專利名稱：人神經(jīng)肽受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新近鑒別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途以及這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的多肽是人7-轉(zhuǎn)膜G-蛋白偶聯(lián)受體。更具體地說，本發(fā)明的多肽是神經(jīng)肽受體多肽(此后有時(shí)稱作神經(jīng)肽受體多肽)。本發(fā)明也涉及抑制這些多肽的作用的方法。
肥胖癥是在西方社會(huì)中最普通的營(yíng)養(yǎng)性疾病。十個(gè)成年的美國(guó)人中的三個(gè)體重超過他們理想體重的至少20％(Burroa，M.紐約時(shí)報(bào)，19947月17日)。增加的體重是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，因?yàn)樗cII型糖尿病，高血壓，血脂過多和某些癌癥有關(guān)(Grundy，S.M.和Barnett，J.P.，Disease-a-Month，36645-696(1990))。
在導(dǎo)致肥胖表型的小鼠肥胖基因(ob)中的5個(gè)單一基因突變已有描述(Priedman，J.M.&Leibel，R.L，細(xì)胞，66217-220(1990))。小鼠ob基因和其人類同系物的克隆與測(cè)序已被報(bào)道(Zhang，Y.，等，自然，372425-431(1994))。ob基因編碼具有高度保守的167個(gè)氨基酸的開放讀框的4.5-kb脂肪組織mRNA。預(yù)測(cè)的氨基酸序列在人類和小鼠之間84％相同，并且具有分泌蛋白質(zhì)的特征。ob基因產(chǎn)物可以作為脂肪組織信號(hào)途徑的一部分起作用，其為了調(diào)節(jié)身體脂肪積存而發(fā)揮作用(同上，425)。
在牽涉進(jìn)食行為調(diào)節(jié)的腦區(qū)中，下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核(VMH)被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最重要的飽滿中心。因此假定在哺乳動(dòng)物中的能量平衡被反饋-環(huán)控制，在其中所存儲(chǔ)的能量的量由下丘腦感知，其調(diào)節(jié)食物攝入和能量消耗以維持恒定體溫(Ombeck，J.R.，Yale生物醫(yī)學(xué)雜志，20545-552(1948)和Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。在脂郁積(lipostasis)理論中，身體脂肪積存的多少由CNS調(diào)節(jié)，身體脂肪代謝的產(chǎn)物通過與下丘腦相互作用來影響能量平衡(Kennedy，G.C.，Proc.R.Soc.148578-592(1953))。
不能從脂肪鑒別推定的信號(hào)障礙了脂郁積理論的證實(shí)。至少一種信號(hào)系統(tǒng)的組分在血流中循環(huán)的可能性最早由Hervey提出(Dietrich，W.等，遺傳學(xué)，131423-447(1992))，他顯示了通過血管移植物將血液從具有VMH損傷的動(dòng)物轉(zhuǎn)移到未處理的動(dòng)物中(聯(lián)體生活實(shí)驗(yàn))導(dǎo)致在無傷的動(dòng)物中食物攝取的減弱。現(xiàn)在明顯的是，具有ob基因產(chǎn)物被分泌的證據(jù)，表明ob可以編碼這一循環(huán)因子。
ob信號(hào)可以直接或者間接地作用于CNS上，以作為內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)制的一部分抑制食物攝取和/或者調(diào)節(jié)能量消耗，保持脂肪質(zhì)量的恒定性(Zhang，V等，自然，372425-431，431(1994))。ob基因顯然編碼脂肪分泌的蛋白質(zhì)，并且突變明顯地阻止所述基因的翻譯或表達(dá)(Rink，T.，自然，372406-407(1994))。
聯(lián)體生活實(shí)驗(yàn)表明ob受體由小鼠db(糖尿病)基因編碼(Coleman，D.L.，Diabetologia，14141-149(1978))。具有db基因中的突變的小鼠也肥胖，具有可能是受體缺損的缺損(同上，406)。
神經(jīng)肽Y類似于ob基因產(chǎn)物之處在于它調(diào)節(jié)進(jìn)食反應(yīng)。神經(jīng)肽Y作用于被稱為Y1、Y2、Y3和非典型的Y1受體(其調(diào)節(jié)由神經(jīng)肽Y刺激的進(jìn)食反應(yīng))的至少四種類型的神經(jīng)肽Y受體上。
神經(jīng)肽Y有各式各樣的生物功能。發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽Y廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中，在PNS中，神經(jīng)肽Y在血管去甲腎上腺素能交感神經(jīng)神經(jīng)分布和其它平滑肌組織中以及腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)肽Y免疫反應(yīng)性纖維也出現(xiàn)在非血管平滑肌中，圍繞著外分泌腺和表面上皮。神經(jīng)肽Y也出現(xiàn)在神經(jīng)元亞群中，一般與其它神經(jīng)介質(zhì)(特定的去甲腎上腺素)共同定位。
在CNS中，神經(jīng)肽Y包含在更高的中心和優(yōu)勢(shì)兒茶酚胺能細(xì)胞(其更后地凸出)的GABA能中間神經(jīng)元中。例如，神經(jīng)肽Y包含在皮、海馬、扁桃體、基部前腦和紋狀體中的中間神經(jīng)元中，而在人腦干中，神經(jīng)肽Y包含在髓質(zhì)和藍(lán)斑(locus coeruleus)(LC)中的A1和A2組的去甲腎上腺素能神經(jīng)元中。在下丘腦中，神經(jīng)肽Y顯著地在弓形核和外側(cè)下丘腦發(fā)現(xiàn)。
在外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，神經(jīng)肽Y存在于神經(jīng)節(jié)后部交感神經(jīng)中，并如上所述，與其它神經(jīng)介質(zhì)(包括兒茶酚胺)共同定位。當(dāng)在藥理學(xué)上使用時(shí)，神經(jīng)肽Y顯示出有效的血管收縮活性，并且戲劇性地加強(qiáng)由許多其它壓力劑產(chǎn)生的血管收縮。特別是，發(fā)現(xiàn)在交感神經(jīng)中高濃度的神經(jīng)肽Y使得冠狀、腦部和腎部血管收縮，并且當(dāng)融合進(jìn)這些血管床時(shí)，神經(jīng)肽Y導(dǎo)致延長(zhǎng)的不被腎上腺素能阻斷劑逆轉(zhuǎn)的血管收縮。這些觀察結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生這樣一種觀點(diǎn)神經(jīng)肽Y是病理學(xué)血管痙攣(當(dāng)涉及冠狀和腦部血管時(shí)，是主要的發(fā)病和死亡因素)的候選介質(zhì)。
神經(jīng)肽Y似乎也牽涉與腎素血管緊張素系統(tǒng)的相互作用。在腎皮層近血管小球器官中發(fā)現(xiàn)含有交感神經(jīng)末端的神經(jīng)肽Y，并且神經(jīng)肽影響腎素釋放。這些信息以及高血壓動(dòng)物模型中神經(jīng)肽Y濃度的所有持續(xù)時(shí)間的實(shí)證和輸注所述肽的壓力反應(yīng)導(dǎo)致得自這樣一種結(jié)論這種肽牽涉到高血壓。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)肽Y主要定位在中間神經(jīng)元之內(nèi)，在此其似乎具有調(diào)節(jié)作用。因此，其具有廣泛的和不同的作用，包括對(duì)記憶的作用和在阿耳茨海默氏病中的可能的作用。神經(jīng)肽Y是引起增加進(jìn)食的最有效的已知物質(zhì)，可以在II型糖尿病的遺傳基礎(chǔ)中起作用。神經(jīng)肽Y也可以作為壓迫反應(yīng)和生殖功能中的調(diào)節(jié)劑和腦垂體功能以及潛在的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能發(fā)揮作用。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新的成熟多肽以及其生物活性的和并且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人類來源的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的受體多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其反義類似物和其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種受體多肽的方法，該方法包括在促進(jìn)本發(fā)明的受體多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含有編碼所述受體多肽之核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞，并且接著回收所說的多肽。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了篩選結(jié)合到本發(fā)明的受體多肽上并激活該多肽或抑制該多肽的激活的化合物的方法。
按照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了為了刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞，增強(qiáng)活性水平和攝取的食物的利用度，向宿主施用化合物的方法，所述化合物結(jié)合到本發(fā)明的受體多肽上并激活該多肽，該多肽在預(yù)防和/或治療肥胖、高脂血和某些癌癥中是有用的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因治療施用所述受體多肽的方法，以治療與本發(fā)明的受體多肽的過量表達(dá)或所述受體多肽之配體的表達(dá)不足相關(guān)的病癥。
按照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供了向宿主施用化合物的方法，所述化合物結(jié)合到本發(fā)明的受體多肽上并抑制該多肽的激活，其在預(yù)防和/或治療阿耳茨海默氏病、II型糖尿病、癲癇、緊張、焦慮、高血壓，心血管病、精神病和由神經(jīng)肽Y引起的肥胖中是有用的。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長(zhǎng)度足以特異性地與編碼本發(fā)明的多核苷酸序列雜交的核酸分子。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)與編碼本發(fā)明的多肽之核酸序列中的突變相關(guān)的疾病以及檢測(cè)受體多肽的可溶形式的改變的水平的診斷測(cè)定方法。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將這些受體多肽，或編碼這些多肽的多核苷酸體外用于與科學(xué)研究、DNA合成及DNA載體的人工合成有關(guān)之目的的方法。
從本文的教導(dǎo)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
下列附圖用來說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而無意于用來限制本發(fā)明權(quán)利要求所包括的范圍。


圖1顯示了本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。采用373自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystem公司)進(jìn)行測(cè)序。
圖2顯示了本發(fā)明的神經(jīng)肽受體剪接變體1多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。
圖3顯示了本發(fā)明的神經(jīng)肽受體剪接變體2多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。
圖4說明了所述神經(jīng)肽受體的氨基酸序列和7個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)。所述轉(zhuǎn)膜區(qū)有下劃線，并用TM表示。
圖5說明了所述神經(jīng)肽受體剪接變體1的氨基酸序列和7個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)。所述轉(zhuǎn)膜區(qū)有下劃線，并用TM表示。
圖6說明了所述神經(jīng)肽受體剪接變體2的氨基酸序列和7個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)。所述轉(zhuǎn)膜區(qū)有下劃線，并用TM表示。
圖7顯示了本發(fā)明的人神經(jīng)肽受體多肽(和人神經(jīng)肽Y1受體)之間的氨基酸同源性。
本發(fā)明的受體多肽是一些已知和未知配體的受體，所說配體調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和由中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的外周組織兩者中的細(xì)胞的活性。這種配體的例子是神經(jīng)肽Y、物質(zhì)P、人ob基因產(chǎn)物和神經(jīng)激肽B。因此，本發(fā)明的受體多肽活性的調(diào)節(jié)會(huì)具有廣泛的治療和診斷用途，特別是對(duì)糖尿病的治療而言。
