專利名稱：使用衍生自ap205外殼蛋白的病毒樣顆粒的分子抗原陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
接種提供了抵抗感染性疾病的最有效途徑之一，并且在上個世紀對公眾健康產(chǎn)生 了最重要的益處。早期接種方案使用活的、減毒的或滅活的病原體作為免疫原。公眾和官 方在安全性方面的關(guān)注一直以來促進了對更確定的和更安全的疫苗的探索。該探索促進了新的研究方向，其中單個抗原被分離或重組表達，并且作為免疫原 進行注射。這些研究的例子包括亞單元疫苗的開發(fā)和利用。然而，因為分離的蛋白質(zhì)通常 沒有足以導(dǎo)致保護性免疫應(yīng)答的免疫原性，所以這種疫苗常常需要添加佐劑以產(chǎn)生足夠抵 抗抗原的免疫應(yīng)答。盡管已知幾種強的佐劑，諸如弗氏完全佐劑，但是它們通常是有毒的， 并且不能在人類中使用。因此，大量的努力被投入到新佐劑的探索中。最近，對免疫系統(tǒng)區(qū)分自我和外來物的原理的研究已經(jīng)表明病毒表面上抗原的 組織程度和重復(fù)性是抗原作為外來物被識別的非常強的信號(Bachmarm & Zinkernagel， Immunol. Today 17:553-558(1996))。在基于病毒樣顆粒(VLP)的新疫苗設(shè)計中利用了病 毒結(jié)構(gòu)的這種特性，該新疫苗聯(lián)合了病毒結(jié)構(gòu)的免疫原性和非復(fù)制疫苗改進的安全性。在 這些疫苗中，抗原融合或化學(xué)附著(chemical attachment)于病毒樣顆粒上，所述化學(xué)附著 是共價或非共價的。這樣，通過連接抗原和病毒樣顆粒，病毒結(jié)構(gòu)的免疫原特性被轉(zhuǎn)移給抗 原。各種VLP已經(jīng)用于附著抗原。例如，WO 00/32227描述了乙型肝炎病毒核心抗原
在一些類型疫苗的生產(chǎn)中的用途。WO 03/056905中公開了一類新的高度可表達的并具有高度免疫原性的VLP，這里 將這篇文獻整體并入為參考文獻。這些VLP由RNA噬菌體的外殼蛋白組成。該外殼蛋白在 細菌中重組表達，并且VLP不含有噬菌體RNA基因組，因此不能復(fù)制。最近鑒定了新RNA 噬菌體，AP205(Klovins, J.，等，J Gen. Virol. 83 1523-33(2002).)。AP205RNA 噬菌體(Taxonomy ID :154784)是單鏈、正鏈 RNA(沒有 DNA 階段)病毒，其屬于輕小病毒科(Leviviridae)，輕小病毒屬(Levivirus Genus)，未分類 的輕小病毒(Unclassified Levivirus)亞組。該亞組的其它成員是RNA噬菌體BOl，frl， TW19和PP7。兩種已描述的輕小病毒亞組包括下列RNA噬菌體fr，JP501，f2，M12，MS2和 R17(亞組 I)和 BZ13，JP;34，TH1，GA 和 KUl (亞組 II)。AP205 基因組長 4267 核苷酸(nt)。 全長基因組序列登錄號AF334111，NC-002700。AP205噬菌體的天然宿主是不動桿菌屬 種(Acinetobacter Spp.) (Klovins, J.，等，J. Gen. Virol. 83 1523-33 (2002))。AP205 噬
4菌體基因組包含3個大的開放讀框(ORFs)，其編碼成熟蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶蛋白質(zhì)。 此外，在5’末端還存在兩個小0RF，位于成熟蛋白基因之前。這些ORFs編碼的蛋白質(zhì)的 功能未知。推測這些ORF之一可能編碼裂解蛋白質(zhì)(Klovins，J.，等，J. Gen. Virol. 83 1523-33(2002))。

發(fā)明內(nèi)容
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明載體，可以在細菌中重組表達AP205外殼蛋白。我們也 已經(jīng)研究出了 AP205病毒樣顆粒的純化方法。而且，正如電子顯微鏡術(shù)(EM)和免疫擴散所 證明的，本發(fā)明方法產(chǎn)生的AP205外殼蛋白自發(fā)地形成衣殼，因此在大腸桿菌(E. coli)中， 外殼蛋白單獨與RNA —起就足以裝配衣殼。這排除了兩種未知功能ORFs編碼的蛋白質(zhì)的 任何作用。本發(fā)明令人驚奇的特征是在結(jié)構(gòu)已闡明的其它RNA噬菌體外殼蛋白和AP205外 殼蛋白之間不存在序列同源性，但是當在電子顯微鏡(EM)下觀察時，AP205外殼蛋白形成 的衣殼和這些RNA噬菌體外殼蛋白形成的衣殼具有幾乎是不能區(qū)分的結(jié)構(gòu)特征。我們已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)AP205VLP具高度免疫原性，并且其可以連接有機分子以產(chǎn)生疫苗構(gòu)建體，從而展示出 以重復(fù)方式定向的有機分子。針對此展示的有機分子已經(jīng)誘導(dǎo)了高效價，這表明結(jié)合的有 機分子可以被抗體分子接近以發(fā)生相互作用，并且具有免疫原性。本發(fā)明提供了重組表達的病毒樣顆粒(VLP)，其從至少一種大腸桿菌中重組表達 的噬菌體AP205外殼蛋白自發(fā)裝配而成。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了能夠裝配的突變形 式的AP205VLP，其包括在氨基酸5位具有脯氨酸到蘇氨酸置換的AP205外殼蛋白(SEQ ID N0:3)。這些VLP，來源于天然來源的AP205VLP(SEQ ID NO :1)或AP205病毒顆粒，可以結(jié)合 至少一種有機分子以產(chǎn)生有機分子的有序重復(fù)陣列。本發(fā)明的有機分子包括抗原和抗原決 定簇、變應(yīng)原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及小的有機分子諸如濫用的藥 物，如煙堿和它們的衍生物。利用本發(fā)明提供的抗原-AP205VLP綴合物或含有這種綴合物 的組合物進行動物免疫接種，可以誘導(dǎo)抗所展示的抗原的強免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的VLP 可以用于分子(特別是抗原)的附著和展示。從而，本發(fā)明的綴合物、組合物和方法可以用 于刺激抗各種展示抗原的免疫應(yīng)答，因此可用于在動物中使用。在第一方面，本發(fā)明提供了病毒樣顆粒，其包含或者備選地或優(yōu)選地其基本組成 為或者備選地或優(yōu)選地其組成為至少一種選自以下的蛋白質(zhì)(a)具有SEQ ID N0:1中所 述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有SEQ IDNO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c)所述(a)或 (b)蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是重組蛋白。因此，本發(fā)明提供了由至少一 種選自以下的蛋白質(zhì)形成的衣殼(a)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b) 具有SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c)所述(a)或(b)蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)。 在優(yōu)選的實施方式中，所述突變蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述的 氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的至少1個氨基酸殘 基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中 優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。在另一優(yōu)選實施方式中，所述突變蛋白質(zhì)具有 SEQ ID NO 1中所述或SEQID NO 3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置換了 SEQ ID NO 1 或SEQID NO 3的至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少 1個，優(yōu)選地2個置換是保守性置換。在另一個優(yōu)選實施方式中，所述突變蛋白質(zhì)具有SEQID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘 基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。在第二方面，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的突變蛋白質(zhì)。 做為可替代方案，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3的重組蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)， 其中添加、缺失或置換了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個 氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至 少1個置換是保守性置換。在另一方面，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的重組蛋白質(zhì)的突變蛋 白質(zhì)，其中缺失或置換了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選地2 個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個，優(yōu)選地2個置換是保守性置換。做為可替代 方案，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的重組蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)，其中添加、 缺失或置換了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘 基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置 換是保守性置換。在另一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的載體，其序列與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的序列至少80 %，優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，甚至更優(yōu)選 地99%相同。做為可替代方案，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的載體，該重組蛋白質(zhì) 包含與選自以下的蛋白質(zhì)融合的多肽(a)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c)所述(a)或(b)多肽的突變蛋 白質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a) 提供核酸，該核酸包含與SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的核苷酸序列至少80%，優(yōu)選地至 少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，甚至更優(yōu)選地100 %相同的核苷酸序列，或者提供載體，該載 體包含與SEQ IDNO :2或SEQ ID NO 4的核苷酸序列至少80 %，優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地 至少95%，甚至更優(yōu)選地99%相同的核苷酸序列；(b)將所述核酸或載體引入到宿主細胞 中；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列，以獲得能形成AP205病毒樣顆 粒的蛋白質(zhì)或突變蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a) 提供編碼至少一種選自以下的蛋白質(zhì)的核酸或載體(i)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸 序列的蛋白質(zhì)；(ii)具有SEQ ID N0:3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(iii)所述⑴或(ii) 蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)；(b)將所述核酸或所述載體引入到宿主細胞中；(c)在所述宿主細胞 中表達所述核酸或所述載體的序列，以獲得能形成AP205病毒樣顆粒的所述蛋白質(zhì)或所述 突變蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述宿主細胞是大腸桿菌。上面已經(jīng)指出了(i)和(ii)下所述的蛋 白質(zhì)和突變蛋白質(zhì)的優(yōu)選實施方式。在第一實施方式中，本發(fā)明提供了包含一種或多種RNA噬菌體AP205重組VLP或 其突變體的組合物。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了包含一種或多種AP205VLP和一種或 多種有機分子的組合物，其中所述分子附著、連接、偶聯(lián)或融合，即，結(jié)合于AP205VLP上。在 另一個實施方式中，有機分子是抗原。
