃度。肽和AP205 VLP的偶聯(lián)效率(定義為相應于每個單體亞單位偶聯(lián)1，2或3個肽的條帶的強度總和除以偶聯(lián)和未偶聯(lián)的AP205單體亞單位總和)是88％。如測定偶聯(lián)效率一樣相似地測定表位密度，修改之處是在分數(shù)的分子中，偶聯(lián)條帶的強度乘以各個條帶中每個亞單位偶聯(lián)的肽的個數(shù)。表位密度是每個AP205VLP亞單位為1.6 Angio I肽。
B.用偶聯(lián)Angio I肽的AP205 VLP免疫小鼠在沒有佐劑的情況下，在第0和14天，給3只小鼠皮下注射如A部分中所述產(chǎn)生的偶聯(lián)Angio I肽的AP205 VLP。用在PBS中稀釋到200μl的25μg疫苗免疫每只小鼠。在第21天從小鼠眶后取血，通過ELISA測定對Angio I肽特異的抗體效價。利用化學交聯(lián)劑磺基-SPDP，使Angio I肽偶聯(lián)牛RNA酶A。以10μg/ml的濃度，用偶聯(lián)Angio I的RNA酶包被ELISA板。封閉該平板，然后與系列稀釋的小鼠血清溫育。用酶學標記的抗小鼠IgG抗體檢測結合的抗體。做為對照，也檢測了相同小鼠免疫前的血清。結果如圖8所示。
圖8顯示在第0和14天免疫的3只小鼠(1-3)血清中，對Angio I肽特異的IgG抗體的ELISA分析，其中小鼠用與AP205 VLP偶聯(lián)的AngioI肽免疫。在第21天血清中測定總IgG效價。在所分析的免疫前血清中沒有檢測到對Angio I特異的抗體。獲得了抗Angio I的平均1∶69000的非常高特異性效價(表示為在450nm，產(chǎn)生半最大OD值的稀釋度)，證明已經(jīng)破壞了對于Angio I(小鼠中自身肽)的自身耐受性。該數(shù)據(jù)證明抗原和AP205 VLP偶聯(lián)后可以獲得具有非常高度的肽展示的疫苗。該數(shù)據(jù)也證明當將自身抗原與AP205 VLP偶聯(lián)，并且隨后在沒有佐劑的情況下用所獲得的疫苗進行免疫，可以獲得抗這些自身抗原的非常高的效價。
為了澄清理解的目的，通過示例和實施例的方式，現(xiàn)在已經(jīng)相當詳細地全面描述了本發(fā)明，對本領域普通技術人員而言顯而易見，在廣泛的等同條件、方式和其它參數(shù)范圍內可以修改或改變本發(fā)明，而不影響本發(fā)明范圍和其任何特定實施方式，并且所附權利要求的范圍意欲包括這些修改或改變。
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請表明了本發(fā)明涉及的技術領域的技術人員的技術水平，在此將它們并入為參考文獻，就如同具體和單獨地指明將每個單獨的出版物、專利或專利申請并入為參考文獻一樣。
序列表<110> 希托斯生物技術股份公司(Cytos Biotechnology AG)<120> 使用衍生自AP205外殼蛋白的病毒樣顆粒的分子抗原陣列<130> C62336PC<150> US 60/396,126<151> 2002-07-17<160> 125<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 131<212> PRT<213> 噬菌體AP205<400> 1Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210> 2<211> 3635<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 質粒，pAP283-58，編碼RNA 噬菌體AP205外殼蛋白<400> 2cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg 840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg1020gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg atatggtgca ctctcagtac1080aatctgctct gatgccgcat agttaagcca actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg1140gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg1200gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca1260ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat1320ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg1380gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc1440tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta1500ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg1560ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg1620gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac1680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg1740acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt1800actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg1860ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac1920cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt1980gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag2040caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc2100aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc2160ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta2220tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg2280ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga2340ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac2400ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa2460tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat2520cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc2580taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg2640gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc2700acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg2760ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg2820ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa2880cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg2940aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga3000gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct3060gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca3120gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc3180ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg3240ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635<210> 3<211> 131<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 噬菌體AP205突變體<400> 3Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210> 4<211> 3613<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 質粒pAP281-32<400> 4
