專利名稱：垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(pacap)受體(vpac2)激動(dòng)劑及其藥物使用方法
垂體腺普酸環(huán)化酶激活肽(PACAP) 受體(VPAC2)激動(dòng)劑及其藥物使用方法本申請(qǐng)要求享受于2002年7月12曰申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) No.60/395，738的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容被全部引入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新鑒定的多肽以及此多肽用于治療目的的用途。更具 體地，本發(fā)明的多肽可以以依賴于葡萄糖的方式刺激胰腺P -細(xì)胞釋放 胰烏素，從而為受代謝失調(diào)諸如糖尿病或削弱的葡萄糖耐量-一種前糖 尿病狀態(tài)的病癥困擾的個(gè)體提供一種治療的選擇方案。發(fā)明背景糖尿病的特征是具有削弱的葡萄糖代謝作用，其在高糖尿病患者 中顯示為血糖水平升高.依據(jù)下述的缺陷將糖尿病分為兩個(gè)主要的 組I型糖尿病，或胰烏素依賴型糖尿病(1DDM)，當(dāng)患者的胰腺缺 少生產(chǎn)胰烏素的P-細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生，以及H型糖尿病，或非胰島素依賴型 糖尿病(NIDDM)，其患者具有削弱的P-細(xì)胞功能和改變的胰島素作 用。目前l(fā)型糖尿病患者用胰烏素來(lái)進(jìn)行治療，而大多數(shù)的II型糖尿 病患者用刺激P-細(xì)胞功能的藥物或增強(qiáng)病人對(duì)胰島素的組織敏感性的 藥物進(jìn)行治療。幾乎一半的II型糖尿病患者受試者隨著時(shí)間喪失了對(duì) 這些藥物的應(yīng)答，然后必須寄予胰烏素療法。目前用于治療II型糖尿 病的藥物描述在下文中.a-葡糖苷酶抑制劑(例如Precose⑧、VogliboseTM和Miglitol )其 通過(guò)延遲內(nèi)臟對(duì)葡萄糖的吸收而降低餐后葡萄糖的移動(dòng)，這些藥物是 安全的并且為輕度糖尿病患者提供了治療，然而，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了 對(duì)胃腸道的副作用。胰島素敏化刑是增強(qiáng)身體對(duì)胰烏素應(yīng)答的藥物.噻唑烷二稱類化 合物諸如AvandiaTM ( rosiglitazone)和ActosTM激活過(guò)氧化物酶體增 殖劑-激活的受體(PPAR) Y亞型并調(diào)節(jié)尚沒(méi)有被較好描述的一組基因的活性。RezulinTM (troglitazone)是此類型中的第一個(gè)藥物，其因 為增加了肝臟的酶水平和藥物誘導(dǎo)的肝臟毒性而被人們所摒棄了。對(duì) 肝的這些影響在使用AvandiaTM和ActosTM的患者中沒(méi)有成為顯著的 問(wèn)題，即使如此，建議在治療的第一年每?jī)蓚€(gè)月進(jìn)行一次肝臟酶測(cè)定 且此后定期地進(jìn)行.AvandiaTM和ActosTM好像與水腫和浮肺相關(guān)聯(lián)。 AvandiaTM不與胰烏素一起使用，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致充血性心力衰竭。另 一種可能的副作用是體重增加.胰烏素促泌劑(例如，磺酰脲類(SFlIs)及其它通過(guò)ATP-依賴型 K+通道起作用的藥物)是目前另一種類型用于治療II型糖尿病的藥 物.SFUs是用于具有輕中度禁食糖血癥的II型糖尿病患者的標(biāo)準(zhǔn)療 法.SFUs具有包括可能誘導(dǎo)低血糖、體重增加和高的初級(jí)和次級(jí)失敗 在內(nèi)的局限性。10 ~ 20°/。的最初被治療的患者未能顯示顯著的治療效 果(初級(jí)失敗)。次級(jí)失敗表現(xiàn)為另外的20-30%的患者在使用6個(gè)月 后對(duì)SFU喪失了治療效果，在治療5-7年后具有50。/。SFU應(yīng)答者的胰 烏素療法是人們所需要的(Scheen等，Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533國(guó)543，1989 )。GlucophageTM ( metformin HC1)是一種通過(guò)減少肝葡萄糖排出量 并增加外圍葡萄糖吸收和利用來(lái)降低血糖的雙縮胍，該藥物對(duì)于降低輕度和中度受影響的受試者的血糖是有效的并且不具有體重增加或可 能誘導(dǎo)低血糖的副作用。然而，GlucophageTM具有大量的副作用包括 胃腸道紊亂和乳酸酸中毒。GlucophageTM被禁忌用于年齡超過(guò)70歲的 糖尿病患者并且損傷受試者的腎的或肝的功能.最后，GhicophageTM 具有與SFUs相同的初級(jí)和次級(jí)失敗率'胰島素冶療在餐后和鍛煉后進(jìn)行，并且內(nèi)服不能充分地控制血 糖。這些治療具有如下的缺點(diǎn)，即其是可注射的，其可能產(chǎn)生低血糖， 并且其導(dǎo)致體重增加.由于目前治療方法具有的問(wèn)題，需要新的治療II型糖尿病的治療 方法。尤其是，維持正常(依賴于葡萄糖的)胰島素分泌的治療方法 是需要的，這些新藥應(yīng)該具有以下特性依賴于葡萄糖來(lái)促進(jìn)胰島素 的分泌(即，僅僅在增加血糖的情況下產(chǎn)生胰島素分泌)；低的初級(jí) 和次級(jí)失敗率；以及保持小島細(xì)胞功能.此處公開(kāi)的開(kāi)發(fā)新治療方法 的策略基于環(huán)腺苷一磷酸(eAMP )信號(hào)機(jī)制以及其對(duì)胰島素分泌的影響。環(huán)化AMP是胰烏素分泌過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子.此信號(hào)分子的增加 促進(jìn)了激活蛋白激酶A途徑后k+通道的閉合，K+通道的閉合導(dǎo)致細(xì)胞 去極化以及隨后的Ca—通道的打開(kāi)，其反過(guò)來(lái)導(dǎo)致胰島素顆粒的胞吐 作用。其在缺少低葡萄糖濃度的情況下對(duì)胰島素分泌的發(fā)生基本上沒(méi) 有任何影響(Weinhaus等,Diabetes 47:1426-1435,1998),促泌劑類 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽("PACAP")以及GLP-1 (胰高血糖素樣 肽1)以依賴于葡萄糖的方式利用cAMP系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)胰烏素的分泌(Komatsu等，Diabetes 46:1928國(guó)1938，1997; Filipsson等，Diabetes 50:1959-1969,2001; Drucker， Endocrinology 142:521-527,2001 )。通 過(guò)增加cAMP進(jìn)行作用的胰鳥(niǎo)素促泌劑諸如GLP-1和PACAP除了增 強(qiáng)胰島素釋放外也能夠增強(qiáng)胰島素的合成(Skoglund等，Diabetes 49:1156-1164,2000; Borboni等，Endocrinology 140:5530-5537,1999 )。 PACAP是一種由胰腺P-細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖-依賴性胰島素分泌的有 效刺激物，三種不同的PACAP受體類型(PAC1， VPAC1和VPAC2) 已被描述(Harmar等，Pharmacol. Reviews 50:265-270,1998; Vaudry 等，Pharmacol. Reviews 52:269-324,2000) ft PACAP沒(méi)有受體選擇性， 三種受體具有類似的活性和效力。PAC1主要在CNS中，而VPAC1 和VPAC2則更廣泛地分布.VPAC1位于CNS以及肝臟、肺臟和腸中。 VPAC2位于CNS、胰腺、骨骼肌、心臟、腎臟、脂肪組織、睪丸以及 胃中.最近的研究表明VPAC2負(fù)責(zé)由P-細(xì)胞分泌胰烏素(Inagaki等， Proc， Natl. Acad. Sci. USA 91:2679-2683,1994; Tsutsumi等，Diabetes 51:1453-1460,2002) 。 PACAP的促胰烏素作用是受CTP結(jié)合蛋白Gs 調(diào)節(jié)的.胞內(nèi)cAMP的累積隨后激活了增加
的P-細(xì)胞中的非選 擇性陽(yáng)離子通道，以及促進(jìn)了含有胰烏素的分泌顆粒的胞吐作用.PACAP是那些通過(guò)cAMP-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用的新陳 代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)介質(zhì)肽類激素的超家族的新成員(Arimura， Regul. Peptides 37:287-303,1992 )。生物學(xué)活性肽由生物 合成前體釋放為兩種分子形式，具有酰胺化的羧基末端的38-氨基酸肽(PACAP-38 )和/或27-氨基酸肽(PACAP-27) ( Arimura,如上文所 述).兩種形式肽的最高濃度被發(fā)現(xiàn)存在于腦和睪丸中(Arimura，如上文所述)。肽的較短形式PACAP-27顯示出與腸血管活性肽(VIP)具 有68%的結(jié)構(gòu)同源性'然而，PACAP和VIP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的分布 表明這些結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽具有不同的神經(jīng)遞質(zhì)功能(Koves等， Neuroendocrinology 54:159-169,1991 ).最近的研究證明了 PACAP-38的各種生物學(xué)功能，從在繁殖中的 作用(McArdle， Endocrinology 135:815-817,1994 )到刺激胰烏素分泌 的能力(Yada等，J. Biol. Chem. 269:1290-1293,1994)。此外，PACAP 似乎在脂類和碳水化合物代謝的激素調(diào)節(jié)(Gray等，Mol. Endrocrinol. 15:1739-47,2001 );生理節(jié)奏功能(Harmar等，Cell 109:497-508,2002 ); 和免疫系統(tǒng)、生長(zhǎng)、能量穩(wěn)態(tài)以及男性生殖功能(Asnicar等， Endrocrinol. 143:3994-4006,2002 );食欲的調(diào)節(jié)(Tachibana等，Neurosci. Lett. 339:203-206,2003 );以及急性的和慢性炎癥性疾病、膿毒性休克 和自身免疫疾病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼掩)(Pozo， Trends Mol. Med. 9:211-217,2003)中起作用'血管活性腸肽(VIP)是具有28個(gè)氨基酸的肽，其首先分離自豬 的上部小腸(Said和Mutt, Science 169:1217-1218,1970;美國(guó)專利No, 3,879,371 )。此肽屬于包括毒晰皮肽、分泌素、抑生長(zhǎng)素和胰高血糖 素的結(jié)構(gòu)相關(guān)的小的多肽家族。通過(guò)與胞內(nèi)cAMP信號(hào)系統(tǒng)偶聯(lián)的膜 結(jié)合受體蛋白的激活調(diào)節(jié)VIP的生物學(xué)功能。這些受體最初被稱為 VIP-R1和VIP-R2，然而，隨后發(fā)現(xiàn)它們是與VPAC1和VPAC2相同 的受體.VIP顯示出與VPAC1和VPAC2類似的活性和效力。為了改善人肺液中VIP的穩(wěn)定性，Bolin等(Biopolymers 37:57-66，1995)制備了一系列VIP變體來(lái)增強(qiáng)這些肽的螺旋傾向和降低蛋白 水解的降解，取代集中在位置8、 12、 17和25-28處，這些已被證明對(duì) 于受體結(jié)合是不重要的，此外，"GGT"序列被標(biāo)記到VIP突變蛋白 的C-末端上，期望其更有效地覆蓋螺旋。最后，為了進(jìn)一步穩(wěn)定螺旋， 合成了一些環(huán)狀的變體(專利US5，677，419)。盡管這些努力沒(méi)有指向 受體的選擇性，但是它們產(chǎn)生了兩個(gè)具有大于100倍的VPAC2選擇性 的類似物(Gourlet等，Peptides 18:403-408,1997; Xia等，J. Pharmacol. Exp.Ther.， 281:629-633,1997).GLP-1是由腸L-細(xì)胞在進(jìn)餐后釋放的并且具有與腸胰烏素激素相 同的功能(即其增強(qiáng)從胰腺P-細(xì)胞釋放葡萄糖-誘導(dǎo)的胰島素)。它是一種37-氨基酸肽，其通過(guò)依賴于組織類型的胰高血糖素基因而差異表 達(dá)。關(guān)于GLP-1的支持增加P-細(xì)胞中cAMP水平的有益作用的臨床資 料已被收集，向缺乏調(diào)控的II型糖尿病患者注入GLP-l來(lái)使他們的空 腹血糖水平正?；?Gutniak等，New Eng. J. Med. 326:1316-1322,1992 )并且通過(guò)持續(xù)的注入來(lái)改善0 -細(xì)胞功能而達(dá)到正常受試者 的水平(Harmar等，Diabetes 45:1524-1530,1996).最近的報(bào)告表明 GLP-1提高了具有削弱的葡萄糖耐量的受試者中p-細(xì)胞對(duì)葡萄糖應(yīng)答 的能力(Byrne等.,Diabetes 47:1259-1265,1998)'然而所有的這些作 用由于肽的短的半衰期而是短暫的.糊精藥物被用Exendin 4TM ( AC2993 )進(jìn)行III期試驗(yàn)，其中的 Exendin 4TM ( AC2993 )是一種最初在毒晰中鑒定的39個(gè)氨基酸的肽. 臨床研究報(bào)道證明糊精提高了用Exendin 4"^治療的II型糖尿病患者 中的改善的糖血控制.然而，惡心和嘔吐的發(fā)生是顯著的。申請(qǐng)人在WO 01/23420中公開(kāi)了在體內(nèi)具有VPAC2受體激動(dòng)劑作 用的新的多肽，WO 01/23420的說(shuō)明書在此處被整體引入，并且尤其 是，申請(qǐng)人公開(kāi)了一種確定為R3P66的VPAC2激動(dòng)劑。然而其中描 述的多肽，包括R3P66,并非合適的商用候選物，因?yàn)槠湟l(fā)的與制 劑中的多肽有關(guān)的穩(wěn)定性問(wèn)題以及與多肽的短半衰期有關(guān)的問(wèn)題。人們需要一種具有PACAP、GLP-1或Exendin 4TM的依賴于葡萄 糖的胰烏素促分泌活性，但具有較少的副作用，并且優(yōu)選地在制劑中 是穩(wěn)定的并具有長(zhǎng)的血漿半衰期的改進(jìn)的肽。此外，嚴(yán)格控制血漿的 葡萄糖水平可防止長(zhǎng)期糖尿病患者的并發(fā)癥。因此，新的糖尿病藥物 應(yīng)該為患者提供改進(jìn)的生活質(zhì)量。發(fā)明概迷本發(fā)明提供了新的多肽，其在體內(nèi)具有VPAC2受體(下文稱 VPAC2 )激動(dòng)劑的作用并且在可通過(guò)具有VPAC2激動(dòng)劑活性的藥物來(lái) 改善疾病和病癥的治療中是有效的，優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是選擇性 的VPAC2激動(dòng)劑，具有比VPAC1和PAC1更大的VPAC2效力。例 如，然而并非作為對(duì)其的限制，這些多肽刺激胰島素合成和胰腺P-細(xì) 胞以葡萄糖依賴性的方式進(jìn)行的釋放以及隨后的血漿葡萄糖減少，這 些促分泌的多肽被顯示降低體內(nèi)血糖超過(guò)當(dāng)葡萄糖攻擊時(shí)的栽體對(duì)照。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在制劑中是穩(wěn)定的，并且具有長(zhǎng)的血漿 半衰期以及當(dāng)釋放時(shí)在體內(nèi)持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的作用.本發(fā)明的多肽對(duì)于具有例如代謝失調(diào)，諸如那些因降低的內(nèi)源胰 島素分泌而產(chǎn)生的，尤其是II型糖尿病的患者，或?qū)τ诰哂邢魅醯钠?萄糖耐量-具有輕度胰島素分泌改變的前糖尿病狀態(tài)的患者，提供了一 種新的治療方案.此外，本發(fā)明的多肽可用于預(yù)防和/或治療I型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成熟期發(fā)病型糖尿病(MODY)、成人隱 匿性自身免疫糖尿病(LADA)以及相關(guān)聯(lián)的糖尿病血脂紊亂及其它糖 尿病并發(fā)癥，以及高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡菊糖耐量、削弱 的空腹血糖、血脂紊亂、高甘油三酯血癥、綜合癥X和胰烏素抗性.本發(fā)明的多肽也可被用于預(yù)防和/或治療肥胖癥(例如，食欲和食 物攝入的調(diào)節(jié))、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、高脂質(zhì)血、高膽固醇血癥、低 HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、冠狀 動(dòng)脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾??；以及用于預(yù)防和/或 治療狼瘡、多囊印巢綜合癥、致癌作用和細(xì)胞增生、哮喘、男性生殖 問(wèn)題、潰瘍、睡眠障礙、脂類和碳水化合物代謝的紊亂、生理節(jié)奏的 機(jī)能障礙、生長(zhǎng)障礙、能量穩(wěn)態(tài)平衡的紊亂、免疫疾病包括自身免疫 疾病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡)，以及急性和慢性炎癥性疾病、膿毒 性休克及其它此處確定的病癥，或其它在下面描述的功能。具體地，本發(fā)明的一個(gè)方面為多肽，其選自SEQIDNOs:l至152， 以及其顯示至少一種生物學(xué)功能與列舉的SEQ ID NOs基本上相同的 片段、衍生物和變體(總稱，"本發(fā)明的多肽")，包括其功能等價(jià) 物。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案為一種多肽，其選自SEQIDNOs:l 至38和SEQ ID NOs:115至152，以及其顯示出至少一種生物學(xué)功能與 列舉的SEQIDNOs基本上相同的片段、衍生物和變體。本發(fā)明的一個(gè) 更優(yōu)選的實(shí)施方案為選自SEQ ID NOs:l至5和SEQ ID NOs:115至 119，以及其顯示出至少一種生物學(xué)功能與列舉的SEQIDNOs基本上 相同的片段、衍生物和變體的多肽.本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方 案為選自SEQIDNOs:l、 2、 115和116以及顯示出至少一種生物學(xué)功 能與列舉的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和變體的組的多 肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為一種編碼本發(fā)明的多肽、重組表達(dá)本發(fā)明多肽所必需的栽體和宿主細(xì)胞.這些多核苷酸序列包括SEQ ID NOs: 154-264。本發(fā)明也提供了那些選擇性地結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體和抗體片 段.這些抗體在本發(fā)明多肽的檢測(cè)中是有用的，并且可通過(guò)本領(lǐng)域公 知的方法來(lái)鑒定和制備。 一種多克隆的N-末端IgG抗體和一種單克隆 的C-末端Fab抗體已被制備，其識(shí)別本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療哺乳動(dòng)物中的糖尿病、與糖尿病-相關(guān)的紊亂疾病和/或其它受本發(fā)明的多肽影響，優(yōu)選地受本發(fā)明多肽 的VPAC2激動(dòng)劑功能作用的疾病或病癥的方法，包括將治療有效量的 任意的本發(fā)明的多肽或在VPAC2諸如SEQ ID NOs:l至152處具有活 性的任意多肽給藥所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明也公開(kāi)了制備本發(fā)明的多肽，包括重組的和合成的多肽的 方法。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖la-Id描述了 SEQIDNOs:l至152的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NOs:115-152為通過(guò)順丁烯二酰亞胺鍵在C-末端半胱氨酸處加入了 聚乙二醇的肽.PEG可以是22 kD的線性PEG或43 kD的分支PEG,圖2描述了克隆到pGEX-6P-l中產(chǎn)生SEQ IDNO:l氨基酸序列的 DNA序列(SEQ ID NO:153).加下劃線的限制性酶位點(diǎn)BamHI和 Xhol允許框內(nèi)克隆到pGEX-6P-l表達(dá)栽體中。編碼FactorXa識(shí)別位 點(diǎn)的12merDNA序列和兩個(gè)終止密碼子被用粗體突出標(biāo)注。中間的非 突出標(biāo)注的序列編碼SEQIDNO:l (氨基酸序列)，來(lái)自VIP的突變密碼子用小寫核苷酸表述.圖3a-3h描述了核酸序列SEQ ID NOs:154至264。這些核酸序列編碼本發(fā)明的多肽.圖4是說(shuō)明分散的大鼠胰烏細(xì)胞在暴露于本發(fā)明的聚乙二醇化的 肽之后胰烏素分泌的直方困.圖5是顯示通過(guò)皮下給藥途徑給藥本發(fā)明的聚乙二醇化的肽的大 鼠的增強(qiáng)的葡萄糖處理的直方圖.圖6描述了三種VPAC2類似物(P5、P7和對(duì)照R3P66 )在1 mg/mL 含有150mMNaCl和加mM磷酸鹽的水溶液中在pH8.0， 4010溫育過(guò)程中的穩(wěn)定性傾向。通過(guò)毛細(xì)管電泳分析來(lái)測(cè)定樣品中肽的純度.用最初的百分比純度校正在2-和4-周時(shí)間點(diǎn)時(shí)的純度.