在一些其它實施方式中，有機分子選自(a)適于誘導(dǎo)抗癌細胞的免疫應(yīng)答的有 機分子；(b)適于誘導(dǎo)抗感染性疾病的免疫應(yīng)答的有機分子；(c)適于誘導(dǎo)抗變應(yīng)原的免疫 應(yīng)答的有機分子；(d)適于誘導(dǎo)改進的抗自身抗原的應(yīng)答的有機分子；(e)適于在農(nóng)畜或?qū)?物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有機分子；和(f)適于誘導(dǎo)抗藥物、激素或有毒化合物的應(yīng)答的有機 分子和(g) (a)-(f)中所述任何分子的片段(例如表位或抗原結(jié)構(gòu)域)。在另一個實施方式中，有機分子是一種或多種抗原。在一個這樣的實施方式中，抗 原是重組多肽。在另一個實施方式中，從天然來源諸如花粉、蜂、病原體或腫瘤提取抗原。而 在另一個實施方式中，抗原選自(a)適于誘導(dǎo)抗癌細胞的免疫應(yīng)答的多肽；(b)適于誘導(dǎo) 抗感染性疾病的免疫應(yīng)答的多肽；(c)適于誘導(dǎo)抗變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的多肽；(d)適于誘導(dǎo) 抗自身抗體的免疫應(yīng)答的多肽；和(e)適于在農(nóng)畜或?qū)櫸镏姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答的多肽。在特別的實施方式中，抗原包含細胞毒性T細胞或輔助T細胞的表位。在相關(guān)實 施方式中，抗原包含B細胞表位。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于將有機分子附著，即結(jié)合到AP205VLP上的方法。 在一些實施方式中，有機分子以定向方式結(jié)合到AP205VLP上。在本發(fā)明另一個實施方式中，在免疫動物的方法中使用本發(fā)明綴合物或組合物， 其中通過皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、口服方式將綴合物或組合物引入 到動物體中或者直接引入到淋巴結(jié)中。在另一個實施方式中，在想要免疫接種以進行抵抗 的腫瘤或局部病毒儲庫(reservoir)的附近，局部地施用組合物。本發(fā)明也涉及包含免疫學(xué)有效量的本發(fā)明組合物和藥物學(xué)可接受稀釋劑、載體或 賦形劑的疫苗。在進一步實施方式中，該疫苗進一步包含至少一種佐劑，諸如明礬或弗氏不 完全佐劑。本發(fā)明也提供了免疫和/或治療動物的方法，該方法包括向動物施用免疫學(xué)有 效量的本發(fā)明綴合物、組合物或疫苗。AP205VLP綴合物或組合物可以用于接種以抵抗例如腫瘤、病毒疾病、自身分子或 非肽小分子。接種可以用于預(yù)防或治療目的，或者同時用于這兩種目的。AP205VLP綴合物 或組合物還可以用于抗變態(tài)反應(yīng)接種，以誘導(dǎo)適于變態(tài)反應(yīng)治療或預(yù)防的抗變應(yīng)原的免疫 偏離和/或抗體應(yīng)答。本發(fā)明也提供了通過施用包含或可替代地基本組成為與有機分子結(jié)合的 AP205VLP的組合物，治療或預(yù)防個體或一群個體中的疾病、身體病癥或狀況的方法。在相關(guān) 的方面，抗該組合物產(chǎn)生的免疫分子或抗體，如抗體，可以用于疾病、狀況或病癥的治療、預(yù) 防或診斷。在本發(fā)明另一個方面，以試劑盒形式提供包含與有機分子結(jié)合的AP205VLP的組 合物。在本發(fā)明另一方面，還以試劑盒形式提供了包含免疫分子或抗體的組合物，其中所 述的免疫分子和抗體是利用結(jié)合有機分子的AP205VLP分離的。這種試劑盒可以用于各種 目的，包括但不限于檢測與VLP上呈遞的有機分子反應(yīng)的免疫分子或抗體，檢測有機分子， 篩選免疫分子或抗體；和/或診斷通過免疫分子或抗體的存在或不存在表征的狀況。在一 些相關(guān)實施方式中，本發(fā)明試劑盒可以包含一種或多種額外的成分諸如緩沖液、載體、賦形 劑、佐劑和檢測試劑等。在另一方面，本發(fā)明也提供了用于表達RNA噬菌體AP205的外殼蛋白從而形成病 毒樣顆粒的載體和宿主細胞。宿主細胞包括原核生物，包括大腸桿菌；和真核生物，包括酵母、動物、細胞系等。在另一方面，本發(fā)明提供了表達RNA噬菌體AP205及其病毒樣顆粒的外殼蛋白的 方法。在另一方面，本發(fā)明提供了純化和分離噬菌體AP205病毒樣顆粒的方法。根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)、下面附圖和本發(fā)明說明書及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它 實施方式對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見。本發(fā)明涉及以下內(nèi)容1、包含至少一種選自如下的蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒(a)具有SEQ ID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突變蛋白質(zhì)。2、如項1所述的病毒樣顆粒，其中所述蛋白質(zhì)是重組蛋白。3、如項1或2所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO 1中所述或 SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地 3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所 述至少1個置換是保守性置換。4、如項1至3任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO=I 中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置換了至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu) 選地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。5、如項1至4任一項所述的病毒樣顆粒，其中所述突變蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO=I 中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置換了至少1個賴氨酸殘 基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基，其中 優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。6、具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的突變蛋白質(zhì)。7、SEQ ID NO 1的重組蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)。8、如項7所述的突變蛋白質(zhì)，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選 地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地， 所述至少1個置換是保守性置換。9、如項7或8所述的突變蛋白質(zhì)，其中缺失或置換了至少1個半胱氨酸殘基，優(yōu)選 地2個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。10、如項7至9任一項所述的突變蛋白質(zhì)，其中添加、缺失或置換了至少1個賴氨 酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個賴氨酸殘基， 其中優(yōu)選地，所述至少1個置換是保守性置換。11、用于產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的載體，其包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的 核苷酸序列至少80%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少95%，甚至更優(yōu)選地99%相同的核 苷酸序列。12、用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的載體，其包含編碼與選自如下的蛋白質(zhì)融合的多肽的 核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和
(c)所述(a)或(b)多肽的突變蛋白質(zhì)。13、一種組合物，其包含(a)選自如下的核心顆粒(i)AP205病毒顆粒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；和(b)有機分子，其中有機分子與核心顆粒結(jié)合。14、如項13所述的組合物，其中，所述有機分子和核心顆粒形成一個在核心顆粒 表面上的有序重復(fù)的有機分子陣列。15、如項13或14所述的組合物，其中有機分子通過第三分子結(jié)合核心顆粒，所述 第三分子將有機分子與核心顆粒連接在一起。16、如項13至15任一項所述的組合物，其中所述有機分子通過至少一個共價鍵結(jié) 合核心顆粒，其中優(yōu)選地所述共價鍵包括肽鍵。17、如項13至16任一項所述的組合物，其中所述有機分子通過至少一個共價鍵結(jié) 合核心顆粒，其中優(yōu)選地所述共價鍵包括非肽鍵。18、如項13至17任一項所述的組合物，其中有機分子包括或者優(yōu)選地是半抗原、 抗原或抗原決定簇，并且其中更優(yōu)選地所述有機分子是抗原或抗原決定簇。19、如項13至18任一項所述的組合物，其中病毒樣顆粒含有至少一個第一附著位 點，并且有機分子含有至少一個第二附著位點，這樣所述第二附著位點能夠與所述第一附 著位點締合，優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵締合，以形成有序重復(fù)的抗原陣列。20、如項13至19任一項所述的組合物，其中所述第一附著位點包含，優(yōu)選地是氨 基基團，并且其中優(yōu)選地所述第一附著位點包含，優(yōu)選地是賴氨酸殘基，并且其中所述第二 附著位點包含，優(yōu)選地是巰基，并且其中優(yōu)選地所述第二附著位點包含，優(yōu)選地是半胱氨酸 殘基。21、如項13至20任一項所述的組合物，其中所述第二附著位點不天然出現(xiàn)在所述 有機分子中。22、如項13至21任一項所述的組合物，其中所述組合物包含氨基酸接頭，并且其 中優(yōu)選地所述氨基酸接頭通過至少一個共價鍵，優(yōu)選地通過至少一個肽鍵與所述抗原或所 述抗原決定簇結(jié)合。23、如項13至22任一項所述的組合物，其中所述氨基酸接頭包含所述第二附著位
點ο24、如項13至23任一項所述的組合物，其中所述氨基酸接頭選自(a) CGG ；(b) N-末端 Yl 接頭；(c) N-末端 Y 3 接頭；(d) Ig 鉸鏈區(qū)；(e) N-末端甘氨酸接頭； (f) (G) kC (G) η，η = 0-12 且 k = 0-5 (SEQ ID NO :93)； (g) N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；
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(h) (G)kC(G)m(S)1(GGGGS)1^n = 0-3, k = 0-5,m = 0-10,1 = 0—2 (SEQ IDNO 94)；(i)GGC ；(k) GGC-NH2 ；(I)C-末端 Yl 接頭；(m) C-末端 γ 3 接頭；(n) C-末端甘氨酸接頭；(ο) (G)nC(G)k, η = 0-12 且 k = 0-5 (SEQ ID NO 95)；(ρ) C-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(q) (G)m(S)1(GGGGS)n(G)0C(G)k, η = 0—3，k = 0—5，m = 0-10, 1 = 0—2，且 ο = 0-8(SEQID NO :96)。25、如項13至M任一項所述的組合物，其中所述有機分子選自(a)適于誘導(dǎo)抗癌細胞的免疫應(yīng)答的有機分子；(b)適于誘導(dǎo)抗感染性疾病的免疫應(yīng)答的有機分子；(c)適于誘導(dǎo)抗變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的有機分子；(d)適于誘導(dǎo)改進的抗自身抗原的應(yīng)答的有機分子；(e)適于在農(nóng)畜或?qū)櫸镏姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答的有機分子；和(f)適于誘導(dǎo)抗藥物、激素或有毒化合物的應(yīng)答的有機分子和(g) (a)-(f)中所述分子的片段、突變蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域。26、如項13至25任一項所述的組合物，其中有機分子是選自如下的抗原或抗原決 定簇或者其片段或突變蛋白質(zhì)(a)適于誘導(dǎo)抗癌細胞的免疫應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；(b)適于誘導(dǎo)抗感染性疾病的免疫應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；(c)適于誘導(dǎo)抗變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；(d)適于誘導(dǎo)改進的抗自身抗原的應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；(e)適于在農(nóng)畜或?qū)櫸镏姓T導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；和(f)適于誘導(dǎo)抗藥物、激素或有毒化合物的應(yīng)答的抗原或抗原決定簇；和(g) (a)-(f)中所述分子的片段或結(jié)構(gòu)域。27、如項13至沈任一項所述的組合物，其中所述有機分子是選自如下的抗原(a) HIV 多肽，(b)流感病毒多肽，(c)丙型肝炎病毒多肽，(d)弓形體多肽，(e)惡性瘧原蟲多肽，(f)間日瘧原蟲多肽，(g)卵形瘧原蟲多肽，(h)三日瘧原蟲多肽，(i)乳腺癌細胞多肽，(j)腎癌細胞多肽，(k)前列腺癌細胞多肽，
(1)皮膚癌細胞多肽，(m)腦癌細胞多肽，(η)白血病細胞多肽，(ο)重組 profiling,(ρ)蜂螫刺變態(tài)反應(yīng)多肽，(q)堅果變態(tài)反應(yīng)多肽，(r)食物變態(tài)反應(yīng)多肽，(s)哮喘多肽，或(t)衣原體多肽，(u) Her2,(ν) GD2,(w) EGF-R,(χ) CEA，(y) CD52,(ζ)人黑素瘤 gplOO，(aa)人黑素瘤 melanA/MART-1，(bb)酪氨酸酶，(cc)NA17-A nt,(dd)MAGE3,(ee)P53，和(ff)HPV16E7 ；禾口(gg) (a)至(ζ)及(aa)至(ff)的所述抗原的任何片段或突變蛋白質(zhì)。28、如項13至27任一項所述的組合物，其中所述抗原或抗原決定簇是選自如下的 肽、蛋白質(zhì)，或者蛋白質(zhì)或肽的片段或突變蛋白質(zhì)a)磷脂酶A2蛋白質(zhì)；b)人 IgE;c)淋巴毒素；d)流感M2蛋白質(zhì)；和e)Der ρ I 肽。29、如項13至28任一項所述的組合物，其中所述有機分子是抗原或抗原決定簇， 而且所述抗原或所述抗原決定簇是自身抗原或抗獨特型抗體，或其片段。30、如項13至四任一項所述的組合物，其中所述自身抗原是選自如下的蛋白質(zhì)、 肽或者其任何片段或突變蛋白質(zhì)a)淋巴毒素；b)淋巴毒素受體；c) RANKL ；d) VEGF ；e) VEGFR ；f)白細胞介素5;
g)白細胞介素8;h)白細胞介素17 ；i)白細胞介素13 ；j)血管緊張肽；k)CCL21 ；1)CXCL12 ；m) SDF-I ；n) MCP-I ；ο) Endogl in;ρ)抵抗素；q) GHRH ；r) LHRH ；s) TRH;t)MIF ；U) Eotaxin;ν)緩激肽;w) BLC;χ) M-CSF ；χ)腫瘤壞死因子α (TNFa)；y)淀粉樣 β 肽(Ai^42)；和ζ)人 IgE。31、如項13至30任一項所述的組合物，其中所述自身抗原是選自如下的淋巴毒素 或其片段a)淋巴毒素 a (LTa)；b)淋巴毒素β (LT β)；和c) LT α和LT β的混合或組合。32、如項13至31任一項所述的組合物，其中所述有機分子是適于誘導(dǎo)抗藥物、激 素或毒素的免疫應(yīng)答的有機分子。33、如項13至32任一項所述的組合物，其中所述有機分子是適于誘導(dǎo)抗藥物的免 疫應(yīng)答的有機分子。34、如項13至33任一項所述的組合物，其中所述藥物選自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)嗎啡;(e)苯丙胺；(f)可卡因；(g)甲烯二氧甲苯丙胺；(h)甲苯丙胺；