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt 300tgtgcagatg cctgtgtcat tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca 360gggtcagccg aaaacttggc taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt 420gacacactct tcgcgagcgg caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc 480gtatcgtctg atactactgc ttaagcttgt attctatagt gtcacctaaa tcgtatgtgt 540atgatacata aggttatgta ttaattgtag ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct 600aattgtgtag catctggctt actgaagcag accctatcat ctctctcgta aactgccgtc 660agagtcggtt tggttggacg aaccttctga gtttctggta acgccgttcc gcaccccgga 720aatggtcacc gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg ccggacgcat 780cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac 840cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat 900ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct 960tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc1020gcataaggga gagcgtcgat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag1080ttaagccaac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa1140cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg1200tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga1260ggcagcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat1320aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat1380ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata1440aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct1500tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa1560agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa1620cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt1680taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg1740tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca1800tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa1860
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt1920gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc1980cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa2040actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga2100ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc2160tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga2220tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga2280acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga2340ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat2400ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt2460ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct2520gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc2580ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc2640aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc2700gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc2760gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg2820aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata2880cctacagcgc gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta2940tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc3000ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg3060atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt3120cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt3180ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga3240gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc3300cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg tggtgtcatg gtcggtgatc gccagggtgc3360cgacgcgcat ctcgactgca tggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag3420ctgtggtatg gccgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact3480cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa3540tgagctgttg acaattaatc atcgaactag ttaactagta cgcaagttca cgtaaaaagg3600gtatcgcgga att 3613<210> 5
<211> 57<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 含有推定的AP205核糖體結合位點的序列<400> 5tctagaattt tctgcgcacc catcccgggt ggcgcccaaa gtgaggaaaa tcacatg57<210> 6<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 載體pQb185的Shine-Dalgarno序列<400> 6tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg35<210> 7<211> 42<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210> 8<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 1-15 GGC<400> 8Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Gly1 5 10 15Gly Cys
<210> 9<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 1-27 GGC<400> 9Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Gly Gly Cys20 25 30<210> 10<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 33-42突變體<400> 10Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile1 5 10 15Ala<210> 11<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 11Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Val Ile His Asn1 5 10<210> 12<211> 10<212> PRT<213> 人<400> 12Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210> 13<211> 8<212> PRT
<213> 人<400> 13Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5<210> 14<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-血管緊張肽I<400> 14Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5 10<210> 15<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-血管緊張肽I肽<400> 15Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210> 16<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 血管緊張肽-I GGC肽<400> 16Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys1 5 10<210> 17<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″cprplong″<400> 17
Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg20 25<210> 18<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″cprpshort″<400> 18Cys Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg1 5 10 15<210> 19<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒蛋白″人cprplong″<400> 19Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg20 25<210> 20<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″人cprpshort″<400> 20Cys Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg1 5 10 15<210> 21<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″牛cprplong″<400> 21Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Asn Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg20 25<210> 22<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″牛cprpshort″<400> 22Cys Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg1 5 10 15<210> 23<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″綿羊cprplong″<400> 23Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Asn Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg20 25<210> 24<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″綿羊cprpshort″<400> 24Cys Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg1 5 10 15<210> 25<211> 14
<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突變體<400> 25Cys Gly Gly Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg1 5 10<210> 26<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突變體<400> 26Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15His Gly Val Gly Gly Cys20<210> 27<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突變體肽<400> 27Cys Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala1 5 10 15Asn His Gly Val20<210> 28<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人TNF-α肽突變體<400> 28Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15
Pro Gln Ala Glu Gly Gln20<210> 29<211> 11<212> PRT<213> 人<400> 29Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala1 5 10<210> 30<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-IgE肽突變體<400> 30Cys Gly Gly Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 31<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模擬表位<400> 31Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210> 32<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模擬表位<400> 32Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210> 33
<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模擬表位<400> 33Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp1 5 10<210> 34<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模擬表位<400> 34Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 35<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3表位<400> 35Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 36<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3表位<400> 36Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 37<211> 10<212> PRT<213> 人工序列
<220>
<223> CeH3表位<400> 37Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 38<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 38Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 39<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 39Val Lys Leu Pro Trp Arg Phe Tyr Gln Val1 5 10<210> 40<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 40Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met1 5 10<210> 41<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 41
Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser1 5<210> 42<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 42Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp1 5<210> 43<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 43Gln Pro Ala His Ser Leu Gly1 5<210> 44<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 44Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg1 5<210> 45<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 45Leu Thr Leu Ser His Pro His Trp Val Leu Asn His Phe Val Ser1 5 10 15
<210> 46<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 46Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg15<210> 47<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 47Val Asn Leu Thr Trp Ser1 5<210> 48<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模擬表位<400> 48Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro1 5 10 15Ala<210> 49<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 甘氨酸絲氨酸接頭<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(5)<223> 這些殘基作為一組可以重復零次至任何次數(shù)
<400> 49Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210> 50<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端γ1接頭<400> 50Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210> 51<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端γ1接頭<400> 51Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys1 5<210> 52<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端γ3接頭<400> 52Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro<210> 53<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端γ3接頭
