專利名稱：：通過△6-去飽和酶生產γ亞麻酸的制作方法通過Δ6-去飽和酶作用，亞油酸(18∶2)(LA)轉化為γ亞麻酸(18∶3)(GLA)。當此酶或者編碼此酶的核苷酸轉移進生產LA的細胞時，生產出GLA。本發(fā)明提供含有Δ6-去飽和酶基因的核苷酸。尤其是此核苷酸包含Δ6-去飽和酶基因的啟動子、編碼區(qū)域和終止區(qū)域。本發(fā)明進一步目標是建立重組結構，它包含Δ6-去飽和酶編碼區(qū)域并與異源調節(jié)序列功能上相組合。本發(fā)明的核苷酸和重組結構在轉基因組織中生產GLA是有用的。不飽和脂肪酸比如亞油酸(C18Δ9,12)和α-亞麻酸(C18Δ9,12,15)是必需的飲食組成成份，它們不能被脊椎動物合成，因為脊椎動物細胞能在飽和酸Δ9位置引入雙鍵，但是不能在Δ9雙鍵和脂肪酸鏈甲基末端之間引入其它雙鍵。因為它們是其它產物的前體，亞油酸和α-亞麻酸是必需的脂肪酸，經常從植物中獲取。亞油酸被哺乳動物轉變成γ-亞麻酸(GLA，C18Δ6,9,12)，γ-亞麻酸接著被轉變成花生四烯酸(20∶4)，一個非常關鍵的脂肪酸，因為它是大多數前列腺素的必需前體。飲食提供的亞油酸，因為可以轉變?yōu)镚LA和花生四烯酸，滿足了飲食上對GLA和花生四烯酸的需要。然而已表明在飽和脂肪的消耗和健康危險方面存在一個關系，這些健康危險比如血膽固醇過多，動脈粥樣硬化和對冠狀疾病敏感有關的其它臨床疾病。而消耗未飽和脂肪則與降低的血膽固醇濃度以及降低動脈動脈粥樣硬化的危險有聯系。食用GLA治療的好處也許在于GLA是花生四烯酸的前體，因此有助于前列腺素的合成。相應地，消耗更多的未飽和GLA而不是亞油酸，有潛在的健康益處。然而，GLA并不存在于任何商業(yè)性生長的作物中。亞油酸通過Δ6-去飽和酶轉變?yōu)镚LA。Δ6-去飽和酶，超過350個氨基酸，有一個膜固定區(qū)域和一個脂肪酸去飽和的活性位點。如果細胞內源性生產亞油酸而不是GLA，當Δ6-去飽和酶轉化進細胞時，則會產生GLA。通過提供編碼Δ6-去飽和酶的基因，本發(fā)明允許轉基因組織的生成，它含有功能性Δ6-去飽和酶，而且能生產GLA。除了允許生產大量GLA外，本發(fā)明提供GLA的新的飲食來源。本發(fā)明的目的在于分離Δ6-去飽和酶基因。尤其是分離的基因含有Δ6-去飽和酶啟動子，編碼區(qū)域和終止區(qū)域。本發(fā)明進一步目的在于組建含有Δ6-去飽和酶啟動子，編碼區(qū)域和終止區(qū)域的表達載體。本發(fā)明另一方面是組建含有Δ6-去飽和酶編碼區(qū)域并與異源調節(jié)區(qū)域功能上相聯合的表達載體，異源調節(jié)區(qū)域即不起源于Δ6-去飽和酶基因的組份。含有本發(fā)明載體的細胞和組織以及這些組織的后代，也可以由本發(fā)明提供。本發(fā)明更進一步在于提供分離的細菌的Δ6-去飽和酶。也可以提供分離的植物的Δ6-去飽和酶。本發(fā)明的另一方面是提供一種方法，用于生產具有增高γ亞麻酸成份的植物。本發(fā)明也提供一種方法用于生產耐寒性植物。圖1描述了集胞藻屬Δ6-去飽和酶(A組)和Δ12-去飽和酶(B組)推斷的氨基酸序列的水療(hydropathy)外形圖。推斷的跨膜區(qū)用實體棒表示，疏水指數經過計算是19個氨基酸殘基的窗口大小[Kyte，etal.(1982)《分子生物學雜志》157]。圖2提供了野生型(A組)和轉基因魚腥藻屬(B組)的氣液相色譜分布圖。圖3是帶有重疊區(qū)域和亞克隆的粘粒Csy75，Csy13和Csy7的圖的圖解。Csy75，Csy75-3.5和Csy7的亞克隆區(qū)域用添加的斜線表示出來。失活的限制性酶切位點放于括號內。圖4提供了野生型(A組)和轉基因煙草(B組)的氣液相色譜分布圖。圖5A描述了從琉璃苣中分離的Δ6-去飽和酶的DNA序列。圖5B描述了分離出的琉璃苣的Δ6-去飽和酶cDNA中開讀框架的蛋白序列。去飽和酶三個特有的氨基酸功能域顯示出來，依照順序分別是脂類框，金屬框1和金屬框2圖6是一個樹狀圖，顯示了琉璃苣的Δ6-去飽和酶與其它膜固定的去飽和酶的類似性。通過GeneWorks(IntelliGenetics)比較琉璃苣Δ6-去飽和酶與其它已知去飽和酶的氨基酸序列。各亞屬之間與相對系統發(fā)育距離有關的數值得到比較。圖7是221.Δ6.NOS和121.Δ6.NOS的限制性酶切圖譜。在221.Δ6.NOS中，質粒余下的部分pBI221，在121.Δ6.NOS，質粒余下的部分是pBI121。圖8提供了模擬轉化(A組)和221.Δ6.NOS轉化(B組)的胡蘿卜細胞的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α和18∶3γ(GLA)的位置得到顯示。圖9提供了未轉化的煙草葉子(A組)和用121.Δ6.NOS轉化的煙草葉子(B組)的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α，18∶3γ(GLA)和18∶4的位置得到顯示。圖10提供了未轉化的煙草種子(A組)和用121.Δ6.NOS轉化的煙草種子(B組)的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α，18∶3γ(GLA)的位置得到顯示。本發(fā)明提供分離的編碼Δ6-去飽和酶的核酸。為了確認編碼Δ6-去飽和酶的核酸，DNA從生產GLA的組織中分離出來。所說的組織可以是，例如動物細胞，某些真菌(如被孢霉屬)，某些細菌(如集胞藻屬)或某些植物(琉璃苣、月見草屬、茶藨子類)?；蚪MDNA的分離可以通過許多方法來完成，這些方法是本領域中熟知的常規(guī)技術之一，舉例說明見Sambrooketal.(1989)《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港，紐約。分離的DNA通過物理方法或酶切方法片段化，克隆進合適的載體，比如噬菌體或粘粒載體，這些都可以通過一系列熟知方法中的任一種來進行，這些方法在文獻中可以找到，比如Sambrooketal(1989)。含有本發(fā)明DNA的表達載體在此得到重點考慮。編碼Δ6-去飽和酶的DNA通過功能獲得性分析得到證實。含有片段DNA的載體通過傳染，轉結合(transconjugation)，轉染等方法轉移進產亞油酸而不產GLA的宿主組織。用在這里，“轉化”總的來說是指吸收外源DNA進入宿主細胞。誘導重組DNA進入宿主組織的方法對本領域中普通技術人員是熟知的常規(guī)技術之一，能在Sambrooketal(1989)中找到。這些組織生產的GLA(即功能的獲取)可以通過比如氣相色譜法或本領域普通技術人員所熟知的其它方法來測定。被誘導產生GLA，即通過導入載體而獲得功能的組織被確認為表達DNA編碼的Δ6-去飽和酶，所說的DNA從此組織中獲取。獲取的DNA再一次片段化，克隆進表達載體，通過上述程序進行功能性測試以更精確確認編碼Δ6-去飽和酶的DNA。做為本發(fā)明的一個例子，隨機DNA從藍細菌集胞藻屬(PasteurCultureCollection(PCC)6803，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)27184)中分離出來，克隆進粘粒載體，通過轉結合誘導進入GLA缺陷的藍細菌魚腥藻屬菌株PCC7120，ATCC27893。從魚腥藻屬的亞油酸中生產的GLA通過氣相色譜法來監(jiān)測，對應的DNA片段被分離出來。分離的DNA進行測序，此方法是本領域技術人員中熟知的常規(guī)技術之一，見Sambrooketal(1989)。依據本發(fā)明，含有Δ6-去飽和酶基因的DNA分子已被分離。更確切地說，一個3.588kb含有Δ6-去飽和酶基因的DNA已從藍細菌集胞藻屬中分離出來。3.588kbDNA的核苷酸序列已確定，顯示于SEQIDNO1。定義潛在編碼區(qū)域的開讀框架位于核苷酸317至1507和2002至3081。為了確定編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸，賦于Δ6-去飽和酶活性的3.588kb的片段被切成兩個亞片段，每一個只含有一個開讀框架。片段ORF1含有核苷酸1至1704，片段ORF2含有核苷酸1705至3588。每一片段都以正反兩個方向亞克隆進一個共同的表達載體(AM542，Wolketal.《美國國家科學院院刊》81，1561)此載體含有一個藍細菌1羧化酶啟動子。產生的重組(即ORF1(F)，ORF1(R)，ORF2(F)和ORF2(R))通過標準方法(見Wolketal.(1984)《美國國家科學院院刊》81，1561)結合進野生型魚腥藻屬PCC7120；在選擇培養(yǎng)基(依據Rippkaetal.，(1979)普通微生物學雜志.111.1，標準礦物培養(yǎng)基BG11N+30ug/ml新霉素)上生長兩周以后，在將要死亡的非結合細胞的棕色背景上，魚腥藻屬的結合細胞被確認為NeoR綠色克隆。挑出綠色克隆，培養(yǎng)于選擇性液體培養(yǎng)基(BG11N+15ug/ml新霉素)內。通過標準方法(如Dahmeretal.(1989)美國石油化學聯合物雜志66，543)脂類從含有正反向ORF1和ORF2重組的轉結合物中抽提出來。做為對照，脂類也從野生型的魚腥藻屬和集胞藻屬培養(yǎng)物中抽提出來。用氣液相色譜(GLC)分析脂肪酸甲酯，例如用Tracor-560氣液相色譜儀并配備一個氫火焰離子檢測器和一個毛細管柱。GLC分析結果顯示于表1表1在野生型和轉基因的藍細菌中C18脂肪酸的出現</tables>通過GLC分析，當含有ORF2正方向的重組物通過轉結合被誘導進細胞時，GLA缺陷的魚腥藻屬獲得產GLA的功能。轉結合物中含有對于羥化酶啟動子呈反方向的ORF2或ORF1正反方向重組物，未有GLA產生。此分析表明在1884bp片段的單個開讀框架(ORF2)中編碼Δ6-去飽和酶。此1884bp片段顯示于SEQIDNO3。通過Δ6-去飽和酶和Δ12-去飽和酶(Wadaetal.(1990)《自然》347)水療圖全面相似性。這些得到具體證明，此圖分別顯示于圖1(A)和(B)。依據本發(fā)明，包含Δ6-去飽和酶基因的cDNA從琉璃苣中分離。此1.685kbcDNA的核苷酸序列得到確認并顯示于圖5A(SEQIDNO4)ATG起始密碼子和終止密碼子下面劃線。對應于琉璃苣Δ6-去飽和酶中開讀框架的氨基酸序列顯示于圖5B(SEQIDNO5)。分離的編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸也可以通過上面描述的功能獲得分析法從其它生產GLA的組織中得到確認，或者用分離出的編碼集胞藻屬或琉璃苣Δ6-去飽和酶的核苷酸作雜交探針，通過核酸雜交技術來確認?