(i)哌醋甲酯；(j)煙堿;(k) LSD ；(1)三甲氧苯乙胺；(M)叔胺吲哚磷酯；和(η)四氫大麻酚。35、如項13至34任一項所述的組合物，其中所述藥物是煙堿。36、如項13至35任一項所述的組合物，其中有機分子適于誘導(dǎo)抗激素的免疫應(yīng)答。37、如項13至36任一項所述的組合物，其中所述有機分子是激素，其選自包含如 下激素的組，優(yōu)選選自由如下激素組成的組(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睪酮；(d)促卵泡激素；(e)促黑素激素(melanin stimulating hormone)；(f)腎上腺素；和(g)去甲腎上腺素。38、如項13至37任一項所述的組合物，其中有機分子適于誘導(dǎo)抗毒素的免疫應(yīng)答。39、如項13至38任一項所述的組合物，其中有機分子是毒素，選自(a)黃曲霉毒素；(b)ciguetera 毒素；(c)河豚毒素；(d)抗生素；和(e)抗癌劑。40、一種藥物組合物，其包含(a)項13至39任一項所述的組合物和(b)可接受的藥物載體。41、一種疫苗組合物，其包含免疫有效量的項13至39任一項所述的組合物。42、一種免疫方法，該方法包括施用項41所述的疫苗組合物。43、如項41所述的疫苗組合物，其還包含佐劑。44、一種用于產(chǎn)生非天然的、有序重復(fù)抗原陣列的方法，該方法包括(a)提供包含核心顆粒的分子支架，該核心顆粒選自(i) AP2O5 病毒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；禾口(b)提供適于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有機分子；(c)提供連接(a)和(b)的物質(zhì)，所述物質(zhì)可選地包含在(a)和/或(b)中，或者 作為一個單獨分子存在；和
(d)組合(a)到(C)的元件，使所述有機分子與所述支架連接以形成有序重復(fù)的抗 原陣列。45、一種治療或預(yù)防個體中疾病、病癥或生理狀況的方法，該方法包括向個體施用 項13至39任一項所述的組合物。46、一種治療或預(yù)防個體中疾病、病癥或生理狀況的方法，該方法包括向個體施用 項41所述的疫苗組合物。47、一種核酸分子，其包含SEQ ID NO :125中所述的核苷酸序列。48、一種宿主細胞，其含有項47所述的核酸或項11所述的載體。49、如項48所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。50、一種產(chǎn)生項1至5任一項所述的病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a)提供項47所述的核酸或項11所述的載體；(b)向宿主細胞中引入所述核酸或所述載體；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列以獲得能形成項1所述的 病毒樣顆粒的蛋白質(zhì)或突變蛋白質(zhì)。51、如項50所述的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。52、如項41所述的疫苗組合物，其用于免疫方法中，優(yōu)選地，其中所述組合物還包 含佐劑。53、如項41所述的疫苗組合物在制備疫苗中的用途，其中所述疫苗被施用給對 象；優(yōu)選地，其中所述組合物還包含佐劑。54、如項13-39之任一項所述的組合物，其用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理 學(xué)狀況的方法中，所述方法包括給所述個體施用所述組合物。55、如項13-39之任一項所述的組合物在制備用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或 生理學(xué)狀況的組合物中的用途，其中所述組合物被施用給所述個體。56、如項41所述的疫苗組合物，其用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué)狀況 的方法中，所述方法包括給所述個體施用所述組合物。57、如項41所述的疫苗組合物在制備用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué)狀 況的疫苗中的用途，其中所述疫苗組合物被施用給所述個體。


圖IA-B顯示了 AP205病毒樣顆粒和AP205噬菌體顆粒相比較的電子顯微照片，其 中所述AP205病毒樣顆粒自大腸桿菌表達并純化的重組蛋白質(zhì)自發(fā)裝配而成。圖IA顯示 AP205噬菌體顆粒的電子顯微照片，而圖IB所示是重組AP205VLP的自裝配顆粒的電子顯微 照片。圖2顯示AP205VLP和Q^VLP與Derpl. 2肽的偶聯(lián)反應(yīng)的SDS-PAGE分析。在 16% Tris-甘氨酸凝膠上，在還原條件下電泳樣品。泳道1是蛋白質(zhì)標記物，具有凝膠左 側(cè)邊緣標明的相應(yīng)分子量；泳道2，衍生的Qi3衣殼蛋白；泳道3，Q^衣殼蛋白和Derpl. 2 肽的偶聯(lián)反應(yīng)的上清液；泳道4，Q^衣殼蛋白和Derpl. 2肽的偶聯(lián)反應(yīng)的沉淀；泳道5，衍 生的AP205VLP ；泳道6 :AP205VLP和Derpl. 2肽的偶聯(lián)反應(yīng)的上清液；泳道7，AP205VLP和 Derpl. 2肽的偶聯(lián)反應(yīng)的沉淀。在圖中，箭頭標示對應(yīng)于每個單體與1，2，3，4或5個肽偶聯(lián)
14的偶聯(lián)產(chǎn)物。與Q0衣殼蛋白比較，更大數(shù)量的表位可以與AP205VLP偶聯(lián)。圖3顯示在免疫小鼠血清中“Derpl. 2”特異的IgG抗體的ELISA分析，其中該小鼠 用分別與AP205VLP或Qi3衣殼蛋白偶聯(lián)的Derpl. 2肽免疫。測定了總IgG效價和IgG亞 型效價。針對每種IgG亞型分析了免疫前血清，在所有分析的免疫前血清中均未能檢測到 Derpl. 2特異的抗體。該圖顯示對于AP205和Q β，誘導(dǎo)了 Thl免疫應(yīng)答典型的抗體亞型，因 為IgGh效價比IgGl效價高得多。用偶聯(lián)VLP的肽獲得了強的特異性抗肽免疫應(yīng)答。通 過ELISA也測定了對載體特異的抗體，并且對兩種載體，這些是相當?shù)?。圖4A-4C顯示所用不同真核生物表達載體的部分序列。僅示出了修飾的序列。圖 4A:pC印-Xa-Fc * 顯示了從BamHI位點起的序列，在翻譯序列(SEQ ID NO :103和SEQ ID NO 104)上方顯示了不同特征。箭頭指示因子)(a蛋白酶的切割位點。圖4B :pCep-EK-Fc * 顯示了從BamHI位點起的序列，在翻譯序列(SEQ ID NO :105和SEQ ID NO :106)上方 顯示了不同特征。箭頭指示腸激酶的切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所示序列 相同。圖4C :pC印-SP-EK-Fc * 顯示從信號肽起始的序列，翻譯序列(SEQ ID NO :107和 SEQ ID NO 108)上方顯示了不同特征。用粗體表示信號肽酶切割的信號肽序列。箭頭指 示腸激酶切割位點。HindIII位點下游序列與圖4A中所述序列相同。圖5A-B顯示rMIF構(gòu)建體，和表示rMIF構(gòu)建體的表達和純化的SDS-PAGE，該構(gòu)建 體用于與AP205VLP偶聯(lián)。圖5A顯示MIF構(gòu)建體的示意圖，該構(gòu)建體具有添加的包含半胱 氨酸殘基的氨基酸接頭。圖5B顯示在還原條件下電泳并且用考馬斯亮藍染色的純化MIF構(gòu) 建體的SDS-PAGE分析。圖5A中，凝膠上的加樣是純化的大鼠構(gòu)建體rMIF_Cl (SEQ ID NO 114), rMIF-C2(SEQ ID NO :115)和 rMIF_C3(SEQ ID NO :117)。圖6顯示rMIF-Cl與AP205VLP偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。泳道1 分子標記物。泳道2 AP205VLP。泳道3 衍生的AP205VLP。泳道4 經(jīng)透析的衍生的AP205VLP。泳道5 經(jīng)透析 的衍生的AP205VLP。泳道6:rMIF-Cl與AP205VLP的偶聯(lián)反應(yīng)。在圖中用箭頭標明了偶聯(lián) 產(chǎn)物。在凝膠左側(cè)邊緣標出了標記物蛋白質(zhì)的分子量。圖7顯示在用偶聯(lián)AP205VLP的rMIF_Cl免疫的小鼠的血清中，對rMIF_Cl特異的 IgG免疫應(yīng)答的ELISA分析。圖8顯示在0和14天免疫的3只小鼠(1_3)的血清中Angio I肽特異的IgG抗 體的ELISA分析，其中小鼠用與AP205VLP偶聯(lián)的Angio I肽免疫。在第21天血清中測定 總IgG效價。發(fā)明詳述定義下面的定義是對相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的概念的總結(jié)，提供這些定義旨 在用于理解下面的公開，但是不意味著其限制本公開。氨基酸接頭如這里所使用的，本說明書中“氨基酸接頭”，或也稱為“接頭”在于連 接第二附著位點與抗原或抗原決定簇，或者更優(yōu)選地，其已經(jīng)包含或含有第二附著位點，通 常，但不是必需地，該位點為一個氨基酸殘基，優(yōu)選地為半胱氨酸殘基。然而，即使由氨基酸 殘基組成的氨基酸接頭是本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，但是這里使用的術(shù)語“氨基酸接頭”并沒 有意指這種氨基酸接頭專門地由氨基酸殘基組成。氨基酸接頭的氨基酸殘基優(yōu)選地由本領(lǐng) 域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物組成。然而，包含具有巰基或
15半胱氨酸殘基的分子的氨基酸接頭也包括在本發(fā)明中。這種分子優(yōu)選地包含C1-C6烷基_、 環(huán)烷基(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分。然而，除了氨基酸接頭外，優(yōu)選地包含C1-C6烷 基_、環(huán)烷基_(C5，C6)、芳基或雜芳基組成部分并且無任何氨基酸的接頭也包括在本發(fā)明 范圍內(nèi)?？乖蚩乖瓫Q定簇或可選地第二附著位點和氨基酸接頭之間的連接優(yōu)選地通過至 少一個共價鍵，更優(yōu)選地通過至少一個肽鍵進行。動物這里使用的術(shù)語“動物”意在包括例如人類、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳 動物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蛛形綱動物。抗體這里所用術(shù)語“抗體”指能結(jié)合表位或抗原決定簇的分子。該術(shù)語意在 包括整個抗體和其抗原結(jié)合片段，包括單鏈抗體。這些抗體包括人抗原結(jié)合抗體片段，并 且包括，但不限于Fab，F(xiàn)ab'和F(ab' ) 2，F(xiàn)d，單鏈Fvs (scFv)，單鏈抗體，二硫鍵連接的 FvS(SdFV)及含有\(zhòng)或Vh結(jié)構(gòu)域的片段?？贵w可以來源于任何動物來源，包括鳥類和哺乳 動物。優(yōu)選地，抗體來自哺乳動物，例如人類、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬等等或者其它適合 的動物例如雞。這里所用術(shù)語“人”抗體包括具有人類免疫球蛋白氨基酸序列的抗體，并包 括從人類免疫球蛋白文庫分離的抗體或者從具有一種或多種人類免疫球蛋白基因并且不 表達內(nèi)源免疫球蛋白的動物分離的抗體，例如，參見美國專利號5，939，598中所述，這里整 體將該文獻并入為參考文獻?？乖@里所用術(shù)語“抗原”指能被抗體結(jié)合或者在被MHC分子呈遞后能被T細胞 受體(TCR)結(jié)合的分子。這里所用術(shù)語“抗原”也包括T-細胞表位。在MHC I類(存在于 除了紅細胞以外的所用身體細胞上)背景中，或者MHC II類(存在于免疫細胞上，并且特別 是抗原呈遞細胞上)背景中，T細胞受體識別T-細胞表位。該識別事件引起了 T細胞和隨 后效應(yīng)機制的激活，諸如T細胞增殖、細胞因子分泌、穿孔素分泌等。抗原還能被免疫系統(tǒng) 識別和/或能誘導(dǎo)引起B(yǎng)-和/或T-淋巴細胞激活的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答。 然而，這可能要求，至少在一些情況下，抗原含有或連接Th細胞表位，并且以在佐劑中的形 式給出?？乖梢杂幸环N或多種表位(B-和T-表位)。上述特異性反應(yīng)意思是指抗原典型 地以高度選擇性方式優(yōu)先地與其相應(yīng)抗體或TCR反應(yīng)，并且不與可能由其它抗原激發(fā)的大 量其它抗體或TCR反應(yīng)。這里所用抗原也可以是幾種單獨抗原的混合物。這里所用抗原包 括但不限于變應(yīng)原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及有機小分子諸如濫用的 藥物(象煙堿)及其片段和衍生物。而且，用于本發(fā)明的抗原可以是肽、蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、碳 水化合物、生物堿、脂質(zhì)或小分子諸如，類固醇激素和其片段和衍生物?？乖瓫Q定簇這里所用術(shù)語“抗原決定簇”意指B或T淋巴細胞特異地識別的抗原 部分。B-淋巴細胞通過抗體產(chǎn)生對外源抗原決定簇應(yīng)答，而T淋巴細胞是細胞免疫的介導(dǎo) 者。因此，抗原決定簇或表位是被抗體識別的或者在MHC背景中被T細胞受體識別的那些 抗原部分?？乖瓫Q定簇含有一個或多個表位。在脊椎動物中，變應(yīng)原也起到抗原作用。變應(yīng)原這里所用術(shù)語“變應(yīng)原”指與變態(tài)反應(yīng)有關(guān)的抗原。變態(tài)反應(yīng)以釋放炎性 因子，特別是組胺，及在個體中導(dǎo)致病理學(xué)炎癥為特征。變態(tài)反應(yīng)通常也與抗變應(yīng)原的IgE 抗體有關(guān)。這里所用術(shù)語“變應(yīng)原”也包括“變應(yīng)原提取物”和“變應(yīng)原性表位”。變應(yīng)原的 例子包括但不限于花粉(例如，草、豚草、樺樹和雪松(mountain cedar))；屋塵螨和塵螨； 哺乳動物表皮變應(yīng)原和動物毛發(fā)皮屑；霉菌和真菌；昆蟲身體和昆蟲毒液；羽毛；食物；和 藥物(例如，青霉素)。