本發(fā)明人分離了編碼人類神經(jīng)肽受體多肽的全長(zhǎng)cDNA克隆。所述全長(zhǎng)cDNA已被定位到人1號(hào)染色體位置p31-34上，其相應(yīng)于發(fā)現(xiàn)db基因的小鼠4號(hào)染色體上的位置。人們認(rèn)為小鼠db基因編碼肥胖基因產(chǎn)物的受體。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或由1995年4月27日以保藏號(hào)ATCC-----保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
本發(fā)明的多核苷酸在來源于成人下丘腦的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，其在結(jié)構(gòu)上和G蛋白偶聯(lián)受體家族相關(guān)，所述神經(jīng)肽受體多肽包含一個(gè)編碼402個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開放讀框。所述神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)顯示出與人神經(jīng)肽受體Y1受體蛋白質(zhì)最高程度的同源性，在整個(gè)氨基酸序列上具有52％的相似性和26％的相同性。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡(jiǎn)并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其能和圖1的DNA(SEQ ID NO1)或所說保藏物的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖2的成熟多肽(SEQID NO2)或編碼由所述所說保藏物的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術(shù)語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。這種變體的特定例子包括SEQ ID NO3和5所示的多核苷酸序列，其分別編碼本發(fā)明的多肽的剪接變體1和2。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1中所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。本領(lǐng)域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，而實(shí)質(zhì)上不改變所編碼的多肽的功能。
所述多核苷酸也可以編碼神經(jīng)肽受體多肽的可溶形式，該多肽是本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽裂解TM和胞內(nèi)功能域后的多肽的胞外部分。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其用來純化與標(biāo)記融合的成熟多肽，或者例如當(dāng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。所說的HA標(biāo)記相應(yīng)于來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一種表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(條件是兩個(gè)序列之間具有至少70％，優(yōu)選地具有至少90％，更優(yōu)選地具有至少95％的等同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選地具有至少97％的相同性時(shí)雜交才可以發(fā)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實(shí)質(zhì)上保持與由圖1的cDNA(SEQ ID NO1)或所說保藏物的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性，即，通過保留結(jié)合受體之配體的的能力(即使所述多肽不能作為膜結(jié)合神經(jīng)肽受體起作用)，例如通過引發(fā)第二信使反應(yīng)，作為一種可溶性的神經(jīng)肽受體起作用。
此外，所述多核苷酸可以具這樣一些多核苷酸，其具有至少20個(gè)堿基，優(yōu)選地是至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選地是至少50個(gè)堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交，并且如上所述具有與該多核苷酸的相同性，不保留活性。這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸或其變體的探針，例如或作為診斷探針或作為PCR引物用于回收多核苷酸。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保持。這些保持物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對(duì)保藏材料的任何制造、使用或者銷售需要經(jīng)過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及多肽，其具有圖2的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的FGF多肽或具有由所說保藏物的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”，當(dāng)有關(guān)圖2的多肽(SEQ ID NO2)或由所說保藏物的cDNA編碼的多肽時(shí)，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。即，通過保留結(jié)合受體之配體的的能力(即使所述多肽不能作為膜結(jié)合神經(jīng)肽受體起作用)。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進(jìn)而產(chǎn)生活性成熟多肽激活。特定的例子分別是圖2和3(SEQ ID NO4和6)的剪接變體1和2。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說的圖2的多肽(SEQ ID NO2)或由所說保藏物的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基取代)取代并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的氨基酸殘基，或者(ii)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包含取代基，或者(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)這樣一種，其中附加氨基酸與成熟多肽融合，例如這樣一種序列，其是用來純化成熟多肽的序列，或者(iv)成熟多肽的剪接變體，該變體可以具有從成熟多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失。通過本文的闡述，可以認(rèn)為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，并且優(yōu)選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質(zhì)性的。
術(shù)語“基因”是指和產(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA區(qū)段；其包括編碼區(qū)之前的區(qū)域和之后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和尾隨序列)以及在各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語“分離的”意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動(dòng)物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因?yàn)檫@種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程操作(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所說的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程化宿主細(xì)胞可以在修飾得適于激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增人神經(jīng)肽受體基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度和pH值等，是以前用于表達(dá)選擇的宿主細(xì)胞的那些，對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
在表達(dá)載體中所說的DNA序列可操作地連接到適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)mRNA合成的表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)上。這樣的啟動(dòng)子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動(dòng)子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。所說的表達(dá)載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該載體也可以包含供擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，其提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征(例如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性)。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或者控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過本文的闡述，對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，該載體已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包含可操作連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括例如啟動(dòng)子。大量適合的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(St ratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體都可以使用，只要它們?cè)谒拗髦锌蓮?fù)制和穩(wěn)定。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體從任何所需的基因選擇啟動(dòng)子區(qū)。兩種合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核生物啟動(dòng)子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對(duì)適當(dāng)?shù)妮d體與啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)?？梢杂闪姿徕}轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來以常規(guī)方式生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。
本發(fā)明的多肽片段可以用于經(jīng)肽合成產(chǎn)生相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽。因此所述片段可以用作產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽的中間體。本發(fā)明的多肽片段可以以類似的方式用于合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽。
成熟蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下表達(dá)。采用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達(dá)載體。
高等真核生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄被插入到載體中的增強(qiáng)子序列增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動(dòng)子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)100至270 bp上的SV40增強(qiáng)子、細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)上的多形瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