<400> 53Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210> 54<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸接頭<400> 54Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210> 55<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸接頭<400> 55Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210> 56<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸-賴氨酸接頭<400> 56Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210> 57<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸-賴氨酸接頭
<400> 57Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210> 58<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端接頭<400> 58Gly Gly Cys Gly1<210> 59<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.44引物<400> 59aaccatggca aataagccaa tgcaa 25<210> 60<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.45引物<400> 60aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30<210> 61<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.46引物<400> 61aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac g31<210> 62<211> 43<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> p1.47引物<400> 62gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg43<210> 63<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.4 8引物<400> 63cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc43<210> 64<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Derp1 117-137肽突變體<400> 64Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala1 5 10 15Gln Thr His Ser Ala20<210> 65<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Flag<400> 65Cys Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10<210> 66<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-b引物
<400> 66cttggtgccg caggatcag19<210> 67<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 3′LT-b引物<400> 67cagatggctg tcaccccac 19<210> 68<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-blong-NheI引物<400> 68gcccgctagc ctgcggtggt caggatcagg gacgtcg 37<210> 69<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-sbhort-NheI引物<400> 69gcccgctagc ctgcggtggt tctccagctg cggattc 37<210> 70<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 3′LT-bstop-NotI引物<400> 70caatgactgc ggccgcttac cccaccatca ccg 33<210> 71<211> 74<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pET22b(+)載體的MCS
<400> 71gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg gatccggcta gcgctcgagg gtttaaacgg60cggccgcatg cacc 74<210> 72<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物MCS-1F<400> 72tatggatccg gctagcgctc gagggtttaa acggcggccg cat 43<210> 73<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物MCS-1R<400> 73tcgaatgcgg ccgccgttta aaccctcgag cgctagccgg atcca 45<210> 74<211> 58<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Bamhis6-EK-Nhe-F引物<400> 74gatccacacc accaccacca ccacggttct ggtgacgacg atgacaaagc gctagccc 58<210> 75<211> 58<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Bamhis6-EK-Nhe-R<400> 75tcgagggcta gcgctttgtc atcgtcgtca ccagaaccgt ggtggtggtg gtggtgtg 58<210> 76<211> 42<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> oligo1F-C-甘氨酸-接頭<400> 76tcgagggtgg tggtggtggt tgcggttaat aagtttaaac gc 42<210> 77<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1R-C-甘氨酸-接頭<400> 77ggccgcgttt aaacttatta accgcaacca ccaccaccac cc 42<210> 78<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1F-C-γ1-接頭<400> 78tcgaggataa aacccacacc tctccgccgt gtggttaata agtttaaacg c51<210> 79<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1R-C-γ1-接頭<400> 79ggccgcgttt aaacttatta accacacggc ggagaggtgt gggttttatc c51<210> 80<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1FA-C-γ3-接頭<400> 80tcgagccgaa accgtctacc ccgccgggtt cttctg 36<210> 81<211> 38<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> oligo1RA-C-γ3-接頭<400> 81caccaccaga agaacccggc ggggtagacg gtttcggc 38<210> 82<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo2FB-C-γ3-接頭<400> 82gtggtgctcc gggtggttgc ggttaataag tttaaacgc39<210> 83<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo2RB-C-γ3-接頭<400> 83ggccgcgttt aaacttatta accgcaacca cccggag 37<210> 84<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> rMIF-F<400> 84ggaattccat atgcctatgt tcatcgtgaa cac 33<210> 85<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> rMIF-Xho-R<400> 85cccgctcgag agcgaaggtg gaaccgttc29<210> 86<211> 62<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> RANKL-UP寡核苷酸<400> 86ctgccagggg cccgggtgcg gcggtggcca tcatcaccac catcaccagc gcttctcagg 60ag 62<210> 87<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> RANKL-DOWN 寡核甘酸<400> 87ccgctcgagt tagtctatgt cctgaacttt gaaag 35<210> 88<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物5′PrP-BamHI<400> 88cgggatccca ccatggtggg gggccttgg 29<210> 89<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物3′PrP-NheI<400> 89ctagctagcc