圖7描述了三種VPAC2類似物(P7、P8和對(duì)照R3P66 )在2 mg/mL 二甲基亞砜(DMSO)于40TC溫育過(guò)程中的穩(wěn)定性傾向。通過(guò)毛細(xì)管 電泳分析測(cè)定樣品中肽的純度.通過(guò)最初的百分比純度校正在2-和4-周時(shí)間點(diǎn)時(shí)的純度。圖8說(shuō)明了全長(zhǎng)的聚乙二醇化的肽對(duì)在N-末端具有單個(gè)氨基酸缺 失的類似的聚乙二醇化的肽的選擇性識(shí)別.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的多肽，及其與附圖la-ID (總稱為本發(fā)明的多 肽)的多肽顯示出具有至少一個(gè)基本上相同的生物學(xué)功能的片段、衍 生物和變體。本發(fā)明的多肽在體內(nèi)起VPAC2激動(dòng)劑的作用或在這些疾 病或病癥如糖尿病包括I型和II型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成 熟期發(fā)病型成人糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 ); 成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA ) ( Zim邁et等，Diabetes Med.lh299，1994);以及相關(guān)聯(lián)的糖尿病血脂紊亂及其它糖尿病并發(fā) 癥，以及高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹血 糖、血脂紊亂、高甘油三酯血癥、綜合癥X和胰島素抗性的預(yù)防和/或 治療中起作用。此外，本發(fā)明的多肽也可用于預(yù)防和/或治療肥胖癥(例如食欲和 食物攝入的調(diào)節(jié))、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、高脂質(zhì)血、高膽固醇血癥、 低HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、冠 狀動(dòng)脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾?。灰约坝糜陬A(yù)防和/ 或治療狼瘡、多囊卵巢綜合癥、致癌作用和超常增生、哞喘、男性生 殖問(wèn)題包括人精子活力、潰瘍、睡眠障礙及其它此處確定的病癥，或 具有其它在下文描述的功能.優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽以葡萄糖-依賴性的方式刺激胰腺P -細(xì)胞的 胰烏素釋放。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽在含水的和無(wú)水的兩種制劑中 是穩(wěn)定的并且具有大于一個(gè)小時(shí)的血漿半衰期.本發(fā)明的多肽為VPAC2激動(dòng)劑。優(yōu)選地，它們是選擇性的VPAC2 激動(dòng)劑，相對(duì)于VPAC1和/或PAC1對(duì)VPAC2具有至少10倍的選擇性'更優(yōu)選地，它們是相對(duì)于VPAC1和/或PAC1對(duì)VPAC2具有至少 100倍的選擇性的選擇性VPAC2激動(dòng)劑。最優(yōu)選地，它們以葡萄糖-依賴性的方式刺激胰島素釋放到血漿中，而不誘導(dǎo)對(duì)例如II型糖尿病 的治療起相反作用的血漿葡萄糖水平的郁積或增加，另外，本發(fā)明多 肽優(yōu)選地是VPAC2受體的選擇性激動(dòng)劑，由此當(dāng)選擇性地抵抗其它產(chǎn) 生不愉快或危險(xiǎn)的副作用如胃腸道水分保留和/或有害的心血管作用諸 如增加心率的受體時(shí)，導(dǎo)致例如釋放到血漿中的胰島素的增加.本發(fā)明的多肽在含水和無(wú)水的制劑中也是穩(wěn)定的.優(yōu)選地，本發(fā) 明的多肽當(dāng)溶于水(pH值在7-8之間)或無(wú)水的有機(jī)溶劑時(shí)，于37-40 x:在一周的時(shí)間內(nèi)具有小于10%的降解。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽當(dāng) 溶于水(pH值在7-8之間)或無(wú)水的有機(jī)溶劑時(shí)，在37-40"C—周的時(shí) 間內(nèi)具有小于5%的降解.此外，本發(fā)明的組合物和制劑可包括本年明 的多肽和大約2%到大約30%的DMSO。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案 中，組合物和制劑可選擇性地包括大約0.2%到大約3% ( w/v)的其它 溶劑諸如丙二醇、二甲基甲跣胺、碳酸亞丙基酯、聚乙二醇和甘油三 酯。最后，優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生化多肽在靜脈注射后的大鼠中具有至少一個(gè)小時(shí)的血漿半衰期；更優(yōu)選的，血漿半衰期為至少兩個(gè)小時(shí)，并且進(jìn)一步優(yōu)選地，血漿半衰期為至少3個(gè)小時(shí)。本發(fā)明的多肽為具有降低的內(nèi)源胰島素分泌或削弱的葡萄糖耐量，尤其是n型糖尿病的患者提供了一種新的治療方案.也就是說(shuō)，本發(fā)明的多肽是長(zhǎng)效的VPAC2激動(dòng)劑，可被用于維持、提高和修復(fù)葡 萄糖-刺激的胰島素分泌。此外， 一種VPAC2受體的選擇性肽激動(dòng)劑 能增強(qiáng)胰腺中的葡萄糖-依賴性胰島素分泌，而不引起與另一 PACAP 受體的非選擇性激活有關(guān)的副作用。現(xiàn)在定義本說(shuō)明書中的特定的術(shù)語(yǔ)，并且其它的將被定義為如同 所引用的.特定氨基酸的單字母縮寫、其相應(yīng)的氨基酸以及三字母縮 寫如下A，丙氨酸(ala); C，半胱氨酸(cys); D，天冬氨酸(asp); E，谷氨酸(glu) ; F，苯丙氨酸(phe) ; G，甘氨酸(gly) ; H，組 氨酸(his ) ; I，異亮氨酸(ile ) ; K，賴氨酸(lys ) ; L，亮氨酸(leu ); M，甲硫氨酸(met) ; N,天冬酰胺(asn) ; P，脯氨酸(pro) ; Q 谷氨酰胺(gin) ; R，精氨酸(arg) ; S，絲氨酸(ser) ; T，蘇氨酸(thr ) ; V，纈氨酸(val) ; W，色氨酸(trp ) ; Y，酪氨酸(tyr)。 術(shù)語(yǔ)"編碼多肽的多核苷酸"包括其僅僅包含多肽的編碼序列的 多核苷酸，以及其包括其它的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及了與上文所述的序列雜交的多核苷酸，這些序列之間具 有至少大約70%，優(yōu)選至少具有大約卯°/。，并且更優(yōu)選地至少具有大 約95%的同一性。本發(fā)明尤其涉及了在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜 交的編碼多肽的多核苷酸.此處所用的"嚴(yán)格條件"是指"嚴(yán)格的雜 交條件"。優(yōu)選地，雜交僅在至少具有大約90%,并且優(yōu)選地具有大 約95%至97。/。同一性的序列之間發(fā)生'在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與 上述所述的多核香酸雜交的多核苷酸編碼基本上保留與cDNAs編碼的 成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。"功能性等價(jià)物，'與"基本上相同的生物學(xué)功能或活性"各自是 指生物活性的程度在大約30%到大約100%以內(nèi)，或該多肽顯示的生物 活性當(dāng)與通過(guò)相同方法測(cè)定的各多肽的生物活性比較時(shí)更多.例如，

圖1多肽的功能性等價(jià)物當(dāng)通過(guò)實(shí)施例7的環(huán)化AMP (cAMP)閃爍 親近檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其在表達(dá)人VPAC2受體的CHO細(xì)胞系中顯示 出cAMP的累積.本發(fā)明的多肽也即VPAC2激動(dòng)劑是一種當(dāng)在實(shí)施例7的方案中測(cè) 定時(shí)顯示出30%到大約100%或更多的最大PACAP-27 VPAC2激動(dòng)劑 活性的多肽'本發(fā)明優(yōu)選的多肽，即相對(duì)于PACAP、 VPAC1和PAC1 受體的VPAC2的選擇性激動(dòng)劑為那些多肽，其顯示VPAC2激動(dòng)劑活 性與VPAC1活性的比率為大約10:1或更大，并且更優(yōu)選地，大約100:1 或更大，和/或顯示出VPAC2激動(dòng)劑活性與PAC1受體活性的比率為 大約10:1或更大，并且更優(yōu)選地，當(dāng)在實(shí)施例7的方案中利用表達(dá)合 適的受體的細(xì)胞測(cè)定該多肽時(shí)該比率為大約100:1或更大。"嚴(yán)格的雜交條件"是指兩個(gè)多核苷酸(或片段)在42TC在溶液 中過(guò)夜溫育雜交，該溶液包括50%甲酰胺、5xSSC (750mMNaCl， 75 mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6) 、 5x Denhardt溶液、10% 葡聚糖硫酸酯、和20 fig/mL變性的、剪切的鮭精DNA，然后在大約 65TC在O.lxSSC中洗滌過(guò)濾器.術(shù)語(yǔ)"片段"，"衍生物"和"變體"，當(dāng)涉及圖1的多肽時(shí)， 是指維持與這些多肽基本上相同生物學(xué)功能或活性的多肽的片段、衍生物和變體，如下所述.類似物包括含有本發(fā)明多肽的氨基酸序列在內(nèi)的前-多肽。本發(fā)明 的活性多肽可通過(guò)天然的、體內(nèi)作用或通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法諸如通 過(guò)酶切或化學(xué)裂解技術(shù)裂解自完全的前多肽分子的其它氨基酸.例如，28-氨基酸的天然肽VIP被天然表達(dá)為大量較大的多肽，其然后被 體內(nèi)加工來(lái)釋放28-氨基酸的活性的成熟肽。片段是多肽的一部分，其保留基本上類似的功能性活性，如此處 公開(kāi)的體內(nèi)模型所述的.衍生物包括所有對(duì)多肽的修飾，其基本上保持此處公開(kāi)的功能并 且包含其它的結(jié)構(gòu)和伴隨的功能(例如，具有較大半衰期的聚乙二醇 化多肽)，賦予了靶特異性或其它的活性諸如對(duì)預(yù)定目標(biāo)的毒性的融 合多肽，如下文所述。本發(fā)明的多肽可以是重組的多肽、天然純化的多肽或合成的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或變體可以是(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨 基酸殘基被保守的或非-保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選地為保守的氨基 酸殘基)，并且此取代的氨基酸殘基可以是或可以不是通過(guò)遣傳密碼 編碼的氨基酸殘基，或(ii)其中氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)包括取代基 的，或(m)其中成熟多肽與另一個(gè)化合物，諸如一種增加多肽半衰期 的化合物(例如，聚乙二醇)熔合的，或(iv) —種其中其它的氨基酸 被融合到成熟多肽上的，諸如前導(dǎo)或分泌的序列或被用于成熟多肽的 純化的序列或前多肽序列，或(v) —種其多肽序列與較大的多肽熔合 的(例如，人白蛋白、抗體或Fc，用于增加作用持續(xù)時(shí)間)。本領(lǐng)域 的技術(shù)人員從此處的教導(dǎo)可以理解這些片段、衍生物和變體以及類似 物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生物將在一或多個(gè)推定的，優(yōu)選非必需氨基 酸殘基處含有保守的氨基酸取代(在下面定義的)。"非必需氨基酸，， 殘基是一種可改變自蛋白質(zhì)的野生型序列而沒(méi)有改變生物活性的殘 基，而"必需"氨基酸殘基是生物活性所需要的."保守的氨基酸取 代"是指其中氨基酸殘基被用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換.具有 類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在現(xiàn)有技術(shù)中已被定義，本家族包括具 有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬醜胺、 谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性的側(cè)鏈(例 如，丙氨酸、翔氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫 氨酸色氨酸)、P-分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、翔氨酸、異亮氨酸) 以及芳香族側(cè)鏈(例如，輅氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨 基酸，非-保守取代不能用于保守的氨基酸殘基或用于保守的蛋白功能區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，諸如殘基19和27，其中這些殘基是蛋白質(zhì)活性諸 如VPAC2活性和/或VPAC2選擇性所必不可少的.片段或生物學(xué)活性 部分包括適于用作藥物來(lái)產(chǎn)生抗體，以及用作研究試劑等的多肽片 段。片段包括含有充分類似于或來(lái)源于本發(fā)明多肽氳基酸序列的氨基 酸序列并且具有那些多肽的至少一種活性，但其包含比此處公開(kāi)的全 長(zhǎng)多肽更少的氨基酸的肽.典型地，生物學(xué)活性部分包括具有多肽的 至少一種活性的功能區(qū)或基序。多肽的生物學(xué)活性部分可以是例如五 個(gè)或更多氨基酸長(zhǎng)的肽。這些生物學(xué)活性部分可以合成或通過(guò)重組技 術(shù)來(lái)制備，并且可以通過(guò)此處公開(kāi)的和/或本領(lǐng)域公知的方法來(lái)評(píng)價(jià)本 發(fā)明多肽的一或多種功能性活性.此外，本發(fā)明優(yōu)選的衍生物包含已經(jīng)與另一個(gè)化合物熔合的成熟 多肽，諸如一種增加多肽半衰期和/或減少多肽的潛在免疫原性的化合 物(例如，聚乙二醇，"PEG")。就聚乙二醇化而言，可通過(guò)本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的任意方法來(lái)進(jìn)行多肽與PEG的融合.例如，聚乙二 醇化可通過(guò)首先引入一個(gè)半胱氨酸突變到多肽中來(lái)提供一個(gè)接頭來(lái)連 接PEG，然后與PEG-馬來(lái)酰亞胺進(jìn)行位點(diǎn)特異性的衍生作用。半胱氨 酸可被添加到肽的C-末端，并且其中C-末端是本發(fā)明中優(yōu)選的位點(diǎn)。 (參見(jiàn)，例如，Tsutsumi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15 ):8548-53，2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417,2001; Goodsoon &Katre， Bio/Technology 8:343-346,1990),本發(fā)明多肽的變體包括具 有充分類似于圖1中SEQ ID NOs氨基酸序列的氨基酸序列的多肽或其 功能區(qū)。術(shù)語(yǔ)"充分地相似"是指第一氨基酸序列相對(duì)于第二氨基酸 序列含有足夠的或最小數(shù)目的相同或等價(jià)的氨基酸殘基，使得第一和 第二氨基酸序列具有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如， 含有至少大約45%,優(yōu)選大約75%至98%同一性的共同結(jié)構(gòu)域的氨基 酸序列在此處被定義為充分地相似。優(yōu)選地，變體應(yīng)充分類似于本發(fā)明的優(yōu)選多肽的氨基酸序列。變體包括由與本發(fā)明的多核苷酸雜交或 其在嚴(yán)格條件下互補(bǔ)的多核苷酸編碼的多肽的變體。這些變體通常保 持本發(fā)明多肽的功能活性。多核苷酸片段的文庫(kù)可用于產(chǎn)生用于篩選 和隨后選擇的多樣化群體。例如，片段的文庫(kù)可通過(guò)在其中每一分子僅僅發(fā)生大約一次切口的條件下用核酸酶處理多核苷酸的雙鏈PCR片 段，退火雙鏈DNA,復(fù)性DNA來(lái)從不同的切口產(chǎn)物形成包括正義/反 義對(duì)的雙鏈DNA，通過(guò)用Sl核酸酶處理除去重組雙鏈體的單鏈部分， 以及將產(chǎn)生的片段文庫(kù)連接到表達(dá)栽體中而產(chǎn)生。通過(guò)此方法，可以 荻得編碼本發(fā)明多肽的N-末端以及不同大小的內(nèi)部片段.變體包括由于突變而導(dǎo)致的氨基酸序列不同的多肽.用作VPAC2 激動(dòng)劑的變體可通過(guò)篩選突變體的組合文庫(kù)而被鑒定，例如用于 VPAC2激動(dòng)劑活性的本發(fā)明多肽的平截突變體.在一個(gè)實(shí)施方案中，類似物的多樣化文庫(kù)通過(guò)在核酸水平上組合 的突變來(lái)產(chǎn)生并且被多樣化的基因文庫(kù)所編碼。變體的多樣化文庫(kù)可 通過(guò)，例如將合成的寡核苷酸的混合物酶促連接到基因序列中，使得 潛在變體氨基酸序列的簡(jiǎn)并組被表達(dá)為單獨(dú)的多肽，或可選擇地，被 表達(dá)為其中含有該序列組的更大的融合蛋白組(例如，用于噬菌體展 示)，有許多方法可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生可能變體的文庫(kù)。 可在DNA自動(dòng)合成儀中進(jìn)行簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成，并且然后將合 成基因連接到合適的表達(dá)載體中?；蚝?jiǎn)并組的使用使得有可能在一 種混合物中提供編碼可能的變體序列的目的組的所有序列，合成筒并 寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如，Narang， Tetrahedron 39:3,1983j Itakura，等，Aimu. Rev, Biochem. 53:323,1984; Itakura 等，Science 198:1056,1984; Ike等，Nucleic Acid Res. 11:477,1983 ),篩選組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物的一些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，其中組合 文庫(kù)是通過(guò)點(diǎn)突變或平截產(chǎn)生的并且用于篩選具有選擇特性的基因產(chǎn) 物cDNA文庫(kù)。這些技術(shù)適用于通過(guò)R-激動(dòng)劑多肽的組合突變來(lái)對(duì)產(chǎn) 生的基因文庫(kù)進(jìn)行快速篩選.最廣泛使用的技術(shù)，其用于篩選大基因 文庫(kù)的高通量分析典型地包括克隆基因文庫(kù)到可復(fù)制的表達(dá)載體中， 用產(chǎn)生的栽體的文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在檢測(cè)目的活性促進(jìn)編碼其產(chǎn) 物被檢測(cè)的基因栽體分離的條件下表達(dá)組合基因.遞推集團(tuán)突變形成 (REM)， 一種增強(qiáng)文庫(kù)中功能性突變頻率的技術(shù)，可用于與篩選試驗(yàn)組合來(lái)鑒定目的變體。本發(fā)明也提供了嵌合的或融合的多肽。設(shè)計(jì)目的序列來(lái)用于定位 傳遞多肽到胰腺來(lái)使可能的副作用最小化。本發(fā)明的多肽可由彼此通 過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵連接的氨基酸組成(即，肽的電子等排物)，并且可含有除了 20個(gè)基因-編碼的氨基酸之外的氨基酸。多肽可通過(guò)自然 過(guò)程，諸如轉(zhuǎn)譯后的作用，或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)被修 飾，這些修飾被廣泛描述在基本的教科書中和更具體的專著中，以及 在長(zhǎng)篇的研究文獻(xiàn)中.修飾可發(fā)生在多肽的任意位置，包括肽主鏈、 氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端.可以理解相同類型的修飾可以相同或 不同的程度存在于給定的多肽的一些位點(diǎn)處。同樣地，給定的多肽可 含有很多類型的修飾.多肽可以是分支的，例如，作為遍在蛋白化的 結(jié)果，并且它們可以是環(huán)狀的，有或者沒(méi)有分支。環(huán)狀的、分支的和 分支環(huán)狀的多肽可產(chǎn)生于轉(zhuǎn)譯后的自然過(guò)程或通過(guò)合成方法來(lái)產(chǎn)生。 修飾包括乙酰化、?；饔谩DP-核糖基化、醜胺化、核黃素的共價(jià) 連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、 脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化 作用、二疏鍵形成、脫甲基作用、共價(jià)交連的形成、半胱氨酸的形成、 焦谷氨酸的形成、曱?；饔?、Y-羧基化、糖基化作用、GPI錨形成、 羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、十四碳?；?、氧化、聚乙醇化、 蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒酰化、酸酯化 作用、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸添加到蛋白質(zhì)上，諸如精氨?；?、以及 遍在蛋白4匕(參見(jiàn)，例如，Proteins ， Structure and Molecular Properties. 第二版，T. E. Creighton， W, H. Freeman and Company, 紐約(1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins. B.C.Johnson, ed"學(xué)院出版社，紐約，pgs.1-12 ( 1983 ) ; Seifter，等.