一般來說，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表達(dá)基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進(jìn)周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質(zhì)包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或簡(jiǎn)化純化步驟。
通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列及合適的翻譯起始和終止信號(hào)以可操作閱讀方式(reading phase)與具有功能性啟動(dòng)子一起插入來構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體。所說載體包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，以在宿主來保證保持載體和需要時(shí)提供擴(kuò)增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種(雖然其它的也可以選擇來使用)。
作為一個(gè)代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達(dá)載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國(guó))。這些pBR322“骨架”片段與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。
在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時(shí)間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保持所形成的粗產(chǎn)物用于進(jìn)一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融循環(huán)、聲處理、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞裂解劑。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)、適合的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽可以用以前所使用的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時(shí)在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生的。依據(jù)重組產(chǎn)生方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作人類疾病的治療和診斷的研究試劑和材料。
本發(fā)明的人類神經(jīng)肽受體多肽可以用于篩選結(jié)合并激活所述受體多肽的化合物的方法中，和用于篩選結(jié)合到本發(fā)明的受體多肽上并抑制其激活的化合物的方法中。
一般來說，將分離的，固定化的或者細(xì)胞結(jié)合形式的神經(jīng)肽受體與多種化合物接觸并選擇那些與所述受體結(jié)合并與其相互作用的化合物。通過采用放射性標(biāo)記的感興趣化合物或通過從候選化合物的相互作用和結(jié)合產(chǎn)生的第二信使效應(yīng)可以直接測(cè)定所述的結(jié)合或相互作用。此外，可以對(duì)候選化合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)篩選測(cè)定，其中將已知配體和待試驗(yàn)的化合物一起引入，并測(cè)量化合物抑制或者增強(qiáng)標(biāo)記配體結(jié)合的能力，優(yōu)選的配體是用分析上可檢測(cè)的試劑標(biāo)記的，最優(yōu)選的是放射活性的。就化合物對(duì)本發(fā)明的受體多肽的增加的親和性和選擇性來篩選化合物。
一種這樣的方法涉及使用黑素細(xì)胞，該細(xì)胞是被轉(zhuǎn)染的以表達(dá)本發(fā)明的神經(jīng)肽受體。在1992年2月6日出版的PCT WO 92/01810中描述了這種篩選技術(shù)。
例如，為了篩選抑制本發(fā)明的受體多肽激活的化合物，將所述化合物和已知結(jié)合受體的配體與黑素細(xì)胞接觸。對(duì)配體產(chǎn)生的信號(hào)的抑制作用表明所述化合物抑制所述受體的激活。
通過將所述細(xì)胞與待篩選的化合物接觸并檢測(cè)這種化合物是否產(chǎn)生信號(hào)(即激活受體)，該篩選方法可以用于測(cè)定結(jié)合并活化本發(fā)明的受體多肽的化合物。
其它例子包括在測(cè)定由受體激活引起的胞外pH改變的系統(tǒng)中使用表達(dá)本發(fā)明的受體多肽的細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞)，例如科學(xué)，246卷，181-296(1989年10月)中所描述的。例如，可以將化合物與表達(dá)本發(fā)明的受體多肽的細(xì)胞接觸，并可以檢測(cè)第二信使反應(yīng)(例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或pH改變)，以確定所述潛在的化合物作為激活劑或抑制劑是否有效。
另一個(gè)例子涉及將編碼本發(fā)明的神經(jīng)肽受體的RNA引入到非洲蟾蜍屬卵母細(xì)胞中以瞬時(shí)表達(dá)所述受體。然后，可以將卵母細(xì)胞與受體配體和待篩選的化合物接觸，接著檢測(cè)胞內(nèi)鈣的抑制或增加。
另一個(gè)例子涉及在細(xì)胞表面表達(dá)本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽，其中，所述受體多肽連接到磷脂C或D上。作為這些細(xì)胞的代表性例子可以提到的是內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、胚腎細(xì)胞等?？梢匀缟纤鰪牧字诙盘?hào)檢測(cè)受體激活或受體激活的抑制來完成所述篩選。
另一種方法涉及測(cè)定標(biāo)記配體結(jié)合到細(xì)胞(在其表面上具有神經(jīng)肽受體)上的抑制作用。這樣一種方法包括用編碼本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以便所述細(xì)胞在其表面表達(dá)所述受體，并且在標(biāo)記形式的已知配體存在下使細(xì)胞與化合物接觸。所述配體可以是例如用放射性標(biāo)記的。通過例如測(cè)定受體的放射性檢測(cè)連接到受體上的標(biāo)記配體的量。如果在經(jīng)結(jié)合到受體上的標(biāo)記配體的減少測(cè)得化合物結(jié)合到受體上，則標(biāo)記配體與受體的結(jié)合受到抑制。
另一種篩選技術(shù)涉及在細(xì)胞表面表達(dá)本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽，其中，所述受體多肽連接到第二信使上以增加轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中胞質(zhì)鈣水平。這種方法的例子包括用編碼本發(fā)明的受體的核酸序列轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，以便所述受體在其表面表達(dá)。然后，將轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞在待篩選的化合物存在下在具有標(biāo)記鈣的反應(yīng)混合物中培養(yǎng)。然后通過利用標(biāo)記(例如放射性)檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的標(biāo)記鈣的量可以測(cè)定化合物增加鈣攝入或抑制鈣攝入的能力。
結(jié)合到CNS內(nèi)的特定亞區(qū)上的化合物也可以通過以上方法鑒別，所述亞區(qū)對(duì)通過與本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的間接相互作用的特定行為是重要的。
為了測(cè)定胞內(nèi)環(huán)狀A(yù)MP水平，在用100微摩爾異丁基黃嘌呤(ISMX；西格馬)處理15分鐘的全細(xì)胞中測(cè)定環(huán)狀A(yù)MP。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1X106/0.5毫升)用10微摩爾毛喉素和各種濃度的已知或未知受體配體溫育。經(jīng)添加鹽酸至0.1M，在室溫下溫育15分鐘，中和并以50mM乙酸鈉(pH6.2)進(jìn)行樣品稀釋終止反應(yīng)。采用放射免疫測(cè)定法定量環(huán)狀A(yù)PM。
為了測(cè)定胞內(nèi)鈣水平，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮在上樣培養(yǎng)基(修飾的RPMI 1640培養(yǎng)基/10mM Hepes/1％新生牛血清)中并在旋轉(zhuǎn)搖瓶中以1X106個(gè)細(xì)胞/毫升于37℃溫育2.5小時(shí)。然后于37℃用1微摩爾Fura-2乙氧甲基酯(Fura-2AM；分子探針)處理細(xì)胞30分鐘，用上樣培養(yǎng)基洗滌兩次，并以5X106個(gè)細(xì)胞/毫升再懸浮。在將要熒光分光光度分析之前，在1000 rpm下經(jīng)離心回收細(xì)胞，在含有磺吡酮的修飾的Krebs緩沖液(135 mM NaCl/4.7 mM KCl/1.2 mM MgSO4/1.2mMKH2PO4/5mM NaHCO3/1mM CaCl2/2.8 mM葡萄糖/10 mM hepes，pH7.4)中以1X106個(gè)細(xì)胞/毫升再懸浮。Bombesin購自西格瑪和Auspep。用5nm狹縫寬度和2秒的反應(yīng)時(shí)間在340nm(激發(fā))和505nm(發(fā)射)處在Hitachi熒光分光光度計(jì)(F4010)上進(jìn)行熒光記錄。采用Grynkiewicz等，生物化學(xué)雜志2603440-3450，1985描述的等式定量胞內(nèi)鈣。
本發(fā)明也提供了治療和/或預(yù)防肥胖的方法，該方法通過對(duì)宿主施用結(jié)合并激活本發(fā)明的受體多肽的化合物。這樣一種化合物不是Zhang，等，自然，372425-431(1994)所公開的ob基因產(chǎn)物。本發(fā)明的受體多肽在人染色體上的位置相應(yīng)于編碼ab基因產(chǎn)物之受體的小鼠染色體的位置。人ob基因編碼“飽滿”(satiety)因子，該因子結(jié)合并激活本發(fā)明的受體多肽。因此，激活本發(fā)明的受體多肽的化合物會(huì)降低食欲和阻止肥胖。
以上描述的化合物也可以用于增強(qiáng)活動(dòng)水平、改善進(jìn)餐行為、增加消化食物的利用度和調(diào)節(jié)脂肪貯藏的積存。也可以用結(jié)合并激活本發(fā)明的受體多肽的化合物治療與肥胖相關(guān)的病癥，包括血脂過多、II型糖尿病和某些癌癥。
這些化合物也可以用于治療和/或預(yù)防其它與本發(fā)明受體多肽或結(jié)合到其上的配體的表達(dá)不足相關(guān)的病癥，例如用于刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)。
抑制本發(fā)明的受體多肽激活的化合物的特定的例子包括抗體，或者在某些情況下包括寡核苷酸，其結(jié)合所述受體但不引發(fā)第二信使反應(yīng)從而阻止所述受體的活性。
另一個(gè)例子是與受體配體密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，即配體片段，其喪失了生物學(xué)功能，并且在結(jié)合到受體上時(shí)不引發(fā)反應(yīng)。
另一個(gè)例子是采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可以通過三螺旋形成或反義DNA或者RNA來控制基因的表達(dá)，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約10至40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成與轉(zhuǎn)錄所涉及的基因區(qū)互補(bǔ)(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，進(jìn)而阻止本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為本發(fā)明的多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細(xì)胞中，以便可以體內(nèi)表達(dá)反義RNA和DNA，抑制所述多肽的產(chǎn)生。
另一個(gè)例子是小分子，這些小分子結(jié)合到本發(fā)明的神經(jīng)肽受體上，使得受體不能接近其配體，由此阻止正常的生物學(xué)活性。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子以及神經(jīng)肽Y片段和/或衍生物。
本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的可溶性形式(例如，受體的片段，其結(jié)合到配體上并阻止配體與膜結(jié)合受體相互作用)也可以抑制本發(fā)明的受體多肽的激活。