tggatcttct cccg 24<210> 90<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Spelinker3-F1<400> 90ccccgccggg ttcttctggc ggtgctccgg ctagcatgga gattcccatg agcac 55<210> 91<211> 49<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 引物IL5StopXho-R<400> 91ttttgcggcc gcgtttaaac tcgagttatt agccttccat tgcccactc 49<210> 92<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物SpeNlinker3-F2<400> 92ttttactagt tggttgcggc ggcccgaaac cgagcacccc gccgggttct tc 52<210> 93<211> 3<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸接頭<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重復零次至5次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重復零次至12次<400> 93Gly Cys Gly1<210> 94<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸-絲氨酸接頭<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重復零次至5次
<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重復零次至10次<220>
<221> REPEAT<222> (4)..(4)<223> 絲氨酸可以重復零次至2次<220>
<221> REPEAT<222> (5)..(9)<223> 這些殘基作為一組可以重復零次至3次<400> 94Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210> 95<211> 3<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸接頭<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重復零次至12次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重復零次至5次<400> 95Gly Cys Gly1<210> 96<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸-絲氨酸接頭<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重復零次至10次
<220>
<221> REPEAT<222> (2)..(2)<223> 絲氨酸可以重復零次至2次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(7)<223> 這些殘基作為一組可以重復零次至3次<220>
<221> REPEAT<222> (8)..(8)<223> 甘氨酸可以重復零次至8次<220>
<221> REPEAT<222> (10)..(10)<223> 甘氨酸可以重復零次至5次<400> 96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210> 97<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-Der p1肽突變體<400> 97Cys Gly Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys1 5 10 15Ala Ser Gln His Gly Cys His20<210> 98<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-血管緊張肽I肽<400> 98Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His1 5 10<210> 99<211> 26
<212> PRT<213> 人<400> 99Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu1 5 10 15Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys20 25<210> 100<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C TNF-a肽突變體<400> 100Cys Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala15 10 15Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln20<210> 101<211> 25<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> TNF-a-C突變體<400> 101Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15Pro Gln Ala Glu Gly Gln Gly Gly Cys20 25<210> 102<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-TNF-a突變體<400> 102Cys Gly Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala
1 5 10<210> 103<211> 745<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-Xa-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(741)<400> 103gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg 48Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15atc gaa ggt cgc aag ctt act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 96Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag144Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys35 40 45gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg192Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val50 55 60gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac240Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp65 70 75 80ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac288Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr85 90 95aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac336Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp100 105 110tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc384Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu115 120 125cca gcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga432Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg130 135 140gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag480Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys145 150 155 160aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac528Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp165 170 175atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag576
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys180 185 190acc acg cct ccc gtg ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc624Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser195 200 205aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca672Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser210 215 220tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc720Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser225 230 235 240ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgac745Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210> 104<211> 247<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-Xa-Fc*<400> 104Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys35 40 45Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val50 55 60Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp65 70 75 80Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr85 90 95Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp100 105 110Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu115 120 125
Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg130 135 140Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys145 150 155 160Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp165 170 175Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys180 185 190Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser195 200 205Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser210 215 220Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser225 230 235 240Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210> 105<211> 96<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-EK-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(96)<400> 105gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg 48Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15gac gat gac gac aag ctt act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 96Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30<210> 106<211> 32<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-EK-Fc*<400> 106Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30<210> 107<211> 144<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-SP-EK-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(141)<400> 107atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15ggt tcc act ggt gac gcg gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg 96Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala20 25 30gga ggg ggt gga tgt ggg gac gat gac gac aag ctt act cac aca tgc 144Gly Gly Gly Gly Cys GlV Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr35 40 45<210> 108<211> 47<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-SP-EK-Fc*<400> 108Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala20 25 30Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr35 40 45
<210> 109<211> 399<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-Xa<220>
<221> CDS<222> (10)..(399)<400> 109ggatccggg atg aag aac ctt tca ttt ccc ctc ctt ttc ctt ttc ttc ctt51Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu1 5 10gtc cct gaa ctg ctg ggc tcc agc atg cca ctg tgt ccc atc gat gaa 99Val Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu15 20 25 30gcc atc gac aag aag atc aaa caa gac ttc aac tcc ctg ttt cca aat 147Ala Ile Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn35 40 45gca ata aag aac att ggc tta aat tgc tgg aca gtc tcc tcc aga ggg 195Ala Ile Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly50 55 60aag ttg gcc tcc tgc cca gaa ggc aca gca gtc ttg agc tgc tcc tgt 243Lys Leu Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys65 70 75ggc tct gcc tgt ggc tcg tgg gac att cgt gaa gaa aaa gtg tgt cac 291Gly Ser Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His80 85 90tgc cag tgt gca agg ata gac tgg aca gca gcc cgc tgc tgt aag ctg 339Cys Gln Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu95 100 105 110cag gtc gct tcc tct cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg atc gaa ggt 387Gln Val Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ile Glu Gly115 120 125cgc aag ctt actArg Lys Leu Thr130<210> 110<211> 130<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-Xa<400> 110
Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu Val Pro1 5 10 15Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu Ala Ile20 25 30Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn Ala Ile35 40 45Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly Lys Leu50 55 60Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His Cys Gln85 90 95Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu Gln Val100 105 110Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ile Glu Gly Arg Lys115 120 125Leu Thr130<210> 111<211> 399<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-EK<220>
<221> CDS<222> (10)..(399)<400> 111ggatccggg atg aag aac ctt tca ttt ccc ctc ctt ttc ctt ttc ttc ctt51Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu1 5 10gtc cct gaa ctg ctg ggc tcc agc atg cca ctg tgt ccc atc gat gaa 99Val Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu15 20 25 30gcc atc gac aag aag atc aaa caa gac ttc aac tcc ctg ttt cca aat 147Ala Ile Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn35 40 45