AP205病毒樣顆?；駻P205VLP 這里所用術(shù)語“AP205病毒樣顆粒”或“AP205VLP” 指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地并優(yōu)選地組成為至少 一種噬菌體AP205蛋白質(zhì)或外殼蛋白質(zhì)，或其片段或突變蛋白質(zhì)，其中所述至少一種外殼 蛋白或其片段或突變蛋白質(zhì)典型地并優(yōu)選地能裝配形成病毒樣顆粒。在可替代和優(yōu)選的 實施方式中，這里所用術(shù)語“AP205病毒樣顆粒”或“AP205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其 包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種噬菌體AP205蛋白質(zhì) 或外殼蛋白或其突變蛋白質(zhì)，其中所述至少一種噬菌體AP205外殼蛋白或所述其突變蛋白 質(zhì)能裝配形成病毒樣顆粒。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒樣顆?！被?“AP205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地 組成為至少一種具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的噬菌體AP205外殼蛋白，其中典型 地且優(yōu)選地，所述至少一種外殼蛋白能裝配成病毒樣顆粒或衣殼。在本發(fā)明另一可替代的 非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒樣顆粒”或“AP205VLP”指組合物，其包含，或可 替代地基本組成為，或可替代地且優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ IDNO 3中所述氨基酸 序列的噬菌體AP205外殼蛋白的突變蛋白質(zhì)，其中所述至少一種所述外殼蛋白的突變蛋白 質(zhì)能裝配成病毒樣顆粒。在本發(fā)明另一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒 樣顆粒”或“AP205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代 地且優(yōu)選地組成為至少一種具有SEQ ID NO :1中或SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的噬 菌體AP205外殼蛋白的突變蛋白質(zhì)，其中所述至少一種所述蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)能裝配成 病毒樣顆粒。在本發(fā)明另一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒樣顆?！被?“AP205VLP”指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地 組成為至少一種具有SEQ ID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的突變蛋白 質(zhì)，其中添加、缺失或置換了至少1個氨基酸殘基，優(yōu)選地3個氨基酸殘基，更優(yōu)選地2個氨 基酸殘基，甚至更優(yōu)選地1個氨基酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。 在本發(fā)明再一可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205VLP” 指組合物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少 一種具有SEQ ID NO 1中所述或SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的突變蛋白質(zhì)，其中缺失 或置換了至少1個半胱氨酸殘基、優(yōu)選地3個半胱氨酸殘基、更優(yōu)選地2個半胱氨酸殘基， 甚至更優(yōu)選地1個半胱氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。在本發(fā)明 另一個可替代的非常優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“AP205病毒樣顆?！被颉癆P205VLP”指組合 物或病毒樣顆粒，其包含，或可替代地基本組成為，或可替代地和優(yōu)選地組成為至少一種具 有SEQ ID NO :1中所述或SEQ IDNO :3中所述氨基酸序列的突變蛋白質(zhì)，其中添力Π、缺失或 置換了至少1個賴氨酸殘基，優(yōu)選地3個賴氨酸殘基，更優(yōu)選地2個賴氨酸殘基，甚至更優(yōu) 選地1個賴氨酸殘基，其中優(yōu)選地，所述至少一個置換是保守性置換。隨著本說明書的描 述，AP205VLP的其它優(yōu)選的實施方式將顯而易見。組成AP205VLP的AP205亞單位每一個 均可以通過二硫鍵與顆粒中的其它亞單位連接，或者做為替代方案，大多數(shù)AP205VLP亞單 位通過二硫鍵與顆粒中的其它AP205VLP亞單位連接。在一些實施方式中，少數(shù)或沒有一個 AP205VLP亞單位通過二硫鍵與顆粒中其它AP205VLP亞單位連接。締合(association)這里所用術(shù)語“締合”當用于第一和第二附著位點時，指第 一和第二附著位點的結(jié)合，優(yōu)選地通過至少一個非肽鍵結(jié)合。締合的性質(zhì)可以是共價的、離子的、疏水的、極性的或它們的任何組合，優(yōu)選地締合的性質(zhì)是共價的。第一附著位點這里所用短語“第一附著位點”指非天然或天然來源的元件，位于 抗原或抗原決定簇上的第二附著位點可以與其締合。第一附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、 氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃 醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的聯(lián)合或者它們的化學(xué)反應(yīng)基 團。通常地和優(yōu)選地，第一附著位點位于核心顆粒諸如，優(yōu)選地病毒樣顆粒的表面上。多個 第一附著位點通常以重復(fù)構(gòu)型存在于核心或病毒樣顆粒的表面上。第二附著位點這里所用短語“第二附著位點”指與抗原或抗原決定簇連接的元 件，位于核心顆粒或病毒樣顆粒表面上的第一附著位點可以與其締合?？乖蚩乖瓫Q定簇 的第二附著位點可以是蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代謝物或 化合物(生物素、熒光素、視黃醇、地高辛配基、金屬離子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它們的 聯(lián)合或者它們的化學(xué)反應(yīng)基團。至少一個第二附著位點存在于抗原或抗原決定簇上。因此， 術(shù)語“具有至少一個第二附著位點的抗原或抗原決定簇”指包含至少該抗原或抗原決定簇 和該第二附著位點的抗原或抗原性構(gòu)建體。然而，特別是對于非天然來源，即，不天然出現(xiàn) 在抗原或抗原決定簇中的第二附著位點，這些抗原或抗原性構(gòu)建體包含“氨基酸接頭”。結(jié)合這里所用術(shù)語“結(jié)合”指可以是例如通過化學(xué)偶聯(lián)的共價的結(jié)合或附著，或 者可以是通過例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等的非共價的結(jié)合或附著。共價鍵可 以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亞胺、碳-硫鍵、碳-磷鍵等等。術(shù)語“結(jié)合”更廣義， 并且包括術(shù)語諸如“偶聯(lián)”、“融合”和“附著”。外殼蛋白這里所用術(shù)語“外殼蛋白”指能在噬菌體或RNA噬菌體衣殼裝配中摻入 的噬菌體或RNA噬菌體蛋白質(zhì)。外殼蛋白也稱為CP。在本發(fā)明中，該術(shù)語更常指RNA噬菌 體AP205的外殼蛋白。核心顆粒這里所用術(shù)語“核心顆粒”指具有固有重復(fù)組織的剛性結(jié)構(gòu)。這里所用 核心顆?？梢允呛铣蛇^程的產(chǎn)物或者是生物學(xué)過程的產(chǎn)物。疾病(disease)、病癥(disorder)，狀況(condition)這里所用術(shù)語“疾病”或“病 癥”指個體的任何不利狀態(tài)，包括腫瘤、癌癥、變態(tài)反應(yīng)、成癮、自身免疫性、中毒或最佳的精 神或身體功能的受損。這里所用“狀況”包括疾病和病癥，但是也指生理狀態(tài)。例如，生育 力是生理狀態(tài)而不是疾病或病癥。因此，將適于通過降低生育力預(yù)防懷孕的本發(fā)明組合物 描述為對狀況(生育力)的治療，而不是對病癥或疾病的治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了其它 的狀況。表位這里所用術(shù)語“表位”指由單個抗體或T細胞受體識別的基本元件或最小單 位，因此也指抗體或T細胞受體結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或分子結(jié)構(gòu)?？乖梢杂纱罅勘砦?組成，而半抗原通常具有很少的表位。免疫應(yīng)答這里所用術(shù)語“免疫應(yīng)答”指個體免疫系統(tǒng)針對分子或化合物(諸如 抗原)的任何行動。在哺乳動物中，免疫應(yīng)答包括細胞的活動和可溶分子諸如細胞因子和 抗體的產(chǎn)生。因此，該術(shù)語包括體液免疫應(yīng)答和/或引起B(yǎng)和/或T-淋巴細胞激活或增殖 的細胞免疫應(yīng)答。然而，在一些情況下，免疫應(yīng)答可能具有低的強度，只有當使用至少一種 本發(fā)明物質(zhì)時才可檢測。“免疫原性的”指用于刺激活生物體的免疫系統(tǒng)的試劑，這種刺激 使得免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增強，并且定向于該免疫原性劑?！懊庖咴远嚯摹笔窃谧魟┐嬖诨虿淮嬖诘那闆r下，單獨地或是與載體連接時能激發(fā)細胞和/或體液免疫應(yīng)答的多 肽。“免疫偏離”這里所用術(shù)語免疫偏離指刺激與預(yù)先存在的免疫應(yīng)答具有不同性質(zhì) 的免疫應(yīng)答。例如，可以通過本發(fā)明實施方式，誘導(dǎo)具有對抗變應(yīng)原的TH2免疫應(yīng)答(這樣 一旦暴露于變應(yīng)原將產(chǎn)生IgE抗體)的個體，產(chǎn)生抗變應(yīng)原的ThI免疫應(yīng)答。這種ThI應(yīng)答 將抵消誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的Th2應(yīng)答，由此緩解變應(yīng)性疾病。免疫治療這里所用術(shù)語“免疫治療”指用于疾病、病癥或狀況治療的組合物。更 具體地，該術(shù)語用于指通過接種引起有益的免疫應(yīng)答的治療方法。免疫有效量這里所用術(shù)語“免疫有效量”指當引入個體中時足以在個體中誘導(dǎo)免 疫應(yīng)答的組合物的量。達到免疫有效所必需的組合物的量根據(jù)許多因素而變化，這些因素 包括組合物，組合物中其它成分的存在(例如，佐劑)，抗原，免疫途徑，個體，以前的免疫或 生理狀態(tài)等。個體這里所用術(shù)語“個體”指多細胞生物體，并且包括植物和動物。優(yōu)選地多細 胞生物體是動物，更優(yōu)選地是脊椎動物，甚至更優(yōu)選地是哺乳動物，最優(yōu)選地是人類。低或不可檢測的這里所用短語“低或不可檢測的”當用于基因表達水平時指表達 水平顯著低于最大限度地誘導(dǎo)基因時所觀察到的表達水平(例如，至少低5倍)，或者該表 達水平通過本文實施例中所用方法不容易檢測到。模擬表位(mimotope)這里所用術(shù)語“模擬表位”指誘導(dǎo)對抗原或抗原決定簇 的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。一般地，與特定抗原相關(guān)聯(lián)使用術(shù)語模擬表位。例如，激發(fā)抗磷脂酶 A2(PLA2)抗體產(chǎn)生的肽是與該抗體結(jié)合的抗原決定簇的模擬表位。模擬表位可以與誘導(dǎo)的 免疫應(yīng)答所針對的抗原或抗原決定簇有或沒有相似的實質(zhì)結(jié)構(gòu)或共有結(jié)構(gòu)特性。本領(lǐng)域已 知并且在本文其它地方也描述了產(chǎn)生和鑒定誘導(dǎo)針對特定抗原或抗原決定簇的免疫應(yīng)答 的模擬表位的方法。突變蛋白質(zhì)這里所用術(shù)語“突變蛋白質(zhì)”指有一個或多個氨基酸不同于給定的 參照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白質(zhì)或多肽，其中這種差異由至少一個氨基酸的 添加、置換或缺失或它們的聯(lián)合引起。優(yōu)選的實施方式包括由至少一個氨基酸置換引起 的突變，優(yōu)選地由至少一個氨基酸的保守性置換引起的突變。保守性置換包括同構(gòu)置換 (isostericsubstitution)，在該置換中維持氨基酸的電荷、極性、芳香族、脂肪族或疏水性 質(zhì)。例如，用絲氨酸殘基置換半胱氨酸殘基是保守性置換。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，術(shù) 語“突變蛋白質(zhì)”指有3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸不同于給定參照(例如，天然、 野生型等)多肽的蛋白質(zhì)或多肽，其中這種差異由添加、置換或缺失或它們的聯(lián)合引起。在 本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“突變蛋白質(zhì)”指有3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨 基酸不同于給定參照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白質(zhì)或多肽，其中這種差異來源于 3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1個氨基酸的置換，優(yōu)選地來源于3個，優(yōu)選地2個，最優(yōu)選地1 個氨基酸的保守性置換。天然來源這里所用術(shù)語“天然來源，，意指物質(zhì)的整體或其部分不是合成的，而是 在自然界中存在或產(chǎn)生的。優(yōu)選地，這里所用術(shù)語“天然來源”意指就整體而言不是合成的， 而是在自然界中存在和產(chǎn)生的。非天然的一般地，這里用該術(shù)語指非來源于自然界，更具體地，該術(shù)語指來源于
19人工。非天然來源的這里所用術(shù)語“非天然來源的” 一般指合成的，或非來源于自然界 的；更具體地指來源于人工的。有序和重復(fù)的抗原或抗原決定簇陣列這里所用術(shù)語“有序重復(fù)的抗原或抗原決 定簇陣列”一般地指抗原或抗原決定簇的重復(fù)模式，其特征在于抗原或抗原決定簇相對于 核心顆?；虿《緲宇w粒的一種典型地且優(yōu)選地一致的空間排列。在本發(fā)明一個實施方式 中，重復(fù)模式可以是幾何學(xué)模式。適宜的有序重復(fù)抗原或抗原決定簇陣列的典型和優(yōu)選例 子是具有嚴格重復(fù)的抗原或抗原決定簇次晶晶序的陣列，優(yōu)選地具有1到30納米晶面間距 (spacing)，優(yōu)選地5到15納米晶面間距。有機分子如這里所用術(shù)語“有機分子”或本發(fā)明提到的“有機分子”優(yōu)選地包括 抗原和抗原決定簇、變應(yīng)原、自身抗原、半抗原、癌癥抗原和感染性疾病抗原及有機小分子 諸如濫用的藥物(如煙堿)及它們的片段和衍生物。多肽這里所用術(shù)語“多肽”指由氨基酸殘基，一般地天然氨基酸殘基，通過肽鍵連 接在一起形成的聚合物。多肽不必限定大小，并且包括蛋白質(zhì)和肽。肽是大小為通常約5 到約50個氨基酸或者該通常范圍內(nèi)的任何數(shù)量氨基酸的多肽。然而，肽也可以具有更長的 長度，例如達到120-150個氨基酸。蛋白質(zhì)這里所用術(shù)語蛋白質(zhì)指通常具有大于約5個或更多個，10個或20個以上 或更多個，25個或更多個，50個或更多個，75個或更多個，100個或更多個，200個或更多個， 500個或更多個，1000個或更多個，2000個或更多個氨基酸的多肽。盡管蛋白質(zhì)不一定有確 定的三維結(jié)構(gòu)，但是蛋白質(zhì)通常具有確定的并常常稱為折疊的三維結(jié)構(gòu)，這與常常不具有 確定三維結(jié)構(gòu)而是采用大量不同的構(gòu)象并且稱為未折疊的肽和多肽不同。然而，肽也可以 具有確定的三維結(jié)構(gòu)。純化的如這里所用，當術(shù)語“純化的”用于指分子時，它意指被純化的分子相對于 在該分子的天然環(huán)境中或者在產(chǎn)生、發(fā)現(xiàn)或合成該分子的環(huán)境中與該分子相關(guān)的分子，其 濃度已經(jīng)得以增加。天然相關(guān)分子包括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和糖，但是一般不包括為維持被 純化分子的完整性或有利于該分子的純化而添加的水、緩沖液和試劑。例如，即使在寡dT 柱層析期間mRNA被水性溶劑稀釋，但如果天然相關(guān)核酸和其它生物學(xué)分子不結(jié)合柱子并 且與所述mRNA分子分離，那么通過該層析亦純化了 mRNA分子。根據(jù)該定義，當相對于雜質(zhì) 考慮時，物質(zhì)可以是5%或以上，10%或以上，20%或以上，30%或以上，40%或以上，50%或 以上，60%或以上，70%或以上，80%或以上，90%或以上，95%或以上，98%或以上，99%或 以上或100%純度。受體這里所用術(shù)語“受體”指能與稱為配體的另一分子相互作用的蛋白質(zhì)、糖蛋 白或其片段。