；蚪M或cDNA克隆的方法對于熟練的技術人員是已知的，并在本發(fā)明中得到研究。雜交探針可以含有顯示于SEQIDNO1或SEQIDNO4全長的DNA序列，或一個限制性片段或其它片段，并且包括寡核苷酸探針。通過交叉雜交克隆同源基因的方法對于普通的技術人員是已知的，可以在Sambrook(1989)和Beltzetal(1983)《酶學方法》100,266中找到。在另一個從生產GLA組織中確定Δ6-去飽和酶的方法中，從Poly-A+RNA制備cDNA文庫，而Poly-A+RNA是從多核糖體RNA中分離。為了從cDNA群中去除超豐富表達的基因，cDNA或其相對于超豐富cDNA基因的片段被用作對cDNA文庫雜交的探針。未雜交的噬菌斑切除下來，產生的細菌克隆孵育在液體培養(yǎng)基中并測序。例如，為了把從琉璃苣多核糖體RNA中制備的cDNA文庫中去除其它種子貯存蛋白cDNAs，對應于豐富表達的種子貯存蛋白cDNA首先與cDNA文庫雜交?！安顪p”DNA文庫接著用于產生表達的序列標簽(ETSs)，這些標簽用于掃描數據庫，比如GenBank來確認潛在的去飽和酶。通過導入編碼Δ6-去飽和酶DNA，轉基因組織獲得生產GLA功能的同時，也獲得了生產十八碳四烯酸(18∶4Δ6,9,12,15)的功能。十八碳四烯酸目前通常存在于魚油中和紫草科家族的某些植物種屬中(Craigetal，美國石油化學聯合會雜志，41,209-211；Grossetal.Can.J.Plant.Sci56,659-664)。在本發(fā)明的轉基因組織中，十八碳四烯酸產生于Δ6-去飽和酶對α亞麻酸進一步去飽和作用，或者通過Δ15-去飽和酶對GLA去飽和作用。被ORF2即編碼集胞藻屬Δ6-去飽和酶的開讀框架所編碼的359個氨基酸，顯示于SEQIDNO2。編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶的開讀框架顯示于SEQIDNO5。本發(fā)明進一步重點考慮編碼SEQIDNO2和SEQIDNO5中氨基酸的別的核苷酸序列。確認這些序列是在普通的熟練的技術人員的知識范圍之內，例如這些序列產生于遺傳密碼的破譯。此外，本領域常規(guī)技術之一是通過下面描述的功能獲得的分析，來決定含有編碼Δ6-去飽和酶開讀框架的片段中更少的亞片段。本發(fā)明密切注視Δ6-去飽和酶的任何多肽片段和仍保持將LA轉變?yōu)镚LA活性的核苷酸。本發(fā)明的另一方面，一個含有本發(fā)明核苷酸的載體，或者一個含有Δ6-去飽和酶基因啟動子，編碼序列和終止區(qū)域的小片段被轉化進一個組織，比如藍細菌，其中Δ6-去飽和酶啟動子和終止區(qū)域都是功能性的，因此，本發(fā)明提供了產生重組Δ6-去飽和酶的組織。本發(fā)明另一方面是提供分離Δ6-去飽和酶，通過標準的蛋白純化方法，(比如見Ausubeletal(1987)《當氣分子生物學方法》GreenpublishingAssociates，NewYork)可以從重組組織中純化出來。包含編碼Δ6-去飽和酶DNA的載體也可以由本發(fā)明指供。構建合適的載體在各種組織中表達Δ6-去飽和酶的編碼序列明顯是本領域常規(guī)技術之一。復制表達載體尤其得到優(yōu)選。在此描述的復制表達載體是工程化為了控制目的基因即Δ6-去飽和酶表達的DNA或RNA分子。優(yōu)選的載體是質粒，噬菌體，粘粒或病毒。穿梭載體如描述于Wolketal.(1984)《美國國家科學院院刊》1561-1565和Bustosetal.(1991)J.Bacterol.174,7525-7533。依據本發(fā)明也可以考慮。Sambrooketal.(1989)，Goeddel，ed.(1990)《酶學方法》185，Academic.Press，和Perbal(1988)分子克隆操作指南，Johnwiley和Sons，Inc.提供了載體的詳細論著，編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸可以插入并表達。這些載體還包含能夠影響編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸表達的核苷酸序列。能夠影響一個基因產物表達的序列元件包括啟動子、增強子、上游激活序列、轉錄終止信號和多腺苷酸位點。組成性的和組織特異的啟動子都可以考慮。為了轉化植物細胞，花椰菜花斑病毒(CaMV)355啟動子和在植物種子成熟過程中被調節(jié)的啟動子尤其令人感興趣。所有這些啟動子或轉錄調節(jié)元件，單個或組合形式，都可以在本復制表達載體中被考慮得到使用，并且是本領域技術人員已知的。CaMV35S啟動子被Restrepoetal(1990)所描述，《植物細胞》2，987，遺傳工程和突變的調節(jié)序列也可以考慮。普通的技術人員能夠決定適合于在特定宿主細胞中表達的載體和調節(jié)元件。例如，一個載體含有來源于編碼魚腥藻屬羧化酶基因的啟動子可操作性連接到Δ6-去飽和酶區(qū)域，進一步可操作性連接到來源于集胞藻屬的終止信號上，此載體適合在藍細菌中表達去飽和酶?！翱刹僮餍赃B接”在此文中指啟動子和終止子序列能夠有效對轉錄調控行使功能，再舉一個例子，一個適合于在轉基因植物中表達Δ6-去飽和酶的載體可以含有來源于半日花素、napin、大豆球蛋白的種子特異性序列，可操作性連接到Δ6-去飽和酶的編碼區(qū)域，進一步可操作性連接到一個種子終止信號或胭脂堿合成酶的終止信號上。再舉一例，一個在植物中表達Δ6-去飽和酶的載體，可以含有一個組成性的啟動子或一個組織特異性啟動子可操作性連接到Δ6-去飽和酶的編碼區(qū)域。并進一步可操作性連接到一個基本的或組織特異的終止子或胭脂堿合成酶的終止信號上。尤其是半日花素調節(jié)元件顯示于申請人共同未決的美國專利申請，申請流水號682,354，1991年4月8號提交，并引入本文作為參考，可以做為在本發(fā)明中指導Δ6-去飽和酶表達的啟動子元件來考慮。修改顯示于此的核苷酸序列或調控元件，并同時維持在此所考慮的功能，是在本發(fā)明范圍之內的。這些修飾包括插入，替換或刪除。特別是刪除，它反映了遺傳密碼的簡并性。組建這些雜種載體的標準技術是本領域中普通技術人員是眾所周知的，可以在許多文獻中找到，此如Sambrooketal(1989)，或者是廣泛所找到的關于重組DNA技術的無數實驗室手冊的任一種，有許多關于連接DNA片段的策略，選擇其中的策略依靠于DNA片段的性質。依據本發(fā)明，進一步考慮的是在雜種載體中包括一些有助于克隆，表達或者加工的其它核苷酸序列元件，例如編碼信號肽的序列，編碼KDEL的序列，此序列對于固定蛋白于內質網上是必需的，或者編碼轉運多肽的序列，它能夠定向Δ6-去飽和酶至葉綠體中。這些序列是本領域中的技術人員已知的最優(yōu)。VandenBroecketal(1985)《自然》313,358描述了最優(yōu)的轉還多肽。Michaelisetal(1982)《Ann.Rev.Microbiol》36,425顯示了原核和真核的信號肽。本發(fā)明另一方面是提供除了藍細菌或植物之外的其它含有編碼本發(fā)明的Δ6-去飽和酶的組織。依據本發(fā)明考慮的轉基因組織包括細菌、藍細菌、真菌、植物和動物。本發(fā)明所分離的DNA可以通過本領域已知的方法導入宿主，比如傳染、感染、轉化或轉結合。把本發(fā)明的DNA轉移進入這些組織的技術是廣泛熟知的，在文獻中可以找到，比如Sambrooketal.(1989)。一系列植物轉化方法也已熟知。Δ6-去飽和酶基因可以通過Horshetal.(1985)《科學》227,1229所描述的葉盤轉化-再生程序導入植物。其它的轉化方法，比如原生質體培養(yǎng)(Horschetal.(1984)《科學》223,496；DeBlocketal.(1984)EMBOJ.2,2143，Bartonetal.(1983)《細胞》32,1033)也可以使用，屬于本發(fā)明的范圍。一個優(yōu)選的具體化的植物可以用土壤桿菌屬起源的載體來轉化，然而把本發(fā)明的Δ6-去飽和酶插入植物細胞也可以使用其它方法。這些替代方法包括biolistic方法(Kleinetal.(1987)《自然》327,70)，電穿孔，化學誘導DNA的吸收，使用病毒或花粉做為載體。對于轉化方法所必要的是，本發(fā)明的Δ6-去飽和酶基因可以插入植物轉化載體，如Bevan(1984)《核酸研究》12,8111，上所描述的二元載體。植物轉化載體來源于修改根癌生桿菌的自然基因轉移系統。自然系統包含一個大Ti(腫瘤誘導)質粒，此質粒中含有一個大片段，已知為T-DNA，它可以轉移到轉化的植物中。Ti質粒的另一個片段，Vir區(qū)域，負責T-DNA的轉移。T-DNA區(qū)域與未端重復序列接界。在修飾的二元載體中，刪除了腫瘤誘導基因，Vir區(qū)域的功能用于轉移被T-DNA邊界序列所接界的外源DNA。T區(qū)域還含有一個抗生素抗性的選擇性標記，和一個用于插入要轉移序列的多克隆位點。這些工程化的菌種已知為“去除武裝”的(“disarmed”)的根癌生桿菌菌種，允許有效地轉化T區(qū)域接界的序列進入植物的核基因組。表面無菌葉盤與“去除武裝”(“disarmed”)含有外源DNA的根癌生桿菌孵育，培養(yǎng)兩天，然后轉移到含有抗生素的培養(yǎng)基中。等到在含有抗生素的培養(yǎng)基中長出根后，選擇長出的轉化的嫩芽，轉移到土壤中再生。本發(fā)明的另一方面是提供含有本發(fā)明分離DNA的轉基因植物或這些植物的后代。單子葉和雙子葉植物都可以考慮。通過上面描述的任一種植物轉化方法，用分離的編碼Δ6-去飽和酶DNA轉化植物細胞。轉化的植物細胞，經常在愈傷組織培養(yǎng)物或葉盤中，通過本領域熟知的常規(guī)技術之一(如Horshetal.(1985)《科學》227,1129)再生成一個完整的轉基因植物。優(yōu)選的轉基因植物是向日葵、油籽油菜、玉米、煙草、花生或大豆。因為轉化植物的后代遺傳了編碼Δ6-去飽和酶的DNA，來源于轉化植物的種子或剪枝可以用做保持轉基因的植物系。本發(fā)明提供了一種方法用于提供具有增高的GLA含量的轉基因植物。這些方法包括誘導編碼Δ6-去飽和酶的DNA進入植物細胞，此細胞缺少或只含有低含量的GLA，但含有LA，再生的植物從轉基因細胞中具有增開的GLA含量。尤其是，商業(yè)中生長的糧食植物做為轉基因組織可以考慮的有，向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草，但并不限于此。本發(fā)明進一步提供了方法用于提供含有GLA的轉基因組織。