gca ata aag aac att ggc tta aat tgc tgg aca gtc tcc tcc aga ggg 195Ala Ile Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly50 55 60aag ttg gcc tcc tgc cca gaa ggc aca gca gtc ttg agc tgc tcc tgt 243Lys Leu Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys65 70 75ggc tct gcc tgt ggc tcg tgg gac att cgt gaa gaa aaa gtg tgt cac 291Gly Ser Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His80 85 90tgc cag tgt gca agg ata gac tgg aca gca gcc cgc tgc tgt aag ctg 339Cys Gln Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu95 100 105 110cag gtc gct tcc tct cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg gac gat gac 387Gln Val Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp115 120 125gac aag ctt act 399Asp Lys Leu Thr130<210> 112<211> 130<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-EK<400> 112Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu Val Pro1 5 10 15Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu Ala Ile20 25 30Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn Ala Ile35 40 45Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly Lys Leu50 55 60Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His Cys Gln85 90 95Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu Gln Val100 105 110
Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp Asp Lys115 120 125Leu Thr130<210> 113<211> 26<212> PRT<213> 小家鼠(Mus musculus)<400> 113Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp Phe Thr Trp His1 5 10 15Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys Lys20 25<210> 114<211> 120<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C1<400> 114Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110
Phe Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly115 120<210> 115<211> 132<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C2<400> 115Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro115 120 125Gly Gly Cys Gly130<210> 116<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 氨基酸接頭C2<400> 116
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210> 117<211> 124<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C3<400> 117Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly115 120<210> 118<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 氨基酸接頭C3<400> 118Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
1 5 10<210> 119<211> 114<212> PRT<213> 人<400> 119Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 120<211> 114<212> PRT<213> 褐家鼠(rattus norvegicus)<400> 120Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile
50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 121<211> 114<212> PRT<213> 小家鼠<400> 121Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 122<211> 120<212> PRT
<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C1<400> 122Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly115 120<210> 123<211> 132<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C2<400> 123Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45
Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro115 120 125Gly Gly Cys Gly130<210> 124<211> 124<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C3<400> 124Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110
Phe Ala Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly115 120<210> 125<211> 396<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> AP205 P5T突變體<400> 125atggcaaata agacaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat 60ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt120atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct180aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc240acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac300aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct360actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaa 39權利要求
1.包含至少一種選自如下的蛋白質的病毒樣顆粒(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白質；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突變蛋白質。
2.如權利要求1所述的病毒樣顆粒，其中所述蛋白質是重組蛋白。
3.如權利要求1或2所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
4.如權利要求1至3任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置換了至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
5.如權利要求1至4任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
6.具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突變蛋白質。
7.SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重組蛋白質的突變蛋白質。
8.如權利要求7所述的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
9.如權利要求7或8所述的突變蛋白質，其中缺失或置換了至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
10.如權利要求7至9任一項所述的突變蛋白質，其中添加、缺失或置換了至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。
11.用于產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的載體，其包含與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，甚至更優(yōu)選地99％相同的核苷酸序列。
12.用于產(chǎn)生重組蛋白質的載體，其包含編碼與選自如下的蛋白質融合的多肽的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白質；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白質；和(c)所述(a)或(b)多肽的突變蛋白質。