該配體可以屬于任何類型的生物化學(xué)或化學(xué)化合物。受體不需要一定是結(jié)合 膜的蛋白質(zhì)?？扇艿鞍踪|(zhì)，象麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)或視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)也是受體。殘基這里所用術(shù)語“殘基”意指多肽主鏈或側(cè)鏈中的具體氨基酸。重組宿主細胞這里所用術(shù)語“重組宿主細胞”指其中已經(jīng)引入本發(fā)明一種或多種 核酸分子的宿主細胞。宿主細胞包括真核生物，包括例如哺乳動物、昆蟲、植物、鳥類、酵母； 和原核生物例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)等。RNA噬菌體這里所用術(shù)語“ RNA噬菌體”指感染細菌的RNA病毒，更具體地指感染細菌的單鏈正義RNA病毒。自身抗原這里所用術(shù)語“自身抗原”指能被宿主DNA編碼的分子或化合物。這 種自身抗原包括肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)和其它生物分子。更通常地和優(yōu)選地， 術(shù)語“自身抗原”指宿主DNA編碼的多肽或蛋白質(zhì)。通過宿主DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn) 生的產(chǎn)物也定義為自身的。通過翻譯后修飾和蛋白酶解加工或通過自身基因產(chǎn)物可變剪接 修飾的蛋白質(zhì)也定義為自身的。通過宿主DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)生的產(chǎn)物被定義為自 身的。此外，由2種或幾種自身分子聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者代表自身分子的一部分的蛋白 質(zhì)，和與上述自身分子具有高度同源性(> 95%，優(yōu)選地> 97%，更優(yōu)選地> 99%，)的蛋 白質(zhì)也可以考慮是自身的。載體這里所用術(shù)語“載體”指用于向宿主細胞傳送遺傳材料的工具(例如質(zhì)?；?病毒)。載體可以由DNA或RNA組成。病毒樣顆粒(VLP)這里所用術(shù)語“病毒樣顆?！敝割愃撇《绢w粒的結(jié)構(gòu)。而且， 本發(fā)明病毒樣顆粒由于缺少所有或部分病毒基因組，特別是病毒基因組中的復(fù)制和感染元 件，所以它是非復(fù)制和非感染性的。本發(fā)明病毒樣顆?？梢院胁煌谄浠蚪M的核酸。本 發(fā)明病毒樣顆粒的典型和優(yōu)選的實施方式是病毒衣殼，諸如病毒，噬菌體或RNA噬菌體的 病毒衣殼。這里可交換地使用的術(shù)語“病毒衣殼”和“衣殼”指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的 大分子裝配物。典型并優(yōu)選地，病毒蛋白質(zhì)亞單位裝配成病毒衣殼或衣殼，所述衣殼具有固 有的重復(fù)組織的結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)通常是球形或管狀。例如，RNA噬菌體的衣殼具有二十 面對稱的球形。這里所用術(shù)語“衣殼樣結(jié)構(gòu)”指由病毒蛋白質(zhì)亞單位組成的大分子裝配物， 其形態(tài)類似上述意義的衣殼，但是偏離典型的對稱裝配，而是維持了足夠程度的有序和重 復(fù)性。噬菌體的病毒樣顆粒這里所用術(shù)語“噬菌體的病毒樣顆粒”指類似噬菌體結(jié)構(gòu)的 病毒樣顆粒，其是非復(fù)制和非感染性的，并且缺少至少一種或多種編碼噬菌體復(fù)制機器的 基因，并且典型地也缺少一種或多種編碼負責(zé)病毒附著或進入到宿主中的蛋白質(zhì)的基因。 然而，該定義也應(yīng)該包括這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一種或多種基因仍舊存在但 是已失活，因此也導(dǎo)致非復(fù)制和非感染性的噬菌體病毒樣顆粒。病毒顆粒這里所用術(shù)語“病毒顆?！敝覆《镜男螒B(tài)學(xué)形式。在一些病毒類型中， 它包括蛋白質(zhì)衣殼環(huán)繞的基因組；其它病毒還具有另外的結(jié)構(gòu)(例如，包膜，尾等)。一個/ 一種除非另有說明，當在本公開中使用術(shù)語“一個/ 一種”時，它們意指 “至少一個/ 一種”或者“一個/ 一種或多個/多種”。如這里所用，當指任何數(shù)值時，術(shù)語“約”意指所述值士 10%的值(例如，“約50°C” 包括從45°C到55°C的溫度范圍，包含45°C和55°C在內(nèi)；類似地，“約lOOmM”包括從90mM到 IlOmM的濃度范圍，包含90mM和IlOmM在內(nèi))。_既述我們已經(jīng)公開了利用本發(fā)明載體可以在細菌中表達重組的AP205外殼蛋白，并且 獲得其純化形式。在細菌中，重組AP205外殼蛋白自發(fā)地自裝配為AP205病毒樣顆粒。本發(fā) 明提供了適于AP205VLP表達的宿主細胞和載體，和能裝配的AP205外殼蛋白變異體形式。 這些表達的VLP、來源于天然來源的AP205VLP或AP205病毒顆?？梢越Y(jié)合有機分子以產(chǎn)生 有序重復(fù)的有機分子陣列。本發(fā)明的有機分子包括抗原、變應(yīng)原、自身抗原、半抗原、癌癥抗
21原和感染性疾病抗原。在一個實施方式中，有機分子是多肽或蛋白質(zhì)。通過附著、連接、融合或其它結(jié)合方式(包括共價和非共價鍵)可以形成本發(fā)明綴 合物，即，有機分子與VLP結(jié)合。在一個實施方式中，VLP含有第一附著位點，有機分子含有 第二附著位點。可以通過直接地或者利用第三分子，典型地且優(yōu)選地借助于交聯(lián)劑，連接第 一和第二附著位點，從而實現(xiàn)與有機分子間的締合。附著位點可以天然存在或者可以引入。 在優(yōu)選的實施方式中，該結(jié)合包含至少一個共價鍵，優(yōu)選地包含肽鍵或者可替代地和優(yōu)選 地包含非肽鍵。用本發(fā)明提供的AP205VLP綴合物或用包含這種綴合物的組合物免疫動物，可以 誘導(dǎo)抗所展示的有機分子的強免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明綴合物和組合物可以用于刺激抗各 種展示的抗原的免疫應(yīng)答，因此可以用于動物中使用。本發(fā)明也涉及一種疫苗，該疫苗包含 免疫有效量的具有本發(fā)明一種或多種綴合物的組合物及藥物學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦 形齊IJ。AP205VLP可以用于接種以抵抗例如半抗原、變應(yīng)原、腫瘤、病毒疾病或自身分子或非 肽小分子。接種可以用于預(yù)防或治療目的，或者這兩種目的。在相關(guān)方面，抗這種組合物產(chǎn) 生的免疫分子或抗體，諸如抗體，可以用于疾病、狀況或病癥的治療、預(yù)防或診斷。本發(fā)明的 這種抗體和組合物也可以以試劑盒形式使用。AP205噬菌體外殼蛋白的克隆AP205基因組由成熟蛋白質(zhì)、外殼蛋白、復(fù)制酶及在相關(guān)噬菌體中不存在的兩個開 放讀框(一個裂解基因和一個開放讀框在成熟基因的翻譯中起作用)組成(Klovins，J.， 等，J. Gen. Virol. 83 1523-33 (2002))。在本發(fā)明的一個方面，利用本領(lǐng)域已知的方法，通 過AP205噬菌體RNA的逆轉(zhuǎn)錄，之后通過PCR分離外殼蛋白質(zhì)cDNA。將包含外殼蛋白基因 上游的核糖體結(jié)合位點的外殼蛋白cDNA克隆到載體pQblO (K0Zl0VSka，T. Μ.，等，Gene137 133-37(1993))中。在另一個方法中，AP205外殼蛋白cDNA可以克隆到載體pQbl85中，置 換噬菌體Q0外殼蛋白基因，并由此位于載體中的核糖體結(jié)合位點下游。這兩種方法都引 起了蛋白質(zhì)的表達和衣殼的形成。因此，在本發(fā)明中，可以從含有核糖體結(jié)合位點的載體表 達外殼蛋白，其中該核糖體結(jié)合位點不是AP205核糖體結(jié)合位點，而是諸如載體pQbl85中 的核糖體結(jié)合位點。載體pQblO和pQbl85是來源于pGEM載體的載體，在這些載體中trp啟動子控 制克隆基因的表達(Kozlovska, Τ. Μ..等，Gene 137:133-37(1993))。pAP283_58 (SEQ ID NO. 2)在下面序列中包含推定的AP205核糖體結(jié)合位點，其位于^CbaI位點下游和AP205外 殼蛋白 ATG 起始密碼子的緊上游tctagatagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT^A GGAAAATCACatg (SEQ ID NO :5)。載體pQbl85包含位于)(bal位點下游和起始密碼子上游的 SD (Shine DelaRarno)序列(tctagaTTMCCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg (SEQ ID N0:6)，下劃 線的是SD序列)，其也存在于載體pAP^l-32(SEQ ID No. 4)中。本領(lǐng)域已知的其它載體包 括，例如PKK223. 3，ρΕΤ載體家族，pBR322(Sutcliffe，J. G. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43Ptl :77-90 (1979))，pUC18，pUC19，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的，如果這些載體不 存在啟動子和核糖體結(jié)合位點或者不適于外殼蛋白的表達和隨后病毒樣顆粒的形成，則可 以對所有這些載體進行修飾以包含適宜的啟動子和核糖體結(jié)合位點。來源于前述載體的其 它載體和適于在大腸桿菌或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它宿主中表達蛋白質(zhì)的其它載體， 和一般地適于在大腸桿菌或者其它宿主中表達蛋白質(zhì)的任何載體均適于實施本發(fā)明，條件是它們允許外殼蛋白表達和隨后形成病毒樣顆粒。在本發(fā)明的一個方面，將用于AP205外 殼蛋白基因表達的載體轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中。適合的大腸桿菌菌株包括，但不限于大腸桿菌 K802，JM109，RRl。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知其它大腸桿菌菌株，并且通過SDS-PAGE檢測外 殼蛋白的表達，及通過可選地首先凝膠過濾純化衣殼，隨后在免疫擴散試驗(Ouchterlony 試驗)或電子顯微鏡術(shù)(Kozlovska, T.M..等，Gene 137 :133-37(1993))中檢測衣殼來測 試衣殼的形成和裝配，可以鑒定載體和菌株的適宜聯(lián)合。由于在大腸桿菌胞質(zhì)中加工，從載體pAP^3_58和pAP^l_32表達的AP205外殼 蛋白可以無起始的甲硫氨酸氨基酸。切除了甲硫氨酸的多肽，特別是切除了甲硫氨酸的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3的多肽，及產(chǎn)生本發(fā)明AP205VLP的未切割形式的AP205多肽，或 者產(chǎn)生本發(fā)明AP205VLP的以上多肽的混合物均是本發(fā)明實施方式，并且在本發(fā)明范圍內(nèi)。AP205病毒樣顆粒在一個實施方式中，本發(fā)明提供了形成衣殼的AP205外殼蛋白。這種蛋白質(zhì)通過 重組方式表達或從天然來源制備。能裝配為VLP的重組AP205外殼蛋白片段也是本發(fā)明的 實施方式。通過外殼蛋白的內(nèi)部或者末端缺失可以產(chǎn)生這些片段。與裝配為VLP相容的在 外殼蛋白序列中的插入或與外殼蛋白序列的融合也是本發(fā)明的實施方式?？梢酝ㄟ^電子顯 微鏡術(shù)檢測外殼蛋白序列的插入、缺失和融合的結(jié)果、及其是否與裝配為VLP相容。本發(fā)明提供了重組AP205外殼蛋白的純化方法。利用沉淀分級分離步驟和凝膠過 濾純化步驟的聯(lián)合，可以以純化形式分離由AP205外殼蛋白形成的顆粒。分離病毒樣顆粒 的其它方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于分離噬菌體AP205的病毒樣顆粒(VLP)。例如， 美國專利號4，918，166中描述了超離心用于分離酵母逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty的VLP的用途，這 里將這篇文獻整體并入為參考文獻。除了凝膠過濾外，也可以使用其它層析步驟諸如離子 交換、疏水相互作用或者親和層析。重組AP205外殼蛋白的表達引起病毒樣顆粒的裝配，當通過電子顯微鏡術(shù)分析 時，該病毒樣顆粒和噬菌體顆粒具有相同外觀和大小?？梢约兓@些VLP是本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)。 因此，本發(fā)明提供了新的VLP，該VLP可以以高數(shù)量純化形式獲得。大腸桿菌中自裝配的AP205VLP與AP205噬菌體顆粒具有相同的外觀和大小。與 針對其它VLP所證明的一樣(多瘤病毒VPlVLP和乳頭瘤病毒L1VLPS，Chackerian B.等， PNAS 96 :2373-2378(1999)),實驗條件的操作或表位與VLP的融合可以導(dǎo)致具有不同裝 配狀態(tài)的VLP。例如，可以獲得比野生型或主要顆粒形式具有低的三角劃分數(shù)的顆粒。因 此，比AP205噬菌體顆粒更小尺寸的AP205VLP，或者與AP205噬菌體顆粒相比同樣尺寸的 AP205VLP和更小尺寸的AP205VLP的混合物也是本發(fā)明的實施方式。如W003/0M481的實施例17中所述，在非還原性PAGE中分析時比在還原性PAGE 中分析時，AP205VLP亞單位電泳具有更高表觀分子量，表明這些亞單位通過二硫鍵締合。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有適于AP205病毒樣顆粒產(chǎn)生的開放讀框的載 體，所述載體還包含額外的核酸，這樣，由此得到的載體能產(chǎn)生包含所述額外核酸編碼的氨 基酸的重組AP205病毒樣顆粒。在另一方面，本發(fā)明提供了含有適于AP205病毒樣顆粒產(chǎn)生的開放讀框的載體， 所述載體還包含適于引入額外核酸的限制酶位點，這樣由此得到的載體能產(chǎn)生包含所述額 外核酸編碼的氨基酸的重組病毒樣顆粒。