本發(fā)明還提供了將抑制激活的這種化合物用于治療與本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的過量活性相關(guān)的異常疾病和治療肥胖的方法，這是因?yàn)楸景l(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽可以結(jié)合神經(jīng)肽Y，后者是引起進(jìn)食行為增加和II型糖尿病的最有力的已知物質(zhì)，神經(jīng)肽Y可以在這一疾病的遺傳基礎(chǔ)中起作用。
本發(fā)明的抑制受體多肽激活的化合物可以用于治療和/或預(yù)防高血壓，這是因?yàn)樯窠?jīng)肽Y刺激腎素釋放并且已知神經(jīng)肽Y在涉及冠狀和腦部血管時(shí)具有潛在的血管收縮活性。
本發(fā)明的化合物也可以用于治療阿耳茨海默氏病，這是因?yàn)樯窠?jīng)肽受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在，并且占優(yōu)勢(shì)地定位在內(nèi)神經(jīng)元內(nèi)，此時(shí)，它們顯得對(duì)記憶和阿耳茨海默氏病具有調(diào)節(jié)作用。
所述化合物也可以用于在海馬中抑制神經(jīng)肽Y的刺激性傳遞，并因此可以用于治療癲癇發(fā)作、緊張和憂慮。
神經(jīng)肽受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍性表明抑制本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的化合物通過調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞可以用作抗精神病的藥物。
抑制本發(fā)明的受體多肽的化合物也可以用于治療病理性血管痙攣，包括冠狀和腦部血管的血管痙攣。
本發(fā)明也提供了測(cè)定未知是否能夠結(jié)合到本發(fā)明的神經(jīng)肽受體上的配體是否可以結(jié)合到其上的方法，該方法包括在足以使以前鑒別為結(jié)合這樣的受體的配體結(jié)合到受體上的條件下，把待鑒別的配體與包含神經(jīng)肽受體編碼序列并在其表面上表達(dá)該序列的細(xì)胞接觸。在其它實(shí)施方案中，包含受體的細(xì)胞膜組分或分離的游離受體或固定在固體支持物上的分離受體可以用于測(cè)定待試驗(yàn)的配體的結(jié)合。當(dāng)重組細(xì)胞用于受體表達(dá)目的時(shí)，優(yōu)選地是使用具有少的或者沒有內(nèi)源性受體活性的細(xì)胞，以便結(jié)合(如果存在任何結(jié)合的話)是由于表達(dá)的目的受體的存在所致。優(yōu)選的細(xì)胞包括人類早期腎細(xì)胞、猴腎(HEK-293細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞(COS)、中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、果蠅或鼠L-細(xì)胞。優(yōu)選地采用其中存在受體反應(yīng)性第二信使系統(tǒng)的細(xì)胞為宿主細(xì)胞。著名的第二信使系統(tǒng)包括在響應(yīng)配體結(jié)合到胞外受體域中磷酸肌醇水解、腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶或離子通道活性的增加或減少。在另外的實(shí)施方案中，可以構(gòu)建特異設(shè)計(jì)的受體結(jié)合指示劑。例如，融合蛋白可以通過把本發(fā)明的受體與對(duì)受體配體結(jié)合敏感的蛋白質(zhì)功能域融合來制備。這里稱作指示劑功能域的這種功能域自身或者與附加分子一起能夠產(chǎn)生分析上可檢測(cè)的信號(hào)，其指示受體配體結(jié)合。
本發(fā)明也提供了通過檢測(cè)編碼受體的mRNA的存在而檢測(cè)本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽在細(xì)胞表面上表達(dá)的方法，該方法包括從細(xì)胞獲得總mRNA，將如此獲得的mRNA與核酸探針接觸(所述探針包含至少10個(gè)核苷酸的核酸分子，在雜交條件下其能夠與包含在編碼所述受體的核酸分子內(nèi)的序列特異性地雜交)，檢測(cè)雜交到探針上的mRNA的存在，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞對(duì)受體的表達(dá)。
本發(fā)明也提供了用于鑒別與本發(fā)明的受體多肽相關(guān)的受體的方法?？梢杂膳c本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的同源性鑒別這些相關(guān)受體，其是通過低嚴(yán)格性交叉雜交、或通過鑒別受體進(jìn)行的，所述受體與相關(guān)天然或合成配體相互作用或在本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的遺傳或藥理學(xué)阻滯后激發(fā)類似的行為。
所述基因片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，以分離具有與本發(fā)明的基因高同源性或者類似生物學(xué)活性的的其它序列。這種類型的探針優(yōu)選地具有50個(gè)堿基或者更多。所述探針也可以用于鑒別與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物和基因組克隆或克隆相應(yīng)的cDNA克隆，其包含包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子在內(nèi)的本發(fā)明的完整基因。這種類型的篩選的實(shí)例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針分離所說基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明的基因的序列互補(bǔ)性的標(biāo)記的寡核苷酸用于篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫以確定探針雜交到文庫的哪些成員上。
所述神經(jīng)肽受體多肽和以上鑒別的為多肽的化合物可以依據(jù)本發(fā)明通過體內(nèi)表達(dá)這樣的多肽來利用，這常被稱作“基因治療”。
這樣，例如，可以體外對(duì)細(xì)胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進(jìn)行基因工程操作，用工程細(xì)胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且由本文的描述也顯而易見。例如，可以用本領(lǐng)域公知的方法用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程操作，以便體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域已知的，產(chǎn)生包含編碼本發(fā)明的多肽之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的產(chǎn)生細(xì)胞可以施用到患者以便體內(nèi)經(jīng)基因工程操作細(xì)胞并體內(nèi)表達(dá)所說的多肽。經(jīng)本發(fā)明的描述，通過這種方式施用本發(fā)明多肽的這些或其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的。例如，經(jīng)基因工程操作細(xì)胞的載體可以不是逆轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其可以在與合適的運(yùn)送載體組合后用于體內(nèi)經(jīng)基因工程操作細(xì)胞。
可以得自上文描述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長(zhǎng)臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？梢允褂玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動(dòng)子；和人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Miller，等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9,980-990(1989)描述)；或者其它任何啟動(dòng)子(例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，如包括但不限于組蛋白、po1 III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。使用的其它病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。通過本文的描述，合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動(dòng)子控制下。可以使用的合適的啟動(dòng)子包括，但不限于腺病毒啟動(dòng)子(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子)；或者異源啟動(dòng)子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子)；熱休克啟動(dòng)子；清蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人類珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(如單純皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；和人類生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。所說的啟動(dòng)子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動(dòng)子。
使用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以便形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DNA細(xì)胞系(Miller、人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知的方法用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包囊在脂質(zhì)體中，或者和脂類偶合，然后施用到宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然后可以使用這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體內(nèi)或者體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼所述多肽的核酸序列?？杀晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚干細(xì)胞、胚癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
可溶性神經(jīng)肽受體多肽和結(jié)合并激活本發(fā)明的受體或者抑制其激活的化合物也可以用于與合適的藥物載體組合。這種組合物包含治療有效量的所述可溶性神經(jīng)肽受體多肽或化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合體。配方應(yīng)適合于施用模式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個(gè)或多個(gè)填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。這種容器中可以附有管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品得到政府機(jī)構(gòu)的同意。此外，本發(fā)明的可溶性神經(jīng)肽受體多肽或化合物可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的基因作為診斷劑的用途，例如由遺傳缺陷基因引起的某些疾病的診斷劑?？梢酝ㄟ^比較缺陷基因序列與正?；蛐蛄衼頇z測(cè)這些基因。接著，人們可以證實(shí)“突變”基因與異常受體活性相關(guān)。此外，人們可以在功能性測(cè)定系統(tǒng)(例如比色測(cè)定、在MacConkey平板上的表達(dá)、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，HEK293細(xì)胞的受體缺陷株中)中將突變受體基因插入到合適的表達(dá)載體中，其作為證實(shí)或鑒別突變的另一種方法。一旦“突變”基因被鑒別出，人們就可以篩選“突變”受體基因載體群。