此方法包括誘導編碼Δ6-去飽和酶的DNA進入組織，此組織缺少或含有低水平的GLA，但含有LA。在另一實施方案中，方法包括誘導一個或多個含有編碼Δ12-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的表達載體進入缺乏GLA和LA的組織。相應的，通過Δ12-去飽和酶的表達，缺乏LA和GLA的組織被誘導產生LA，由于Δ6-去飽和酶的表達，接著產生GLA。含有編碼Δ12-去飽和酶或Δ12-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的表達載體，可以通過本領域普通技術人員已知重組技術的方法來構建(Sambrooketal.(1989)發(fā)表的Δ12-去飽和酶序列見(Sambrooketal.(1990)《自然》(倫敦)347,200-2030。此外，已發(fā)現對應于本發(fā)明，SEQIDNO1的核苷酸2002-3081編碼藍細菌Δ12-去飽和酶。因此，此序列用于構建目標作物表達載體。尤其是，商業(yè)生長的作物可以考慮做為轉基因的組織包括，但不限于此的有向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草。本發(fā)明進一步目標是提供在植物中誘導抗凍的方法。冷的敏感性也許是由于細胞膜中脂類的相的轉換。相的轉換溫度依賴于細胞膜脂類中脂肪酸的不飽和程度。這樣，例如通過導入Δ6-去飽和酶把LA轉變GLA，提高了不飽和的程度，就能誘導或增進抗凍性。因此，本發(fā)明包括誘導編碼Δ6-去飽和酶的DNA進八植物細胞，從所說植物細胞中再生的植物具有增強的抗凍能力。在優(yōu)選的實施方案中，植物可以是向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生，或煙草植物。下面的實施例進一步說明本發(fā)明實施例1菌株和培養(yǎng)條件集胞藻屬(PCC6803，ATCC27184)，魚腥藻屬(PCC7120，ATCC27893)和聚球藻屬(PCC7942，ATCC33912)光自養(yǎng)生長于白熾燈照射下(60uE.m-2.S-1)，30℃BG11N+培養(yǎng)基中(Rippkaetal(1979)J.Gen.Microbiol111.1-61)選擇粘粒和質粒，在大腸桿菌DH5α中擴增，DH5α生長于加入標準抗生素濃度的LB培養(yǎng)基中，描述見Maniatisetal(1982)《分子克隆實驗手冊)》，冷泉港實驗室，冷泉，紐約。實施例2集胞藻屬粘?；蚪M文庫的建立集胞藻屬(PCC6803)總的基因組DNA用Sau3A部分酶切，在蔗糖梯度中分級分離(Ausubeletal(1987)《當氣分子生物學方法》GreenepublishingAssociateandWileyinterscience，紐約)。含有30至40KbDNA片段的部分選擇出來，連接進粘粒載體pDUCA7(Buikemetal.(1991)細菌學雜志173,1879-1885)的去磷酸化的BamHI位點。連接的DNA體外進行包裝，見Ausubeletal.(1987)。包裝的噬菌體在含有AvaI和Eco4711甲基化酶輔助質粒，pRL528(見Buikemaetal(1991)的大腸桿菌DH5α中擴增。隨機分離1152個克隆，分別培養(yǎng)于12個96孔微滴度板中。例3GLA在魚腥藻屬中功能獲得性表達魚腥藻屬(PCC7120)，一種絲狀藍細菌，缺乏GLA，但含有顯著量的亞油酸，即GLA的前體(圖2；表2)。實施例2中描述的集胞藻屬粘粒文庫結合進魚腥藻屬(PCC7120)以確認能夠生產GLA的轉結合物。魚腥藻屬細胞在BG11N液體培養(yǎng)基中生長至對數中期，重新懸浮于相同的培養(yǎng)基中至終濃度約為每毫升2×109個細胞。生長于含有氨芐青霉素LB中的大腸桿菌RP4(Burkavdtetal(1979)普通微生物學雜志114,341-348)的對數中期培養(yǎng)物被洗滌，重新懸浮于新鮮的LB培養(yǎng)基中。魚腥藻屬和RP4混合，均勻涂布于含有5％LB的BG11N平皿中。粘?；蚪M文庫影印鋪板于含有50ug/ml卡那霉素和17.5ug/ml的氯霉素的LB板上，然后挑斑放于含有魚腥藻屬和RP4的BG11N平皿上。30℃培養(yǎng)24小時后，加入30ug/ml新霉素，30℃下培養(yǎng)直至轉結合物出現。結合后單個轉結合物分離出來，生長在加有15ug/ml新霉素的2mlBG11N液體培養(yǎng)基中。脂肪酸甲酯從野生型培養(yǎng)物以及10個轉結合物的細胞群培養(yǎng)物中參照如下制備。野生型和轉基因的藍細菌培養(yǎng)物通過離心收獲，用蒸餾水洗滌兩次。脂肪酸甲酯從這些培養(yǎng)物中抽提出來，見Dahmeretal(1989)美國石油化學聯合會雜志，66,543-548，通過氣液相色譜法分析(GLC)。GLC使用配備有氫火焰離子探測器和毛細柱(30m×0.25mmbondedFSOTSuperoxII，AlltechAssociatesInc.IL)的Tracor-560。保留時間和標準的共色譜(從Sigma化學公司獲得)用于確認脂肪酸。平均脂肪酸成份由每個C18脂肪酸的峰區(qū)對內在標準進行標準化的比率決定。典型GLC圖形顯示于圖2。顯示C18脂肪酸甲酯。通過與已知標準的脂肪酸甲酯比較洗脫時間確定峰值，并通過氣相色譜-質譜加以確定。A組描述了野生型魚腥藻屬的脂肪酸GLC分析，箭頭表示GLA遷移時間。B組是用pAM542+1.8F轉化的魚腥藻屬轉結合物中脂肪酸的GLC圖。兩個生產GLA的混合細胞群(代表250個轉結合物的25個混合細胞群之中的)被確認可以產生GLA。每個GLA陽性混合細胞群中的單個轉結合物用于分析GLA的產生；兩個獨立的轉結合物AS13和AS75，分別來自此兩個混合細胞群被確認可以表達顯著水平的GLA，并分別含有粘粒cSy13和cSy75(圖3)。粘粒重疊于一個大約7.5kb長的區(qū)域內，cSy75的一個3.5kb的NheI片段被重新克隆進載體PDUCA7，并轉化進魚腥藻屬產生一個GLA功能獲得性表達(表2)。cSy75-3.535kbNheI片段的兩個NheI/HindIII亞片段(1.8和1.7kb)重新亞克隆進入pBLUESCR1PT(Stratagene)(圖3)進行測序。執(zhí)行標準的分子生物學技術，見Maniatisetal(1982)和Ausubeletal(1987)。通過由先進DNA技術實驗室(生物系，TexasACM大學)合成的特定寡核苷酸引物，在兩條鏈上用“測序酶”(“SEQUENASE”)(美國生化)對pBS1.8進行雙脫氧測序(Sangeretal.(1977)《美國國家科學院院刊》74,5463-5467)。DNA序列分析采用GCG(Madison，WI)軟件，見Devereuxetal(1984)《核酸研究》12,387-395。兩個NheI/HindIII亞片段相對于藍細菌羧化酶啟動子分別以正反兩個方向連接進一個共同的表達載體AM542，并通過結合誘導進入魚腥藻屬。以正向進入含1.8kb片段《AM542-1.8F)的轉結合物產生顯著量的GLA和十八碳四烯酸(圖2，表2)。含有其它重組的轉結物，如1.8kb片段的反向1.7kb的正反向，并不產生可檢測水平的GLA(表2)。圖2比較從野生型魚腥藻屬(圖2A)和從含有cSy75-3.5中1.8kb片段正向重組的轉基因魚腥藻屬(圖2B)中抽提的C18脂肪酸圖。從AM542-1.8F的脂肪酸甲酯GLC分析中揭示，一個具有保留時間的峰與真正的GLA標準的峰是相同的。通過氣相色譜-質譜[GC-MS]分析此峰證實它有GLA參考樣品同樣的物質片段形式。具有改變的多不飽和脂肪酸水平的轉基因魚腥藻屬在生長速率和形態(tài)上與野生型相似。表2在野生型和轉基因藍細菌中C18脂肪酸的組成脂肪酸(％)菌株18∶018∶118∶218.3(α)18.3(γ)18.4野生型集胞藻屬13.64.554.5-27.3-(種.PCC6803)魚腥藻屬2.924.837.135.2--(種.PCC7120)聚球藻屬20.679.4----(種PCC7942)魚腥藻屬的轉結合物cSy753.824.422.39.127.912.5cSy75-3.54.327.618.13.240.46.4pAM542-1.8R4.213.912.119.125.425.4pAM542-1.8R7.723.138.430.8--pAM542-1.7R2.827.836.133.3--pAM542-1.7R2.825.442.329.6--聚球藻屬轉化子pAM85427.872.2----pAM854-Δ124.043.246.0---pAM854-Δ618.281.8----pAM854-Δ12&Δ1242.725.319.5-16.5-18∶0，硬脂酸；18∶1油酸；18∶2亞油酸；18∶3(α)亞麻酸；18∶3(γ)，γ亞麻酸；18∶4，十八碳四烯酸實施例4用Δ6和Δ12去飽和酶基因轉化聚球藻屬用已發(fā)表的集胞藻屬Δ12去飽和酶基因序列(Wadaetal.《自然》(倫敦)347,200-203)合成寡核苷酸，以此篩選集胞藻屬基因組文庫，分離到含有Δ12去飽和酶基因的第三個粘粒cSy70。以含有Δ12去飽和酶的此粘粒上確認一個1.7kbAvaI片段，用做探針表明cSy13不僅含有Δ6-去飽和酶基因，而且還有Δ12-去飽和酶基因(圖3)?；蚪MSouthern點印跡分析進一步表明Δ6和Δ12-去飽和酶基因在集胞藻屬基因組中是單一的，兩個與C18脂肪酸去飽和相關的功能性基因在集胞藻屬基因組中是緊密相連在一起的。單細胞的藍細菌聚球藻屬(PCC7942)在亞油酸和GLA上的缺乏的，Δ12和Δ6-去飽和酶基因分別或一起克隆進pAM854(Bustosetal.細菌學雜志，174,7525-7533)，pAM854是一個穿梭載體，含有把外源DNA整合進入聚球藻屬基因組所需的序列(Goldenetal.《酶學方法》153,215-231)用這些基因重組物轉化聚球藻屬，挑選克隆，從轉基因的聚球藻屬中抽提脂肪酸甲酯，并且GLC分析。表2顯示野生型聚球藻屬中主要的脂肪酸是硬脂酸(18∶0)和油酸(18∶1)。用pAM854Δ12轉化的聚球藻屬除了主要的脂肪酸外，還表達亞油酸(18∶2)。用pAM854Δ6和Δ12轉化子產生亞油酸和GLA(表1)。這些結果表明，含有Δ12和Δ6去飽和酶基因的聚球藻屬已獲得了在C18脂肪酸Δ12位置上引入第二個雙鍵和在Δ6的位置上引入第三個雙鍵的能力。然而在含有pAM854-Δ6轉化子中沒有觀察到脂肪酸組份的變化，表明在缺少由Δ12去飽和酶合成底物的情況下，Δ6去飽和酶是無活性的。