13.一種組合物，其包含(a)選自如下的核心顆粒(i)AP205病毒顆粒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；和(b)有機分子，其中有機分子與核心顆粒結合。
14.如權利要求13所述的組合物，其中，所述有機分子和核心顆粒形成一個在核心顆粒表面上的有序重復的有機分子陣列。
15.如權利要求13或14所述的組合物，其中有機分子通過第三分子結合核心顆粒，所述第三分子將有機分子與核心顆粒連接在一起。
16.如權利要求13至15任一項所述的組合物，其中所述有機分子通過至少一個共價鍵結合核心顆粒，其中優(yōu)選地所述共價鍵包括肽鍵。
17.如權利要求13至16任一項所述的組合物，其中所述有機分子通過至少一個共價鍵結合核心顆粒，其中優(yōu)選地所述共價鍵包括非肽鍵。
18.如權利要求13至17任一項所述的組合物，其中有機分子包括或者優(yōu)選地是半抗原、抗原或抗原決定簇，并且其中更優(yōu)選地所述有機分子是抗原或抗原決定簇。
19.如權利要求13至18任一項所述的組合物，其中病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位點，并且有機分子含有至少一個第二附著位點，這樣所述第二附著位點能夠與所述第一附著位點締合，優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵締合，以形成有序重復的抗原陣列。
20.如權利要求13至19任一項所述的組合物，其中所述第一附著位點包含，優(yōu)選地是氨基基團，并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點包含，優(yōu)選地是賴氨酸殘基，并且其中所述第二附著位點包含，優(yōu)選地是巰基，并且其中優(yōu)選地所述第二附著位點包含，優(yōu)選地是半胱氨酸殘基。
21.如權利要求13至20任一項所述的組合物，其中所述第二附著位點不天然出現(xiàn)在所述有機分子中。
22.如權利要求13至21任一項所述的組合物，其中所述組合物包含氨基酸接頭，并且其中優(yōu)選地所述氨基酸接頭通過至少一個共價鍵，優(yōu)選地通過至少一個肽鍵與所述抗原或所述抗原決定簇結合。
23.如權利要求13至22任一項所述的組合物，其中所述氨基酸接頭包含所述第二附著位點。
24.如權利要求13至23任一項所述的組合物，其中所述氨基酸接頭選自(a)CGG；(b)N-末端γ1接頭；(c)N-末端γ3接頭；(d)Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO93)；(g)N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ IDNO94)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接頭；(m)C-末端γ3接頭；(n)C-末端甘氨酸接頭；(0)(G)nC(G)k，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO95)；(p)C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO96)。
25.如權利要求13至24任一項所述的組合物，其中所述有機分子選自(a)適于誘導抗癌細胞的免疫應答的有機分子；(b)適于誘導抗感染性疾病的免疫應答的有機分子；(c)適于誘導抗變應原的免疫應答的有機分子；(d)適于誘導改進的抗自身抗原的應答的有機分子；(e)適于在農畜或寵物中誘導免疫應答的有機分子；和(f)適于誘導抗藥物、激素或有毒化合物的應答的有機分子和(g)(a)-(f)中所述分子的片段、突變蛋白質或結構域。
26.如權利要求13至25任一項所述的組合物，其中有機分子是選自如下的抗原或抗原決定簇或者其片段或突變蛋白質(a)適于誘導抗癌細胞的免疫應答的抗原或抗原決定簇；(b)適于誘導抗感染性疾病的免疫應答的抗原或抗原決定簇；(c)適于誘導抗變應原的免疫應答的抗原或抗原決定簇；(d)適于誘導改進的抗自身抗原的應答的抗原或抗原決定簇；(e)適于在農畜或寵物中誘導免疫應答的抗原或抗原決定簇；和(f)適于誘導抗藥物、激素或有毒化合物的應答的抗原或抗原決定簇；和(g)(a)-(f)中所述分子的片段或結構域。
27.如權利要求13至26任一項所述的組合物，其中所述有機分子是選自如下的抗原(a)HIV多肽，(b)流感病毒多肽，(c)丙型肝炎病毒多肽，(d)弓形體多肽，(e)惡性瘧原蟲多肽，(f)間日瘧原蟲多肽，(g)卵形瘧原蟲多肽，(h)三日瘧原蟲多肽，(i)乳腺癌細胞多肽，(j)腎癌細胞多肽，(k)前列腺癌細胞多肽，(l)皮膚癌細胞多肽，(m)腦癌細胞多肽，(n)白血病細胞多肽，(o)重組profiling，(p)蜂螫刺變態(tài)反應多肽，(q)堅果變態(tài)反應多肽，(r)食物變態(tài)反應多肽，(s)哮喘多肽，或(t)衣原體多肽，(u)Her2，(v)GD2，(w)EGF-R，(x)CEA，(y)CD52，(z)人黑素瘤gp100，(aa)人黑素瘤melanA/MART-1，(bb)酪氨酸酶，(cc)NA17-A nt，(dd)MAGE3，(ee)P53，和(ff)HPV16E7；和(gg)(a)至(z)及(aa)至(ff)的所述抗原的任何片段或突變蛋白質。
28.如權利要求13至27任一項所述的組合物，其中所述抗原或抗原決定簇是選自如下的肽、蛋白質，或者蛋白質或肽的片段或突變蛋白質a)磷脂酶A2蛋白質；b)人IgE；c)淋巴毒素；d)流感M2蛋白質；和e)DerpI肽。
29.如權利要求13至28任一項所述的組合物，其中所述有機分子是抗原或抗原決定簇，而且所述抗原或所述抗原決定簇是自身抗原或抗獨特型抗體，或其片段。
30.如權利要求13至29任一項所述的組合物，其中所述自身抗原是選自如下的蛋白質、肽或者其任何片段或突變蛋白質a)淋巴毒素；b)淋巴毒素受體；c)RANKL；d)VEGF；e)VEGFR；f)白細胞介素5；g)白細胞介素8；h)白細胞介素17；i)白細胞介素13；j)血管緊張肽；k)CCL21；l)CXCL12；m)SDF-1；n)MCP-1；o)Endoglin；p)抵抗素；q)GHRH；r)LHRH；s)TRH；t)MIF；u)Eotaxin；v)緩激肽；w)BLC；x)M-CSF；x)腫瘤壞死因子α(TNFα)；y)淀粉樣β肽(Aβ1-42)；和z)人IgE。
31.如權利要求13至30任一項所述的組合物，其中所述自身抗原是選自如下的淋巴毒素或其片段a)淋巴毒素α(LTα)；b)淋巴毒素β(LTβ)；和c)LTα和LTβ的混合或組合。
32.如權利要求13至31任一項所述的組合物，其中所述有機分子是適于誘導抗藥物、激素或毒素的免疫應答的有機分子。
33.如權利要求13至32任一項所述的組合物，其中所述有機分子是適于誘導抗藥物的免疫應答的有機分子。
34.如權利要求13至33任一項所述的組合物，其中所述藥物選自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)嗎啡；(e)苯丙胺；(f)可卡因；(g)甲烯二氧甲苯丙胺；(h)甲苯丙胺；(i)哌醋甲酯；(j)煙堿；(k)LSD；(l)三甲氧苯乙胺；(M)叔胺吲哚磷酯；和(n)四氫大麻酚。
35.如權利要求13至34任一項所述的組合物，其中所述藥物是煙堿。
36.如權利要求13至35任一項所述的組合物，其中有機分子適于誘導抗激素的免疫應答。
37.如權利要求13至36任一項所述的組合物，其中所述有機分子是激素，其選自包含如下激素的組，優(yōu)選選自由如下激素組成的組(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睪酮；(d)促卵泡激素；(e)促黑素激素(melanin stimulating hormone)；(f)腎上腺素；和(g)去甲腎上腺素。
38.如權利要求13至37任一項所述的組合物，其中有機分子適于誘導抗毒素的免疫應答。
39.如權利要求13至38任一項所述的組合物，其中有機分子是毒素，選自(a)黃曲霉毒素；(b)ciguetera毒素；(c)河豚毒素；(d)抗生素；和(e)抗癌劑。
40.一種藥物組合物，其包含(a)權利要求13至39任一項所述的組合物和(b)可接受的藥物載體。
41.一種疫苗組合物，其包含免疫有效量的權利要求13至39任一項所述的組合物。
42.一種免疫方法，該方法包括施用權利要求41所述的疫苗組合物。
43.如權利要求41所述的疫苗組合物，其還包含佐劑。
44.一種用于產(chǎn)生非天然的、有序重復抗原陣列的方法，該方法包括(a)提供包含核心顆粒的分子支架，該核心顆粒選自(i)AP205病毒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；和(b)提供適于誘導免疫應答的有機分子；(c)提供連接(a)和(b)的物質，所述物質可選地包含在(a)和/或(b)中，或者作為一個單獨分子存在；和(d)組合(a)到(c)的元件，使所述有機分子與所述支架連接以形成有序重復的抗原陣列。
45.一種治療或預防個體中疾病、病癥或生理狀況的方法，該方法包括向個體施用權利要求13至39任一項所述的組合物。
46.一種治療或預防個體中疾病、病癥或生理狀況的方法，該方法包括向個體施用權利要求41所述的疫苗組合物。
47.一種核酸分子，其包含SEQ ID NO125中所述的核苷酸序列。
48.一種宿主細胞，其含有權利要求47所述的核酸或權利要求11所述的載體。
49.如權利要求48所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
50.一種產(chǎn)生權利要求1至5任一項所述的病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a)提供權利要求47所述的核酸或權利要求11所述的載體；(b)向宿主細胞中引入所述核酸或所述載體；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列以獲得能形成權利要求1所述的病毒樣顆粒的蛋白質或突變蛋白質。
51.如權利要求50所述的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含AP205病毒樣顆粒(VLP)和抗原的組合物。本發(fā)明也提供了制備結合AP205 VLP的抗原或抗原決定簇的方法。可以使用結合抗原的AP205 VLP制備用于誘導免疫應答的組合物，其中所述免疫應答可以用于預防或治療疾病、病癥或狀況，包括感染性疾病、變態(tài)反應、癌癥、藥物成癮、中毒，和有效地誘導自身特異性免疫應答，特別是抗體應答。
文檔編號C07K14/54GK1668637SQ03816862
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權日2002年7月17日
發(fā)明者M·F·巴赫曼, A·蒂索, P·龐朋斯, I·西倫斯, R·倫霍法 申請人:希托斯生物技術股份公司