， Meth. Enzymol 182:626-646,1990; Rattan等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 663:48-62,1992).本發(fā)明的多肽包括圖1的多肽(SEQ ID NOs:l至152 )，以及那 些在序列上具有非實(shí)質(zhì)變化的序列."非實(shí)質(zhì)性變4匕"包括實(shí)質(zhì)上保持本發(fā)明多肽的至少一個(gè)生物學(xué)功能的任意的序列添加、取代或缺失 的變體，優(yōu)選的生物學(xué)功能為VPAC2激動(dòng)劑活性，并且更優(yōu)選地為選 擇性的VPAC2激動(dòng)劑活性，并且最優(yōu)選地，為在此處顯示的胰島素分泌活性。這些功能性等價(jià)物可優(yōu)選地包括與圖1的多肽具有至少大約90%同一性的多肽，并且更優(yōu)選地至少與圖1的多肽具有95%同一性， 并且更優(yōu)選地與閨1的多肽具有至少97%的同一性，也包括這些具有 大體上相同生物活性的多肽。然而，在此處進(jìn)一步描述的來(lái)自圖1多 肽在氨基酸序列中具有非實(shí)質(zhì)性變化的顯示出功能性等價(jià)的任意多肽 被包含在本發(fā)明的描述中。本領(lǐng)域公知的兩個(gè)多肽之間的"相似性"被通過(guò)氨基酸序列及其 多肽的保守氨基酸取代物與第二多肽的序列之間的比較來(lái)測(cè)定，這些 保守的取代包括如上所述的和Dayhoff所描述的(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，1978 ),和Argos所述的(EMBO J. 8:779-785,1989),例如，屬于下組之一的氨基酸表示保守的變化-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸；-半胱氨酸、絲氨酸、輅氨酸、蘇氨酸；-翔氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；-賴氨酸、精氨酸、組氨酸；-苯丙氨酸、輅氨酸、色氨酸、組氨酸；和-天冬氨酸、谷氨酸。本發(fā)明同樣涉及編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸以及包含這些多核苷 酸的栽體、用本發(fā)明栽體遺傳改造的宿主細(xì)胞，以及通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn) 生本發(fā)明多肽的方法?？捎帽景l(fā)明的栽體進(jìn)行遣傳改造對(duì)宿主細(xì)胞(傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn) 染)，其中栽體可以是例如克隆栽體或表達(dá)栽體.栽體可以是，例如 質(zhì)粒、病毒粒子、噬菌體的形式等。工程改造的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)在被 改變成適于激活啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化體的常規(guī)培養(yǎng)基中.培養(yǎng)條件，諸 如溫度、pH值等，為以前選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所使用的，并且對(duì) 于普通的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的多核苷酸可用于通過(guò)重組 技術(shù)來(lái)產(chǎn)生多肽.因此，例如，多核苷酸序列可包含在各種任意的表 達(dá)栽體中，尤其是用于表達(dá)多肽的栽體或質(zhì)粒中.這些栽體包括染色 體的、非染色體的以及合成的DNA序列(例如，SV40的衍生物)； 細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA;酵母質(zhì)粒；獲自質(zhì)粒和噬菌體的DNA組合 的栽體；病毒DNA諸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及偽狂犬病病毒。 然而，任意其它的栽體或質(zhì)粒可被使用，只要它們?cè)谒拗髦惺强蓮?fù)制的和有活力的。可通過(guò)各種方法將合適的DNA序列插入到載體中。通常，通過(guò)本 領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。 認(rèn)為這些以及其它的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。表達(dá)栽體 中的DNA序列可操作地連接于合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)來(lái)直接 合成mRNA。這些啟動(dòng)子的典型實(shí)例包括但不限于，LTR或SV40啟 動(dòng)子、大腸桿菌lae或trp、噬菌體X PL啟動(dòng)子，及其它已知調(diào)控基 因在原核或真核細(xì)胞或他們的病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)栽體也可含 有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子.栽體也可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列.此外，表達(dá)栽體優(yōu)選地含有一種基因來(lái)提供 用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特性，諸如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或諸如在大腸桿菌中的四環(huán)素或氨節(jié)音霉 素抗性。含有在此處描述的合適DNA序列，以及合適啟動(dòng)子或調(diào)控序 列的載體可被利用來(lái)轉(zhuǎn)化合適的宿主來(lái)允許宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。合適宿 主的典型實(shí)例包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏 菌、鏈霉菌屬；真菌細(xì)胞，諸如酵母；昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2和 Spodoptera Sf9;動(dòng)物細(xì)胞諸如CHO、 COS或Bowes黑色素瘤；腺病 毒；植物細(xì)胞等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從此處的教導(dǎo)可以理解如何進(jìn)行 合適宿主的選擇。本發(fā)明也包括含有一個(gè)或多個(gè)如上所述的序列的重組構(gòu)建體.構(gòu) 建體包括一個(gè)栽體，諸如質(zhì)?；虿《驹泽w，其中以正向或反向插入了 本發(fā)明的序列，在這些實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選的方面，構(gòu)建體進(jìn)一步含 有調(diào)節(jié)序列，包括，例如與該序列可操作地相連的啟動(dòng)子.大量的合 適的栽體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知的，并且是市售 的。下面的栽體以實(shí)例的方式來(lái)提供'細(xì)菌pQE70、 pQE卯、pQE-9、 pBS、 phagescript、 psiX174、 pBluescript SK、 pBsKS、 pNH8a、 pNH16a、 pNH18a、 pNH46a、 pTRC99A、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540 和PRIT5。真核生物的pWLneo、 pSV2cat、 pOG44、 pXTl、 pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG和PSVL。然而，任意其它的栽體或栽體可被使用，只 要它們?cè)谒拗髦惺强蓮?fù)制和有活力的.啟動(dòng)子區(qū)域可選自任意的使用 CAT (氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它具有選擇性標(biāo)記的栽體的目的基因。 兩個(gè)合適的栽體為pkk232-8和pCM7,特定命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lad、 lacZ、 T3、 T7、 gpt、入PR、 PL和trp.真核細(xì)胞的啟動(dòng)子包括 CMV的立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、來(lái)自逆病毒的 LTRs和老鼠金屬硫蛋白-I。對(duì)合適栽體和啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員可理解的范圍內(nèi)。本發(fā)明也涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等 的真核細(xì)胞，諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或低等的真核細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞， 或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞。將構(gòu)建體導(dǎo)入到宿主細(xì) 胞中可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔法(Davis 等，Basic Methods in Molecular Biology, 1986)來(lái)進(jìn)行。宿主細(xì)胞中 的構(gòu)建體可通過(guò)常規(guī)的方式用于產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?？蛇x擇地，本發(fā)明的多肽可以通過(guò)常規(guī)的肽合成儀來(lái)合成制備，成熟的蛋白可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中合適啟 動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。也可以使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)利用獲自本發(fā)明DNA 構(gòu)建體的RNAs來(lái)產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)，用于原核生物和真核生物宿主的 合適克隆和表達(dá)栽體被Sambrook等描迷于Molecular Cloning:實(shí)驗(yàn)室 指南，第二版，(Cold Spring Harbor, N.Y， 1989)，其內(nèi)容通過(guò)引 用在此作為參考.由更高等的真核生物編碼本發(fā)明多肽的DNA轉(zhuǎn)錄被通過(guò)插入一個(gè) 增強(qiáng)子到序列中而增強(qiáng)。增強(qiáng)子為DNA的順式作用元件，通常為從大 約10到大約300bp，其作用于啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。實(shí)例包括在復(fù)制 起點(diǎn)的晚期一側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp 100到270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng) 子.通常，重組表達(dá)栽體包括允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的復(fù)制起點(diǎn)以及選擇 性標(biāo)記(例如，大腸桿菌的氨爺青霉素抗性基因或畔酒八疊球菌 (S.cerevisiae) TRP1基因)，以及指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的獲自高度 表達(dá)基因的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可獲自編碼糖酵解酶諸如3磷酸甘油 酸激酶(PGK) 、 a因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白等的操縱子，異源的 結(jié)構(gòu)序列在合適的階段被裝配了翻譯、起始和終止序列，以及優(yōu)選地， 裝配了能夠指導(dǎo)分泌翻譯的蛋白到周質(zhì)間隙或胞外介質(zhì)中的前導(dǎo)序 列。選擇性地，異源序列可編碼包括賦予目的特性(例如，表達(dá)的重 組產(chǎn)物的穩(wěn)定化或簡(jiǎn)單化的純化)的N-末端鑒定肽的融合蛋白。用于細(xì)菌的有益表達(dá)栽體可以通過(guò)插入一個(gè)編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列以及在可操作的閱讀階段插入合適的翻譯、起始以及終止信 號(hào)與功能性的啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建。栽體可包括一個(gè)或多個(gè)表型的選擇性標(biāo) 記以及一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)來(lái)確保栽體的維持以及如果希望，在宿主內(nèi)提供 擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的合適的原核生物宿主包括，例如大腸桿菌、枯草芽 胞桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中 的不同的種，盡管其它的也可被使用作為一種選擇，用于細(xì)菌的有益 表達(dá)栽體可包括獲自含有眾所周知的克隆栽體pBR322 (ATCC 37017)的遺傳元件的市售質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn).這些商 用栽體包括例如，pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden和GEM1 (Promega， Madison, Wis" USA)。這些pBR322 "主鏈"部分可與合適的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合而被表達(dá)，在合適的宿主菌林的轉(zhuǎn)化和宿主菌林生長(zhǎng)到合適的細(xì)胞密度后， 將選擇的啟動(dòng)子通過(guò)適當(dāng)手段去阻遏(例如，溫度變化或化學(xué)誘導(dǎo)) 并且將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。典型地通過(guò)離心收集細(xì)胞，通過(guò)物理 的或化學(xué)的方法裂解，并且保留產(chǎn)生的粗提物用于進(jìn)一步的純化。用 于蛋白質(zhì)表達(dá)的微生物細(xì)胞可通過(guò)任意方便的方法來(lái)破壞，包括凍融 循環(huán)、超聲波處理、機(jī)械破壞或使用細(xì)胞裂解試劑。不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)重組蛋白質(zhì).哺乳動(dòng) 物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括猴腎臟成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系，描述于 Gluzman， Cell 23:175,1981 )，及其它能夠表達(dá)相容性栽體的細(xì)胞系， 例如，C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體 可以包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、 一個(gè)合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任意必需 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終 止序列和5，側(cè)接非轉(zhuǎn)錄序列。獲自SV40病毒基因組的DNA序列，例 如SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、接頭和聚腺苷酸化位點(diǎn)可被用來(lái) 提供需要的非轉(zhuǎn)錄遣傳元件.本發(fā)明的多肽可被回收并通過(guò)目前使用的方法從重組的細(xì)胞培養(yǎng) 物中純化，包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取、陰離子或陽(yáng)離子交換 層析、磷酸纖維素色譜層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石 層析和凝集素色謙層析?？筛鶕?jù)需要在完成成熟蛋白的構(gòu)型中使用蛋 白質(zhì)重折疊步驟.最后，可以將高效液相色鐠(HPLC)用于最后的純 化步驟。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或由原核生物或真核 生物宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)通過(guò) 重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。取決于在重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的多 肽可以用哺乳動(dòng)物或其它真核生物的碳水化合物糖基化或可以是非糖 基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括最初的甲硫氨酸氨基酸殘基.本發(fā) 明的分離或純化的多肽或其生物學(xué)活性部分，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí) 大體上不含有其它的細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)大體上不含 有化學(xué)前體或其它化合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離多肽大體上不含有細(xì)胞物質(zhì)并且具有小于大約30% (干重)的非多肽或污染物質(zhì)。當(dāng)本 發(fā)明的多肽或其生物學(xué)活性部分被重組產(chǎn)生時(shí)，優(yōu)選地培養(yǎng)基占多肽 制品的30%以下的體積。當(dāng)本發(fā)明通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選地該制 品含有小于大約30%干重的化合物前體或非發(fā)明的化合物。本發(fā)明的多肽可通過(guò)下面所述的特定的實(shí)施例被很方便地分離。 純化的多肽制品為至少大約70%純；優(yōu)選地，該制品為大約85%至大約99°/。純，本制品的純度可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法進(jìn)行評(píng)估，諸 如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)謙/液相色譜.可以利用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)方法完全地或部分地合成編碼本 發(fā)明多肽的多核苷酸序列(參見(jiàn)，例如，Camthers等，Nucl. Acids Res. Symp, Ser, 215-223，1980; Horn等，Nucl Acids Res. Symp. Ser. 225-232,1980).然后可以將編碼多肽的多核苷酸克隆到表達(dá)栽體中來(lái)表達(dá) 多狀，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的編 碼多肽的核苷酸序列也許是有益的。例如，可選擇特定的原核生物或 真核生物宿主的優(yōu)選的密碼子來(lái)增加多肽表達(dá)的速率或來(lái)產(chǎn)生具有目 的特性的RNA轉(zhuǎn)錄本，諸如比由天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的半衰期更長(zhǎng)的半衰期。由于種種原因，可以利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法對(duì)此處公開(kāi)的核 苷酸序列進(jìn)行改造來(lái)改變多編碼肽的序列，包括但不限于修飾多肽或 mRNA產(chǎn)物的封閉、加工和/或表達(dá)的改變?？赏ㄟ^(guò)隨機(jī)斷裂來(lái)重組 DNA和基因片段以及合成寡核苷酸的PCR重裝配來(lái)改造核苷酸序 列.例如，定點(diǎn)誘變可被用來(lái)插入新的限制性位點(diǎn)，改變糖基化模式， 改變密碼子偏愛(ài)性，產(chǎn)生接頭變體，引入突變等.也提供在本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的范閨內(nèi)的相關(guān)的化合物， 諸如化學(xué)模擬物、有機(jī)模擬物或肽模擬物。此處使用的術(shù)語(yǔ)"模擬物"、"肽模擬物"、"多肽模擬物，'、"有機(jī)模擬物"和"化學(xué)模擬物" 包括肽衍生物、肽類似物以及與本發(fā)明的肽等價(jià)的在三維方向具有原 子排列的化合物。可以理解此處所用的術(shù)語(yǔ)"等價(jià)于，，是指包含在所 述肽中的具有特定原子或化學(xué)部分的取代的化合物，具有鍵長(zhǎng)，鍵角，合物的排列，從而i有本發(fā)明肽的生"學(xué)功A。在本i明二肽模擬物 中，化學(xué)組分的三維排列在結(jié)構(gòu)和/或功能上等價(jià)于肽主鏈和肽的組分 氨基酸側(cè)鏈的三維排列，使得本發(fā)明肽的這些肽模擬物，有機(jī)模擬物 和化學(xué)模擬物具有實(shí)質(zhì)上的生物活性。這些術(shù)語(yǔ)被依照本領(lǐng)域的理解來(lái)使用，例如，F(xiàn)auchere ( Adv, Drug Res. 15:29,1986) ; Veber & Freidinger， (TINS p.392，1985 );和Evans等，(J, Med. Chem. 30:1229,1987)所詳細(xì)闡述的，在此引作參考?？