有機分子，半抗原和抗原本發(fā)明方法、綴合物和組合物中使用的有機分子包括任何抗原、半抗原、有機分子 或其片段。本發(fā)明分子包括本身(g卩，不結(jié)合AP205病毒或病毒樣顆粒)在動物中不能誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答的半抗原、有機分子和抗原片段。有機分子包括例如(a)適于誘導(dǎo)抗癌細胞的免 疫應(yīng)答的有機分子；(b)適于誘導(dǎo)抗感染性疾病的免疫應(yīng)答的有機分子；(C)適于誘導(dǎo)抗變 應(yīng)原的免疫應(yīng)答的有機分子；(d)適于誘導(dǎo)抗自身抗原的免疫應(yīng)答的有機分子；(e)適于誘 導(dǎo)抗藥物、激素或毒素，特別是濫用的藥物的免疫應(yīng)答的抗原或半抗原；和(f) (a)-(e)中 所述任何有機分子、抗原或半抗原的片段(例如，結(jié)構(gòu)域)。感染性疾病在本發(fā)明一個特別實施方式中，有機分子、抗原或抗原決定簇可以用于感染性疾 病的預(yù)防。這種治療方法可以用于治療影響廣泛宿主，例如人類、母牛、綿羊、豬、狗、貓、其 它哺乳動物物種及非哺乳動物物種的廣泛種類的感染性疾病。這種疫苗可以預(yù)防地用于 防止個體或群體中的傳染，或者治療地用于減輕正在發(fā)生的感染。已知存在疫苗的或期望 使用疫苗的感染性疾病是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，所述感染性疾病例如包括病毒病因?qū)W的 感染，諸如HIV，流感、皰疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰質(zhì)炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘等；細菌 病因?qū)W的感染諸如肺炎、結(jié)核病、梅毒、Lyme氏疏螺旋體病、霍亂、沙門氏菌病、腦膜炎、膿毒 等；或者寄生蟲病因?qū)W的感染，諸如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、毛滴蟲病、阿米巴病等。本發(fā)明 綴合物、組合物和方法中可以使用的抗原或抗原決定簇是相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。 抗原或抗原決定簇的例子包括HIV抗原gpl40和gpl60 ；流感病毒抗原血凝素，M2蛋白質(zhì) 和神經(jīng)氨酸酶、乙型肝炎表面抗原和瘧疾的環(huán)子孢子蛋白。在本發(fā)明一個這種實施方式中，抗原或抗原決定簇選自(a)重組HIV蛋白質(zhì)，(b) 重組流感病毒蛋白質(zhì)(例如流感病毒M2蛋白質(zhì)或其片段)，(c)重組丙型肝炎病毒蛋白質(zhì)， (d)重組弓形體屬(Toxoplasma)蛋白質(zhì)，(e)重組惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)蛋 白質(zhì)，(f)重組間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)蛋白質(zhì)，(g)重組卵形瘧原蟲(Plasmodium oval)蛋白質(zhì)，(h)重組三日瘧原蟲(Plasmodium Malariae)蛋白質(zhì)，(i)重組衣原體 (Chlamydia)蛋白質(zhì)和(j) (a)-(i)中所述任何蛋白質(zhì)的片段。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及疫苗組合物，該疫苗組合物包含至少一種流感 病毒核酸編碼的抗原或抗原決定簇；并涉及這種疫苗組合物激發(fā)免疫應(yīng)答的用途。在特 定的這種實施方式中，流感抗原或抗原決定簇是M2蛋白質(zhì)(例如，具有GenBank登錄號 P06821, PIR登錄號MFIV62中所示氨基酸的M2蛋白質(zhì)或其片段(例如，從約2到約M位 的氨基酸))。適于本發(fā)明使用的引起免疫應(yīng)答的M2蛋白質(zhì)部分及其它蛋白質(zhì)包括長度為 任何數(shù)量氨基酸的肽，但是一般為至少6個氨基酸長度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18， 20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 或 97 個氨基酸長度的肽)。激素、毒素和藥物，特別是濫用的藥物在另一個方面，本發(fā)明提供了適于刺激抗半抗原的免疫應(yīng)答的組合物。這些半抗 原包括，但不限于激素、藥物和有毒化合物。抗各種藥物、激素和有毒化合物的免疫應(yīng)答可 以用于保護有危險暴露于這種化合物的個體，用于治療已暴露于這種化合物的個體，或者 用于預(yù)防或治療對這種化合物的成癮性。代表性的有毒化合物包括但不限于有毒植物、動物和微生物的天然產(chǎn)物。這種產(chǎn)物包括黃曲霉毒素、cigimutera毒素和河豚毒素。人工或作為代謝結(jié)果產(chǎn)生的其它代表性 有毒化合物包括抗生素(例如，萬古霉素)，抗癌化合物(例如，長春花堿)和化學(xué)戰(zhàn)試劑 (例如，沙林，芥子氣，VX) 0本發(fā)明的一個方面包括產(chǎn)生抗體，以抵抗通常所用的藥劑的有 毒代謝物；由此個體可以繼續(xù)接受藥劑的有益效果，而不出現(xiàn)與有毒代謝物有關(guān)的副作用。 因此，在優(yōu)選的實施方式中，毒素是個體身體中產(chǎn)生的代謝物，其中所述代謝物是藥劑的代 謝物。在進一步優(yōu)選的實施方式中，毒素是化學(xué)戰(zhàn)試劑。適于在治療藥物成癮，特別是消遣性藥物成癮的綴合物、組合物和方法中使用的 有機分子，抗原或抗原決定簇是相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。有機分子、抗原或抗原決定 簇的代表性例子包括，例如阿片樣物質(zhì)和嗎啡衍生物諸如可待因、芬太尼、海洛因、嗎啡和 鴉片；興奮劑諸如苯丙胺、可卡因、MDMA(甲烯二氧甲苯丙胺)、甲基苯丙胺，哌醋甲酯和煙 堿；致幻劑諸如LSD、三甲氧苯乙胺和叔胺吲哚磷酯；Carmabinoids諸如大麻粉和大麻；其 它成癮性藥物或化合物；和這些化合物的衍生物，副產(chǎn)物，變異體和復(fù)合物。變態(tài)反應(yīng)和癌癥在相關(guān)實施方式中，本發(fā)明提供了適于作為免疫療法用于變態(tài)反應(yīng)或癌癥的治療 或預(yù)防的組合物。適于在治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的綴合物、組合物和方法中使用的抗原或抗原決定簇 將是相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這種抗原或抗原決定簇的代表性例子包括蜂毒磷脂 酶 A2、Bet ν 1(樺樹花粉變應(yīng)原)、5Dol m V(white faced hornet 毒液變應(yīng)原)、Mellitin 和Der ρ I (屋塵螨變應(yīng)原)、谷蛋白、麥醇溶蛋白、貝類變應(yīng)原、蟑螂變應(yīng)原、花生和其它堅 果變應(yīng)原、豚草和其它花粉變應(yīng)原，銀樺屬(Grevillea)變應(yīng)原，及其可以用于激發(fā)免疫應(yīng) 答的片段。在本發(fā)明特定的實施方式中，變應(yīng)原選自(a)重組蜂螫刺變態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)，(b) 重組堅果變態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)，(c)重組食物變態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)，(d)重組哮喘蛋白質(zhì)，(e)重組衣 原體(Chlamydia)蛋白質(zhì)和(f) (a)到(e)任何變應(yīng)原的片段。如上所述，適于本發(fā)明綴合物、組合物或方法中使用的抗原或抗原決定簇是Der P I。Der ρ I是在屋塵螨糞粒中發(fā)現(xiàn)的25kD蛋白酶，并且是屋塵螨的主要變應(yīng)原。因 此，80%螨變應(yīng)性患者具有抗Der ρ I IgE抗體。特別地，已知其中Der ρ I肽ρ52_72 和pll7-133(SEQ ID NO :64)包含天然Der ρ I特異性抗體所識別的表位。在針對整個 抗原的多克隆應(yīng)答中產(chǎn)生的IgE抗體以高親和力結(jié)合肽區(qū)域59-94(L.PierS0n-Mullany 等“2000) Molecular Immunology)。其它區(qū)域也以高親和力結(jié)合IgE。肽pll7_133在其 N末端包含可以作為本發(fā)明第二附著位點的半胱氨酸。3D模建將肽p52-72和pll7-133分 配至整個蛋白質(zhì)的表面(Jeannin，P.等，MolecularImmunology 30 1511-1518 (1993))。然 而，Der ρ I蛋白質(zhì)的其它片段也可能包含適用于本發(fā)明的B細胞表位。在本發(fā)明組合物的優(yōu)選實施方式中，抗原或抗原決定簇是Der ρ I肽，其中具有所 述第二附著位點的所述 Der ρ I 肽有選自a) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(SEQ ID NO :97)； 和 b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA(SEQ ID NO :64)的氨基酸序列。在另外實施方式中，本發(fā)明提供了適于在預(yù)防和/或減弱變應(yīng)性反應(yīng)(諸如引起 過敏反應(yīng)的變應(yīng)性反應(yīng))的方法中使用的疫苗組合物。如本文其它地方所公開的，變應(yīng)性 反應(yīng)的特征在于引起IgE抗體出現(xiàn)的抵抗抗原的TH2應(yīng)答。ThI免疫應(yīng)答的刺激和IgG抗體 的產(chǎn)生可以緩解變應(yīng)性疾病。因此，本發(fā)明疫苗組合物包括引起如下抗體產(chǎn)生的組合物，該抗體可以預(yù)防和/或減弱變應(yīng)性反應(yīng)。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明的疫苗組合物包括 激發(fā)抗變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的組合物。這種變應(yīng)原的例子包括磷脂酶諸如意大利蜜蜂(Apis MelIifera) (GenBank 記錄號 443189，GenBank 記錄號 2四378)，大蜜蜂(Apis dorsata) (GenBank 記錄號 B59055)，中華蜜蜂(Apis cerana) (GenBank 記錄號 A59055)，Bombus Pennsylvanicus (GenBank 記錄號 B56338)禾口純尾毒晰(Heloderma Suspectum) (GenBank 記 錄號 P80003 ；GenBank 記錄號 S 14764 ；GenBank 記錄號 226711)磷脂酶 A2 (PLA2)蛋白質(zhì)。利用意大利蜜蜂(Apis MelIifera)的PLA2蛋白質(zhì)氨基酸序列(GenBank記錄號 443189, GenBank記錄號2四378)做為示例，構(gòu)成整個PLA2序列中的任何一個部分的長至少 約60個氨基酸的肽也可以用在組合物中以預(yù)防和/或減弱變應(yīng)性反應(yīng)。這種肽的例子包括 含有氨基酸1-60，氨基酸1-70，氨基酸10-70，氨基酸20-80，氨基酸30-90，氨基酸40-100， 氨基酸47-99，氨基酸50-110，氨基酸60-120，氨基酸70-130或氨基酸90-134的肽，以及 其它PLA2蛋白質(zhì)(例如上述PLA2蛋白質(zhì))的相應(yīng)部分。這種肽的進一步例子包括包含氨 基酸1-10，氨基酸5-15，氨基酸10-20，氨基酸20-30，氨基酸30-40，氨基酸40-50，氨基酸 50-60，氨基酸60-70，氨基酸70-80，氨基酸80-90，氨基酸90-100，氨基酸100-110，氨基酸 110-120或者氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白質(zhì)(例如上述PLA2蛋白質(zhì))的相應(yīng) 部分。適于本發(fā)明使用的引起免疫應(yīng)答的PLA2部分及其它蛋白質(zhì)部分可以包含一般地 至少 6 個氨基酸長度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，；35，40，45，50，55，60，
65，70，75，80，85，90，95或100個氨基酸長度的肽)，或者可替代由上述肽組成。PLAJt (例如上述全長PLA2蛋白質(zhì)及每個蛋白的子部分)也可以與允許有序和 重復(fù)抗原陣列形成的任何物質(zhì)(例如，AP205衣殼蛋白或其片段)偶聯(lián)。對于在治療癌癥的組合物和方法中使用的抗原或抗原決定簇，其選擇將是相關(guān) 領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明特定的實施方式中，抗原或抗原決定簇選自(a)重 組乳腺癌細胞蛋白質(zhì)；(b)重組腎癌細胞蛋白質(zhì)；(c)重組前列腺癌細胞蛋白質(zhì)；(d)重組 皮膚癌細胞蛋白質(zhì)；(e)重組大腦癌細胞蛋白質(zhì)；(f)重組白血病癌細胞蛋白質(zhì)；(g)重組 profiling;和(h) (a)-(g)中所述任何蛋白質(zhì)的片段。這種類型的抗原或抗原決定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)，⑶2 (成神經(jīng) 細胞瘤)，EGF-R(惡性成膠質(zhì)細胞瘤)，CEA(甲狀腺髓樣癌)，和CD52(白血病)，人黑素 瘤蛋白質(zhì)gplOO，人黑素瘤蛋白質(zhì)melan-A/MART-1，酪氨酸酶，NA17-A nt蛋白質(zhì)，MAGE-3 蛋白質(zhì)，P53蛋白質(zhì)和HPV16E7蛋白質(zhì)，及可以用于激發(fā)免疫應(yīng)答的這些蛋白質(zhì)之每一個 的片段?？梢杂糜诎┌Y治療組合物和方法的另外抗原決定簇是參與血管生成的分子和抗 原決定簇。血管生成，即新血管的形成，在生理學(xué)和病理生理學(xué)過程諸如傷口愈合和實體 腫瘤生長中起到必需的作用(Folkman, J. (1995) Nat. Medicine 1，27-31 ；Folkman, J.，和 Klagsbum, Μ. (1987)Science 235,442-446 ；Martiny-Baron, G.，禾口 Marme, D. (1995)Curr. Opin. Biotechnol. 6,675-680 ；Risau, W. (1997)Nature 386,671-674)。快速生長的腫瘤起 始并依賴于血管的形成以提供所需的血液供應(yīng)。因此，認為抗血管生成藥劑作為抗癌療法 是有效的。在已經(jīng)鑒定的幾種推定的血管生成因子中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是有效的 內(nèi)皮細胞特異性促細胞分裂劑和許多實體腫瘤血管形成的主要刺激劑。因此，VEGF作用的阻斷可以作為干擾腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的靶標，成為一種阻斷內(nèi)皮而不是腫瘤的抗腫瘤策 略(Millauer, B.等· (1994) Nature367, 576-579 ；KIM，J 等.(1993) Nature 362,841-844)。已經(jīng)公開了抗VEGFR-II 抗體(IMC-1C11)和抗 VEGF抗體(Lu，D.等.Q000) J. Biol Chem. 275，14321-14330 ；Presta，L. G，等(1997) Cancer Res. 47，4593-4599)。前者，中和性 單克隆抗VEGFR-2抗體識別已經(jīng)鑒定為推定的VEGF/VEGFR-II結(jié)合位點的表位(Piossek， C.等· (1999) J Biol Chem. 274，5612-5619)。因此，在本發(fā)明一個實施方式中，本發(fā)明綴合物、組合物或方法中使用的抗原或抗 原決定簇是來源于VEGFR-II接觸位點的肽。這提供了具有用于癌癥治療的抗血管生成 特性的本發(fā)明組合物和疫苗組合物。在小鼠中，利用對VEGFR-2特異的血清，已經(jīng)證明了 對腫瘤生長的抑制作用(Wei，YQ等· (2000) Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，適于 抗血管生成的本發(fā)明組合物和本發(fā)明疫苗組合物的其它抗原決定簇包括具有氨基酸序列 CTARTELNVGI DFNWEYPSSKHQHKK(SEQ ID NO 99)的 VEGFR-II 衍生肽，和 / 或具有氨基酸序 列 CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK (SEQ ID NO :113)的鼠 VEGFR-II 衍生肽，和 / 或 VEGFR-II 的相關(guān)細胞外球狀結(jié)構(gòu)域1-3。