這個實驗進一步證實1.8kbNheI/HindIII片段(圖3)含有集胞藻屬Δ6-去飽和酶基因的編碼區(qū)域和啟動子區(qū)域。具有改變的多不飽和脂肪酸水平的轉基因聚球藻屬在生長速率和形態(tài)上與野生型類似。實施例5Δ6-去飽和酶的核苷酸序列鑒定包含功能性Δ6-去飽和酶基因的cSy75-3.5中1.8kb片段的核苷酸序列。確定了一個編碼359個氨基酸多肽的開讀框架(圖4)。Kyte-Doolittle水療圖分析(Kyteetal.(1982)J.Mol.Biol.157,105-132)證實兩個疏水氨基酸區(qū)域代表了跨膜區(qū)(圖1A)；此外，Δ6-去飽和酶的水療圖與Δ12-去飽和酶(圖1B；Wadaetal)和Δ9-去飽和酶(Thiedeetal.J.Biol.Chem261,13230-13235)的類似。然而，集胞藻屬Δ6和Δ12-去飽和酶序列相似性在核苷酸水平少于40％，在氨基酸水平大約有18％例6轉移藍細菌1Δ6-去飽和酶進入煙草藍細菌Δ6-去飽和酶基因移動至植物表達載體，用土壤桿菌屬介導的基因轉移技術轉移至煙草。為了確保轉移的去飽和酶在葉中和正發(fā)育的種子中表達，以及去飽和酶基因產生定向于內質網或葉綠體中，構建各種帶有集胞藻屬Δ6-去飽和酶開讀框架(ORF)的表達盒。這些盒的成份包括(i)35S啟動子或來源于向日葵半日花素基因的種子特異性啟動子去驅動Δ6-去飽和酶基因在所有的植物組織或只在發(fā)育的種子中表達(ii)一個推斷的信號肽，或者來源于胡蘿卜伸展蛋白基因或者是向日葵半日花素基因，以定向新合成的Δ6-去飽和酶進入內質網(iii)一個位于Δ6-去飽和酶開讀框架羧基端的內質網腔保留信號序列(KDEL)，(iv)一個最優(yōu)的轉移多肽以定向Δ6-去飽和酶進入葉綠體。35S啟動子是PRTL2的衍生物，見Restrepoetal(1990)。優(yōu)化的轉移多肽序列見VandeBroecketal(1985)。胡蘿卜伸展蛋白信號肽見Chenetal(1985)EMBOJ.9,2145轉基因煙草植物產生，含有嵌合的藍細菌去飽和酶基因，組成有集胞藻屬Δ6-去飽和酶基因與內質網保留序列(KDEL)融合，以及由CaMV35S啟動子啟動的伸展蛋白信號肽。PCR擴增轉基因煙草基因組DNA顯示Δ6-去飽和酶基因已整合進煙草基因組。抽提轉基因煙草葉中脂肪酸甲酯，并用氣液色譜法(GLC)分析。這些轉基因煙草中聚集了顯著數量的GLA(圖4)。圖4顯示了由GLC決定的脂肪酸甲酯。通過與脂肪酸甲酯比較已知標準確定峰值。相應的，參與脂肪酸代謝的藍細菌1基因用于產生具有改變的脂肪酸組份的轉基因植物。例7構建琉璃苣的cDNA文庫用Larkins和Davies(1975植物生理學，55749-756)為豌豆所建立的方法，從受粉后12天(12DPP)的琉璃苣種子中分離出膜結合的多核糖體。RNA被從多核糖體中抽提出來，見Mechler，(1987《酶學方法》152241-248，Academicpress)所述。用oligotex-dT小珠(Qiagen)將poly-ARNA從膜結合的核糖體RNA中分離出來。用Stratagene′sZAPcDNA合成試劑盒制備相應的cDNA。用λZAPII載體試劑盒在λZAPII載體中構建cDNA文庫。原始文庫在GigapackII金包裝提取物(Stratagene)中包裝，文庫用于產生表達序列標簽(ESTs)，對應于標準的序列用于掃描GenBank數據庫。例8雜交方法用于篩選琉璃苣cDNA文庫的雜交探針通過隨機引物DNA合成法產生，見Ausubeletal(1994《分子生物學現行方法》Wileyintezscience，N.Y)。此探針并與先前確認的豐富表達的種子貯存蛋白cDNA相對應。未摻入的核苷酸通過G-50旋轉柱(BoehringerManheim)除去。為了雜交，探針在沸水中煮5分鐘變性，然后迅速放入冰中冷卻。雜交膜于60℃在預雜交液[6XSSC(maniatisetal1984，《分子克隆實驗室手冊》冷泉港實驗室)。1XDenharts溶液，0.05％焦磷酸鈉，100ug/ml變性鮭魚精子DNA]雜交2-4小時，變性探針加入雜交液中(6xSSC，1xDenharts溶液，0.05％焦磷酸鈉，100ug/ml變性鮭魚精子DNA)60℃攪拌孵育過夜。膜在4x，2x和1xSET中60℃下分別洗滌15分鐘。20xSET儲液是3MWacl，0.4MTris堿，20mMNa2EDTA-2H2O。4xSET洗滌是4xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS，2×SET洗滌是2xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS，1xSET洗滌是1xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS。膜可以在空氣中干燥，然后用增感屏于-80℃下曝光X-光膠片24小時。實施例9從琉璃苣種子(12DPP)膜結合的核糖體文庫而來的cDNA的隨機測序琉璃苣cDNA文庫以低密度鋪板(5000pfu于150mmpetri細菌培養(yǎng)皿中)。用以前確認的相應的cDNA，通過篩選，差減去廣泛存在的種子貯存蛋白cDNA。未雜交的噬菌斑用Stratagene′s切除方法和試劑切除。產生的細菌克隆孵育于液基培養(yǎng)基中，手工測序或者用ABI自動測序儀測序。每個cDNA測序一次，從200至300個堿基對產生一個序列標簽。所有測序通過循環(huán)測序(Epicentre)來執(zhí)行。產生超過300個ESTs。每個序列標簽用BLASTX計算機程序與GenBank數據庫相比較，許多脂類代謝的基因，包括Δ6去飽酶得以確認。采用BLASTX在GenBank數據庫中搜索命名為mbp-65的cDNA克隆，發(fā)現與集胞藻屬的Δ6-去飽和酶有顯著的匹配。然而發(fā)現它并不是全長cDNA。用mbp-65篩選琉璃苣膜結合的多核糖體文庫，分離出全長cDNA。確定分離出的cDNA序列(圖5A，SEQIDNO4)，開讀框架的蛋白質序列(圖5B，SEQIDNO5)用Geneworks(IntelligGenetics)蛋白排列程序(圖2)與已知去飽和酶相比較。排列表明此cDNA是琉璃苣Δ6-去飽和酶基因。盡管與其它已知植物去飽和酶類似，琉璃苣Δ6-去飽和酶是獨特的，即在圖6樹狀圖中所顯示的。此外，進一步比較去飽和酶特征性的氨基酸序列，特別是那些參與金屬結合的氨基酸序列(金屬框1和金屬框2)，表明了琉璃苣Δ6-去飽和酶和別的植物去飽和酶的區(qū)別(表3)。琉璃苣Δ6-去飽和酶與藍細菌1的不僅所有序列不同(圖6)，而且在于脂類框，金屬框1，金屬框2這些氨基酸框(表3)。依表3所顯示，所有3個基序在序列上是新的。只有琉璃苣Δ6-去飽和酶的金屬框2顯示出與集胞藻屬Δ6-去飽和酶的金屬框2有一些關系。此外，琉璃苣Δ6-去飽和酶與另一個琉璃苣去飽和酶基因，Δ12-去飽和酶也是有區(qū)別的。P1-81是通過EST分析確認的全長cDNA，表明與擬南芥屬Δ12-去飽和酶(Fad2)有高度類似。比較琉璃苣Δ6和Δ12-去飽和酶中脂類框，金屬框1和2這些氨基酸基序(表3)，顯示在這些區(qū)域有極少的同源性。把此這個序列放入圖6的樹狀圖中表明這兩個基因關系有多遠。表3.比較膜結合的去飽和酶中普通的氨基酸基序氨基酸基序去飽和酶脂類框金屬框1金屬框2破璃苣Δ6WIGHDAGH(SEQ.ID.NO6)HNAHH(SEQ.ID.NO12)FQIEHH(SEQ.ID.NO20)集胞藻屬Δ6NVGHDANH(SEQ.ID.NO7)HNYLHH(SEQ.ID.NO13)HQVTHH(SEQ.ID.NO21)擬南芥屬葉綠體Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)稻Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)甘氨酸葉綠體Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)擬南芥.fad3(Δ15)VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)蕓苔屬fad3(Δ15)VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)玻璃苣Δ12(P1-81)*VIAHECGH(SEQ.ID.NO9)HRRHH(SEQ.ID.NO15)HVAHH(SEQ.ID.NO23)擬南芥fad2(Δ12)VIAHECGH(SEQ.ID.NO9)HRRHH(SEQ.ID.NO15)HVAHH(SEQ.ID.NO23)擬南芥屬葉綠體Δ12VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDRHH(SEQ.ID.NO16)HIPHH(SEQ.ID.NO24)甘氨酸質體Δ12VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDRHH(SEQ.ID.NO16)HIPHH(SEQ.ID.NO24)菠菜質體n-6VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDQHH(SEQ.ID.NO17)HIPHH(SEQ.ID.NO24)集胞藻屬Δ12VVGHDCGH(SEQ.ID.NO11)HDHHH(SEQ.ID.NO18)HIPHH(SEQ.ID.NO24)魚腥藻屬Δ12VLGHDCGH(SEQ.1D.NO8)HNHHH(SEQ.ID.NO19)HVPHH(SEQID.NO25)*P1-81是通過EST分析確認的全長cDNA，顯示出與擬南芥屬Δ12去飽和酶(fad2)有高度類似性實施例10構建221.Δ6.NOS的瞬時表達載體pBI221(Jeffersonetal1987EMBOJ.63901-3907)用BamHI和EcoICRI(promega)酶切去除GUS編碼區(qū)域剩于完整的35S啟動子和NOS完整的終止子，以制備連接片段。琉璃苣Δ6-去飽和酶cDNA用BamHI和xhoI酶切從Bluescript質粒(Stratagene)上切下。XhoI末端用Klenow大片段補齊，此片段克隆進pBI221的BamHI/EcoICRI位點，產生221Δ6.NOS(圖7)。在221.Δ6NOS中，圖7的限制性圖譜余下的部分骨架是pBI221。