梢岳斫獗景l(fā)明的各種肽存在生物活性的藥效基團(tuán)。在本領(lǐng)域中 藥效基團(tuán)被理解為包括生物活性所需的理想化的，三維的結(jié)構(gòu)定義. 肽模擬物、有機(jī)模擬物和化學(xué)模擬物可被設(shè)計(jì)來(lái)適合各自的藥效基團(tuán) 與當(dāng)前的計(jì)算機(jī)模擬軟件(計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì))。所述模擬物可通 過(guò)結(jié)構(gòu)-功能分析，基于本發(fā)明肽中取代基原子的位置信息來(lái)產(chǎn)生.本發(fā)明提供的肽可通過(guò)本領(lǐng)域任意已知的化學(xué)合成技術(shù)，尤其是 固相合成技術(shù)方便地合成，例如，利用商業(yè)-獲得的自動(dòng)肽合成儀。本 發(fā)明的模擬物可通過(guò)通常用于肽合成的固相或液相方法來(lái)合成。(參 見(jiàn)，例如，Merrifield, J. Amer, Chem. Soc. 85:2149-54,1963; Carpino， Acc. Chem. Res. 6:191-98， 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vols. 1, 2， 3，和5， ( Gross & Meinhofer， eds.)， 學(xué)院出版社紐約，1979; Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版，Pierce Chem. Co.: Rockford， 111" 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89,1988;和Gregg等，Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214,1990，其在此全部引入作為參考)。優(yōu)選使用固相方法。簡(jiǎn)要地，N-保護(hù)的C-末端氨基酸殘基被連接 于不溶解的載體諸如二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯跣胺樹(shù)脂、硅藻土/聚酰胺(p印syn K)、可控的微孔玻璃、纖維素、聚丙烯膜、 丙烯酸-涂層的聚乙烯棒，等.去保護(hù)、中和和相繼的保護(hù)性氨基酸衍 生物的偶聯(lián)的循環(huán)被用于從C-末端依照氨基酸序列來(lái)連接氨基酸.對(duì) 一些合成肽而言，可以使用利用酸敏感性樹(shù)脂的FMOC策略。優(yōu)選的 固相栽體為二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯樹(shù)脂，其是以各種功能化的形 式市售的，包括氯甲基樹(shù)脂、羥甲基樹(shù)脂、對(duì)乙酰胺基曱基樹(shù)脂、二 苯甲基胺(BHA)樹(shù)脂、4-甲基二苯曱基胺(MBHA)樹(shù)脂、肟樹(shù)脂、 4-烷氧基苯曱醇樹(shù)脂(Waiig樹(shù)脂)、4- U，，4，-二甲氧基苯基氨基曱基 (MBHA)樹(shù)脂-苯氧基甲基樹(shù)脂、2，4-二甲氧基二苯甲基-胺樹(shù)脂和4-(2，，4，-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基乙酰胺基正亮氨酰基 MBHA樹(shù)脂(Rink酰胺MBHA樹(shù)脂)。此外，酸-敏感的樹(shù)脂也提供 了C-末端酸類，如果希望的話。尤其優(yōu)選的a-氨基酸的保護(hù)基是堿不 穩(wěn)定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC).本領(lǐng)域眾所周知的是，氨基酸側(cè)鏈功能團(tuán)的合適保護(hù)基在化學(xué)上 與BOC (叔-丁氧基羰基)和FMOC基團(tuán)是相容的.當(dāng)利用FMOC化 學(xué)作用時(shí)，下列的保護(hù)性氨基酸衍生物是優(yōu)選的FMOC-Cys ( Trit)、 FMOC-Ser (But) 、 FMOC-Asn ( Trit) 、 FMOC垂Leu、 FMOC-Thr (Trit) 、 FMOC-Val、 FMOC-Gly、 FMOC-Lys (Boc) 、 FMOC-Gln (Trit) 、 FMOC誦Glu ( OBut) 、 FMOC-His ( Trit) 、 FMOC-Tyr ( But)、 FMOC-Arg (PMC ( 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺跣基))、 FMOC-Arg (BOC) 2、 FMOC-Pro和FMOC-Trp ( BOC )。氨基酸殘基可通過(guò)利用各種偶聯(lián)劑和本領(lǐng)域已知的化學(xué)作用被偶聯(lián)，諸如直接 與DIC (二異丙基-碳二亞胺)、DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)、BOP(苯 并三唑基-N-氧基三(二甲氨基)膦錯(cuò)六氟褲酸)、PyBOP (苯并三唑 -l-基-羥基-三-吡咯烷基膦六氟-磷酸酯)、PyBrOP (溴代-三-吡咯烷基 膦錯(cuò)六氟磷酸酯偶聯(lián)；通過(guò)對(duì)稱的酸酐偶聯(lián)；通過(guò)活性酯諸如五氯苯 基酯偶聯(lián)；或通過(guò)進(jìn)行的HOBt (1-羥基苯并三唑)活性酯或通過(guò)利用 FMOC-氨基酸氟化物和氯化物或通過(guò)利用FMOC-氨基酸-N-羧基肝偶 聯(lián)。在HOBt或HOAt( 7-氮雜羥基苯并三唑)存在下用HBTU( 2-( 1H-苯并三唑-l-基)、1，1，3，3-四甲基脲錙六氟磷酸酯)或HATU ( 2- (1H-7-氮雜-苯并三唑-l-基)、1，1，3，3-四曱基脲鏡六氟磷酸酯)激活是優(yōu)選的。 盡管優(yōu)選在市售的肽合成儀(例如，Applied Biosystems 431A等；Applied Biosysteras， Foster City, CA)上自動(dòng)合成，但固相方法可以 人工進(jìn)行。在一個(gè)代表性的合成方案中，第一個(gè)(C-末端)氨基酸被 加載到氯代三苯甲基樹(shù)脂上.依照ABI FastMoc方案(A卯lied Biosystems )的相繼的去保護(hù)(用20。/。哌啶/NMP ( N-甲基吡咯烷酮)) 和偶聯(lián)循環(huán)可用于產(chǎn)生序列。通過(guò)用乙酸肝加帽的雙倍和三倍偶聯(lián)， 也可被4吏用?？梢詮臉?shù)脂上裂解合成的模擬肽并通過(guò)用含有合適凈化劑的TFA (三氟乙酸)去保護(hù).許多這樣的裂解試劑，諸如試劑K(0."g結(jié)晶 酚、0.25 mL乙硫醇、0.5mL苯甲碗鍵、0.5mL去離子水、10mLTFA) 以及其它可以被使用。通過(guò)過(guò)濾從樹(shù)脂中分離肽并通過(guò)瞇沉淀進(jìn)行分 離。通過(guò)傳統(tǒng)的方法，諸如凝膠過(guò)濾和反相HPLC(高效液相色鐠) 進(jìn)行進(jìn)一步的純化。本發(fā)明合成的模擬物可以是藥用鹽的形式，特別 是堿加成鹽包括有機(jī)堿和無(wú)機(jī)堿的鹽。依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方 法，通過(guò)用合適的堿或無(wú)機(jī)堿處理肽來(lái)制備酸性氨基酸殘基的堿加成 鹽，或可通過(guò)冷凍干燥合適的堿而直接獲得目的鹽.通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解可通過(guò)各種化學(xué)技術(shù)修飾此處 所述的肽來(lái)產(chǎn)生與未修飾的肽具有基本上相同活性，并且選擇性地具 有其它的目的特性的肽'例如，肽的羧酸基團(tuán)可以是以藥學(xué)上可接受 的陽(yáng)離子的鹽形式來(lái)提供。舦內(nèi)的氨基可以是藥學(xué)上可接受的酸加成 鹽的形式，諸如HC1、 HBr、醋酸、安息香酸、甲苯磺酸基、馬來(lái)酸、 酒石酸的鹽及其它的有機(jī)鹽，或可被轉(zhuǎn)變?yōu)轷０?。通過(guò)任一大量的熟 知的保護(hù)基諸如乙酰胺基團(tuán)來(lái)保護(hù)硫醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將能夠 確定引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)到本發(fā)明肽中使得天然結(jié)合構(gòu)象進(jìn)一步幾乎接近的 方法。例如，羧基末端或氨基末端半胱氨酸殘基可被添加到肽上，使 得當(dāng)氧化肽時(shí)將含有一個(gè)二硫鍵，由此產(chǎn)生一個(gè)環(huán)肽。其它的肽環(huán)化 方法包括硪酸和羧基-和氨基-末端酰胺和癍的形成。特定地，各種不同的方法被有效地用于構(gòu)建具有與相應(yīng)的肽化合 物相同的或類似的目的生物活性的肽衍生物和類似物，所述的肽衍生 物和類似物具有更有利的關(guān)于溶解性、穩(wěn)定性和對(duì)水解和蛋白酶解的 敏感性的活性。此類衍生物和類似物包括在N-末端氨基、C-末端羧基修飾，和/或改變肽中的一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵為非-酰胺鍵的肽?？梢岳斫?兩種或多種這樣的修飾可偶合在一種肽模擬物結(jié)構(gòu)中(例如，在C-末端羧基上進(jìn)行修飾并且在肽的兩個(gè)氨基酸之間包含-CHr氨基甲酸醋 鍵)。氨基末端修飾包括烷基化、乙酰化、加入一個(gè)羧苯甲酰，以及形 成一個(gè)琥珀酰亞胺基團(tuán)。特定地，可使N-末端氨基反應(yīng)來(lái)形式一個(gè)通 式RC (O) NH—的酰胺基，其中R是烷基，優(yōu)選為低級(jí)烷基，并且通 過(guò)與酰卣、RC (O) Cl或酸fff反應(yīng)而被加入。典型地，反應(yīng)可通過(guò)在 惰性稀釋刑(例如，二氯甲烷)中使大約當(dāng)量克分子的或過(guò)量(例如， 大約5當(dāng)量)的卣化?；c肽接觸來(lái)進(jìn)行，優(yōu)選地惰性稀釋劑含有過(guò) 量(例如，大約10當(dāng)量)的叔胺，諸如二異丙基乙胺，來(lái)清除反應(yīng)過(guò) 程中產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)，使末端氨 基烷基化來(lái)提供低級(jí)烷基的N-取代，然后如上所述與酰卣反應(yīng)將提供 通式RC (O) NR-的N-烷基酰胺基團(tuán).可選擇地，氨基末端可通過(guò)與 琥珀酸酐反應(yīng)而共價(jià)連接于琥珀酰亞胺基團(tuán)上。使用大約當(dāng)量克分子 的量或過(guò)量的琥珀酸酐(例如，大約5當(dāng)量)且末端氨基通過(guò)本領(lǐng)域 公知的方法在合適的惰性溶劑(例如，二氯曱烷)中被轉(zhuǎn)變?yōu)槭灏罚?描述在WoUenberg等(美國(guó)專利No. 4，612，132 )中，其全部引入作為 參考?？梢岳斫忡晁峄鶊F(tuán)可用例如，CV至CV烷基或-SR取代基取 代，其被以常規(guī)的方式制備來(lái)提供肽N-末端的取代的琥珀酰亞胺.此 烷基取代基可通過(guò)低級(jí)烯烴(Cr至Q-烷基)與馬來(lái)酐以Wollenberg 等如上文所述的方式反應(yīng)來(lái)制備，并且-SR取代基可通過(guò)使RSH與馬 來(lái)酐反應(yīng)來(lái)制備，其中R如上述所定義。在另一個(gè)有益的實(shí)施方案中， 氨基末端可被衍生化來(lái)形成節(jié)氣基羰基-NH—或取代的節(jié)氣基羰基-NH-基團(tuán). 此衍生物可通過(guò)與大約一當(dāng)量的或過(guò)量的節(jié)氧基羰基氯化 物(CBZ-C1)或取代的CBZ-C1在合適的惰性稀釋刑(例如，二氯甲 烷)中反應(yīng)來(lái)制備，惰性稀釋劑優(yōu)選地含有叔胺來(lái)清除反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn) 生的酸。在另一個(gè)衍生物中，通過(guò)與當(dāng)量數(shù)或過(guò)量(例如5當(dāng)量)的 R--S (O) 2C1在合適的惰性稀釋劑(二氯甲烷)中反應(yīng)來(lái)將末端胺轉(zhuǎn) 變?yōu)榘被酋惺沟肗-末端包括一個(gè)氨磺?；鶊F(tuán)，其中R是烷基并且優(yōu)選 地為低級(jí)烷基，優(yōu)選地，惰性稀釋液含有過(guò)量叔胺(例如，IO當(dāng)量)， 諸如二異丙基乙胺來(lái)清除反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸.反應(yīng)條件是常規(guī)的(例 如，室溫30分鐘).通過(guò)與一當(dāng)量或過(guò)量(例如5當(dāng)量)的R—OC(O) Cl或R—OC ( O ) OC6H4--p—N02在合適的惰性稀釋液(例如，二氯甲烷)中反應(yīng)來(lái)將末端胺轉(zhuǎn)變?yōu)榘被鶗跛狨?，使得在N-末端產(chǎn)生氨基曱 酸酯基團(tuán)，其中R是烷基，優(yōu)選地為低級(jí)烷基.優(yōu)選地，情性稀釋液 含有過(guò)量叔胺(例如，10當(dāng)量)，諸如二異丙基乙胺來(lái)清除反應(yīng)過(guò)程 中產(chǎn)生的任意酸。反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘).通過(guò)與 一當(dāng)量數(shù)或過(guò)量(例如5當(dāng)量)的R-N=00在合適的惰性稀釋液(例 如，二氯曱烷)中反應(yīng)將末端胺轉(zhuǎn)變?yōu)殡?即，RNHC(O)NH--)基 團(tuán)，使得在N-末端形成脲基團(tuán)，其中R如上文所定義的.優(yōu)選地，惰 性稀釋液含有過(guò)量叔胺(例如，10當(dāng)量)，諸如二異丙基乙胺.反應(yīng) 條件是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘).在肽模擬物的制備中，其中C-末端羧基可被酯替代(例如，-C( O ) OR，其中R是烷基，優(yōu)選地為低級(jí)烷基)，使用用于制備舦酸的樹(shù)脂， 并且側(cè)鏈保護(hù)的肽可用堿基和合適的醇(例如，曱醇)裂解.以常規(guī) 方式通過(guò)用氟化氫處理除去側(cè)鏈保護(hù)基來(lái)荻得目的酯.在制備肽模擬 物中，其中C-末端羧基被酰胺—C (O) NR3R4替代，二苯甲基胺樹(shù)脂被用作肽合成的固相栽體。當(dāng)合成完成時(shí)，用氟化氫處理來(lái)從栽體肽 釋放肽，直接產(chǎn)生游離的肽酰胺(即，C末端為—C (O) NH2),可選 擇地，在肽合成過(guò)程中，將氯曱基化樹(shù)脂的使用與氨反應(yīng)偶合來(lái)由栽 體裂解側(cè)鏈保護(hù)肽而產(chǎn)生游離的肽酰胺，并且與烷基胺或二烴基胺反 應(yīng)來(lái)產(chǎn)生側(cè)鏈保護(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C-末端為-C (O) NRRh其中R和Ri是烷基，優(yōu)選地為低級(jí)烷基)'以常規(guī)方式用氟 化氫處理除去側(cè)鏈保護(hù)來(lái)產(chǎn)生游離的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。在另一個(gè)可選擇的實(shí)施方案中，通過(guò)分別用N-末端氨基分別置換 羧基或酯的—OH或酯—OR)來(lái)誘導(dǎo)C-末端羧基或C-末端酯環(huán)化而形 成環(huán)肽。例如，合成和裂解產(chǎn)生肽酸后，通過(guò)合適的羧基活化劑諸如 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)在溶液中，例如，在二氯曱烷(CH2C12)、 二曱基甲酰胺(DMF)或其混合物中將游離酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹孽?然后 用N-末端胺置換激活的酯而形成環(huán)肽。環(huán)化作用，而不是聚合作用， 可通過(guò)使用合適的稀釋溶液依照本領(lǐng)域公知的方法被增強(qiáng)。可以理解，本發(fā)明提供的肽模擬物在結(jié)構(gòu)上類似于本發(fā)明的肽， 但具有一或多個(gè)選擇性地被選自下組的鍵替代的肽鍵-CH2NH--， 一 CH2S—， —CH2CH2—， —CH-CH-(在順式和反式構(gòu)象異構(gòu)體中)，— COCH2—， —CH(OH)CH2—，和-曙CH2SO—，通過(guò)本領(lǐng)域已知的和在下面參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步描述的方法進(jìn)^f亍Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein， ed,) ， Marcel Dekker:紐約，p. 267,1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1:3，1983; Morley， Trends Pharm. 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Engl. 25:767-778,1986;其內(nèi)容在此引入作為參考)。根據(jù)常規(guī)的藥物設(shè)計(jì)方法，通過(guò)隨機(jī)測(cè)定分子而獲得目的模擬物 分子，其結(jié)構(gòu)具有與"天然的"肽相同的結(jié)構(gòu)特征.由結(jié)合分子的特定基團(tuán)的改變產(chǎn)生的定量的作用可通過(guò)測(cè)定推斷的模擬物與肽活性比 較的生物活性來(lái)測(cè)定。在一個(gè)優(yōu)選的合理藥物設(shè)計(jì)的實(shí)施方案中，模 擬物被設(shè)計(jì)成共有肽的最穩(wěn)定的三位構(gòu)象的特征，因此，例如，模擬 物可被設(shè)計(jì)成以類似于本發(fā)明肽具有的足以引起離子的、疏水性的、 或范德華相互作用的方式具有化學(xué)基團(tuán)，如此處公開(kāi)的。優(yōu)選的設(shè)計(jì)合理模擬物的方法采用能夠形成肽三維結(jié)構(gòu)的模型的 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，諸如Hol 1989a; Hol， 1989b;和Hol， 1986例證的那些。 本發(fā)明肽的肽-、有機(jī)-和化學(xué)-模擬物的分子結(jié)構(gòu)可利用市售的計(jì)算機(jī) 輔助設(shè)計(jì)程序來(lái)產(chǎn)生。此程序的實(shí)例包括sybyl 6.5 , hqsarTM，和 alchemy 2000TM ( Tripos) ; galaxyTM和am 2000TM ( AM Technologies,Inc., San Antonio, TX); catalystTM和ceriusTM( Molecular Simulations, Inc., SanDiego， CA ); cACHE PRODUCTS窗，TSARTM， AMBERTM, 以及CHEM-XTM ( Oxford Molecular Products ， Oxford ， CA )和 CHEMBUIU)ER3DTM( Interactive Simulations, Inc., San Diego， CA)。 利用例如人工-識(shí)別的分子模型建立程序以及利用此處公開(kāi)的肽通 過(guò)常規(guī)的化學(xué)合成技術(shù)來(lái)制備產(chǎn)生的肽-、有機(jī)-和化學(xué)-模擬物，最優(yōu) 選地設(shè)計(jì)成能適應(yīng)高通量篩選，包括組合的化學(xué)作用方法。對(duì)產(chǎn)生本 發(fā)明的肽-，有機(jī)-和化學(xué)-模擬物有用的組合方法包括噬菌體展示陣 列、固相合成和組合的化學(xué)陣列，可提供，例如通過(guò)SIDDCO(Tuscon， Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochera.( San Diego ， CA); Symyx Technologies, Inc. ( Santa Clara, CA ) ; Mediche邁Research, Inc. ( Lemont， IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. ( Bethlehem, PA); 或N.V.Organoii (Oss， Netherlands )提供.本發(fā)明的肽-，有機(jī)-和化學(xué)-模擬物的組合化學(xué)生產(chǎn)可依照本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行，包括但不 P艮于，公開(kāi)于Terrett， ( Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, London, 1998) ; Gallop等，J. Med. Chem. 37:1233-51,1994; Gordon等，J. Med. Chera. 37:1385-1401,1994; Look等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12，1996; Ruhland等，J. Amer. Chem. Soc. 118:253-4,1996; Gordon等，Acc. Chem. Res. 29:144-54,1996; Thompson & Ellman， Chem. Rev. 96:555-600,1996; Fmchtel & Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42,1996; Pavia， "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org， 1995; Adnan等,"Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization, "Id,， 1995; Davies和Briant， "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity, "Id., 1995; Pavia ， "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future, "Id" 1996;以及專利U.S. Nos. 5,880,972; 5,463,564; 5，331573; 和5，573，卯5中 通過(guò)初步的高效液相色譜法大體上純化新合成的多肽(參見(jiàn)，例 如，Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman和Co"紐約，N.Y.