自身抗原在特定實施方式中，本發(fā)明提供了適于在預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物(例 如，腫瘤壞死因子)引起或加重的疾病或狀況的方法中使用的疫苗組合物。通常通過常規(guī) 接種誘導(dǎo)對自身分子的抗體應(yīng)答，即使可能，也是困難的。本發(fā)明通過利用抗原與AP205VLP 的結(jié)合，增加待用于免疫的抗原的重復(fù)程度，提供了一種提高接種效率的方法。不同于分離的蛋白質(zhì)，在有和無T細胞輔助，不存在任何佐劑的情況下，病毒 均能誘導(dǎo)迅速和有效的免疫應(yīng)答(Bachmann & Zinkernagel，Ann. Rev. Immunol :15: 235-270(1997))。盡管病毒常常由少數(shù)蛋白質(zhì)組成，但是它們能比它們的分離的成分引起 強得多的免疫應(yīng)答。對于B細胞應(yīng)答，已知病毒免疫原性的一個至關(guān)重要的因素是表面表 位的重復(fù)性和次序。許多病毒顯示了準晶體表面，該表面展示出一個有規(guī)則的表位陣列， 該表位陣列可以與B細胞上的表位特異性免疫球蛋白有效交聯(lián)(Bachmarm &Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558(1996))。B細胞上表面免疫球蛋白的這種交聯(lián)是強激活信號， 其直接誘導(dǎo)細胞周期進程和IgM抗體的產(chǎn)生。而且，這種觸發(fā)的B細胞能激活T輔助細胞， 這接著可以誘導(dǎo)B細胞中IgM產(chǎn)生向IgG抗體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)換和長壽記憶B細胞的形成——任 何接種的目的(Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol :15 :235-270 (1997))。在自身 免疫疾病中，甚至可以將病毒結(jié)構(gòu)與抗-抗體的產(chǎn)生聯(lián)系起來，作為針對病原體的天然應(yīng) 答的一部分(參見，F(xiàn)ehr，T.等，J Exp. Med. 185 :1785-1792(1997))。這樣，通過高度有組 織的病毒表面呈遞的抗體能誘導(dǎo)強的抗-抗體應(yīng)答。免疫系統(tǒng)通常不能產(chǎn)生抵抗來源于自身的結(jié)構(gòu)的抗體。對于低濃度存在的可溶抗 原而言，這是由Th細胞水平上的耐受性所致。在這些條件下，將自身抗原與可以遞送T輔 助作用的載體偶聯(lián)可以破壞耐受性。對于高濃度存在的可溶蛋白質(zhì)或低濃度的膜相關(guān)蛋白 質(zhì)，B和Th細胞可以是耐受性的。然而，B細胞的耐受性可能是可逆的(無變應(yīng)性)，并且可 以通過施用偶聯(lián)外源載體的高度有組織形式的抗原來破壞(Bachmarm &Zinkernagel,Ann. Rev. Immunol :15 :235-270(1997))。因此，本發(fā)明疫苗組合物包括引起抗體產(chǎn)生的綴合物、組合物和方法，其中該抗體可以預(yù)防和/或減弱由“自身”基因產(chǎn)物引起或加重的疾病或狀況。這種疾病或狀況的例 子包括移植物抗宿主病、IgE介導(dǎo)的變應(yīng)性反應(yīng)，過敏反應(yīng)，成人呼吸窘迫綜合征，局限性回 腸炎、變應(yīng)性哮喘、急性成淋巴細胞白血病(ALL)，糖尿病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性 甲狀腺腫，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，炎性自身免疫性疾病，重癥肌無力，免疫增生性疾病淋巴 結(jié)病(IPL)，血管免疫增生性淋巴結(jié)病(AIL)，免疫母細胞性淋巴結(jié)病(IBL)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎，糖尿病，多發(fā)性硬化，阿爾茨海默氏病，骨質(zhì)疏松癥，和與一些感染有關(guān)的自身免疫狀況 包括風(fēng)濕熱、猩紅熱、Lyme氏疏螺旋體病和傳染性多關(guān)節(jié)炎。對于在治療與自身抗原相關(guān)的其它疾病或狀況的綴合物、組合物和方法中使用的 抗原或抗原決定簇，其選擇也是相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這種抗原或抗原決定簇的 代表性例子是，例如淋巴毒素(例如，淋巴毒素α (LT α )，淋巴毒素β (LTi3))，和淋巴毒素 受體，核因子κΒ受體活化因子配體(RANKL)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，血管內(nèi)皮生長因 子受體(VEGF-R)，白細胞介素-5，白細胞介素-17，白細胞介素-13，CCL21，CXCLl2, SDF-I, MCP-I, Endoglin，抵抗素，GHRH，LHRH，TRH, MIF, Eotaxin，緩激肽，BLC，腫瘤壞死因子 α 和 淀粉樣β肽(Αβ L42)，以及其可以用于激發(fā)免疫應(yīng)答的片段。在一個實施方式中，抗原決定簇是淀粉樣β肽(Α β ^42) (DAEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO :7)，或其片段。Αβ肽在阿爾茨海默氏病的神 經(jīng)病理學(xué)中具有重要作用。Αβ肽的區(qū)域特異性細胞外積累伴隨著小神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生 (microgliosis)，細胞骨架改變，營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎和突觸損失。據(jù)認為這些病理學(xué)改變與 定義這種疾病的認知下降有關(guān)。在阿爾茨海默氏病小鼠模型中，通過基因工程改造產(chǎn)生Ah_42的轉(zhuǎn)基因動物 (PDAPP-小鼠)在大腦中出現(xiàn)了斑塊和神經(jīng)元損害。最近的工作表明利用Ah_42免疫年 青的PDAPP小鼠引起了對斑塊形成和相關(guān)營養(yǎng)不良性神經(jīng)炎的抑制作用(Schenk，D.等， Nature 400:173-77(1999))。而且，對已經(jīng)患有AD樣神經(jīng)病的老年P(guān)DAPP小鼠的免疫也降低了神經(jīng)病理學(xué)的程 度和進展。在另一個研究中，外周施用抗Ah_42產(chǎn)生的抗體能誘導(dǎo)對預(yù)先存在的淀粉狀蛋 白的清除(Bard, F.等，Nature Medicine 6:916-19(2000))。該研究利用了抗 A β 卜42 的多 克隆抗體或抗來源于Aβ不同區(qū)域的合成片段的單克隆抗體。因此，利用本發(fā)明綴合物，組 合物和方法誘導(dǎo)抗Αβ抗體可以被認為是阿爾茨海默氏病的潛在治療方法。公認單獨施用純的蛋白質(zhì)通常不足以引發(fā)強的免疫應(yīng)答；一般地，分離的抗原必 須與稱為佐劑的輔助物質(zhì)一起施用。這些佐劑保護施用的抗原免受快速降解，并且佐劑可 以實現(xiàn)抗原的低水平長期釋放。在本發(fā)明中，Αβ肽或其片段通過結(jié)合AP205VLP而獲得免 疫原性，因此不一定需要佐劑。如所表明的，阿爾茨海默氏(AD)的一個關(guān)鍵事件是淀粉狀蛋白沉積為不溶性纖 維塊(amyloidogenesis)，引起細胞外神經(jīng)炎斑和在腦血管壁周圍的沉積物(綜述參見 Selkoe, D. J. (1999)Nature. 399，A23-31)。神經(jīng)炎斑和嗜剛果紅血管病的主要組分是淀粉 狀蛋白β (Αβ)，盡管這些沉積物也含有其它蛋白質(zhì)諸如糖胺聚糖和載脂蛋白。Αβ從稱 為淀粉樣前體蛋白(APR)的大得多的糖蛋白蛋白酶解切割產(chǎn)生，該前體蛋白包括具有單 一疏水跨膜區(qū)域的695-770個氨基酸的同種型。Αβ形成不超過43個氨基酸長度的一組 肽，這些肽顯示了相當大的氨基和羧基末端異質(zhì)性(截短)及修飾(Roher，A.E.等，(1988)
28J.Cell Biol. 107,2703-2716. Roher，Α. E.等(1993) J. Neurochem. 61，1916-1926)。重要 的同種型是Αβ 1-40和1-42。它具有形成片層以聚集為原纖維的高度傾向，這最終導(dǎo) 致淀粉狀蛋白。最近的研究已經(jīng)表明接種誘導(dǎo)的大腦淀粉狀沉積物的減少引起了認知的改 進(Schenk, D.等· (1999)Nature. 400，173-177)。因此，適于產(chǎn)生本發(fā)明疫苗的Aβ片段 包括，但是不限于Αβ 1-15，Aβ 1-27和Αβ 33-42。如本文其它地方所述，可以利用氨基酸 接頭與Aβ或Αβ片段的氨基酸序列融合以實現(xiàn)和AP205VLP偶聯(lián)。適于與Aβ或Αβ片 段的N末端融合的氨基酸接頭包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。適于與Aβ或Αβ片段 的C末端融合的接頭包括但不限于序列GGC。在一個實施方式中，當接頭與Aβ或Αβ片段 的C末端融合時，酰胺化C末端半胱氨酸。A β片段1-15與氨基酸接頭融合，并且具有序列 DAEFRHDSGYEVHHQGGC-NH2 (SEQ ID NO :8)，其中用C末端“ΝΗ2”表示酰胺化C末端半胱氨酸。 A β片段1-27與氨基酸接頭融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC-NH2 (S EQ ID NO :9)。A β片段33-42與氨基酸接頭融合，并且具有序列CGHGNKSGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 10)。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原或抗原決定簇包含，或者優(yōu)選地是血管緊張肽 或其片段。這里所用術(shù)語“血管緊張肽”包括含有血管緊張肽原、血管緊張肽I或血管 緊張肽II的序列或其任何片段的任何肽。血管緊張肽與高血壓有關(guān)(Gardiner等， Br. J. Pharm. 129 1178 (2000))。因此，適于降低血管緊張肽水平的本發(fā)明綴合物、組合物和 方法適于治療高血壓。在一個實施方式中，綴合物或組合物包含至少一種血管緊張肽。一 些實施方式中肽的氨基酸序列如下血管緊張肽原DRVYIHPFHLVIHN(SEQ IDNO :11)；血管 緊張肽 I :DRWIHPraL(SEQ ID NO :12)；血管緊張肽 II :DRVYIHPF(SEQ ID NO :13)。通常 地，在血管緊張肽序列的C和/或N末端添加一個或多個額外的氨基酸。這些額外氨基酸 對于定向和有序地締合AP205病毒樣顆粒特別有價值。此血管緊張肽序列對應(yīng)于與鼠源序 列相同的人類序列。因此，用包含這種血管緊張肽作為抗原或抗原決定簇的本發(fā)明疫苗或 組合物免疫人類或小鼠是抗自身抗原的免疫接種。在一些實施方式中，帶有所述第二附著 位點的血管緊張肽具有選自如下的氨基酸序列a)CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO :14)氨基酸序 列；b) CGGDRVYIHPi7HL (SEQ ID NO :1 氨基酸序列；c) DRVYIHPFHLGGC (SEQ ID NO: 16)氨基 酸序歹丨J ；禾口 d) CDRVYIHPra(SEQ ID NO 98)氨基酸序列。在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是RANKL(NFkB受體活化因子配體)。 RANKL也稱為TRANCE(TNF-相關(guān)的激活誘導(dǎo)細胞因子)，ODF(破骨細胞分化因子)或 OPGL(骨保護素(Osteoprotegerin)配體)。在EMBL數(shù)據(jù)庫保藏RANKL_人類=TrEMBL 014788中顯示了人類RANKL細胞外部分的氨基酸序列。分別在EMBL數(shù)據(jù)庫保藏RANKL_小 鼠Tr EMBL =035235 中和在 RANKL_ 小鼠剪接形式TrEMBL :Q9JJK8 和 TrEMBL :Q9JJK9 中示 出了鼠源RANKL及同種型的細胞外部分氨基酸序列。已經(jīng)證明RANKL是破骨細胞形成(osteoclastogenesis)中的必需因子。抑制 RANKL與其受體RANK的相互作用可以引起破骨細胞形成受抑，因此提供了阻止骨質(zhì)疏松 癥和其它狀況中所觀察到的過度骨吸收的方法。通過RANK-Fc融合蛋白或稱為骨保護素 (OPG)的RANKL可溶性誘餌受體可以抑制RANKL/RANK相互作用。在骨骼中，RANKL在基質(zhì)細胞或成骨細胞上表達，而RANK在破骨細胞前體上表 達。RANK和RANKL的相互作用對于破骨細胞前體發(fā)育為成熟的破骨細胞至關(guān)重要。通過OPG可以阻斷該相互作用。OPG缺陷的小鼠患有通過重組OPG注射可以救助的骨質(zhì)疏松癥， 表明OPG能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥。因此，通過提供適宜的本發(fā)明綴合物、組合物和方法(例如， RANKL-AP205VLP綴合物)抑制RANK-RANKL相互作用在逆轉(zhuǎn)或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥方面是有效 的。此外，在剔除OPG的小鼠中觀察到了可以通過OPG注射逆轉(zhuǎn)的動脈鈣化(Min等， J. Exp. Med. 4 :463(2000)).在佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，OPG注射能防止骨丟失和軟骨破 壞，但是不能防止炎癥(爪腫脹)。推測活化的T細胞可以引起RANKL介導(dǎo)的破骨細胞形 成和骨丟失的增加。OPG抑制小鼠骨中前列腺癌誘導(dǎo)的破骨細胞形成并防止前列腺腫瘤生 長。OPG減少了小鼠中晚期骨癌的疼痛。RANKL是屬于TNF超家族的245個氨基酸的跨膜蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^TACE樣蛋白酶 切下部分細胞外區(qū)域(178個氨基酸)(Lum等，J Biol Chem. 274 13613 (1999))。此外，已 經(jīng)描述了缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的剪接變異體(Ikeda等，Endocrinology 142 1419 (2001)) 0切 割的細胞外部分含有與可溶性TNF-α高度同源的結(jié)構(gòu)域，并且形成如在TNF-α中所觀察 到的同源三聚體。C末端看似參加了三聚體的接觸位點。在序列的這個區(qū)域中存在一個半 胱氨酸。我們已經(jīng)建立了 RANKL相應(yīng)區(qū)域的3維結(jié)構(gòu)模型，并且發(fā)現(xiàn)在折疊結(jié)構(gòu)中天然存 在的半胱氨酸不可能接近以用于與本發(fā)明載體上第一附著位點相互作用。N末端是適于附 著包含第二附著位點的氨基酸接頭(其具有額外半胱氨酸殘基)的一個位點。具有融合了 N末端氨基酸接頭(含有半胱氨酸殘基)的RANKL細胞外部分的人類RANKL構(gòu)建體，是本發(fā) 明一個實施方式。然而，含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點并且融合在RANKL序列C末 端或者RANKL細胞外部分上的氨基酸接頭也是本發(fā)明的實施方式?？梢愿鶕?jù)這里公開的教導(dǎo)產(chǎn)生人類RANKL構(gòu)建體，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能在 氨基酸序列比對中比較鼠和人的RANKL序列以鑒定載體中要克隆的人RANKL序列部分。含 有氨基酸138-317并且對應(yīng)于人類RANKL細胞外結(jié)構(gòu)域C末端區(qū)域的片段為本發(fā)明一個實 施方式，并且可以按本發(fā)明教導(dǎo)根據(jù)需要修飾該片段以便偶聯(lián)AP205VLP。