可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)具有本發(fā)明的人基因突變的個(gè)體?？梢詮幕颊叩募?xì)胞(包括但不限于例如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸。基因組DNA可以直接用于檢測(cè)，或者在分析前用PCR酶促擴(kuò)增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作為一個(gè)例子，可以用與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸互補(bǔ)的PCR引物鑒別和分析其突變。例如，可以通過與正常遺傳型比較的擴(kuò)增產(chǎn)物大小上的改變來檢測(cè)缺失或者插入。點(diǎn)突變可以經(jīng)擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的RNA或者放射性標(biāo)記的反義DNA序列雜交鑒別。經(jīng)核糖核酸酶A消化，或者從熔點(diǎn)溫度的不同辨別完美配對(duì)的序列和錯(cuò)配雙鏈體。這種診斷劑在潛在的或甚至是新生期試驗(yàn)中會(huì)是特別有用的。
可以通過直接DNA測(cè)序方法揭示參照基因和“突變”基因之間的序列差異性。此外，克隆的DNA區(qū)段可以用作檢測(cè)特定DNA區(qū)段的探針。當(dāng)與PCR組合時(shí)，這一方法的靈敏性得到極大的提高。例如，使用序列引物，其具有雙鏈PCR產(chǎn)物或由修飾的PCR產(chǎn)生的單鏈模板分子。用放射標(biāo)記的核苷酸經(jīng)常規(guī)方法或者用熒光標(biāo)記經(jīng)自動(dòng)測(cè)序方法完成序列測(cè)定。
基于DNA序列差異的遺傳試驗(yàn)可以通過檢測(cè)在有或沒有變性劑時(shí)凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。也可以由核酸酶保護(hù)測(cè)定法(如核糖核酸酶保護(hù)和S1保護(hù))以及化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國(guó)，854397-4401(1985))揭示特定位置上的序列變化。
此外，某些疾病起因于基因表達(dá)的變化或者以其為特征，這種變化可以由mRNA的變化來檢測(cè)。另外，本發(fā)明的基因可以用作參照用于鑒別表達(dá)降低的與這一類型的受體相關(guān)之功能的個(gè)體。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中本發(fā)明的神經(jīng)肽受體多肽的可溶形式的改變的水平的診斷測(cè)定法。用于檢測(cè)來源于宿主的樣品中的可溶性受體多肽水平的測(cè)定法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)-結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析，優(yōu)選地是ELISA測(cè)定。
ELISA測(cè)定起初包括制備對(duì)神經(jīng)肽受體多肽抗原特異性的抗體，優(yōu)選地是一種單克隆抗體。此外，制備針對(duì)所述單克隆抗體的報(bào)道抗體。所述報(bào)道抗體上連接有可檢測(cè)試劑，例如放射性，熒光或在這一實(shí)例中的辣根過氧化物酶。然后，從宿主取得樣品，在固體支持物上溫育，所述支持物例如聚苯乙烯皿，其結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)。通過與非特異性蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白)一起溫育覆蓋皿上任何游離的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。接著溫育所述的單克隆抗體，在此期間，單克隆抗體連接到任何與聚苯乙烯皿連接的神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)上。用緩沖液洗滌掉所有未結(jié)合的單克隆抗體。然后將連接到辣根過氧化物酶上的報(bào)道抗體置于皿中，使得報(bào)道抗體結(jié)合到任何與神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)連接的抗體上。洗掉未連接的抗體。將過氧化物酶底物添加到皿中。但與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較時(shí)，在給定的時(shí)間期限內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量是存在于給定體積患者樣品中的神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)的量。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列特異地靶向位于單個(gè)的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前，僅有少數(shù)幾種以實(shí)際的序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)為基礎(chǔ)的染色體標(biāo)記試劑可以用于標(biāo)記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)的重要的第一步。
簡(jiǎn)而言之，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選10-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計(jì)算機(jī)分析可以快速地選擇引物，其中引物不應(yīng)跨越超過基因組DNA上的一個(gè)外顯子，否則使得擴(kuò)增方法復(fù)雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個(gè)的人染色體的體細(xì)胞雜交體。只有那些含有與該引物對(duì)應(yīng)的人基因的雜交體才會(huì)生產(chǎn)擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR作圖是將一個(gè)特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實(shí)現(xiàn)亞定位(sublocalization)。可以類似地用于對(duì)染色體作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的經(jīng)流式分選的染色體進(jìn)行預(yù)篩選以及通過雜交進(jìn)行預(yù)選，從而構(gòu)建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來實(shí)現(xiàn)一步法準(zhǔn)確染色體定位。該技術(shù)可以采用50或60個(gè)堿基長(zhǎng)短的cDNA。關(guān)于該技術(shù)的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術(shù)手冊(cè)，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列已定位到一個(gè)準(zhǔn)確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫聯(lián)機(jī)得到)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
接下來需要測(cè)定在受影響的和未受影響的個(gè)體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個(gè)體中觀察到的、但是又沒有在任何一個(gè)正常個(gè)體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病因。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術(shù)目前的分辨率，一個(gè)被準(zhǔn)確定位到與疾病有關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的致病(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個(gè)基因)。
所述的多肽、其片段或衍生物或類似物、或者表達(dá)上述物質(zhì)的細(xì)胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
可以通過對(duì)動(dòng)物直接注射多肽或者對(duì)動(dòng)物(優(yōu)選地是非人動(dòng)物)施用多肽獲得抗相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽產(chǎn)生的抗體。然后如此獲得的抗體結(jié)合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可以用于產(chǎn)生結(jié)合全部天然多肽的抗體。用這種抗體從表達(dá)多肽的組織中分離多肽。
對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供由傳代細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生抗體的技術(shù)。例子包括產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、trioma技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當(dāng)今免疫學(xué)，472)和EB病毒-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R. Liss公司，pp.77-96)。
所描述的有關(guān)單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)(美國(guó)專利4,946,778)可以用來產(chǎn)生抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可以利用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)品的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例進(jìn)一步加以說明；但是，應(yīng)當(dāng)了解本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利于理解以下的實(shí)施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)粒”通過一個(gè)在前的小寫p和/或跟隨幾個(gè)大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質(zhì)?；蛘呖梢酝ㄟ^商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎(chǔ)上公眾可得到，或者可以根據(jù)已公開的方法從可得到的質(zhì)粒中構(gòu)建出來。此外，對(duì)于與那些所述等價(jià)的質(zhì)粒是本領(lǐng)域已知的并且對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用一種僅對(duì)DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑得到，并且其反應(yīng)條件、輔因子和其它使用要求對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質(zhì)?；駾NA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建的DNA片段，通常在一個(gè)更大的體積內(nèi)用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對(duì)具體的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下約1小時(shí)的溫育時(shí)間，但是該時(shí)間可以根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)者的指示而變化。在消化后，反應(yīng)混合物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行裂解片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過化學(xué)合成的兩條互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個(gè)磷酸時(shí)，該寡核苷酸將不會(huì)連接到另一個(gè)寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)來實(shí)現(xiàn)連接。
除非另有說明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1