， 1983).本發(fā)明的合成多肽的組成可通 過(guò)氨基酸分析或通過(guò)，例如，Edman降解法(Creighton,如上文所述)測(cè)序來(lái)證實(shí)。另外，可在直接合成中和/或利用化學(xué)方法與來(lái)自其它蛋 白的序列結(jié)合來(lái)改變多肽氨基酸序列的任意部分而產(chǎn)生變體多肽或融 合多肽。也可根據(jù)本發(fā)明通過(guò)此多肽的體內(nèi)表達(dá)來(lái)使用本發(fā)明的多肽，其 通常被稱為"基因治療"。因此，例如，可用一個(gè)編碼先體外后體內(nèi)的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)來(lái)改造細(xì)胞，改造的細(xì)胞被提供給患者來(lái)用多肽進(jìn)行治療.這樣的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，細(xì)胞可 被通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法利用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行改造.利用基因治療的胰島素促泌劑的局部輸送可將治療劑提供到目的 區(qū)域(例如，胰腺)。例如胰腺-特異性啟動(dòng)子被用來(lái)產(chǎn)生p-細(xì)胞胰腺 腫瘤小鼠模型(Hanahan， Nature 315 (6015) :115-22,1985)'體外和體內(nèi)兩種基因治療方法被關(guān)注a —些將潛在的治療基因轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞群體的方法是已知的(參見(jiàn)，例如，Mulligan, Science 260:926-31,1993),這些方法包括，例如1) 直接的基因傳遞(參見(jiàn)，例如，Wolff等，Science 247:1465-68,1990);2) 脂質(zhì)體-介導(dǎo)的DNA傳遞(參見(jiàn)，例如，Caplen等，NatureMed. 3:39-46,1995; Crystal, Nature Med. 1:15-17，1995; Gao和Huang， Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85 1991 );3 )逆轉(zhuǎn)錄酶病毒-介導(dǎo)的DNA傳遞(參見(jiàn)，例如Kay等，Science 262:117-19,1993; Anderson, Science 256:808-13,1992 ),4) DNA病毒-介導(dǎo)的DNA傳遞.此類DNA病毒包括，例如，腺 病毒(優(yōu)選地基于栽體的Ad-2或Ad-5 )、皰疹病毒(優(yōu)選地基于單純 皰療病毒的栽體)和細(xì)小病毒(優(yōu)選地基于"缺陷的"或非-自主的細(xì) 小病毒的栽體，更優(yōu)選地為基于與腺病毒相關(guān)的病毒的栽體，最優(yōu)選 地為基于AAV-2的栽體)(參見(jiàn)，例如，Ali等，Gene Therapy 1:367-84， 1994;美國(guó)專利No.4，797，368;美國(guó)專利No. 5,139,941;在此引入作為參考.傳遞目的基因的特定栽體系統(tǒng)的選擇取決于各種因素。 一個(gè)重要 的因素是靶細(xì)胞群體的特性，盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體已被廣泛地研究并 使用在大量的基因治療應(yīng)用中，但是該栽體通常不適合于侵染非分裂的細(xì)胞.此外，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒具有致癌的可能。然而，有關(guān)豆病毒栽體方面的最新進(jìn)展可繞過(guò)這樣的一些局限性(參見(jiàn)，例如，Naldini等， Science 272:263-67,1996)?？蓮闹蝎@得逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括但不限 于，莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒諸如勞氏 肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病毒、人 類免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髄及外骨髄增殖的肉瘤病毒、以及 乳腺瘤病毒。腺病毒具有下列優(yōu)點(diǎn)，它們具有廣泛的宿主范圍，可侵染靜止的 或在末端分化的細(xì)胞，諸如神經(jīng)元或肝細(xì)胞并且基本上呈現(xiàn)非致瘤性 (參見(jiàn)，例如，Ali等，1994)。腺病毒看來(lái)似乎沒(méi)有被整合到宿主基 因組中。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，插入突變的危險(xiǎn)被大大地降低了. Ali等，1994.與腺病毒相關(guān)的病毒具有類似的優(yōu)點(diǎn)，如基于腺病毒的栽體.然 而，AAVs顯示出位點(diǎn)特異性整合在人的染色體19上(參見(jiàn)，例如， Ali等，1994)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的多肽胰烏素促泌劑的 DNA被用于疾病諸如糖尿病和與糖尿病-相關(guān)的疾病的基因治療中.依照這些實(shí)施方案，用編碼本發(fā)明的多肽胰島素促泌刑或突變蛋 白的DNA進(jìn)行的基因治療在診斷的同時(shí)或診斷后立即被提供給有需求 的患者。技術(shù)人員應(yīng)能理解任意合適的含有多肽胰為素促泌劑、DNA或 DNA片段、衍生物、或多肽胰烏素促泌劑的變體的基因治療栽體可根 據(jù)此實(shí)施方案來(lái)使用。構(gòu)建此栽體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例 如，Anderson, Nature 392:25-30,1998; Verma等，Nature 389:239-242,1998)?？衫靡阎募夹g(shù)完成將含有多肽胰島素促泌劑DNA的 栽體導(dǎo)入到目的位點(diǎn)。栽體可包括一或多個(gè)啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括但不限于，逆轉(zhuǎn) 錄病毒LTR， SV40啟動(dòng)子；和人巨細(xì)胞病毒(CMV )啟動(dòng)子(Miller 等，Biotechniques 7 (9) :980-9卯，1989)，或任意其它的啟動(dòng)子(例 如，細(xì)胞啟動(dòng)子，諸如真核生物的細(xì)胞啟動(dòng)子包括但不限于組蛋白、 polIII和(-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其它可被使用的病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。 合適啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員結(jié)合此處的教導(dǎo)而言是顯而 易見(jiàn)的.編碼本發(fā)明多肽的核酸序列處于合適的啟動(dòng)子的調(diào)控下.合適的 啟動(dòng)子包括但不限于，啟動(dòng)子諸如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源的 啟動(dòng)子諸如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟 動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如MMT (金屬硫蛋白)啟動(dòng)子；熱激啟動(dòng)子； 白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人球蛋白啟動(dòng)子；病毒胸腺嘧啶核苷 激酶啟動(dòng)子諸如單純性皰疹胸苷激醉啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs (包括 在上文描述的修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs) ; P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人 生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。啟動(dòng)子也可以是天然的調(diào)控編碼多肽的基因的啟動(dòng) 子.逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒栽體可被用于傳導(dǎo)包裝細(xì)胞系而形成生產(chǎn)細(xì)胞 系.可被轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，PE501、 PA317、 c|)-2、 (J;-AM、 PA12、 T19-14X、 VT-19-17-、少-CRE、 t|)-CRIP、 GP+E-86、 GP+envAml2和DAN細(xì)胞系如描述在Miller (Hum. Gene Ther.l:5-14，19卯)，其整體引入在此作為參考。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法， 栽體可傳導(dǎo)包裝細(xì)胞。這樣的方法包括但不限于，電穿孔法、脂質(zhì)體 的使用和CaP04沉淀?？商娲?，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒栽體可被裝入到脂 質(zhì)體中或與脂類偶合，然后給藥于宿主。生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生傳染性的包 括編碼多肽的核酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體粒子。此逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體粒 子然后可用于在體外或體內(nèi)傳導(dǎo)真核細(xì)胞。傳導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編 碼多肽的核酸序列?？杀粋鲗?dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、 胚胎的惡性腫瘤細(xì)胞以及造血千細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì) 胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管的上皮細(xì)胞。與基因治療不同的方法為"轉(zhuǎn)有核細(xì)胞治療"，其中在再導(dǎo)入到 患者之后在體內(nèi)胞外處理患者的細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)靜止的染色體基因而產(chǎn)生 目的蛋白。轉(zhuǎn)有核細(xì)胞治療假定個(gè)體具有激活所必需的正常的基因互 補(bǔ)。轉(zhuǎn)有核細(xì)胞治療涉及引入一個(gè)啟動(dòng)子或其它能夠激活新生基因的 外源調(diào)節(jié)序列，到患者細(xì)胞的來(lái)自體內(nèi)的染色體DNA中，培養(yǎng)物和篩 選產(chǎn)生活性蛋白的細(xì)胞，然后再將激活的細(xì)胞導(dǎo)入到患者中來(lái)意欲使 得它們變得完全地接受。"基因激活的"細(xì)胞然后持續(xù)特定的一段時(shí)間產(chǎn)生目的蛋白，也許持續(xù)至患者的生命之久(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利Nos. 5，641，670和5，733，761且通過(guò)引入在此作為參考).本發(fā)明也包括那些選擇性地結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體和抗體片段。 本領(lǐng)域已知的任意類型的抗體可利用本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)產(chǎn)生。 例如，抗體可被產(chǎn)生來(lái)特異性地結(jié)合到本發(fā)明多肽的抗原表位上。此 處使用的"抗體"包括完整的免疫球蛋白分子及其片段，諸如Fab、 F (ab，)2和Fv，其能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗原表位。典型地，抗原表 位的形成要求至少6、 8、 10或12個(gè)連續(xù)的氨基酸。然而，涉及非-連 續(xù)氨基酸的抗原表位可以需要更多的氨基酸，例如至少15、 25 .或50 個(gè)氨基酸。特異性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗原表位的抗體可被應(yīng)用在治療以 及在免疫化學(xué)試驗(yàn)中，諸如Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附，放射免疫 測(cè)定，免疫組織化學(xué)測(cè)定，免疫沉淀反應(yīng)，或其它的本領(lǐng)域已知的免 疫化學(xué)試驗(yàn)中。不同的免疫測(cè)定可用于鑒定具有目的特異性的抗體。 許多的竟?fàn)幮越Y(jié)合或免疫放射測(cè)定的方案是本領(lǐng)域公知的.這樣的免 疫測(cè)定典型地涉及免疫原和特異性地結(jié)合于該免疫原的抗體之間形成 復(fù)合物的測(cè)定。典型地，當(dāng)應(yīng)用免疫化學(xué)測(cè)定時(shí)，特異性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的 抗體形成了比其它蛋白質(zhì)產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)至少高5-、10-或20倍的檢測(cè) 信號(hào).優(yōu)選地，在免疫化學(xué)測(cè)定中，特異性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗 體沒(méi)有檢測(cè)到其它的蛋白質(zhì)并且可從溶液中免疫沉淀本發(fā)明的多肽.本發(fā)明的多肽可被用來(lái)免疫哺乳動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠、兔、豚 鼠、猴或人，來(lái)產(chǎn)生多克隆的抗體。如果希望，本發(fā)明的多肽可共軛 結(jié)合于栽體蛋白，諸如牛血清清蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血蘭素上。 取決于宿主種類，不同的助劑可用于增強(qiáng)免疫學(xué)的應(yīng)答.這樣的助劑 包括但不限于，F(xiàn)reund，s佐劑、礦物膠(例如，氫氧化鋁)和表面活 性物質(zhì)(例如，溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、多聚陰離子、肽油乳化液、 鑰孔血蘭素和二硝基苯盼)。在應(yīng)用的助劑中，BCG (卡介苗)和小 棒狀桿菌是特別有用的。可利用產(chǎn)生抗體分子的任意技術(shù)，通過(guò)在培養(yǎng)物中連續(xù)傳代細(xì)胞 系來(lái)制備特異性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的單克隆抗體.這些技術(shù)包括但 不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV雜交瘤技術(shù)(Kohler等，Nature 256:495-97,1985; Kozbor等，J. Immunol. Methods 81:3142,1985; Cote等，Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-30,1983; Cole 等，Mol. Cell Biol. 62:109-20,1984),此外，對(duì)此技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)來(lái)產(chǎn)生"嵌合的抗體"，可拼接小鼠抗體基因與人抗體基因來(lái)獲得具有合適的抗原特異性和生物活性的分 子(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55,1984; Neuberger 等，Nature 312:604畫08，1984; Takeda等，Nature 314;452誦54，1985)。單克隆及其它抗體也可被"人源化"來(lái)防止當(dāng)患者被治療時(shí)設(shè)置免疫 應(yīng)答抵抗抗體。這樣的抗體可充分地類似于直接在治療中使用的人抗 體的序列或可能需要改變一些關(guān)鍵殘基。嚙齒動(dòng)物抗體和人序列之間 的序列差異可通過(guò)個(gè)體殘基的位點(diǎn)定向誘變或通過(guò)對(duì)全部互補(bǔ)測(cè)定區(qū) 域進(jìn)行評(píng)分來(lái)置換那些不同于人序列的殘基而被最小化.可選擇地， 利用重組方法來(lái)產(chǎn)生人源化抗體(參見(jiàn)，例如，GB21886MB).特異 性地結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗體可含有部分或完全人源化的抗原結(jié)合部 位，如美國(guó)專利No. 5,565,332所公開(kāi)的。可選擇地，利用本領(lǐng)域已知的方法改進(jìn)單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)來(lái)產(chǎn) 生特異性結(jié)合于本發(fā)明多肽的單鏈抗體。具有相關(guān)特異性的抗體，除 了具有顯著獨(dú)特型成的抗體外，可通過(guò)鏈重整由隨機(jī)組合的免疫球蛋 白文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生(Burton, Proc. Na". Acad. Sci. 88:11120-23,1991 )'也可利用DNA擴(kuò)增方法對(duì)單-鏈抗體進(jìn)行構(gòu)建，諸如PCR，利用 雜交瘤cDNA作為模板(Thirion等，Eur. J. Cancer Prev, 5:507-11,1996)。單鏈抗體可以是單-或雙特異性的，并且可是二價(jià)的或四價(jià) 的.四價(jià)的雙特異性的單鏈抗體被教導(dǎo)在，例如，Coloma & Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63,1997) ' 二價(jià)的雙特異性的單鏈抗體的構(gòu) 建被教導(dǎo)在Mallender & Voss (J. Biol. Chem, 269:199-206,1994 )中。如下所述，利用手工的或自動(dòng)的核苷酸合成來(lái)構(gòu)建編碼羊鏈抗體 的核苷酸序列，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法克隆到表達(dá)構(gòu)建體中，并導(dǎo) 入到細(xì)胞中來(lái)表達(dá)編碼序列?？蛇x擇地，可以直接利用例如絲狀噬菌 體技術(shù)來(lái)產(chǎn)生單-鏈抗體(Verhaar等，Int. J. Cancer 61:497-501,1995; Nicholls等，J. Immunol. Meth. 165:81-91,1993 ),通過(guò)在淋巴細(xì)胞群體中活體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生，或通過(guò)篩選免疫球蛋白 文庫(kù)或在文獻(xiàn)中公開(kāi)的高度特異性結(jié)合試劑的組來(lái)產(chǎn)生特異性結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗體(Orlandi等，Proc. Natl, Acad. Sci. 86:38333-37，1989; Winter等，Nature 349:293-99,1991)。其它類型的抗體可被構(gòu)建和治療性地使用在本發(fā)明的方法中 例 如，嵌合抗體的構(gòu)建如WO 93/03151所公開(kāi)的，獲自免疫球蛋白并且 其是多價(jià)的和多特異性的結(jié)合蛋白，諸如"二價(jià)的二聚抗體"也可被 制備(參見(jiàn)，例如WO94/13804),具有結(jié)合于本發(fā)明多肽的能力的人抗體也可由MorphoSys HuCAL⑧文庫(kù)鑒定如下。本發(fā)明的多肽可被涂敷在微量滴定板上并與 MorphoSys HuCAL Fab噬菌體文庫(kù)一起溫育。那些不結(jié)合于本發(fā)明 多肽的噬菌體-連接的Fabs可從平板上被沖洗掉，僅留下緊緊結(jié)合于本 發(fā)明的多肽上的噬菌體。結(jié)合的噬菌體可被洗脫，例如通過(guò)改變pH植 或通過(guò)與大腸桿菌一起洗脫并通過(guò)大腸桿菌宿主的轉(zhuǎn)染被擴(kuò)增.這些 處理過(guò)程可重復(fù)一次或兩次來(lái)富集緊緊地結(jié)合于本發(fā)明多肽上的抗體 群體.來(lái)自富集池的Fabs然后被表達(dá)，純化，并通過(guò)ELISA測(cè)定進(jìn)行 篩選?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)純化本發(fā)明的抗體.例如，可通 過(guò)讓抗體流經(jīng)本發(fā)明的多肽將被結(jié)合的柱而進(jìn)行親合性純化?？梢虼?利用具有高鹽濃度的緩沖液從柱上洗脫結(jié)合的抗體.本發(fā)明的多肽由于具有刺激郎格罕氏島細(xì)胞體外分泌胰島素的能 力，并引起體內(nèi)血糖的下降，可被用于治療糖尿病，包括I型糖尿病和 II型糖尿病(非胰烏素依賴型糖尿病)兩種。