實施例11建立121Δ6.NOS的穩(wěn)定轉化載體pBI121(Jeffersonetal.1981EMBOJ.63901-3907)通過BamHI和EcoICRI(Promega)酶切除去GUS編碼區(qū)域，剩下完整的35S啟動子和NOS終止子，以制備連接片段。琉璃苣的Δ6-去飽酶cDNA用BamHI和XhoI酶切從Bluesoript質粒(Stratagene)上切下。xhoI未端用Klenow大片段補平，此片段克隆進pBI121的BamHI/EcoICRI位點，產生121.Δ6NOS(圖7)。在121.Δ6NOS中，圖7的限制性圖譜余下的部分(骨架)是pBI121。實施例12瞬時表達所有涉及原生質體的工作全在無菌通風櫥中進行。1ml濃集的胡蘿卜懸浮細胞在30ml質壁分離液中過夜消化(25g/lkol，3.5g/lCacl2·H2O，10mMMES，pH5.6和0.2M甘露醇)，此質壁分離液中還含有1％纖維素酶，0.1％果膠酶和0.1％dreisalase，此消化于室溫下反應，并避光。釋放出來的原生質體通過150uM網過濾，然后離心沉淀(100xg，5分)。用質壁分離液洗滌兩次，原生質體用雙室血細胞計數器計數。把106原生質體和50-70ug質粒DNA(221.Δ6NOS)用PEG處理，DNA轉化進原生質體，方法見Nunberg和Thomos(1993《植物分子生物學和生物技術的方法》B.R.GlickandJ.E.Thompson，eds，pp241-248)原生質體在加有0.2M甘露醇和3uM2，4-D的5mlMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時，并避光。實施例13煙草的穩(wěn)定轉化除了開始的轉化子在100ug/ml卡那霉素中選擇，依據標準程序(Horshetal.，1985《科學》2271229-1231；Bogueetal.，1990Mol.Gen.Genet.221；49-57)，121.Δ6NOS質粒通過土壤桿菌屬轉化煙草(Nicotianatabacumcv.xanthi)。實施例14制備與分析脂肪酸甲酯(FAMEs)從轉化原生質體和轉化煙草植物中來源的組織凍于液氮中，過夜冷凍干燥。制備FAMEs，方法見Dahmeretal(1989J.Amer.OilChem.Soc.66543-548)。在一些情況下，溶劑再一次蒸發(fā)，FAMEs懸浮于乙酸乙酯中，并且無離子水抽提一次去除任何水溶性污染物。FAMEs通過氣相色譜法(GC)在一個J&WScientificDB-wax柱(長30m，內徑0.25mm，0.25um膜)上分析。瞬時測定的實例顯示于圖8，它代表混合在一起的三個獨立的轉化子。琉璃苣Δ6-去飽和酶的增加對應于γ-亞麻酸(GLA)的出現，而GLA是Δ6-去飽和酶可能的產物之一。圖9和10描述了來源于對照和轉化煙草植物葉子和種子組織中FAMEs的GC圖。圖9A提供了野生型煙草葉組織的圖(Xanthi)，圖9B提供了在35SCaMV啟動子(pBI121.Δ6NOS)轉錄調控下琉璃苣Δ6-去飽和酶轉化的煙草葉組織圖。峰值對應于18∶2，18∶3γ(GLA)，18∶3α和18∶4(十八碳酸)。圖10A表明了野生型煙草種子的GC圖；圖10B表明用pBI121.Δ6NOS轉化的煙草種子組織的圖。峰值對應于18∶2，18∶3γ(GLA)和18∶3α。C18脂肪酸在對照和轉基因煙草種子中的相對分布顯示于表4中。表4</tables>上述結果顯示，GLA已摻入含有琉璃苣Δ6-去飽和酶的轉基因煙草的葉與種子的三酰基甘油酯中。序列表(1)總的信息(i)申請人Rhone-PoulencAgrochimie(ii)發(fā)明題目通過Δ6-去飽和酶生產γ-亞麻酸(iii)序列數目25(iv)通信地址(A)收信人Scully，Scott，Murphy&Presser(B)街道400GardenCityPlaza(C)城市GardenCity(D)州NewYork(E)國家美國(F)郵區(qū)11530(v)機讀形式(A)媒質形式Floppydisk(B)計算機兼容IBMPC機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease#1.0，Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日期1994.12.30.(C)分類(Viii)委托代理人信息(A)名字Presser，Leopold(B)登記號19,827(C)文獻/檔案號碼8383ZYXW(ix)通信信息(A)電話(516)742-4343(B)傳真(516)742-4366(C)電傳230901SANSUR(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度3588個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型22(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名字/鍵CDS(B)位置2002..3081(xi)序列說明；SEQIDNO1GCTAGCCACCAGTGACGATGCCTTGAATTTGGCCATTCTGACCCAGGCCCGTATTCTGAA60TCCCCGCATTCGCATTGTTAATCGTTTGTTCAACCATGCCCTGGGTAAACGTTTAGACAC120CACCTTGCCAGACCACGTTAGTTTGAGTGTTTCCGCCCTGGCGGCCCCGATTTTTTCCTT180TGCGGCTTTGGGCAATCAGGCGATCGGGCAATTGCGTTTGTTTGACCAGACTTGGCCCAT240TCAGGAAATTGTCATTCACCAAGACCATCCCTGGCTCAATTTACCCCTGGCGGATTTATG300GGATGATCCGAGCCGAATGTTGATCTATTACCTACCGGCCCACAGTGAAACGGATTTAGT360AGGCGCAGTGGTGAATAATTTAACGTTGCAATCTGGGGACCATTTAATAGTGGGACAAAA420ACCCCAACCCAAGACCAAACGGCGATCGCCTTGGCGCAAATTTTCCAAACTGATTACCAA480CCTGCGGGAGTATCAGCGGTATGTCCAACAGGTGATATGGGTGGTGTTGTTTTTATTGTT540GATGATTTTTCTGGCCACCTTCATCTACGTTTCCATTGATCAACATATTGCCCCAGTGGA600CGCGTTGTATTTTTCCGTGGGCATGATTACCGGGGCCGGTGGCAAGGAAGAGGTGGCCGA660AAAGTCCCCCGATATCATCAAAGTATTCACAGTGGTGATGATGATCGCCGGGGCGGGGGT720GATTGGTATTTGTTATGCCCTACTGAATGATTTCATCCTTGGCAGTCGCTTTAGTCAGTT780TTTGGATGCGGCCAAGTTACCCGATCGCCATCACATCATCATTTGTGGGCTGGGGGGAGT840GAGCATGGCCATTATTGAAGAGTTAATTCACCAGGGCCATGAAATTGTGGTAATCGAAAA900GGATACAGATAATCGTTTCTTGCATACGGCCCGCTCCCTGGGGGTGCCCGTAATTGTGGA960GGATGCCCGCCTAGAAAGAACGTTGGCCTGCGCCAATATCAACCGAGCCGAAGCCATTGT1020GGTGGCCACCAGCGACGACACCGTTAACTTGGAAATTGGCCTAACTGCCAAGGCGATCGC1080CCCTAGCCTGCCAGTGGTGTTGCGTTGCCAGGATGCCCAGTTTAGCCTGTCCCTGCAGGA1140AGTATTTGAATTTGAAACGGTGCTTTGTCCGGCGGAATTGGCCACCTATTCCTTTGCGGC1200GGCGGCCCTGGGGGGCAAAATTTTGGGCAACGGCATGACCGATGATTTGCTGTGGGTAGC1260CCTAGCCACCTTAATCACTCCTAACCATCCCTTTGCCGACCAATTGGTTAAAATTGCAGC1320CCAAAAGTCTGATTTCGTTCCCCTCTATCTAGAACGGGGTGGCAAAACCATCCATAGCTG1380GGAATTATTGGGTACCCATCTCGACTCTGGAGACGTGTTGTATTTAACCATGCCCGCCAC1440TGCCCTAGAGCAACTTTGGCGATCGCCCCGTGCCACTGCTGATCCTCTGGACTCTTTTTT1500GGTTTAGCATGGGGGGATGGAACTCTTGACTCGGCCCAATGGTGATCAAGAAAGAACGCT1560TTGTCTATGTTTAGTATTTTTAAGTTAACCAACAGCAGAGGATAACTTCCAAAAGAAATT1620AAGCTCAAAAAGTAGCAAAATAAGTTTAATTCATAACTGAGTTTTACTGCTAAACAGCGG1680TGCAAAAAAGTCAGATAAAATAAAAGCTTCACTTCGGTTTTATATTGTGACCATGGTTCC1740CAGGCATCTGCTCTAGGGAGTTTTTCCGCTGCCTTTAGAGAGTATTTTCTCCAAGTCGGC1800TAACTCCCCCATTTTTAGGCAAAATCATATACAGACTATCCCAATATTGCCAGAGCTTTG1860ATGACTCACTGTAGAAGGCAGACTAAAATTCTAGCAATGGACTCCCAGTTGGAATAAATT1920TTTAGTCTCCCCCGGCGCTGGAGTTTTTTTGTAGTTAATGGCGGTATAATGTGAAAGTTT1980TTTATCTATTTAAATTTATAAATGCTAACAGCGGAAAGAATTAAATTTACC2031MetLeuThrAlaGluArgIleLysPheThr1510CAGAAACGGGGGTTTCGTCGGGTACTAAACCAACGGGTGGATGCCTAC2079GlnLysArgGlyPheArgArgValLeuAsnGlnArgValAspAlaTyr152025TTTGCCGAGCATGGCCTGACCCAAAGGGATAATCCCTCCATGTATCTG2127PheAlaGluHisGlyLeuThrGlnArgAspAsnProSerMetTyrLeu303540AAAACCCTGATTATTGTGCTCTGGTTGTTTTCCGCTTGGGCCTTTGTG2175LysThrLeuIleIleValLeuTrpLeuPheSerAiaTrpAlaPheVal455055CTTTTTGCTCCAGTTATTTTTCCGGTGCGCCTACTGGGTTGTATGGTT2223LeuPheAlaProValIlePheProValArgLeuLeuGlyCysMetVal606570TTGGCGATCGCCTTGGCGGCCTTTTCCTTCAATGTCGGCCACGATGCC2271LeuAlaIleAlaLeuAlaAlaPheSerPheAsnValGlyHisAspAla75808590AACCACAATGCCTATTCCTCCAATCCCCACATCAACCGGGTTCTGGGC2319AsnHisAsnAlaTyrSerSerAsnProHisIleAsnArgValLeuGly95100105ATGACCTACGATTTTGTCGGGTTATCTAGTTTTCTTTGGCGCTATCGC2367MetThrTyrAspPheValGlyLeuSerSerPheLeuTrpArgTyrArg110115120CACAACTATTTGCACCACACCTACACCAATATTCTTGGCCATGACGTG2415HisAsnTyrLeuHisHisThrTyrThrAsnIleLeuGlyHisAspVal125130135GAAATCCATGGAGATGGCGCAGTACGTATGAGTCCTGAACAAGAACAT2463GluIleHisGlyAspGlyAlaValArgMetSerProGluGlnGluHis140145150GTTGGTATTTATCGTTTCCAGCAATTTTATATTTGGGGTTTATATCTT2511ValGlyIleTyrArgPheGlnGlnPheTyrIleTrpGlyLeuTyrLeu155160165170TTCATTCCCTTTTATTGGTTTCTCTACGATGTCTACCTAGTGCTTAAT2559PheIleProPheTyrTrpPheLeuTyrAspValTyrLeuValLeuAsn175180185AAAGGCAAATATCACGACCATAAAATTCCTCCTTTCCAGCCCCTAGAA2607LysGlyLysTyrHisAspHisLysIleProProPheGlnProLeuGlu190195200TTAGCTAGTTTGCTAGGGATTAAGCTATTATGGCTCGGCTACGTTTTC2655LeuAlaSerLeuLeuGlyIleLysLeuLeuTrpLeuGlyTyrValPhe205210215GGCTTACCTCTGGCTCTGGGCTTTTCCATTCCTGAAGTATTAATTGGT2703GlyLeuProLeuAlaLeuGlyPheSerIleProGluValLeuIleGly220225230GCTTCGGTAACCTATATGACCTATGGCATCGTGGTTTGCACCATCTTT2751AlaSerValThrTyrMetThrTyrGlyIleValValCysThrIlePhe235240245250ATGCTGGCCCATGTGTTGGAATCAACTGAATTTCTCACCCCCGATGGT2799MetLeuAlaHisValLeuGluSerThrGluPheLeuThrProAspGly255260265GAATCCGGTGCCATTGATGACGAGTGGGCTATTTGCCAAATTCGTACC2847GluSerGlyAlaIleAspAspGluTrpAlaIleCysGlnIleArgThr270275280ACGGCCAATTTTGCCACCAATAATCCCTTTTGGAACTGGTTTTGTGGC2895ThrAlaAsnPheAlaThrAsnAsnProPheTrpAsnTrpPheCysGly285290295GGTTTAAATCACCAAGTTACCCACCATCTTTTCCCCAATATTTGTCAT2943GlyLeuAsnHisGlnValThrHisHisLeuPheProAsnIleCysHis300305310ATTCACTATCCCCAATTGGAAAATATTATTAAGGATGTTTGCCAAGAG2991IleHisTyrProGlnLeuGluAsnIleIleLysAspValCysGlnGlu315320325330TTTGGTGTGGAATATAAAGTTTATCCCACCTTCAAAGCGGCGATCGCC3039PheGlyValGluTyrLysValTyrProThrPheLysAlaAlaIleAla335340345TCTAACTATCGCTGGCTAGAGGCCATGGGCAAAGCATCGTGACATTGCC3088SerAsnTyrArgTrpLeuGluAlaMetGlyLysAlaSer350355360TTGGGATTGAAGCAAAATGGCAAAATCCCTCGTAAATCTATGATCGAAGCCTTTCTGTTG3148CCCGCCGACCAAATCCCCGATGCTGACCAAAGGTTGATGTTGGCATTGCTCCAAACCCAC3208TTTGAGGGGGTTCATTGGCCGCAGTTTCAAGCTGACCTAGGAGGCAAAGATTGGGTGATT3268TTGCTCAAATCCGCTGGGATATTGAAAGGCTTCACCACCTTTGGTTTCTACCCTGCTCAA3328TGGGAAGGACAAACCGTCAGAATTGTTTATTCTGGTGACACCATCACCGACCCATCCATG3388TGGTCTAACCCAGCCCTGGCCAAGGCTTGGACCAAGGCCATGCAAATTCTCCACGAGGCT3448AGGCCAGAAAAATTATATTGGCTCCTGATTTCTTCCGGCTATCGCACCTACCGATTTTTG3508AGCATTTTTGCCAAGGAATTCTATCCCCACTATCTCCATCCCACTCCCCCGCCTGTACAA3568AATTTTATCCATCAGCTAGC3588(2)SEQIDNO2的信息(I)序列特征(A)長度359個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲構型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列說明SEQIDNO2MetLeuThrAlaGluArgIleLysPheThrGlnLysArgGlyPheArg151015ArgValLeuAsnGlnArgValAspAlaTyrPheAlaGluHisGlyLeu202530ThrGlnArgAspAsnProSerMetTyrLeuLysThrLeuIleIleVal354045LeuTrpLeuPheSerAlaTrpAlaPheValLeuPheAlaProValIle505560PheProValArgLeuLeuGlyCysMetValLeuAlaIleAlaLeuAla65707580AlaPheSerPheAsnValGlyHisAspAlaAsnHisAsnAlaTyrSer859095SerAsnProHisIleAsnArgValLeuGlyMetThrTyrAspPheVal100105110GlyLeuSerSerPheLeuTrpArgTyrArgHisAsnTyrLeuHisHis115120125ThrTyrThrAsnIleLeuGlyHisAspValGluIleHisGlyAspGly130135140AlaValArgMetSerProGluGlnGluHisValGlyIleTyrArgPhe145150155160GlnGlnPheTyrIleTrpGlyLeuTyrLeuPheIleProPheTyrTrp165170175PheLeuTyrAspValTyrLeuValLeuAsnLysGlyLysTyrHisAsp180185190HisLysIleProProPheGlnProLeuGluLeuAlaSerLeuLeuGly195200205IleLysLeuLeuTrpLeuGlyTyrValPheGlyLeuProLeuAlaLeu210215220GlyPheSerIleProGluValLeuIleGlyAlaSerValThrTyrMet225230235240ThrTyrGlyIleValValCysThrIlePheMetLeuAlaHisValLeu245250255GluSerThrGluPheLeuThrProAspGlyGluSerGlyAlaIleAsp260265270AspGluTrpAlaIleCysGlnIleArgThrThrAlaAsnPheAlaThr275280285AsnAsnProPheTrpAsnTrpPheCysGlyGlyLeuAsnHisGlnVal290295300ThrHisHisLeuPheProAsnIleCysHisIleHisTyrProGlnLeu305310315320GluAsnIleIleLysAspValCysGlnGluPheGlyValGluTyrLys325330335ValTyrProThrPheLysAlaAlaIleAlaSerAsnTyrArgTrpLeu340345350GluAlaMetGlyLysAlaSer355(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度1884個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型22(D)拓撲構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO3AGCTTCACTTCGGTTTTATATTGTGACCATGGTTCCCAGGCATCTGCTCTAGGGAGTTTT60TCCGCTGCCTTTAGAGAGTATTTTCTCCAAGTCGGCTAACTCCCCCATTTTTAGGCAAAA120TCATATACAGACTATCCCAATATTGCCAGAGCTTTGATGACTCACTGTAGAAGGCAGACT180AAAATTCTAGCAATGGACTCCCAGTTGGAATAAATTTTTAGTCTCCCCCGGCGCTGGAGT240TTTTTTGTAGTTAATGGCGGTATAATGTGAAAGTTTTTTATCTATTTAAATTTATAAATG300CTAACAGCGGAAAGAATTAAATTTACCCAGAAACGGGGGTTTCGTCGGGTACTAAACCAA360CGGGTGGATGCCTACTTTGCCGAGCATGGCCTGACCCAAAGGGATAATCCCTCCATGTAT420CTGAAAACCCTGATTATTGTGCTCTGGTTGTTTTCCGCTTGGGCCTTTGTGCTTTTTGCT480CCAGTTATTTTTCCGGTGCGCCTACTGGGTTGTATGGTTTTGGCGATCGCCTTGGCGGCC540TTTTCCTTCAATGTCGGCCACGATGCCAACCACAATGCCTATTCCTCCAATCCCCACATC600AACCGGGTTCTGGGCATGACCTACGATTTTGTCGGGTTATCTAGTTTTCTTTGGCGCTAT660CGCCACAACTATTTGCACCACACCTACACCAATATTCTTGGCCATGACGTGGAAATCCAT720GGAGATGGCGCAGTACGTATGAGTCCTGAACAAGAACATGTTGGTATTTATCGTTTCCAG780CAATTTTATATTTGGGGTTTATATCTTTTCATTCCCTTTTATTGGTTTCTCTACGATGTC840TACCTAGTGCTTAATAAAGGCAAATATCACGACCATAAAATTCCTCCTTTCCAGCCCCTA900GAATTAGCTAGTTTGCTAGGGATTAAGCTATTATGGCTCGGCTACGTTTTCGGCTTACCT960CTGGCTCTGGGCTTTTCCATTCCTGAAGTATTAATTGGTGCTTCGGTAACCTATATGACC1020TATGGCATCGTGGTTTGCACCATCTTTATGCTGGCCCATGTGTTGGAATCAACTGAATTT1080CTCACCCCCGATGGTGAATCCGGTGCCATTGATGACGAGTGGGCTATTTGCCAAATTCGT1140ACCACGGCCAATTTTGCCACCAATAATCCCTTTTGGAACTGGTTTTGTGGCGGTTTAAAT1200CACCAAGTTACCCACCATCTTTTCCCCAATATTTGTCATATTCACTATCCCCAATTGGAA1260AATATTATTAAGGATGTTTGCCAAGAGTTTGGTGTGGAATATAAAGTTTATCCCACCTTC1320AAAGCGGCGATCGCCTCTAACTATCGCTGGCTAGAGGCCATGGGCAAAGCATCGTGACAT1380TGCCTTGGGATTGAAGCAAAATGGCAAAATCCCTCGTAAATCTATGATCGAAGCCTTTCT1440GTTGCCCGCCGACCAAATCCCCGATGCTGACCAAAGGTTGATGTTGGCATTGCTCCAAAC1500CCACTTTGAGGGGGTTCATTGGCCGCAGTTTCAAGCTGACCTAGGAGGCAAAGATTGGGT1560GATTTTGCTCAAATCCGCTGGGATATTGAAAGGCTTCACCACCTTTGGTTTCTACCCTGC1620TCAATGGGAAGGACAAACCGTCAGAATTGTTTATTCTGGTGACACCATCACCGACCCATC1680CATGTGGTCTAACCCAGCCCTGGCCAAGGCTTGGACCAAGGCCATGCAAATTCTCCACGA1740GGCTAGGCCAGAAAAATTATATTGGCTCCTGATTTCTTCCGGCTATCGCACCTACCGATT1800TTTGAGCATTTTTGCCAAGGAATTCTATCCCCACTATCTCCATCCCACTCCCCCGCCTGT1860ACAAAATTTTATCCATCAGCTAGC1884(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度1685個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型22(D)拓撲構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO4AATATCTGCCTACCCTCCCAAAGAGAGTAGTCATTTTTCATCAATGGCTGCTCAAATCAA60GAAATACATTACCTCAGATGAACTCAAGAACCACGATAAACCCGGAGATCTATGGATCTC120GATTCAAGGGAAAGCCTATGATGTTTCGGATTGGGTGAAAGACCATCCAGGTGGCAGCTT180TCCCTTGAAGAGTCTTGCTGGTCAAGAGGTAACTGATGCATTTGTTGCATTCCATCCTGC240CTCTACATGGAAGAATCTTGATAAGTTTTTCACTGGGTATTATCTTAAAGATTACTCTGT300TTCTGAGGTTTCTAAAGATTATAGGAAGCTTGTGTTTGAGTTTTCTAAAATGGGTTTGTA360TGACAAAAAAGGTCATATTATGTTTGCAACTTTGTGCTTTATAGCAATGCTGTTTGCTAT420GAGTGTTTATGGGGTTTTGTTTTGTGAGGGTGTTTTGGTACATTTGTTTTCTGGGTGTTT480GATGGGGTTTCTTTGGATTCAGAGTGGTTGGATTGGACATGATGCTGGGCATTATATGGT540AGTGTCTGATTCAAGGCTTAATAAGTTTATGGGTATTTTTGCTGCAAATTGTCTTTCAGG600AATAAGTATTGGTTGGTGGAAATGGAACCATAATGCACATCACATTGCCTGTAATAGCCT660TGAATATGACCCTGATTTACAATATATACCATTCCTTGTTGTGTCTTCCAAGTTTTTTGG720TTCACTCACCTCTCATTTCTATGAGAAAAGGTTGACTTTTGACTCTTTATCAAGATTCTT780TGTAAGTTATCAACATTGGACATTTTACCCTATTATGTGTGCTGCTAGGCTCAATATGTA840TGTACAATCTCTCATAATGTTGTTGACCAAGAGAAATGTGTCCTATCGAGCTCAGGAACT900CTTGGGATGCCTAGTGTTCTCGATTTGGTACCCGTTGCTTGTTTCTTGTTTGCCTAATTG960GGGTGAAAGAATTATGTTTGTTATTGCAAGTTTATCAGTGACTGGAATGCAACAAGTTCA1020GTTCTCCTTGAACCACTTCTCTTCAAGTGTTTATGTTGGAAAGCCTAAAGGGAATAATTG1080GTTTGAGAAACAAACGGATGGGACACTTGACATTTCTTGTCCTCCTTGGATGGATTGGTT1140TCATGGTGGATTGCAATTCCAAATTGAGCATCATTTGTTTCCCAAGATGCCTAGATGCAA1200CCTTAGGAAAATCTCGCCCTACGTGATCGAGTTATGCAAGAAACATAATTTGCCTTACAA1260TTATGCATCTTTCTCCAAGGCCAATGAAATGACACTCAGAACATTGAGGAACACAGCATT1320GCAGGCTAGGGATATAACCAAGCCGCTCCCGAAGAATTTGGTATGGGAAGCTCTTCACAC1380TCATGGTTAAAATTACCCTTAGTTCATGTAATAATTTGAGATTATGTATCTCCTATGTTT1440GTGTCTTGTCTTGGTTCTACTTGTTGGAGTCATTGCAACTTGTCTTTTATGGTTTATTAG1500ATGTTTTTTAATATATTTTAGAGGTTTTGCTTTCATCTCCATTATTGATGAATAAGGAGT1560TGCATATTGTCAATTGTTGTGCTCAATATCTGATATTTTGGAATGTACTTTGTACCACTG1620TGTTTTCAGTTGAAGCTCATGTGTACTTCTATAGACTTTGTTTAAATGGTTATGTCATGT1680TATTT1685(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度448個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO5MetAlaAlaGlnIleLysLysTyrIleThrSerAspGluLeuLysAsn151015HisAspLysProGlyAspLeuTrpIleSerIleGlnGlyLysAlaTyr202530AspValSerAspTrpValLysAspHisProGlyGlySerPheProLeu354045LysSerLeuAlaG1yGlnGluValThrAspAlaPheValAlaPheHis505560ProAlaSerThrTrpLysAsnLeuAspLysPhePheThrGlyTyrTyr65707580LeuLysAspTyrSerValSerGluValSerLysAspTyrArgLysLeu859095ValPheGluPheSerLysMetGlyLeuTyrAspLysLysGlyHisIle100105110MetPheAlaThrLeuCysPheIleAlaMetLeuPheAlaMetSerVal115120125TyrGlyValLeuPheCysGluGlyValLeuValHisLeuPheSerGly130135140CysLeuMetGlyPheLeuTrpIleGlnSerGlyTrpIleGlyHisAsp145150155160AlaGlyHisTyrMetValValSerAspSerArgLeuAsnLysPheMet165170175GlyIlePheAlaAlaAsnCysLeuSerGlyIleSerIleGlyTrpTrp180185190LysTrpAsnHisAsnAlaHisHisIleAlaCysAsnSerLeuGluTyr195200205AspProAspLeuGlnTyrIleProPheLeuValValSerSerLysPhe210215220PheGlySerLeuThrSerHisPheTyrGluLysArgLeuThrPheAsp225230235240SerLeuSerArgPhePheValSerTyrGlnHisTrpThrPheTyrPro245250255IleMetCysAlaAlaArgLeuAsnMetTyrValGlnSerLeuIleMet260265270LeuLeuThrLysArgAsnValSerTyrArgAlaGlnGluLeuLeuGly275280285CysLeuValPheSerIleTrpTyrProLeuLeuValSerCysLeuPro290295300AsnTrpGlyGluArgIleMetPheValIleAlaSerLeuSerValThr305310315320GlyMetGlnGlnValGlnPheSerLeuAsnHisPheSerSerSerVal325330335TyrValGlyLysProLysGlyAsnAsnTrpPheGluLysGlnThrAsp340345350GlyThrLeuAspIleSerCysProProTrpMetAspTrpPheHisGly355360365GlySerGlnPheGlnIleGluHisHisLeuPheProLysMetProArg370375380CysAsnLeuArgLysIleSerProTyrValIleGluLeuCysLysLys385390395400HisAsnLeuProTyrAsnTyrAlaSerPheSerLysAlaAsnGluMet405410415ThrLeuArgThrLeuArgAsnThrAlaLeuGlnAlaArgAspIleThr420425430LysProLeuProLysAsnLeuValTrpGluAlaLeuHisThrHisGly435440445(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO6TrpIleGlyHisAspAlaGlyHis15(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO7AsnValGlyHisAspAlaAsnHis15(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO8ValLeuGlyHisAspCysGlyHis15(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO9ValIleAlaHisGluCysGlyHis15(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO10ValIleGlyHisAspCysAlaHis15(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO11ValValGlyHisAspCysGlyHis15(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO12HisAsnAlaHisHis15(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO13HisAsnTyrLeuHisHis15(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO14HisArgThrHisHis15(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO15HisArgArgHisHis15(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO16HisAspArgHisHis15(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO17HisAspGlnHisHis15(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO18HisAspHisHisHis15(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO19HisAsnHisHisHis15(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO20PheGlnIleGluHisHis15(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO21HisGlnValThrHisHis15(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO22HisValIleHisHis15(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO23HisValAlaHisHis15(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO24HisIleProHisHis15(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長度5個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲構型直線(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列說明SEQIDNO25HisValProHisHis1權利要求1.編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶的分離的核酸。2.權利要求1的分離出的核酸，包括SEQIDNO4的核苷酸序列。3.編碼SEQIDNO5的氨基酸序列的分離出的核苷酸。4.包含權利要求1-3中任何一個核酸的載體。5.一種表達載體，包含權利要求1-3任一項的分離的核酸，其中該核酸可操作性地與啟動子和任選的能夠影響所述分離核酸基因產物表達的終止序列連接。6.權利要求5的表達載體，其中所說的啟動子是Δ6去飽和酶啟動子，魚腥藻屬羧化酶啟動子，半日花素啟動子，大豆球蛋白啟動子，napin啟動子，來源于CaMV的35S啟動子或半日花素組織特異性啟動子。7.權利要求5的表達載體，在此所說的啟動子是組成性的或組織特異性的。8.權利要求5的表達載體，在此所說的終止信號是一個集胞藻屬終止信號，胭脂堿合成酶終止信號或種子終止信號。9.包含權利要求4-8中任一項的載體的細胞。1O.權利要求9的細胞，其中所說細胞是動物細胞，細菌細胞，植物細胞，或真菌細胞。11.包含權利要求1-3中任一項的分離的核酸的轉基因生物體。12.包含權利要求4-8中任一項載體的轉基因生物體。13.權利要求11或12的轉基因生物體，其中所說的生物體是細菌，真菌，植物或動物。14.從權利要求10的植物細胞再生而來的植物或所說植物的后代。15.權利要求14的植物，其中所說的植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜或油籽油菜。16.生產具有增高的γ亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，包括(a).用權利要求1-3任一項中分離的核酸轉化植物細胞；和(b).從所說植物細胞再生具有增加的GLA含量的植物。17.生產具有增高的γ亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，包括(a).用權利要求4-8中任一項的載體轉化植物細胞；和(b).從所說的植物細胞中再生具有增高的GLA含量的植物。18.權利要求16或17的方法，其中所說的植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜和油籽油菜。19.在GLA缺陷或缺乏的生物體中誘導生產γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用權利要求1-3任一項中分離核酸轉化所說生物體。20.在GLA缺陷或缺乏的生物體中誘導生產γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用權利要求4-8任一項中的載體轉化所說的生物體。21.在GLA和亞油酸缺陷或缺乏的生物體中誘導生產γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶和編碼Δ12-去飽和酶的分離的核酸轉化所說的生物體。22.權利要求21的方法，其中所說的編碼Δ6-去飽和酶的分離的核酸包括SEQIDNO4的44至1390核苷酸。23.在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘導生產十八碳四烯酸的方法，包括用權利要求1-3中任一項的分離的核酸轉化所說的生物體。24在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘導生產十八碳四烯酸的方法，包括用權利要求4-8中任一項的載體轉化所說的生物體。25.權利要求23或24的方法，其中所說的生物體是細菌，真菌，植物或動物。26.生產具有增強抗凍性植物的方法，包括(a).用權利要求1-3中任一項的分離的核酸轉化植物細胞；和(b).從所說的轉化的植物細胞中再生具有增強抗凍性的所說植物。27.生產具有增強抗凍性植物的方法，包括(a).用權利要求4-8中任一項的載體轉化植物細胞；(b).從所說轉化的植物細胞中再生具有增強抗凍性的所說的植物。28.權利要求26或27的方法，其中所說植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜或者油籽油菜。全文摘要亞油酸被△6去飽和酶轉化為γ－亞麻酸。本發(fā)明涉及分離的包括△6去飽和酶基因的核酸。更具體地,分離的核酸包括△6去飽和酶基因的啟動子,編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明提供了包含與異源性調節(jié)序列功能性組合的△6去飽和酶編碼區(qū)的重組構建體。本發(fā)明的核酸和重組構建體在轉基因生物體GLA的產生中有用。文檔編號C12N15/74GK1177379SQ95197728公開日1998年3月25日申請日期1995年12月28日優(yōu)先權日1994年12月30日發(fā)明者T·L·湯馬斯,A·S·雷迪,M·盧希奧,A·N·盧恩貝爾格,G·L·弗雷思勒特申請人:羅納-布朗克農業(yè)化學公司