神經(jīng)肽受體的細(xì)菌表達(dá)和純化利用PCR寡核苷酸引物起始擴(kuò)增編碼神經(jīng)肽受體的DNA序列(ATCC#-----)，所說的引物相應(yīng)于加工過的神經(jīng)肽受體基因的5’和3’末端序列(減信號(hào)肽序列)和所述基因的3’載體序列’。將相應(yīng)于神經(jīng)肽受體基因的附加核苷酸分別加入到5’和3’序列中。所說的5’寡核苷酸引物具有序列5’CACTAAAGCTTAATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO7)，并含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，后面接著從推測(cè)的加工蛋白質(zhì)的末端氨基酸密碼子開始的神經(jīng)肽受體編碼序列的18個(gè)核苷酸。所說的3’序列5’ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3′(SEQ ID NO8)含有XbaI位點(diǎn)。所說的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)(ori)、IPTG可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后用Hind III和XbaI消化pQE-9。將擴(kuò)增的序列連接到pQE-9中并將其插入到帶有組氨酸標(biāo)記編碼序列和RBS的讀框中。然后通過Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep 4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝，這種質(zhì)粒表達(dá)lacI阻遏物同時(shí)賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過轉(zhuǎn)化體在LB平板上的生長(zhǎng)能力鑒定轉(zhuǎn)化體，并選擇出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。通過限制分析分離并確認(rèn)質(zhì)粒DNA。將含有所需構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜(O/N)生長(zhǎng)。將O/N培養(yǎng)物以1∶100至1∶250的比率接種大體積培養(yǎng)物。細(xì)胞生長(zhǎng)至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間時(shí)，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過滅活lacI阻遏物、清除P/O誘導(dǎo)基因增加表達(dá)。將細(xì)胞再培養(yǎng)3至4小時(shí)。通過離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解離液劑在6M鹽酸胍中。澄清后，在允許含有5-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在鎳-NAT樹脂上通過層析從溶液中純化溶解的神經(jīng)肽受體(Hochuli，E.等，層析學(xué)雜志411177-184(1984))。將神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)(85％純度)以6M鹽酸胍(pH值5.0)從柱中洗脫下來，為了復(fù)性，調(diào)至3M鹽酸胍、100mM磷酸鹽鈉、10mM谷胱甘肽(還原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在這一溶液溫育12小時(shí)后，將蛋白質(zhì)對(duì)10mM磷酸鈉透析。
實(shí)施例2在COS細(xì)胞中的表達(dá)重組神經(jīng)肽受體神經(jīng)肽受體-HA的質(zhì)粒表達(dá)來源于載體pcDNA3/Amp(Invitrogen)，其包含1)SV40復(fù)制起點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn))，4)CMV啟動(dòng)子，其后為多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點(diǎn)。將編碼完整的神經(jīng)肽受體前體的DNA片段和在讀框中融合進(jìn)3’末端的HA標(biāo)記克隆到所說的載體的多接頭區(qū)，由此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子控制之下。HA標(biāo)記相應(yīng)于來自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位，這一點(diǎn)以前已經(jīng)描述過(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，細(xì)胞37767)。HA和靶細(xì)胞蛋白的融合，使帶有抗體(其識(shí)別HA表位)的重組蛋白質(zhì)很容易檢測(cè)。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下用兩種引物經(jīng)PCR構(gòu)建編碼神經(jīng)肽受體的DNA序列(ATCC#-----)，所說的引物是5’引物5’CCTAGGATGCCCCTCTGCTGCAGCGG 3′(SEQ ID NO9)，包含BamHI位點(diǎn)；3’引物5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTGAGGGC 3′(SEQ ID NO10)包含互補(bǔ)于XbaI位點(diǎn)、翻譯終止密碼子和神經(jīng)肽受體編碼序列區(qū)的最后17個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)的序列。由此PCR產(chǎn)物包含BamHI位點(diǎn)、編碼序列、翻譯終止密碼子和XbaI位點(diǎn)。用BamHI和XbaI消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNA3/Amp并連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株SURE(可從Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla得到)中，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制分析檢測(cè)是否存在正確的片段。為了表達(dá)重組神經(jīng)肽受體，通過DEAE-DEXTRAN方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1989))。通過放射標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)神經(jīng)肽受體HA蛋白的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1988))。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的兩天用15S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)物并用去垢劑裂解細(xì)胞(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA的特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)物兩者。在15％SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質(zhì)沉淀。
實(shí)施例3利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)神經(jīng)肽受體利用PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)神經(jīng)肽受體蛋白質(zhì)的DNA序列(ATCC#-----)，所說引物相應(yīng)于該基因的5’和3’序列
神經(jīng)肽受體5’引物具有序列5′CGGGATCCGCCATCATGGAGCCCTCAGCCACC 3′(SEQ ID NO11)，包含BamHI限制位點(diǎn)(粗體)，接下來是類似真核細(xì)胞翻譯起始有效信號(hào)(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))的6個(gè)核苷酸，其就在所述基因的頭18個(gè)核苷酸之后(翻譯起始密碼子“ATG”有下劃線)。
3’引物具有序列5′ACAAGTCCTTGTCCTTCTAGAGGGC 3’(SEQID NO12)，包含限制性內(nèi)切酶XbaI的切割位點(diǎn)和互補(bǔ)于神經(jīng)肽受體基因3’-非翻譯序列的5個(gè)核苷酸。用市售試劑盒(“Geneclean”BIO101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增的序列。然后將所說的片段用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化，并如實(shí)施例1所述純化。此片段指定為F2。
載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)用于表達(dá)蛋白質(zhì)，這種表達(dá)使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊(cè)，得克薩斯農(nóng)業(yè)的試驗(yàn)站公報(bào)1555)。這種表達(dá)載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子，其后面是限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XbaI的識(shí)別位點(diǎn)。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因作為多角體蛋白啟動(dòng)子以同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)。多角體蛋白序列的兩側(cè)是用于細(xì)胞-介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列。可以用很多其它的桿狀病毒載體代替A2，所說的載體如pGR1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
用限制酶BamHI和XbaI消化所說的質(zhì)粒，并用本領(lǐng)域已知的方法利用牛犢腸磷酸酶使質(zhì)粒去磷酸化。然后如實(shí)施例1的描述從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA指定為V2。
用T4 DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化DH5α，并利用限制酶BamHI和XbaI鑒別含有具有神經(jīng)肽受體基因的所說質(zhì)粒(pBac神經(jīng)肽受體)的細(xì)菌。通過DNA測(cè)序確認(rèn)所克隆的片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，847413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBac神經(jīng)肽受體與1.0μg市售的線性桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBac神經(jīng)肽受體在含有50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉(zhuǎn)染試劑和90微升Grace’s培養(yǎng)基后，混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRLl711)中，所說細(xì)胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上。來回?fù)u動(dòng)平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)5小時(shí)。5小時(shí)后，從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，添加1毫升補(bǔ)充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進(jìn)行噬斑測(cè)定。一點(diǎn)改變是使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍(lán)的噬斑(“噬斑測(cè)定”的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南9-10頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍(lán)的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于包含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendcrf管中。經(jīng)簡(jiǎn)短離心除去瓊脂，將包含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
使Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在感染復(fù)數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-神經(jīng)肽受體感染細(xì)胞。6小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用SF900II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時(shí)后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經(jīng)離心收獲之前，將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)16小時(shí)，標(biāo)記蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實(shí)施例4經(jīng)由基因治療的表達(dá)成纖維細(xì)胞是通過皮膚活組織檢查從一個(gè)研究對(duì)象中得到的。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基上并且分割成小塊。將小組織塊放置在組織培養(yǎng)瓶的濕表面上，其中每瓶中放置約10塊組織。將瓶顛倒放置，蓋緊并于室溫下過夜。在室溫下放置24小時(shí)后反轉(zhuǎn)瓶，組織塊仍固定在瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(例如含有10％FBS，青霉素和鏈霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基)，然后于37℃下溫育大約1周。這時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔幾天更換一次培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2周后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞。將單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁側(cè)有Moloney鼠肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用小牛腸磷酸酶進(jìn)行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對(duì)應(yīng)的PCR引物擴(kuò)增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，3’引物含有一個(gè)Hind III位點(diǎn)。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴(kuò)增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在適于兩個(gè)片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后為了證實(shí)該載體具有插入正確的感興趣基因而將細(xì)菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂平板上。
將兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包裝細(xì)胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的組織培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，直至達(dá)到鋪滿密度。然后將含有所述基因的載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞隨即生產(chǎn)含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現(xiàn)在包裝細(xì)胞被稱作生產(chǎn)細(xì)胞)。
向轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來從一個(gè)鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過濾器過濾以除去脫附(detached)的生產(chǎn)細(xì)胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細(xì)胞。從成纖維細(xì)胞的亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來自于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基并代之以新鮮的培養(yǎng)基。如果病毒的滴度很高，那么實(shí)質(zhì)上所有的成纖維細(xì)胞均被感染并且無需選擇。如果滴度非常低，那么就需要采用具有如neo或his這樣的可選擇性標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射入宿主，它或單獨(dú)注射或在一個(gè)cytodex 3微載體珠上已生長(zhǎng)至鋪滿之后再注射。此時(shí)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化都是可能的，因此在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以另外的方式實(shí)施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人LI等(ii)發(fā)明名稱人神經(jīng)肽受體(iii)序列數(shù)12(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(c)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號(hào)36,134(c)案號(hào)/文檔號(hào)325800-268(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1209個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGACAGCCG 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC CCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CGACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AACCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC760CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCA AATTCCGGGA GCAGTTTAAG GCTGCCTTCT CCTGCTGCCT GCCTGGCCTG 1140GGTCCCTGCG GCTCTCTGAA GGCCCCTAGT CCCCGCTCCT CTGCCAGCCA CAAGTCCTTG 1200TCCTTGTAG 1209(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度402個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Lys Phe Arg Glu Gln Phe Lys Ala Ala Phe Ser Cys365 370 375Cys Leu Pro Gly Leu Gly Pro Cys Gly Ser Leu Lys Ala Pro Ser380 385 390Pro Arg Ser Ser Ala Ser His Lys Ser Leu Ser Leu395 400(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1110個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCGTGGCAG CAGAGAGCCG60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG 120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC 180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC 240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG 300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG 360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC 420CCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG 480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT 540GCAGTCATGC AATCCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA 600CTCTGTCATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT 660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC 720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC 780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC 840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG 900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTCCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT 960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGCC TTCCCTGGAG TCTGCTCTAA 1110(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度369個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Ser Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 100 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ile Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Ser Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr Tyr Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Mat Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ila Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Leu Pro Trp Ser Leu Leu365(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1133個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGGAGCCCT CAGCCACCCC AGGGGCCCAG ATGGGGGTCC CCCCTGGCAG CAGAGACCCC 60TCCCCTGTGC CTCCAGACTA TGAAGATGAG TTTCTCCGCT ATCTGTGGCG TGATTATCTG120TACCCAAAAC AGTATGAGTG GGTCCTCATC GCAGCCTATG TGGCTGTGTT CGTCGTGGCC180CTGGTGGGCA ACACGCTGGT CTGCCTGGCC GTGTGGCGGA ACCACCACAT GAGGACAGTC240ACCAACTACT TCATTGTCAA CCTGTCCCTG GCTGACGTTC TGGTGACTGC TATCTGCCTG300CCGGCCAGCC TGCTGGTGGA CATCACTGAG TCCTGGCTGT TCGGCCATGC CCTCTGCAAG360GTCATCCCCT ATCTACAGGC TGTGTCCGTG TCAGTGGCAG TGCTAACTCT CAGCTTCATC420GCCCTGGACC GCTGGTATGC CATCTGCCAC CCACTATTGT TCAAGAGCAC AGCCCGGCGG480GCCCGTGGCT CCATCCTGGG CATCTGGGCT GTGTCGCTGG CCATCATGGT GCCCCAGGCT540GCAGTCATGG AATGCAGCAG TGTGCTGCCT GAGCTAGCCA ACCGCACACG GCTCTTCTCA600GTCTGTGATG AACGCTGGGC AGATGACCTC TATCCCAAGA TCTACCACAG TTGCTTCTTT660ATTGTCACCT ACCTGGCCCC ACTGGGCCTC ATGGCCATGG CCTATTTCCA GATATTCCGC720AAGCTCTGGG GCCGCCAGAT CCCCGGCACC ACCTCAGCAC TGGTGCGGAA CTGGAAGCGC780CCCTCAGACC AGCTGGGGGA CCTGGAGCAG GGCCTGAGTG GAGAGCCCCA GCCCCGGGGC840CGCGCCTTCC TGGCTGAAGT GAAGCAGATG CGTGCACGGA GGAAGACAGC CAAGATGCTG900ATGGTGGTGC TGCTGGTCTT CGCCCTCTGC TACCTGCCCA TCAGCGTCCT CAATGTCCTT960AAGAGGGTGT TCGGGATGTT CCGCCAAGCC AGTGACCGCG AAGCTGTCTA CGCCTGCTTC 1020ACCTTCTCCC ACTGGCTGGT GTACGCCAAC AGCGCTGCCA ACCCCATCAT CTACAACTTC 1080CTCAGTGGAT GTAAAGAGAA GAGTCTAGTT CTGTCCTGAC CATCGTGCCC CGG 