此治療也可延遲糖尿病 和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病.多肽可被用來(lái)防止具有削弱的葡萄糖耐量的 受試者發(fā)展為H型糖尿病.可在本發(fā)明方法中利用本發(fā)明的化合物治 療或預(yù)防的其它疾病和病癥包括青年人成熟期發(fā)病型糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 );潛在的成人隱匿性 自身免疫糖尿病(LADA) (Zimmet等，Diabetes Med. 11:299,1994 ); 削弱的葡萄糖耐量(IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care 22 (增刊1) :S5，1999;削弱的空腹葡 萄糖(IFG) (Charles等，Diabetes 40:796,1991 );妊娠期糖尿病(Metzger， Diabetes, 40:197,1991 );以及新陳代謝綜合癥X.本發(fā)明的多肽也可用于肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化疾病、高脂質(zhì)血、 高膽固醇血癥、低HDL水平、高血壓、心血管疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、冠狀動(dòng)脈病和高血壓)、腦血管疾病和外圍血管疾病的治療中；以及用于狼瘡、多囊卵巢綜合癥、致癌作用和細(xì)胞增生、哞 喘、男性生殖問(wèn)題、潰瘍、睡眠陣礙、脂類和碳水化合物代謝的素亂、 生理節(jié)奏的機(jī)能障礙、生長(zhǎng)陣礙、能量動(dòng)態(tài)平衡的紊亂、包括自身免 疫疾病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的免疫疾病，以及急性和慢性炎癥 性疾病、膿毒性休克的治療中也是有效的.本發(fā)明的化合物也可用于治療與生理失調(diào)相關(guān)的，例如，生產(chǎn)脂 類累積細(xì)胞的細(xì)胞分化、胰島素敏感性和血糖水平的調(diào)節(jié)，其涉及， 例如異常的胰腺0 -細(xì)胞功能、胰島素分泌腫瘤和/或由于胰島素的自身 抗體、胰烏素受體的自身抗體或自身抗體，也即刺激胰腺P-細(xì)胞的而 產(chǎn)生的自身免疫低血糖，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化噬斑形成的巨噬細(xì)胞分 化、炎癥性應(yīng)答、致癌作用、細(xì)胞增生、脂肪細(xì)胞基因表達(dá)、脂肪細(xì) 胞分化、胰腺P-細(xì)胞量的減少、胰島素分泌、對(duì)胰烏素的組織敏感性、 脂肪肉瘤細(xì)胞發(fā)育、多囊卵巢疾病、慢性排卵停止、雄激素過(guò)多癥、 黃體嗣產(chǎn)生、類固醇生成、細(xì)胞中的氧化還原電勢(shì)和氧化壓力、氧化 氮合酶(NOS)產(chǎn)生、增加的Y-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶、過(guò)氧化氫酶、血漿 甘油三酯、HDL以及LDL膽固醇水平等.本發(fā)明的化合物也可用于本發(fā)明的方法中來(lái)治療糖尿病的次級(jí)起 因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care22 (增刊1) :S5，1"9).這樣的次級(jí)起因包括糖皮質(zhì)激素過(guò)量、 生長(zhǎng)激素過(guò)量、腎上腺髄質(zhì)瘤和藥物誘導(dǎo)的糖尿病?？烧T導(dǎo)糖尿病 的藥物包括但不限于樸鼠脲、煙酸、糖皮質(zhì)激素、二苯乙內(nèi)酰脲、 甲狀腺激素、P-腎上腺素試刑、a-干擾素和用于治療HIV傳染病 的藥物.此外，本發(fā)明的多肽可用于治療哮喘(Bolin等，Biopolymer 37:57-66，1995;美國(guó)專利No. 5,677,419;表明多肽R3P0在松馳的豚鼠 氣管平滑肌中是活化的)；血壓過(guò)低誘導(dǎo)(VIP誘導(dǎo)血壓過(guò)低，心動(dòng) 過(guò)速，以及哞喘患者的面部潮紅(Morice等，Peptides 7:279-280，1986; Morice等，Lancet 2:1225-1227,1983 );男性生殖問(wèn)題(Siow等，Arch. Androl. 43 ( 1 ) :67-71，1999 );作為抗細(xì)胞程序死亡/神經(jīng)保護(hù)藥物 (Brenneman等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 865:207-12,1998 );缺血期間 的心臟保護(hù)(Kalfm等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268 ( 2 ) :952-8,1994;Das等,Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308,1998，控制晝夜節(jié)律鐘及其 關(guān)聯(lián)的棄亂(Hamar等，Cell 109:497-508,2002; Shen等，Proc. Natl. Acad. Sci, 97:11575-80,2000)，最后作為抗?jié)兯幬?Timcel等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22,1998 )。本發(fā)明的多肽可單獨(dú)使用或與其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的治療和/ 或化合物組合應(yīng)用于糖尿病和相關(guān)失調(diào)的治療中.可選擇地，此處描 述的方法和化合物可被部分或完全地應(yīng)用于組合治療中.本發(fā)明的多肽也可與其它已知的治療組合共同給藥用于糖尿病的 治療，包括PPAR激動(dòng)劑、磺酰脲藥物、非-磺酰脲促泌劑、cc-葡糖苷 酶抑制劑、胰烏素敏化劑、胰烏素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化 合物、胰烏素和抗肥胖癥藥物.此治療可以是在本發(fā)明的多肽給藥之 前、同時(shí)或之后給藥.胰島素包括長(zhǎng)的和短的兩種作用形式和胰烏素 的制劑.PPAR激動(dòng)劑可包括任意PPAR亞基或其組合的激動(dòng)刑。例 如，PPAR激動(dòng)劑可包括PPAR-a、 PPAR-y、 PPAR-5或兩個(gè)或三 個(gè)PPAR亞基的組合。PPAR激動(dòng)劑包括，例如，rosiglitazone和 piogUtazone。磺酰脲類藥物包括，例如，優(yōu)降糖、格列美脲、氯磺丙 脲和格列甲溱.當(dāng)與本發(fā)明的多肽一起給藥時(shí)對(duì)治療糖尿病有用的a -葡糖苦酶抑制劑包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖.對(duì)治療糖尿 病有用的胰烏素敏化劑包括噻唑烷二鑭和非-噱唑烷二胡。當(dāng)與本發(fā)明 多肽一起給藥對(duì)糖尿病治療有用的降低肝葡萄糖排出量化合物包括二 甲雙胍，諸如Glucophage和Ghic叩hage XR。當(dāng)與本發(fā)明多肽一起對(duì) 治療糖尿病有用的胰島素促泌劑包括磺酰脲和非-磺酰脲藥物GLP-1、 GIP、 分泌素、nateglinide、 meglitinide、 repaglinide、優(yōu)降糖、 glim印iride、氯磺丙脲、格列曱漆。GLP-1包括具有比天然的GLP-1 更長(zhǎng)半衰期的GLP-1的衍生物，諸如，例如，脂肪酸衍生化的GLP-1 和exendin。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽與胰烏素促泌劑結(jié)合使用來(lái)增強(qiáng)胰腺e-細(xì)胞對(duì)胰島素促分泌素的敏感性。本發(fā)明的多肽也可與抗肥胖癥藥物結(jié)合用于本發(fā)明的方法中。抗 肥胖癥藥物包括p-3激動(dòng)劑、CB-1拮抗劑、食欲抑制劑，諸如，例如， sibutramine ( Meridia )， 和脂肪酶抑制劑，諸如，例如，orlistat (Xenical)。本發(fā)明的多肽可與通常用于治療糖尿病病人的脂類紊亂的藥物結(jié)合用于本發(fā)明的方法中。此類藥物包括但不限于HMG-CoA還原酶抑 制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑和纖維酸衍生物.本發(fā)明的多肽也可與抗 高血壓的藥物結(jié)合使用，諸如，例如，P-阻斷劑和ACE抑制劑。此種共-治療可以以兩種或多種藥物(例如，本發(fā)明的化合物與胰 島素敏化劑和抗肥胖癥藥物結(jié)合)的任意組合給藥.此種共-治療可以 以如上所述藥物組合物的形式給藥。此處使用的不同的術(shù)語(yǔ)定義如下a當(dāng)介紹本發(fā)明或其優(yōu)選的實(shí)施方案的元件時(shí)，冠詞"一個(gè)""一 種""該"和"所述的"是指有一個(gè)或多個(gè)元素。術(shù)語(yǔ)"包含"、"包 括"和"具有"是指包括在內(nèi)的，除了所列元素之外可能還有其它元素。此處使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"包括哺乳動(dòng)物(例如，人和動(dòng)物).術(shù)語(yǔ)"治療"包括提供以直接或間接地改善受試者病癥為目的醫(yī) 療救護(hù)，或減緩受試者的病癥或紊亂的任意方法、作用、應(yīng)用、治療 等，其中受試者包括人。術(shù)語(yǔ)"組合治療"或"共-治療"是指給藥兩種或多種治療藥物來(lái) 治療糖尿病病癥和/或紊亂。此種給藥包括兩種或多種治療藥物以大體 上同時(shí)的方式共同-給藥，諸如在具有固定比率的活性成分的單個(gè)膠囊 中或在多個(gè)分離的各個(gè)抑制劑藥物的膠囊中。此外，這樣的給藥包括 以連續(xù)的方式使用每種類型的治療藥物.術(shù)語(yǔ)"治療有效的"是指每種藥物的給藥量，它將達(dá)到改善糖尿 病病癥或紊亂嚴(yán)重程度的目標(biāo)，而避免或最小化與所用治療方法相關(guān) 聯(lián)的不良副作用.術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的，，是指受試項(xiàng)目適于用在藥物產(chǎn)品中?；诠臏y(cè)定方法來(lái)測(cè)定哺乳動(dòng)物中病癥的治療效果，并且比 較這些結(jié)果與用于治療這些病癥的已知藥物的結(jié)果，本發(fā)明多肽的有 效劑量可容易地被測(cè)定來(lái)用于每一目的適應(yīng)癥的治療。在這些病癥之 一的治療中給藥活性成分(例如，多肽)的量可根據(jù)特定化合物的因 素和所使用的劑量單位、給藥的方式、療程、被治療患者的年齡且性 別、以及治療的病癥的特性和程度而在很大程度上進(jìn)行變化。給藥活性成分的總量通?？稍诖蠹s0.0001 mg/kg到大約200 mg/kg 的范圍，并且優(yōu)選地為0.01 mg/kg到大約200 mg/kg體重每天.單位劑量可包含從大約0.05 mg到大約1500毫克的活性成分，可以每天給藥 一或多次。通過(guò)注射，包括靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射和非腸道 注射以及使用輸注技術(shù)給藥的每日劑量可以是從大約0.01到大約200 mg/kg。每天直腸給藥方案可以是從0.01到200 mg/kg總體重'透過(guò)皮 膚起作用的濃度可被要求保持日劑量從0,01到200 mg/kg.當(dāng)然，每一患者的特異性的最初和連續(xù)的給藥方案依據(jù)診斷醫(yī)生 確定的病癥的特性和嚴(yán)重程度、所用特異性多肽的活性、患者的年齡、 患者的飲食、給藥的時(shí)間、給藥途徑、藥物的排泄速度、藥物組合等 進(jìn)行變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用常規(guī)處理測(cè)試來(lái)確定所要的本發(fā) 明多肽的治療方式和劑量.本發(fā)明多肽可以在適當(dāng)配制的藥物組合物中通過(guò)給藥于需要的患 者而實(shí)現(xiàn)所希望的藥理學(xué)作用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，患者為需要 進(jìn)行特定的病癥或疾病治療的哺乳動(dòng)物，包括人。因此，本發(fā)明包括 包含藥學(xué)上可接受的栽體和治療有效量的多肽的藥物組合物。藥學(xué)上 可接受的載體是在活性成分的有效活性的濃度對(duì)患者相對(duì)無(wú)毒和無(wú)害 的，使得栽體的任何副作用不損害活性成分的有益作用的任意栽體。 多肽的治療有效量是對(duì)特定被治療的病癥產(chǎn)生效果或影響的量.此處 描述的可與藥學(xué)上可接受的栽體一起給藥的多肽可被利用任何有效的 常規(guī)劑量單位形式給藥，包括，例如，立即釋放和定時(shí)釋放制刑、口 服、非腸道、局部地等等.為了用于口服，多肽可被配制到固體或液體制刑中諸如，例如， 膠囊、藥丸、片劑、錠劑、糖錠、熔化物、粉末、溶液、懸浮液或乳 濁液中，并且可按照本領(lǐng)域公知的生產(chǎn)藥物組合物的方法進(jìn)行制備。 固體單位劑型可以是膠囊，其可以是普通的硬殼的或軟殼的凝膠類型包括，例如，表面活性劑、潤(rùn)滑劑和惰性填料諸如乳糖、蔗糖、磷酸 鈣和玉米淀粉.在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以是具有常規(guī)片劑基質(zhì)諸 如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，與粘合劑諸如金合歡膠、玉米淀粉或凝膠 結(jié)合的片劑；在給藥后用于輔助片劑破裂和溶解的崩解劑諸如馬鈴薯 淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜耳豆膠；意欲提高片劑顆粒流動(dòng)性和防止 片劑物質(zhì)粘著到片劑塑模和壓力機(jī)表面的潤(rùn)滑劑，例如，滑石粉、硬 脂酸或鎂、鈣或硬脂酸鋅；色素；著色劑；和意欲增強(qiáng)片劑美感特性使得它們更為患者接受的增味劑，用于口服液體劑型的合適的賦形 劑，包括稀釋劑諸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或 者不添加藥學(xué)上可接受的表面活性劑、懸浮劑或乳化劑。不同的其它 物質(zhì)可以作為涂層或修飾劑量單元的外觀而存在。例如片劑、丸劑或 膠嚢可以涂有蟲膠、糖或兩者.
可分散性粉劑和顆粒適用于水懸浮液的制備。它們?cè)诨旌衔镏刑?供了活性成分與擴(kuò)展劑或潤(rùn)濕劑、懸浮劑和一或多種防腐劑。合適的 分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑已在上文中舉例說(shuō)明。也可存在其它的賦形 劑，例如，那些如上所述的甜味劑、調(diào)味品和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物也可為水包油乳化劑的形式，油相可以是有 機(jī)油，諸如液體石蠟或有機(jī)油的混合物。合適的乳化劑可以是(1)天
然存在的樹(shù)膠，諸如阿拉伯樹(shù)膠和黃蓍樹(shù)膠，(2)天然存在的礴脂， 諸如大豆和印碑脂，(3)獲自脂肪酸和己糖醇酸酐的醋或偏醋，例如， 單油酸山梨醇酐酯，和(4)所述偏酯與環(huán)氧乙烷，例如，聚環(huán)氧乙烷 單油酸山梨醇酐酯的縮合物。乳濁液也包括甜味劑和調(diào)味劑。
含油的懸浮液可以通過(guò)在植物油諸如，例如諸如，例如花生油、 橄欖油、芝麻油或椰子油中或在礦物油，諸如液體石蠟中懸浮活性成 分來(lái)配制.含油的懸浮液可包括增稠劑諸如，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨 蠟醇.懸浮液也可包括一或多種防腐劑，例如，乙基或正-丙基對(duì)鞋基 苯甲酸鹽； 一或多種著色劑； 一或多種調(diào)味劑；和一或多種甜味劑諸 如蔗糖或糖精。
糖漿和酏劑可以與甜味劑諸如，例如丙三醇、丙二醇、山梨糖醇 或蔗糖一起配制.這樣的制劑也可以包括緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑和 著色劑。
本發(fā)明的多肽也可以以非腸道方式給藥，也即皮下地、靜脈內(nèi)、 肌內(nèi)注射或腹腔內(nèi)，作為在生理可接受的稀釋液中化合物的可注射制 劑帶有一種藥物栽體，其可以是無(wú)菌液體或液體諸如水、鹽、含水葡 萄糖和相關(guān)糖液的混合物；醇諸如乙醇、異丙醇或十六醇；二醇諸如 丙二醇或聚乙二醇；甘醇縮酮，諸如2，2-二甲基一1，1-二氧戊環(huán)-4-甲醇， 酸諸如聚(乙二醇)400;油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油酯；或乙?；?脂肪酸甘油酯，添加或者沒(méi)有添加藥學(xué)上可接受的表面活性劑諸如皂 或去垢劑、懸浮劑，諸如果膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素或乳化劑及其它的藥物助劑。
可用于本發(fā)明的非腸道制劑的油類的實(shí)例為石油，動(dòng)物的、植物 或合成來(lái)源的，例如，花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉米油、橄 欖油、礦脂礦物油。合適的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。合 適的脂肪酸酯為，例如油酸乙酯和十四碳烷酸異丙酯。合適的皂包括 脂肪堿金屬、銨和三乙醇胺鹽，合適的洗滌劑包括陽(yáng)離子的洗滌劑，
例如，二甲基二烴基銨基離化物、烷基吡啶鹵化物和烷基胺乙酸鹽； 陰離子的洗滌劑，例如，烷基、芳基和烯屬磺酸酯，烷基、烯烴、醚 和單酸甘油醋硫酸鹽和己醋；非離子的洗滌劑，例如，脂肪胺氧化物、 脂肪酸鏈烷醇酰胺，和聚環(huán)氧乙烷聚丙烯共聚物；以及兩性的洗滌劑， 例如，烷基-P-氨基丙酸鹽和2-烷基咪唑啉季胺鹽，以及混合物.
本發(fā)明的非腸道組合物典型地可包括在溶液中的按重量計(jì)從大約 0.5%到大約25%的活性成分。防腐劑和緩沖液也可被方便地使用.為 了減少或消除對(duì)注射位點(diǎn)的刺激，此組合物可包括一種具有從大約12 到大約17的親水親油平衡(HLB)非離子型表面活性劑。此制劑中的 表面活性劑的量按重量計(jì)為從大約5%到大約15%的范圍。表面活性劑 可以是具有上述HLB的單一組分或可以是兩種或多種具有目的HLB 的組分的混合物.
在非腸道制劑中使用的表面活性劑的實(shí)例為聚乙烯山梨糖醇酐脂 肪酸醋，例如，單油酸山梨醇酐酯和環(huán)氧乙烷與疏水性基質(zhì)的髙分子 量加合物，通過(guò)環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合來(lái)形成，
藥物組合物可以是可注射的無(wú)菌的含水懸浮液的形式.此懸浮液 可以按照已知的方法配制，利用合適的分散劑或潤(rùn)濕劑和懸浮劑諸 如，例如，羧甲基纖維素鈉、甲纖維素、羥丙基甲基-纖維素、海藻酸 鈉、聚乙烯吡咯烷嗣、黃蓍樹(shù)膠和阿拉伯樹(shù)膠；分散劑或潤(rùn)濕劑，其 可以是天然存在的磷脂，諸如卵磷脂、烯化氧與脂肪酸的縮合物，例 如，聚環(huán)氧乙烷硬脂酸酯、環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂族醇的縮合物，例如， 十七亞乙基氧基十六碳烷醇、環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏 酯的縮合物，諸如聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇一油酸，或環(huán)氧乙烷與獲自脂 肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的縮合物，例如聚環(huán)氧乙烷單油酸山梨醇酐 酯。
無(wú)菌的注射制劑也可以是一種在無(wú)毒的非腸道可接受的稀釋液或溶劑中的無(wú)菌注射溶液或懸浮液?？梢允褂玫南♂寗┖腿軇椋?，
水、Ringer，s溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不揮發(fā)油通常用作 溶劑或懸浮介質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)這些目的，任何溫和的、不揮發(fā)油可以被 使用，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸諸如油酸可以 使用在注射的制劑中.
本發(fā)明的組合物也可以用藥物直腸給藥的栓劑形式給藥.這些組 合物可以通過(guò)混合藥物(例如，多肽)與合適的非刺激賦形劑來(lái)制備， 其中的賦形劑在一般溫度下是固體，但在直腸溫度時(shí)是液體，并且因 此在直腸中融化來(lái)釋放藥物。此類物質(zhì)是，例如，可可脂和聚乙二醇.
另一種用于本發(fā)明方法的制劑利用透過(guò)皮膚輸送裝置("貼")， 此種透過(guò)皮膚的貼可被用來(lái)以可控制的量提供持續(xù)的或不連續(xù)的本發(fā) 明化合物的浸入.用于輸送藥物的透過(guò)皮膚的貼的構(gòu)建和使用是本領(lǐng) 域公知的(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No, 5，023，252，引入在此作為參考). 此貼可以被構(gòu)建來(lái)持續(xù)地、脈動(dòng)地或在需要時(shí)輸送藥物.
通過(guò)機(jī)械輸送裝置將藥物組合物輸入給患者是希望的或必需的. 輸送藥物的機(jī)械輸送裝置的構(gòu)建和使用是本領(lǐng)域公知的。例如，直接 給藥藥物到腦的直接技術(shù)通常涉及放置施藥導(dǎo)管到患者的腦室系統(tǒng)來(lái) 繞過(guò)血腦屏陣.這樣的植入輸送系統(tǒng)，用于輸送藥物到身體的特異性 解剖學(xué)區(qū)域，被描述在美國(guó)專利No.5，011，472中，引入在此作為參考。
根據(jù)需要或目的，本發(fā)明的組合物可包括其它常規(guī)的藥學(xué)上可接 受的配料成分，通常指栽體或稀釋劑。本發(fā)明的任意組合物可通過(guò)添 加抗氧化劑，諸如抗壞血酸或通過(guò)其它合適的防腐劑來(lái)防腐.以合適 的劑型制備此類組合物的常規(guī)方法可以被使用。
通常使用的可依據(jù)給藥途徑配制組合物藥物的組分包括酸化 劑，例如但不限于，乙酸、檸檬酸、延胡索酸、鹽酸、硝酸；和堿化 劑諸如，但不限于，氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、單乙醇胺、氫氧化 鉀、硼酸鈉、碳酸鈉、氬氧化鈉、三羥乙基胺、三乙醇胺.
其它的藥物組分包括，例如但不限于，吸附劑(例如，粉末狀的 纖維素和活性炭)；氣霧劑推進(jìn)劑(例如，二氧化碳、CC12F2、 F2C1C-CC1F2和CaF3);空氣置換劑(例如，氮?dú)夂蜌鍤?；抗真菌 的防腐劑(例如，苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸丁醋、對(duì)鞋基苯甲酸乙酯、 對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉)；抗菌的防腐劑(例如，殺藻銨、氯化節(jié)乙氧銨、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁
醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化劑(例如，抗壞血 酸、抗壞血酰棕櫚酸酯、丁羥基大茴香醚、2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚、次 磷酸、單2-硫基乙醇、沒(méi)食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、甲 搭合次硫酸氬鈉、焦亞硫酸鈉)；粘結(jié)材料(例如，嵌段聚合物、天 然和合成橡膠、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅樹(shù)脂和苯乙烯-丁二烯共聚物)； 緩沖劑(例如偏磷酸鐘、鱗酸二氫鉀、乙酸鈉、無(wú)水檸檬酸鈉和檸檬 酸鈉二水合物)；栽體(例如，阿拉伯膠糖漿、芳香族糖漿、芳香酰
劑、櫻桃糖漿、可可粉糖漿、橙皮糖漿、糖漿、玉米油、礦物油、花 生油、芝麻油、抑菌的氯化鈉注射液和抑菌的注射用水)；螯合劑(例 如乙二胺四乙酸二鈉鹽和乙二胺四乙酸)；著色劑(例如，F(xiàn)D&CRed No. 3， FD&CRedNo. 20， FD & C Yellow No. 6， FD & C Blue No. 2 ， D&CGreenNo.5， D & C Orange No. 5， D&CRedNo.8，焦糖和氧 化鐵紅)；澄清劑(例如，膨潤(rùn)土)；乳化劑(但不限于，阿拉伯膠、 cetomacrogol、十六烷醇、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、單油酸山梨醇酐 酯、聚乙烯50硬脂酸酯)；包被劑(例如，凝膠和鄰苯二甲酸醋酸纖 維素)；香料(例如，茴香油、肉桂油、可可粉、薄荷醇、橙油、薄 荷油和香草醛)；潤(rùn)濕劑(例如，甘油、丙二醇和山梨糖醇)；研磨 劑(例如，礦物油和甘油)；油類(例如，花生油、礦物油、橄欖油、 花生油、芝麻油和植物油)；軟貪基質(zhì)(例如，羊毛脂、親水性軟骨、 聚乙二醇油骨、礦脂、親水性的礦脂、白色油骨、黃色油奮和玫瑰水 油奮)；穿透增強(qiáng)劑(透過(guò)皮膚的輸送)(例如， 一羥基或多羥基醇、 飽和或不飽和的脂肪醇、飽和或不飽和的脂肪酸酯、飽和或不飽和的 二羧基的酸類、基本的油類、磷脂?；苌?、腦褲脂、硨烯、酰胺、 酸、酮和脲)；增塑劑(例如，鄰苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶劑(例 如，醇、玉米油、棉子油、甘油、異丙醇、礦物油、油酸、花生油、 凈化水、注射用水、無(wú)菌注射水和用于沖洗的無(wú)菌水)；增稠劑(例 如，十六烷醇、十六烷基醋蠟、微晶石蠟、石蠟、十八烷醇、白蠟； 栓劑基質(zhì)(例如，可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活性劑(例 如，殺藻銨，nonoxynoU0、 oxtoxyno19、聚山梨酸酯80、十二烷基碗 酸鈉和聚山梨糖甘油一棕櫚酸酯)；懸浮劑(例如，瓊脂、膨潤(rùn)土、 carbomers、羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、高吟土、甲基纖維素、黃蓍膠和veegiim );甜味劑(例 如，天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露糖醇、丙二醇、糖精鈉、山梨糖 醇和蔗糖)；片劑防粘劑(例如，硬脂酸鎂和滑石粉)；片刑粘合劑 (例如，阿拉伯膠、海藻酸、羧甲基纖維素鈉、可壓縮的糖、乙基纖 維素、凝膠、液體葡萄糖、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷明和預(yù)膠凝 的淀粉)；片劑和膠囊稀釋劑(例如，二元的磷酸鈣、高嶺土、乳糖、 甘露糖醇、微晶纖維素、粉末狀的纖維素，碳酸鈣沉淀、碳酸鈉、砩 酸鈉、山梨糖醇和淀粉)；片劑包被劑(例如，液體狀葡萄糖、羥乙 基纖維素、羥基丙基纖維素、羥丙基曱基纖維素、曱基纖維素、乙基 纖維素、苯二甲酸醋酸纖維素和蟲膠)；片劑定向受壓賦形劑(例如， 二元的褲酸鈣)；片劑崩解劑(例如，海藻酸、羧甲基纖維素鈣、微 晶纖維素、polacriHin potassium、海藻酸鈉、淀粉乙醇酸鈉和淀粉)； 片劑助流劑(例如，膠態(tài)氧化硅、玉米淀粉和滑石粉)；片劑潤(rùn)滑劑 (例如，硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、硬脂酸和硬脂酸鋅)；片劑/ 膠囊不透明劑(例如，二氧化鈦)；片劑拋光刑(例如，carnubawax 和白蠟)；增稠劑(例如，蜂蠟、十六烷醇和石蠟)；滲透劑(例如， 葡萄糖和氯化鈉)；增粘劑(例如，海藻酸、膨潤(rùn)土、 carbomers、羧 曱基纖維素鈉、甲纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸鈉和黃蓍膠)； 以及潤(rùn)濕刑(例如，十七亞乙基氧基十六碳烷醇、卵辨脂、聚乙烯山 梨糖醇一油酸、聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇一油酸和聚環(huán)氧乙烷硬脂酸酯)。
此處描述的多肽可以作為單一藥物或與一或多種其它的藥物組合 給藥，其中組合用藥沒(méi)有產(chǎn)生不能接受的副作用。例如，本發(fā)明的多 肽可以與已知的抗肥胖癥藥或已知的抗糖尿病藥或其它的指示劑等以 及其混合物和組合組合。
此處所述的多肽也可以以游離堿形式或含在組合物中應(yīng)用在研究 和診斷中，或作為分析參照的標(biāo)準(zhǔn)等。因此，本發(fā)明包括由惰性栽體 和有效量的通過(guò)在此描述的方法鑒定的化合物或其鹽或酯組成的組合 物。惰性栽體是不與化合物相互作用的傳送和提供栽體、運(yùn)送方式、 主體、示蹤物質(zhì)等到欲傳送的化合物的任何物質(zhì)?；衔锏挠行Я渴?對(duì)進(jìn)行的特定方法產(chǎn)生效果或影響的量。
已知多肽在舍水的和無(wú)水環(huán)境中發(fā)生水解、脫酰胺作用、氧化作 用、外消旋作用和異構(gòu)化，降解諸如水解、脫酰胺作用或氧化作用可通過(guò)毛細(xì)管電泳容易地檢測(cè).盡管有酶催降解，但是具有延長(zhǎng)的血漿 半衰期或生物學(xué)駐留時(shí)間的多肽在水溶液中最少應(yīng)該是穩(wěn)定的.在體溫時(shí)， 一天時(shí)間內(nèi)顯示出小于10%降解的多肽是必需的。在體溫時(shí)， 一天時(shí)間內(nèi)顯示出小于5%降解的多肽是更優(yōu)逸的。由于在慢性糖尿病 患者中的治療壽命，大量?jī)?yōu)選的這些藥物適宜于給藥，此外很少通過(guò) 非腸道路徑。在體溫時(shí)的一周期間內(nèi)的穩(wěn)定性(即小于較低的降解百 分比)將允許較少地頻繁給藥.在冷凍溫度時(shí)的在幾年中的穩(wěn)定性將 允許制造商提供液體制劑，因此避免重建的麻煩.另外，在有機(jī)溶劑 中的穩(wěn)定性將提供把多肽配制到新的刑型諸如植入物中，制劑適于皮下注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射等；合適的藥物栽體； 并且用于配制和給藥的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的可用于制備的任意方法 (參見(jiàn)，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co" EastonPa"第20版，2000)。本發(fā)明將通過(guò)下文實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但其不應(yīng)被理解為 以任何方式對(duì)本發(fā)明范圍的限制。膠嚢配方膠嚢制劑由下述物質(zhì)制備而成本發(fā)明的多肽 淀粉 硬脂酸鎂10 mg 109 mg 1 mg將組分混合，通過(guò)合適的網(wǎng)篩，并填充到硬的膠囊中。 片劑配方片劑由下述物質(zhì)制備而成:本發(fā)明的多肽微晶纖維素 膠體二氧化硅硬脂酸25 mg 200 mg 10 mg 5.0 mg47將組分混合并壓縮來(lái)形成片劑?？墒褂煤线m的含水和無(wú)水涂層以 增強(qiáng)適口性，提高雅潔性和穩(wěn)定性或延遲吸收. 無(wú)菌的靜脲內(nèi)注射溶液利用無(wú)菌的注射水制備本發(fā)明目的化合物的mg/mL溶液，并且如 果需要?jiǎng)t調(diào)整pH值.將溶液用無(wú)菌的5%葡菊糖稀釋用于給藥，并且作為靜脈內(nèi)注入給藥. 肌內(nèi)注射懸浮液 制備下列的肌內(nèi)注射懸浮液本發(fā)明的多肽 羧甲基纖維素鈉TWEEN 80氯化鈉苯甲醇懸浮液通過(guò)肌內(nèi)注射給藥. 硬殼膠囊通過(guò)用150mg乳糖、50mg的纖維素和6mg的硬脂酸鎂的各種粉 末狀的活性成分填充標(biāo)準(zhǔn)的上下兩件的硬甘氨酸菌素膠囊來(lái)制備大量 的單位膠嚢。軟膠囊制備活性成分在可吸收的油諸如豆油、棉子油或橄欖油中的混合 物并通過(guò)正置換泵注射到熔化物凝膠中來(lái)形成包含活性成分的軟膠 襲。將膠囊洗滌并干燥?？蓪⒒钚猿煞秩苡诰垡叶肌⒏视秃蜕嚼嫣?醇的混合物來(lái)制備水溶性的醫(yī)用混合物。立即釋放的片劑/膠嚢這些是通過(guò)常規(guī)的和新的方法制備的固體口服劑型。這些單位被 口服而不需水以用于藥物的快速溶解和輸送.將活性成分混合在包含 組分諸如糖、凝膠、果膠和甜味劑的液體中。通過(guò)冷凍干燥和固態(tài)提 取技術(shù)將這些液體固化為固體片劑或錠劑。可以用粘彈性的和熱彈性 的糖和聚合物或發(fā)泡組分壓縮將藥物化合物來(lái)產(chǎn)生用于快速釋放而不 需水的多孔介質(zhì)。50 pg/mL 5 mg/mL 4 mg/邁L 9 mg/mL 9 mg/m!v可以理解對(duì)本發(fā)明進(jìn)行不脫離此處所述的本發(fā)明的精神或范圍的 改變和修飾對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例為了使本發(fā)明能夠被更好地理解，下面對(duì)實(shí)施例進(jìn)行了描述，這 些實(shí)施例僅僅用于解釋的目的，不應(yīng)被理解為以任何方式對(duì)本發(fā)明范 圍進(jìn)行限制.所有提及的出版物被整體引入作為參考。實(shí)施例1.肽合成方法設(shè)計(jì)本發(fā)明的多肽來(lái)提高這些肽的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)其半衰期。特定地，這些肽的非突變形式(參見(jiàn)，例如，WO 01/23420,整體引入在此) 在水中和無(wú)水環(huán)境中顯示出N-末端水解、脫酰胺作用以及二聚化和三 聚化。為了提高穩(wěn)定性和最小化水解作用、脫酰胺作用和二聚化/三聚 化，將天冬酰胺殘基(位置9和28)突變?yōu)楣劝滨邪窔埢?。此外，?置17處的纈氨酸、位置19處的丙氨酸、位置29處的賴氨酸、位置30 處的精氨酸、位置31處的輅氨酸也被突變。此外，如下所述，本發(fā)明 的多肽也被聚乙二醇化來(lái)延長(zhǎng)半衰期.下列的常規(guī)方法被用于合成本發(fā)明的一些多肽通過(guò)FMOC/叔丁基策略，在連續(xù)流動(dòng)條件下利用Rapp-Polymere PEG-聚苯乙彿樹(shù)脂(Rapp-Polymere, Tubingen, Germany)進(jìn)行肽的 合成(Pennington & Dunn, Peptide Synthesis Protocols, Volume 35,1994)。在合成完成后，從樹(shù)脂裂解肽并利用TFA/DTT/H20/三異 丙基硅烷(88/5/5/2)去保護(hù)。利用冷的二乙醚從裂解的混合物中沉淀 肽.將沉淀物用冷的醚沖洗三次，然后在冷凍干燥之前溶于5%的乙 酸。通過(guò)反相色譜法在YMC-Pack ODS-AQ柱(YMC ， Inc., Wilmington, NC )上，利用具有3% TFA的水/乙腈作為從0%到100% 乙腈的梯度，和通過(guò)MALDI質(zhì)譜法在VOYAGER DE (MALDI質(zhì)譜 >|義，(5-2386-00型，PerSeptive BioSystems， Framingham， MA)來(lái) 校驗(yàn)肽。以1/1比例將肽樣品被添加至基質(zhì)援沖液(具有3% TFA的 50/50 (0320/乙腈)中，通過(guò)反相色錯(cuò)法在Waters Delta Pr印4000 HPLC 系統(tǒng)(Waters Corporation, Milford， MA)上純化不滿足>95%的純度 標(biāo)準(zhǔn)的肽。實(shí)施例2,肽聚乙二醇化可通過(guò)將聚乙二醇(PEG)部分連接于肽由此降低肽被腎清除以 及減少肽的蛋白酵降解來(lái)增強(qiáng)肽在體內(nèi)的半衰期。VPAC2受體激動(dòng)劑 的應(yīng)用受其非常短的體內(nèi)半衰期的嚴(yán)重限制；然而，連接PEG部分與 肽(聚乙二醇化)延長(zhǎng)了肽的半衰期，使其充分地允許一天一次至一 周一次的治療.聚乙二醇化可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法來(lái)進(jìn)行.然而，在此實(shí) 施例中，通過(guò)將唯一的半胱氨酸突變引入到肽中，然后通過(guò)肽的巰基 和曱氧基-PEG-馬來(lái)酖亞胺試劑(Nektar (Inhale/Shearwater) ， San Carlos, CA)的巰基之間的穩(wěn)定的硫醚鍵將半胱氨酸聚乙二醇化來(lái)聚 乙二醇化。優(yōu)選地，在肽的C-末端導(dǎo)入唯一的半胱氨酸來(lái)最小化通過(guò) 聚乙二醇化導(dǎo)致的活性可能的減少。特定地，將兩倍摩爾的過(guò)量mPEGmal(MW22kD和43kD)試劑 添加給1毫克的肽(例如，在肽的C-末端具有半胱氨酸突變的SEQ ID NO:l)并在pH6溶于反應(yīng)緩沖液中(0.1M磷酸鈉/0.1M NaCI/0.1M EDTA)。在室溫下0.5小時(shí)后，將反應(yīng)用2倍摩爾的過(guò)量DTT對(duì) mPEG-mal進(jìn)行終止反應(yīng)，肽-PEG-mal反應(yīng)混合物被用于陽(yáng)離子交換 柱來(lái)除去殘余的PEG試劑，然后通過(guò)凝膠過(guò)濾柱來(lái)除去殘余的游離 肽。通過(guò)SDS-PAGE和MALDI-TOF質(zhì)譜法測(cè)定聚乙二醇化位點(diǎn)的純 度、質(zhì)量和數(shù)目。當(dāng)22kDPEG附著于本發(fā)明的舦時(shí)，有效的VPAC2 受體激活被保持.此外，VPAC2對(duì)VPAC1和PAC1的受體激活選擇 性也被保留。用較小PEG(例如，線性22 kD PEG)聚乙二醇化較小 地降低肽的活性是可能的，而大的PEG (例如，分支的43kD PEG) 將更可能地降低活性。然而，較大的PEG將進(jìn)一步增強(qiáng)血漿半衰期， 4吏得一周一次的注射是可能的(Harris等，Clin. Pharmacokinet， 40:539-551,2001 ).實(shí)施例3.肽的克隆為了重組表達(dá)這些肽，將編碼肽的DNA序列在C-末端克隆到具有 分離單體的肽和GST的單因子X(jué)a識(shí)別位點(diǎn)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GST),通過(guò)雜交包含BamHI或XhoI限制性酶位點(diǎn)的兩個(gè)重疊的 單鏈DNA片段(70-90 mers )來(lái)合成編碼融合到肽的DNA序列的因子 Xa識(shí)別位點(diǎn)的基因，隨后克隆基因DNA序列的5'，然后通過(guò)DNA聚 合酶I (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)的大片段DNA合成相對(duì)的鏈。基于設(shè)計(jì)的各肽氨基酸序列的反向翻譯選擇各基因的DNA序列.在一些情況下，通過(guò)對(duì)上述方法制備的基因進(jìn)行PCR突變 來(lái)產(chǎn)生編碼肽的基因(Picard等，Nucleic Acids Res 22:2587-91,1994; Sambrook等，Molecular Cloning:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn) 室出版社，紐約，1989).然后通過(guò)BamHI和XhoI降解雙鏈產(chǎn)物并 連接到也已用Bam HI和Xho I降解的pGEX-6P-l ( Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上。例如，為了表達(dá)作為與GST 的熔合物的SEQ ID NO:l，將設(shè)計(jì)的DNA序列(圖2 )克隆到pGEX-6P-l 中。實(shí)施例4.肽的重組表達(dá)和純化在371C培養(yǎng)用含質(zhì)粒的GST-肽熔合物轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)胞 (Stratagene， LaJoIla, CA)直至OD綱達(dá)到0.6至1.0，然后細(xì)胞用 ImM IPTG (Life Technologies, Carlsbad, CA )在37"C溫育兩小時(shí)。 在7700g離心細(xì)胞(2L) 15分鐘，稱重，并儲(chǔ)存在JOTC至少3小時(shí)， 將冷凍的細(xì)胞丸被重新懸浮在100 mL含有250 pL蛋白酶抑制劑混合 物(Sigma Chemical, St. Louis, MO) /克細(xì)胞的水冷PBS中，在3x 下超聲處理1分鐘15秒。然后在10,000 g離心細(xì)胞20分鐘.將上清液 與2 mL的50%谷胱甘肽瓊脂糖4B樹(shù)脂(Pharmacia )混合，在4TC振 蕩器上過(guò)夜。在1,500 g下離心上清液/樹(shù)脂15分鐘，填充到空的聚制 備性層析柱(Bio-Rad， Hercules, CA)中，用30mLPBS，然后用10 mL因子X(jué)a緩沖液(1 mM CaC12, 100 mM NaCl，和50 mM Tris-HCl， pH8.0)沖洗。通過(guò)加入60單位的在1 mL因子X(jué)a緩沖液中的因子X(jué)a (Pharmacia)從柱裂解肽，在4TC溫育過(guò)夜，并通過(guò)C18 HPLC (Beckman System Gold)分離，利用2 mL環(huán)和2 mL/分4中的流速進(jìn)行 下列的程序IO分鐘的緩沖液A (0.1%TFA/H20) ， 30分鐘的緩沖液 B (0.1%TFA/ACN)的梯度，10分鐘的緩沖液A， 10分鐘的梯度，和 10分鐘的緩沖液A。收集峰組分(每個(gè)1 mL)并通過(guò)10-20"/。 Tricine-SDS凝膠電泳篩選。收集含有閨1的肽的組分并干燥。典型的 產(chǎn)量為幾百微克的游離肽/升大腸桿菌培養(yǎng)物。重組肽顯示與其合成形 式具有相同的活性.實(shí)施例5.從分散的大鼠小烏細(xì)胞分泌胰島素根據(jù)如下步驟測(cè)定由本發(fā)明的大量肽介導(dǎo)的分散的大鼠胰島的胰烏素分泌.利用膠原酶降解從SD大鼠(200-250g)分離的胰島。用胰 蛋白酶處理分散的胰烏細(xì)胞，接種到96孔V形底平板中，并進(jìn)行粒狀 沉淀。然后在含有或者不含有本發(fā)明肽的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng).對(duì)培養(yǎng) 基抽氣并在371C用含有3 mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES緩沖液 預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。除去預(yù)溫育緩沖液，并在37TC將細(xì)胞培養(yǎng)在含有或者不 含肽的合適葡萄糖濃度(例如，8 mM)的Krebs-Ringer-HEPES緩沖 液中達(dá)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。在某些研究中，也包括合適濃度的GLP-l.除去 一部分上清液并通過(guò)SPA測(cè)定其胰島素含量。結(jié)果用"對(duì)照的倍數(shù)" (FOC )來(lái)表示。在300 nM濃度時(shí)，具有SEQ ID NO:l+cys+PEG ( 43kD )的氨基酸序列的多肽使分散的胰烏細(xì)胞的胰島素分泌增加了大約 1.7倍(附困3)。在該分析中，分散的大鼠胰烏細(xì)胞分泌的胰烏素被確定為增加了 至少1.4倍.本發(fā)明多肽的VPAC2受體激動(dòng)劑組分使分散的胰烏細(xì)胞 分泌的胰島素增加了至少1.4倍到約1.7倍 實(shí)施例6.聚乙二醇化肽對(duì)大鼠腹膜內(nèi)葡萄糖耐量的作用通過(guò)對(duì)大鼠皮下給藥檢測(cè)本發(fā)明的聚乙二醇化肽的體內(nèi)活性。給 禁食過(guò)夜的大鼠皮下注射對(duì)照或聚乙二醇化肽U-100網(wǎng)/kg) . 3小時(shí) 后，測(cè)定基礎(chǔ)血糖，并對(duì)大鼠腹膜內(nèi)施用2 g/kg的葡萄糖.15、 30和 60分鐘后再次測(cè)定血糖。根據(jù)IPGTT (腹膜內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn))，本 發(fā)明的代表性聚乙二醇化肽相對(duì)于介質(zhì)顯著地降低了血糖水平，葡萄 糖AUC減少了 17%-28% (附圖4)。這表明聚乙二醇化肽具有體內(nèi)延 長(zhǎng)的降低葡萄糖的活性。本發(fā)明的聚乙二醇化肽除了具有降低葡萄糖 的活性外，它也顯示出延長(zhǎng)肽在體內(nèi)的半衰期的活性。PACAP-27具有 非常短的體內(nèi)半衰期(IO分鐘)。在肽給藥后3小時(shí)，本發(fā)明的聚乙 二醇化肽降低血糖的能力是在此時(shí)間點(diǎn)上在循環(huán)中存在所述肽的明顯 標(biāo)志并且由此相對(duì)于PACAP-27，具有延長(zhǎng)的半衰期。實(shí)施例7, cAMP SPA將表達(dá)VPAC2肽的CHO細(xì)胞以8 x 104細(xì)胞/孔的濃度在96-孔平 板中涂板，并在37TC于aMEM、核苷、谷氨酰胺(Gibco/BRL， Rockville， MD) 、 5%FBS、 100 ( g/mL Pen/Strep， 0.4mg/mL潮霉素 和1.5mg/mL的遣傳霉素(Gibco/BRL)中生長(zhǎng)24小時(shí)。除去培養(yǎng)基， 并用PBS清洗平板，用肽(于10 mM Hepes， 150 mM NaCl， 5 mM KC1，2.5mMCaCl2, 1.2 mM KH2P04， 1.2 mM MgS04， 25 mM NaHC03 ( pH 7.4 ) ， 1% BSA和100 !iM IBMX )在371C溫育細(xì)胞15分鐘，利用cAMP SPA直接篩選分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Piscataway, NJ)測(cè)定細(xì)胞提取物中cAMP的量。按照試劑盒提供的 說(shuō)明書確定裂解物中cAMP的量。利用Prizm軟件通過(guò)非線性回歸標(biāo) 繪每個(gè)肽濃度產(chǎn)生的cAMP的量，并進(jìn)行分析以確定每種肽的EC50?；赩IP設(shè)計(jì)本發(fā)明的多肽已經(jīng)顯示出缺少在PAC1處的活性 (Vaudry等，Pharmacol. Rev, 52:269畫324，2000),因此，人們相信本 發(fā)明的多肽在PAC1處不具有明顯的活性。對(duì)本發(fā)明的代表性多肽的分析結(jié)果顯示于下表l中.確定為P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽都是VPAC2受體的有效激動(dòng)劑，通過(guò) 內(nèi)源肽PACAP-27激活受體來(lái)實(shí)現(xiàn)受體激活達(dá)到100%的最高水平。此 外，確定為P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽是選擇性的VPAC2受 體拮抗劑，具有對(duì)VPAC1非常弱的拮抗劑活性.PACAP-27是VPAC1 的有效拮抗劑.表l肽SEQ ID NO.VPAC2 EC50 ( nM)VPAC1 EC50 ( nM )PACAP-27SEQ ID NO:1160.090.35P5SEQ ID NO:l0.33232.5P7SEQ ID NO:57.81>1000P8SEQ ID NO:20.19130.5P12SEQ ID NO:l+ C-末端的Cys0.38>1000P12加22 kD PEG1.32>1000P12加43 kD PEG4.19>1000實(shí)施例8.藥物組合物-IV和SC制劑利用本領(lǐng)域公知的任一生產(chǎn)方法，用4mg的SEQIDNO:l的多肽 或具有4 mg多肽含量的當(dāng)量的衍生的多肽和1L無(wú)菌鹽水制備無(wú)菌IV 注射制劑。高濃度的多肽可用于制備SC制劑。