1133(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度377個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Glu Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Gln Met Gly Val Pro Pro5 10 15Gly Sar Arg Glu Pro Ser Pro Val Pro Pro Asp Tyr Glu Asp Glu20 25 30Phe Leu Arg Tyr Leu Trp Arg Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Gln Tyr35 40 45Glu Trp Val Leu Ile Ala Ala Tyr Val Ala Val Phe Val Val Ala50 55 60Leu Val Gly Asn Thr Leu Val Cys Leu Ala Val Trp Arg Asn His65 70 75His Met Arg Thr Val Thr Asn Tyr Pha Ile Val Asn Leu Ser Leu80 85 90Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Ile Cys Leu Pro Ala Ser Leu Leu95 l00 105Val Asp Ile Thr Glu Ser Trp Leu Phe Gly His Ala Leu Cys Lys110 115 120Val Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ser Val Ser Val Ala Val Leu125 130 135Thr Leu Ser Phe Ile Ala Leu Asp Arg Trp Tyr Ala Ila Cys His140 145 150Pro Leu Leu Phe Lys Ser Thr Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ser Ile155 160 165Leu Gly Ile Trp Ala Val Sar Leu Ala Ile Met Val Pro Gln Ala170 175 180Ala Val Met Glu Cys Ser Ser Val Leu Pro Glu Leu Ala Asn Arg185 190 195Thr Arg Leu Phe Ser Val Cys Asp Glu Arg Trp Ala Asp Asp Leu200 205 210Tyr Pro Lys Ile Tyr His Ser Cys Phe Phe Ile Val Thr TyT Leu215 220 225Ala Pro Leu Gly Leu Met Ala Met Ala Tyr Phe Gln Ile Phe Arg230 235 240Lys Leu Trp Gly Arg Gln Ile Pro Gly Thr Thr Ser Ala Leu Val245 250 255Arg Asn Trp Lys Arg Pro Ser Asp Gln Leu Gly Asp Leu Glu Gln260 265 270Gly Leu Ser Gly Glu Pro Gln Pro Arg Gly Arg Ala Phe Leu Ala275 280 285Glu Val Lys Gln Met Arg Ala Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu290 295 300Met Val Val Leu Leu Val Phe Ala Leu Cys Tyr Leu Pro Ile Ser305 310 315Val Leu Asn Val Leu Lys Arg Val Phe Gly Met Phe Arg Gln Ala320 325 330Ser Asp Arg Glu Ala Val Tyr Ala Cys Phe Thr Phe Ser His Trp335 340 345Leu Val Tyr Ala Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Phe350 355 360Leu Ser Gly Cys Lys Glu Lys Ser Leu Val Leu Ser Pro Ser Cys365 370 375Pro Gly(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CACTAAAGCT TAATGGAGCC CTCAGCCACC 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 26(2)SEQ ID NO9的信息、(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTAGGATGC CCCTCTGCTG CAGCGG 26(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11CGGGATCCGC CATCATGGAG CCCTCAGCCA CC 32(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO12ACAAGTCCTT GTCCTTCTAG AGGGC 2權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包括選自如下一組的成員(a)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼SEQ ID NO2所示的多肽；(b)一種多核苷酸，這種多核苷酸能夠和(a)的多核苷酸雜交，并且和它們具有至少70％的相同性；(c)一種(a)或(b)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，這種多核苷酸編碼SEQ ID NO2所示的多肽。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是DNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是RNA。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是基因組DNA。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸，該多核苷酸包含SEQ ID NO1所示的1至1209位核苷酸。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO2所示的多肽的可溶形式。
8.一種分離的多核苷酸，這種多核苷酸包括選自如下一組的成員(a)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼一種由包含在ATCC-----號(hào)保藏物中的DNA編碼的成熟多肽；(b)一種多核苷酸，這種多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號(hào)保藏物中的DNA表達(dá)的多肽；(c)一種多核苷酸，這種多核苷酸能夠和(a)或(b)的多核苷酸雜交，并且和它們具有至少70％的相同性；(d)一種(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號(hào)保藏物中的DNA表達(dá)的多肽。
10.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由包含在ATCC-----號(hào)保藏物中的DNA表達(dá)的多肽。
11.一種載體，這種載體包含權(quán)利要求2的DNA。
12.一種用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的宿主細(xì)胞。
13.一種生產(chǎn)多肽的方法，這種方法包括從權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說的DNA編碼的多肽。
14.一種生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽之細(xì)胞的方法，這種方法包括用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。
15.一種受體多肽，這種多肽選自如下一組(a)一種多肽，這種多肽具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列和其片段、類似物及衍生物；和(b)一種由ATCC-----號(hào)保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中所說的多肽具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列。
17.一種權(quán)利要求15的多肽的抗體。
18.一種激活權(quán)利要求15的多肽的化合物。
19.一種抑制權(quán)利要求15的多肽的激活的化合物。
20.一種治療需要激活神經(jīng)肽受體之患者的方法，這種方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求18的化合物。
21.一種治療需要抑制神經(jīng)肽受體之患者的方法，這種方法包括對(duì)患者施用治療有效量的權(quán)利要求19的化合物。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所說的化合物是一種多肽，并且治療有效量的所說化合物是通過對(duì)患者提供編碼所說激動(dòng)劑的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說的激動(dòng)劑來施用的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所說的化合物是一種多肽，并且治療有效量的所說化合物是通過對(duì)患者提供編碼所說拮抗劑的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說的拮抗劑來施用的。
24.一種鑒別結(jié)合并激活權(quán)利要求15的受體多肽之化合物的方法，該方法包括提供在其表面表達(dá)所述受體多肽的重組宿主細(xì)胞，所述受體與能夠提供應(yīng)答一種化合物與所說受體多肽的結(jié)合的可檢測(cè)信號(hào)的第二組分相關(guān)聯(lián)；在足以允許化合物與所說受體多肽結(jié)合的條件下使多種化合物與所說宿主細(xì)胞接觸；和通過檢測(cè)由所說第二組分產(chǎn)生的信號(hào)鑒別能夠與受體結(jié)合的那些化合物。
25.由權(quán)利要求24的方法鑒別的激動(dòng)劑化合物。
26.一種鑒別結(jié)合權(quán)利要求15的多肽并抑制其激活的化合物的方法，該方法包括提供在其表面表達(dá)所述受體多肽的重組宿主細(xì)胞，所述受體與能夠提供應(yīng)答一種化合物與所說受體多肽的結(jié)合的可檢測(cè)信號(hào)的第二組分相關(guān)聯(lián)；在足以允許結(jié)合所說受體多肽的條件下，使已知結(jié)合受體多肽的分析上可檢測(cè)的配體和多種化合物與所說宿主細(xì)胞接觸；和通過檢測(cè)由配體與多肽相互作用產(chǎn)生的信號(hào)是否存在，確定所述配體是否結(jié)合到所述多肽上。
27.由權(quán)利要求26的方法鑒別的拮抗劑化合物。
28.一種測(cè)定未知能否結(jié)合到權(quán)利要求15的多肽上的配體是否可以連接到所述多肽上的方法，該方法包括在允許結(jié)合的條件下，使一種在其表面表達(dá)所述多肽的重組宿主細(xì)胞與一種待鑒別的配體接觸，并檢測(cè)任何結(jié)合配體的受體的存在。
29.權(quán)利要求28的方法，其中在與待鑒別的配體接觸之前，從所說的細(xì)胞分離受體多肽或包含該受體的膜組分。
30.一種篩選化合物以鑒別結(jié)合權(quán)利要求15的受體多肽的那些化合物的方法，該方法包括在允許結(jié)合到受體上的條件下，使一種在其表面表達(dá)所述多肽的重組宿主細(xì)胞與許多候選化合物和已知結(jié)合所述受體的分析上可檢測(cè)的配體接觸；和鑒別能夠增強(qiáng)或抑制所述配體結(jié)合到所述受體上的那些候選化合物。
31.一種由權(quán)利要求30的方法鑒別的拮抗劑或激動(dòng)劑化合物。
32.一種診斷與權(quán)利要求15的多肽表達(dá)不足相關(guān)的疾病或者疾病易感性的方法，這種方法包括測(cè)定在編碼所說多肽的核酸序列中的突變。
33.權(quán)利要求15的多肽，其中所說的多肽是多肽的可溶性片段，并且能夠結(jié)合受體的配體。
34.一種診斷方法，該方法包括分析來源于宿主的樣品中權(quán)利要求33的多肽的存在。
全文摘要
本文公開了人類神經(jīng)肽受體多肽和編碼這些多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法。本文也公開了利用這些多肽鑒別它們的拮抗劑和激動(dòng)劑的方法,以及分別將這些激動(dòng)劑和拮抗劑治療性地用于治療與所述神經(jīng)肽受體多肽表達(dá)不足和過量表達(dá)相關(guān)之疾病的方法。本文還公開了用于檢測(cè)所述神經(jīng)肽受體核酸序列中的突變和該受體的可溶形式之改變的水平的診斷方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1182432SQ9519784
公開日1998年5月20日 申請(qǐng)日期1995年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月5日
發(fā)明者丹尼爾·R·索佩特, 李毅, 克雷格·A·羅森 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司