對(duì)于確定為SEQ ID NO:l的多肽或衍生的多肽而言，將4 mg的所述多肽溶于100 mL鹽水或 DMSO中，并在無(wú)菌小瓶無(wú)菌過(guò)濾后填充所述組合物. 實(shí)施例9.包括本發(fā)明肽的制劑的穩(wěn)定性將實(shí)施例8描述的制劑放置于恒定穩(wěn)定性小室中.定期取出樣品 通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析，所述毛細(xì)管電泳是檢測(cè)這些制劑中多肽降 解的最靈敏的方法。對(duì)多個(gè)峰面積求和，并用親本多肽的峰區(qū)域除以 峰面積總數(shù)(附圖5和6)。比值是純度％。因?yàn)樾迈r多肽中存在雜質(zhì)， 通過(guò)用不同時(shí)間點(diǎn)的純度除以初始純度來(lái)將純度改變標(biāo)準(zhǔn)化. 實(shí)施例IO.生成肽特異性抗體并通過(guò)EUSA測(cè)定肽 通過(guò)利用ABI433A肽合成儀合成本發(fā)明多肽的特異性片段而產(chǎn)生 本發(fā)明多肽的多克隆特異性抗體。然后從樹(shù)脂裂解肽，并在Beckman System Gold的分析和并制備性的HPLC體系上進(jìn)行純化'透視MALDI質(zhì)詳分光光度計(jì)系統(tǒng)用來(lái)鑒定正確的產(chǎn)物，利用冷凍干燥器干燥肽。 然后將肽(2 mg)通過(guò)Cys上的游離疏基基團(tuán)結(jié)合到鑰孔血蘭素 (KLH)上。在第0、 14、 35、 56和77天免疫雌性新西蘭白兔。在第0天用250 mg肽和完全的Feund佐劑皮下注射每只兔子.隨后每只兔子使用125 mg肽進(jìn)行免疫，在第21天開(kāi)始取血并在此后每隔21天連續(xù)取血。通 過(guò)將粗血清流過(guò)特異性肽親和純化柱進(jìn)行抗肽抗體的純化。通過(guò) ELISA測(cè)定抗體滴度。用特異于本發(fā)明肽的C-末端Morphosys F ( ab )抗體包被96-孔 Immulon4HBX平板并在41C溫育過(guò)夜，然后封閉平板防止非特異性結(jié) 合，然后將肽標(biāo)準(zhǔn)樣品(2500 ng/mL-160 pg/mL)稀釋在33%的血漿 中，并將樣品以l:3稀釋在緩沖液中，隨后在室溫下溫育1.5小時(shí).清 洗后，將特異于本發(fā)明肽的多克隆N-末端抗體在平板上溫育1小時(shí). 隨后添加辣根過(guò)氣化酶(HRP)-驢抗兔抗體，并將樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品溫 育1小時(shí)，用3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液溫育后評(píng)估檢測(cè)并 在OD4S0處讀取平板(附圖7 )?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的體外、離體和體內(nèi)分析完成本發(fā)明多肽的 活性檢測(cè)。例如，為了證明藥劑對(duì)治療糖尿病和相關(guān)紊亂，諸如X綜 合癥、葡萄糖耐量削弱、禁食葡萄糖減少和血胰烏素增多；動(dòng)脈粥樣 硬化病和相關(guān)紊亂，諸如高甘油三酯血癥；以及肥胖癥的效力，可以使用下列分析。測(cè)定血糖水平的方法對(duì)db/db小鼠(獲自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME )放 血(通過(guò)眼或者尾靜脈放血)并根據(jù)當(dāng)量平均血糖水平進(jìn)行分組。用 試驗(yàn)多肽每日口服給藥(通過(guò)藥用栽體用填喂法) 一次，共14天.此 時(shí)，通過(guò)眼或尾角靜脈再次對(duì)動(dòng)物放血并確定血糖水平。在所有情況 下，用GIucometer Elite XL ( Bayer Corporation, Elkhart, IN)測(cè)定葡萄糖水平.甘油三酯水平的測(cè)定方法對(duì)hApoAl小鼠(獲自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME ) 取血(通過(guò)眼或者尾靜脈取血)并根據(jù)當(dāng)量平均血清甘油三酯水平進(jìn) 行分組。用試驗(yàn)多肽每日口服給藥(通過(guò)藥用栽體用填哏法) 一次， 共8天。然后經(jīng)眼或尾角靜脈再次對(duì)動(dòng)物取血并確定血清甘油三酯的 水平。在/斤有情〗兄下,矛J用Teclmicon Axon Autoanalyzer (Bayer Corporation, Tarrytown， NY)測(cè)定甘油三酯的水平，高密度脂蛋白膽固醇含量的測(cè)定方法為了確定血漿HDL-膽固醇含量，對(duì)hApoAl小鼠取血并根據(jù)當(dāng)量 平均血漿HDL-膽固醇含量進(jìn)行分組。給小鼠每日口服栽體或試驗(yàn)多 肽，每日 一次，共7天，然后在第8天再次取血.利用Synchron Clinical System ( CX4 ) ( Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血漿的HDL陽(yáng) 膽固醇。總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及葡萄糖水平的測(cè)定方法 在另一體內(nèi)分析中，對(duì)肥胖猴取血，然后每日一次口服栽體或試驗(yàn)多肽，歷時(shí)4周，然后再次取血'利用Synchron Clinical System (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血清的總膽固醇、HDL-膽固醇、甘油三酯以及葡菊糖。通過(guò)0 liver等，(Pr oc. Natl. Acad.Sci. USA 98:5306-5311,2001 )描述的核磁共振詳學(xué)分析脂蛋白亞類. 對(duì)心血管參數(shù)的影響的測(cè)定方法也進(jìn)行心血管參數(shù)(例如，心率以及血壓)的評(píng)估。給SHR大鼠 每曰一次口服栽體或試驗(yàn)多肽，歷時(shí)2周。利用Grinsell等，(Am.J. Hypertens. 13:370-375,2000)描述的尾-套箍方法測(cè)定血壓和心率。如 Shen等(J. Pharmacol, Exp, Therap. 278:1435-1443,1996)所述監(jiān)控猴的血壓和心率。評(píng)估化合物對(duì)瘦弱過(guò)夜禁食的大鼠食物攝入減少(抑制食欲)的效果空腹-再喂養(yǎng)急性喂料分析本方案的目的是測(cè)定單劑量的未知化合物對(duì)瘦弱的過(guò)夜空腹大鼠 食物消耗的影響?？崭?再喂養(yǎng)大鼠模型常常用于肥胖癥領(lǐng)域以鑒定可 能具有厭食作用的化合物.此動(dòng)物模型已被成功用于鑒定和表征正在 或者已被用于控制肥胖人體重的化合物的效果分布圖(參見(jiàn)，例如Balvet等，Gen. Pharmacol. 13:293-297,1982; Grignaschi等，Br. J, Pharmacol, 127:11卯-1194，1999; McTavish和Heel, Drug 43:713-733,1992; Rowland等，Life Sci. 36:2295-2300,1985 ),典型的研究包括平均體重約為280 g的60-80只雄性大鼠(n=10/ 試驗(yàn)組)，將大鼠關(guān)在控制溫度和濕度以及12/12光暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物 房?jī)?nèi)。將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在具有網(wǎng)孔底板的懸挫籠中，連續(xù)給水和食物， 除非是研究空腹動(dòng)物時(shí)。栽體試驗(yàn)基于栽體試驗(yàn)中大鼠的表現(xiàn)進(jìn)行分組。在效果試驗(yàn)前 的2和7天之間進(jìn)行栽體試驗(yàn)。黑暗期間(總共約16-18小時(shí))對(duì)大鼠 過(guò)夜禁食.給動(dòng)物0.5mL的去離子水，給藥后1小時(shí)，將預(yù)稱重的食 物瓶放回動(dòng)物籠，允許大鼠進(jìn)食l小時(shí).l小時(shí)后，將灑落的物質(zhì)放回 食物缸以確定消耗的食物量。將大鼠分配成組，使得1小時(shí)食物消耗 的平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差在組之間類似.效杲試驗(yàn)在黑暗階段(總共約16-18小時(shí))將大鼠禁食過(guò)夜。用 指定劑量的多肽處理動(dòng)物。給藥后1小時(shí)，將預(yù)稱重的食物放回籠內(nèi)。 返回食物后在30、 60、 90、 180和240分鐘時(shí)記錄食物攝入量。測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的食物消耗量，將灑落的物質(zhì)放回食物瓶，然后對(duì)食物瓶稱 重。測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的食物消耗量.利用合適的統(tǒng)計(jì)分析確定處理組 之間的差異.評(píng)估化合物對(duì)肥胖Zucker fa/fa大鼠體重減少以及食物和耗水量 的效果長(zhǎng)期喂料分析此方案的目的是測(cè)定未知化合物的長(zhǎng)期給藥對(duì)肥胖Zucker fa/fa 大鼠體重以及食物和水耗量的影響，肥胖Zuckerfa/fa大鼠常常用于測(cè)定化合物在體重減少中的效果.這個(gè)動(dòng)物模型已經(jīng)成功地用于鑒定和 表征正在或已經(jīng)用于控制肥胖人體重的化合物效果分布圖(參見(jiàn)，例如，Al-Barazanji等,Obes Res. 8:317-323，2000; Assimacopoulos曙Jeannet 等，Am, J, Physiol. 260( 2 Pt 2 ):R278-283，1991; Dryden等，Horm. Metab. Res. 31:363-366,1999; Edwards和Stevens, Pharmacol. Biochem. Behav. 47:865-872,1994; Grinker等，Pharmacol. Biochem. Behav. 12:265-275,1980)。典型的研究包括平均體重約550 g的60-80只雄性Zucker fa/fa (11=10/試驗(yàn)組)。將大鼠關(guān)在控制溫度和濕度以及12/12光暗循環(huán)的 標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。連續(xù)進(jìn)水和食物。將大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在具有格形地面的 大的大鼠鞋盒中。在記錄兩天體重的基線測(cè)定值和24-小時(shí)的食物和水 耗量前，使動(dòng)物適應(yīng)格形地面和用研究載體模仿劑量至少4天?；?基線上他們的體重將大鼠歸于6-8個(gè)試驗(yàn)組中的一個(gè).設(shè)立分組使得平均體重的平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)差類似.在LD/周期的黑暗階段前，每日通過(guò)填喂法給動(dòng)物口服指定劑量的 多肽達(dá)預(yù)確定的天數(shù)(一般6-14天).在這時(shí)候測(cè)定體重、食物和水 耗量。在最后一天，通過(guò)吸入C02處死動(dòng)物，并測(cè)定體重。可以通過(guò)利用這種長(zhǎng)期的喂料分析來(lái)測(cè)定本發(fā)明的多肽對(duì)減輕或 控制體重的效果.所有上述說(shuō)明書中提及的出版物和專利都在此處引作參考。對(duì)本 發(fā)明所述的組合物和方法的各種修飾和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而 易見(jiàn)的，只要不離開(kāi)本發(fā)明的范圍和精神，雖然已經(jīng)連同具體的優(yōu)選 實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解要求保護(hù)的所述的本發(fā) 明不應(yīng)該受限于這種具體的實(shí)施方案，實(shí)際上，對(duì)于分子生物學(xué)或相 關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的實(shí)施本發(fā)明的上述方案的各種修飾應(yīng) 在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就 應(yīng)該認(rèn)識(shí)到或能夠確定本發(fā)明所述的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)物。這 種等價(jià)物應(yīng)該包括在下列權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種選自SEQ ID NOs1至152及其功能性等價(jià)片段、衍生物和變體的多肽。
2. 編碼權(quán)利要求l的多肽序列的多核苷酸或其簡(jiǎn)并變體。
3. —種含有權(quán)利要求2的多核苷酸的栽體.
4. 一種含有權(quán)利要求3的栽體的宿主細(xì)胞。
5. —種產(chǎn)生多肽的方法，包括a) 在適于所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞；和b) 從該宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述的多肽-
6. —種純化的抗體，其特異性與權(quán)利要求l的多肽結(jié)合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的多肽，其中所述的多肽選自SEQIDNOs:l、 2、 3、 4和5。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述的多肽選自SEQ ID NOs:115、 116、 117、 118和119。
9. 一種選自SEQIDNOs:154至264的多核苷酸.
10. —種藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1的多肽或其 功能性等價(jià)物片段、衍生物和變體以及藥學(xué)上可接受的栽體.
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述的組合物包括大約 2%到大約30%的DMSO和任選的選自丙二醇、二甲基甲酰胺、碳酸 亞丙基酯、聚乙二醇和甘油三酯的溶劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述的多肽選自SEQID NOs:l、 2、 3、 4、 5、 115、 116、 117、 118和119。
13. —種藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求l的多肽或其 功能性等價(jià)物片段、衍生物和變體以及藥學(xué)上可接受的栽體和一或多 種藥物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述的藥物選自PPAR 激動(dòng)劑、磺酰脲藥物、非-磺酰脲促泌劑、oc-葡糖苷酶抑制劑、胰島素 敏化劑、胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰鳥(niǎo)素、抗 肥胖癥藥物、HMG輔酵A還原酶抑制劑、煙酸、膽汁酸螯合劑、纖維酸衍生物以及抗高血壓的藥物.
15. —種包括治療有效量的權(quán)利要求1的多肽或其功能性等價(jià)物 片段、衍生物和變體以及與其結(jié)合的惰性栽體的組合物。
16. —種治療糖尿病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的糖尿病選自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期發(fā)病型糖尿病、成人隱匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
18. —種治療綜合癥X的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟。
19. 一種治療與糖尿病相關(guān)的疾病的方法，包括給需要治療的受試 者給藥治療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的與糖尿病-相關(guān)的疾病選 自高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂紊亂、高甘油三酯血癥和胰島素抗性'
21. —種治療糖尿病的方法，包括給需要治療的受試者給藥與一或 多種藥物組合的治療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟.
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動(dòng)劑、 磺酰脲藥物、非-磺酖脲促泌劑、a-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化刑、 胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖癥藥 物.
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的糖尿病選自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期發(fā)病型糖尿病、成人隱匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
24. —種治療綜合癥X的方法，包括給需要治療的受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動(dòng)劑、磺酰脲藥物、非-磺酰脲促泌劑、ot-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、 胰島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖癥藥 物。
26. —種治療與糖尿病相關(guān)的疾病的方法，包括給需要治療的受試 者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的與糖尿病相關(guān)的疾病選 自高血糖、血胰島素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊亂、高甘油三酯血癥和胰島素抗性。
28. 根據(jù)要求27的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動(dòng)刑、磺 酰脲藥物、非磺耽脲促泌劑、ot-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、胰 島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰島素和抗肥胖癥藥物。
29. —種治療糖尿病、綜合癥X或與糖尿病相關(guān)的疾病的方法， 包括給需要治療的受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權(quán) 利要求l的多肽的步驟，其中藥物選自HMG輔酶A還原酶抑制劑、 煙酸、膽汁酸螯合劑、纖維酸衍生物和抗高血壓的藥物.
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的與糖尿病相關(guān)的疾病選 自高血糖、血胰島素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂奮亂、高甘油三酯血癥和胰島素抗性，
31. 根據(jù)權(quán)利要求21到30中任意一項(xiàng)的方法，其中將權(quán)利要求l 的多肽和一種或多種藥物作為單藥物劑量制劑給藥。
32. —種治療或預(yù)防糖尿病的次級(jí)起因的方法，包括給需要治療或 預(yù)防的受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述的次級(jí)起因選自糖皮質(zhì)激 素過(guò)量、生長(zhǎng)激素過(guò)量、嗜鉻細(xì)胞瘤和藥物誘導(dǎo)的糖尿病。
34. —種治療或預(yù)防糖尿病的次級(jí)起因的方法，包括給需要的治療 或預(yù)防受試者給藥與一或多種藥物組合的治療有效量的權(quán)利要求1的 多肽的步驟.
35. 根據(jù)要求34的方法，其中所述的藥物選自PPAR激動(dòng)劑、磺 酰脲藥物、非-磺酰脲促泌劑、a-葡糖苷酶抑制劑、胰島素敏化劑、胰 島素促泌劑、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰烏素和抗肥胖癥藥物.
36. —種治療呼吸道疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
37. —種治療肥胖癥的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療有 效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
38. —種調(diào)節(jié)食欲的方法，包括給需要調(diào)節(jié)食欲的受試者給藥治療 有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟.
39. —種治療心血管疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
40. —種治療或預(yù)防脂質(zhì)和碳水化合物代謝疾病的方法，包括給需要治療或預(yù)防的受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟，
41. 一種治療睡眠障礙的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療 有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟.
42. —種治療男性生殖疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥 治療有效量的權(quán)利要求1的多肽的步驟.
43. —種治療生長(zhǎng)疾病或能量穩(wěn)態(tài)紊亂的方法，包括給需要治療的 受試者給藥治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
44. 一種治療免疫疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥治療 有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
45. —種治療自身免疫疾病的方法，包括給需要治療的受試者給藥 治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟.
46. —種治療急性和慢性炎癥性疾病的方法，包括給需要治療的受 試者給藥治療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟。
47. —種治療膿毒性休克的方法，包括給需要治療的受試者給藥治 療有效量的權(quán)利要求l的多肽的步驟，
48. —種通過(guò)給受試者給藥權(quán)利要求1的多肽而以葡萄糖依賴性 的方式在受試者中刺激胰烏素釋放的方法.
49. 一種基因治療組合物，它包括與治療有效量的基因治療栽體組 合的權(quán)利要求2的多核苷酸.
50. 用于治療和/或預(yù)防糖尿病和與糖尿病-相關(guān)的疾病的權(quán)利要求 1的多肽。
51. 含有至少一種權(quán)利要求1的多肽以及至少一種藥學(xué)上可接受 的、藥學(xué)上安全的栽體或賦形劑的藥物。
52. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽在生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防糖尿病和與 糖尿病-相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用.
53.用于治療和/或預(yù)防糖尿病的權(quán)利要求51的藥物.
全文摘要
本發(fā)明提供了新的在體內(nèi)作為VPAC2受體激動(dòng)劑的肽。這些胰島素促分泌的多肽顯示出當(dāng)葡萄糖攻擊時(shí)比對(duì)照更為降低體內(nèi)的血糖。本發(fā)明的多肽在制劑中也是穩(wěn)定的并且具有長(zhǎng)的半衰期。該本發(fā)明的肽為具有降低的內(nèi)源胰島素分泌，尤其是II型糖尿病的患者提供了一種新的治療方案。具體地，本發(fā)明是一種選自VPAC2相關(guān)多肽或其功能性等價(jià)物的特異性組的多肽。本發(fā)明也提供了治療哺乳動(dòng)物代謝疾病的方法，包括將治療有效量的胰島素促分泌肽給藥于所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明也公開(kāi)了制備本發(fā)明多肽的方法，包括重組的和合成的兩種。
文檔編號(hào)C07K14/705GK101405298SQ03816644
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者D·N·克爾納, J·惠蘭, M·L·杜馬斯, W·A·弗羅蘭德, 潘曉群, 煒 王, 王有章 申請(qǐng)人:拜爾藥品公司