本發(fā)明也包括適 用于在下述適宜宿主中表達的其它載體。本發(fā)明范圍中意欲包括的其它人RANKL構(gòu)建體包 括包含可以被TACE樣蛋白酶釋放的部分細胞外區(qū)域(178個氨基酸)或其片段(Lum等， J Biol Chem. 274 :13613(1999))的人類RANKL構(gòu)建體，或者該人類RANKL構(gòu)建體可以包含 對應(yīng)于缺少跨膜結(jié)構(gòu)域的可變剪接變異體的序列，以及其保守性片段。包含氨基酸165-317 的人RANKL的C末端片段也是本發(fā)明實施方式。包含整個細胞外區(qū)域(氨基酸71-317)并 可以根據(jù)需要按本發(fā)明教導(dǎo)進行修飾以偶聯(lián)AP205VLP的RANKL片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)。已經(jīng)在不同系統(tǒng)中(例如，大腸桿菌，昆蟲細胞，哺乳動物細胞)表達了 RANKL，并 且已經(jīng)證明這些RANKL是活性的。因此，幾種表達系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生組合物中適宜的RANKL 抗原。在使蛋白質(zhì)表達定向于大腸桿菌周質(zhì)的情況下，可以用細菌信號肽置換RANKL或 RANKL構(gòu)建體(由蛋白質(zhì)的細胞外部分組成)的信號肽，該RANKL或RANKL構(gòu)建體可以經(jīng)修 飾包含本發(fā)明的第二附著位點。對于在大腸桿菌胞質(zhì)中表達蛋白質(zhì)，RANKL構(gòu)建體無需信 號肽。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是MIF或其片段。MIF是起巨噬細胞移動 抑制劑作用的細胞因子。它也被稱作延遲早期應(yīng)答蛋白質(zhì)6 (delayed early responseprotein 6，DER6)、糖基化抑制因子或苯丙酮酸互變異構(gòu)酶。已經(jīng)證明MIF涉及多種狀況。在結(jié)核菌素誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)中 MIF(mRNA和蛋白質(zhì))被上調(diào)，并且抗MIF抗體抑制該DTH反應(yīng)。在腎臟同種異體移植排斥 中MIF也被上調(diào)。在眼睛自身免疫病模型中(實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(EAU))， 抗MIF治療引起了 EAU發(fā)展的延遲。患者血清中MIF增加，該增加也出現(xiàn)在貝赫切特病患 者和患有虹膜睫狀體炎的患者中?？筂IF的免疫可以提供抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方法。 因此適于引起抗MIF免疫或適于降低血清MIF的本發(fā)明綴合物、組合物和方法可以用于治 療或預(yù)防與MIF超量產(chǎn)生有關(guān)的這些疾病、病癥和狀況。在特應(yīng)性皮炎患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高血清MIF濃度。在皮膚損傷中，MIF彌散性表 達，而在對照中MIF存在于基細胞層中。類固醇治療后，MIF濃度降低，這與炎癥中MIF的作 用一致。也發(fā)現(xiàn)MIF有助于腎小球腎炎的確立。用抗MIF抗體治療的動物顯示了顯著降低 的腎小球腎炎。MIF是垂體來源的并在例如受到LPS刺激時分泌，并且其增強內(nèi)毒素血癥。 因此，抗MIF mAb抑制內(nèi)毒素血癥和膿毒性休克，而重組MIF顯著地增加腹膜炎的致死率。 MIF也是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的、可以調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生的物質(zhì)，并且其促進炎癥。T細胞(Th2)也產(chǎn)生MIF，并且MIF可以支持T細胞增殖，而抗MIF治療降低T細胞 增殖和IgG水平。在多發(fā)性硬化和神經(jīng)貝赫切特病(neuro-Behcets disease)患者的腦脊 髓液中存在增加的MIF濃度。在患有長期銀屑病的患者的血清中也發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。在 潰瘍性結(jié)腸炎患者而不是局限性回腸炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。在支氣管哮喘患者的血清中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了高MIF水平。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者 的滑液中MIF也被上調(diào)。在小鼠和大鼠模型中，抗MIF治療有效地降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎(Mikulowska 等，J. Immunol. 158 :5514-7(1997) ；Leech 等，Arthritis Rheum. 41 910-7(1998)，Leech 等.Arthritis Rheum. 43 :827-33 (2000)，Santos 等，Clin. Exp. Immunol. 123 :309-14 (2001))。因此，利用包含MIF作為抗原決定簇的組合物定向抑制MIF 活性的治療將有益于上述狀況。如MIF 大鼠=SEQ ID NO :120，MIF 小鼠:SEQ ID NO :121 和 MIF 人類:SEQ ID NO 119SwissProt中所示，來源于小鼠、大鼠和人類的MIF由114個氨基酸組成，并且含有3個 保守性半胱氨酸。3個亞基形成沒有通過二硫鍵穩(wěn)定的同源三聚體。X射線結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析， 顯示了 3個自由半胱氨酸(Sun等，PNAS 93 :5191-96 (1996))，而一些文獻數(shù)據(jù)聲稱存在二 硫鍵。盡管如此，沒有一個半胱氨酸被足夠暴露以致可以與載體上存在的可能的第一附著 位點最佳地相互作用。因此，在本發(fā)明該實施方式中，一方面，含有半胱氨酸殘基的氨基酸 接頭被添加到蛋白質(zhì)的C末端(因為在三聚體結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)C末端是暴露的)用于產(chǎn)生第 二附著位點。在小鼠和大鼠MIF之間只有一個氨基酸改變，相似地，在人類和大鼠MIF或人 類和小鼠MIF之間也具有非常高的序列同源性(約90%序列同一性)。本發(fā)明包括含有與 AP205VLP締合的人類和小鼠MIF構(gòu)建體的綴合物、組合物和方法。在MIF序列N末端添加含有半胱氨酸的氨基酸接頭也是本發(fā)明的實施方式。在 大腸桿菌中已經(jīng)表達、純化了 MIF，并且已證明其具有完全的功能性的(Bernhagen等， Biochemistry 33:14144-14155(1994)。因此，可以在大腸桿菌中表達MIF以產(chǎn)生本發(fā)明有 用的實施方式。如果不從構(gòu)建體切下起始甲硫氨酸，那么MIF的互變異構(gòu)酶活性將受到抑制。大腸桿菌中表達的MIF構(gòu)建體顯示了互變異構(gòu)酶活性。切割了起始甲硫氨酸并且在該序列中 正好位于起始甲硫氨酸后的脯氨酸殘基被突變?yōu)楸彼岬腗IF突變體也不顯示互變異構(gòu) 酶活性，其代表了本發(fā)明進一步的實施方式，并且意欲包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個具體實 施方式中，AP205綴合無互變異構(gòu)酶活性的MIF突變體。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原或抗原決定簇是白細胞介素-17 (IL-17)。人 類IL-17是具有可變糖基化的32kDa、二硫鍵連接的同源二聚體蛋白質(zhì)(私0，Z.等， J. Immunol. 155 :5483-5486(1995) ；Fossiez，F(xiàn).等，J. Exp. Med. 183 :2593-2603 (1996))。該 蛋白質(zhì)包含巧5個氨基酸，并且包含19-23個殘基的N末端分泌信號序列。IL-17的氨基酸 序列只與皰疹病毒(Herpesvirus)蛋白質(zhì)(HSV13)相似，并且與其它細胞因子或已知蛋白 質(zhì)不相似。在GenBank記錄號# :AAC50341中給出了人類IL-17氨基酸序列。在GenBank 記錄號# :AAA37490中給出了小鼠蛋白質(zhì)序列。在評估的大量組織和細胞系中，僅在活化 的T細胞和佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸/離子霉素刺激的外周血單核細胞中檢測到了編 碼 IL-17 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物(Yao，Ζ.等，J. Immunol. 155 :5483-5486(1995)，F(xiàn)ossiez, F.等， J. Exp. Med. 183 2593-2603(1996)) 0人類和小鼠序列都含有6個半胱氨酸殘基。IL-17的受體在許多組織和細胞類型中廣泛地表達(私0，Ζ.等，Cytokine 9 794-800 (1997))。盡管人類IL-17受體的氨基酸序列(866個氨基酸)預(yù)測為具有單跨膜結(jié) 構(gòu)域和一個525個氨基酸的長細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，但是該受體序列是獨特的，與來自 細胞因子/生長因子受體家族的任何受體均不相似。這點和IL-17本身與其它已知蛋白質(zhì) 缺少相似性聯(lián)系在一起，表明IL-17和其受體可能是新信號傳遞蛋白質(zhì)和受體家族的一部 分。臨床研究表明IL-17可能與許多炎性疾病有關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液T細胞分 泌 IL-17，并且 IL-17 刺激炎性介質(zhì)產(chǎn)生(Chabaud，M.等，J. Immunol. 161 :409-414(1998)； Chabaud，Μ.等，Arthritis Rheum. 42 :963-970 (1999))。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中已經(jīng)報 道了 高水平 IL-17 (Ziolkowska M.等，J Immunol. 164 :2832-8 (2000)) 已經(jīng)證明白細胞介素17對鼠膝關(guān)節(jié)中蛋白聚糖的降解具有作用(Dudler J.等，Ann Rheum Dis. 59 :5四_32 (2000))，并且有助于滑膜基質(zhì)的破壞(Chabaud M.等， Cytokine. 12 :1092-9 ； (2000) ) 0現(xiàn)已存在檢測抗IL-17免疫作用的相關(guān)關(guān)節(jié)炎動物模型 (Chabaud M.等，Cytokine. 12 1092-9 ； (2000)) 0在來源于多發(fā)性硬化患者的單核的細胞 中已發(fā)現(xiàn)了升高水平的 IL-17mRNA(Matusevicius，D.等，Mult. Scler. 5 101-104 (1999))。 在患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中觀察到了升高的IL-17血清水平(Wong C. K.等，Lupus 9 :589-93(2000)).此外，在分離自損傷的銀屑病皮膚的T細胞中IL_17mRNA水平增加 (Teunissen, M. B.等，J. Invest. Dermatol, 111 :645-649 (1998))。也已經(jīng)證實了 IL-17參與腎臟移植排斥(Fossiez F.等，Int. Rev. Immunol. 16 541-51(1998)) ο Antonysamy 等(J. Immunol. 162 :577-84 (1999))也已經(jīng)提出了器官同 種異體移植排斥中IL-17作用的證據(jù)，他證明IL-17促進樹突細胞祖先細胞的功能性分 化。他們的發(fā)現(xiàn)提示了在同種異體T細胞增殖中IL-17的作用，其中可能部分地通過對 DCs的成熟誘導(dǎo)作用來介導(dǎo)該T細胞增殖。而且，該研究小組還報道了(Tang J. L.等， Transplantation 72 :348_5(K2001)) IL-17在急性血管性排斥的免疫發(fā)病機理中的作用， 其中白細胞介素17拮抗作用可以抑制急性而不是慢性血管性排斥。IL-17看似有潛力作為 同種異體移植排斥干預(yù)性治療的新靶標。
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抗IL-17 單克隆抗體 mAb5 (Schering-Plough Research hstitute)能完全抑 制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜上清液中通過50ng/ml IL-17誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生。在該測定 中，不相關(guān)的mAb MXl沒有作用。mAb5是用人類rIL_17(r =重組蛋白)免疫后獲得的小 鼠IgGl。在此測定系統(tǒng)中，1 μ g/ml濃度的mAb5能完全抑制IL-6產(chǎn)生(Chabaud, M.等， J. Immunol. 161 :409-414(1998))。因此，抗IL-17免疫為上述各種狀況提供了治療方法。因此，在本發(fā)明一個實施方式中，組合物包含與重組IL-17C末端融合的接頭，該 接頭含有第二附著位點。在進一步實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭與加工后的蛋 白質(zhì)的序列的N末端融合，或者插入到信號肽C末端，即成熟蛋白質(zhì)序列的N末端。對于 真核生物表達系統(tǒng)，與這里所述的其它自身抗原一樣，IL-17基因的信號肽可以用例如來 源于特定真核生物表達載體的另一個信號肽置換。對于在細菌中表達，可以用指導(dǎo)在周質(zhì) 中可溶性表達的細菌信號肽置換該信號肽。對于在細胞質(zhì)中表達，構(gòu)建體不帶有信號肽。 在一些實施方式中，無信號肽的人類IL-17構(gòu)建體將包含殘基M-155，22-155，21-155或 20-155。在一些實施方式中，無信號肽的小鼠IL-17構(gòu)建體將包含殘基沈-158，25-158， M-158或27-155?？梢栽贑Vl/ ΒΝΑ細胞中表達人類IL-17 ；已經(jīng)證明重組hIL_17可以以 糖基化和非糖基化兩種形式分泌(Yao, Z.等，J. Immunol. 155 =5483-5486 (1995)) IL-17 也可以表達為hIL-17/Fc融合蛋白，隨后從融合蛋白切割I(lǐng)L-17蛋白質(zhì)。也可以在酵母巴斯 德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達 IL-17 (Murphy K. P.等，Protein Expr Purif. 12 208-14(1998))。也可以在大腸桿菌中表達人類IL-17。當使大腸桿菌中IL-17的表達定向 于周質(zhì)時，可以用細菌信號肽置換IL-17信號肽。在一個實施方式中，IL-17構(gòu)建體無信號 肽以便該蛋白質(zhì)在大腸桿菌細胞質(zhì)中表達。在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是白細胞介素13 (IL-13)。IL-13是活化 的T淋巴細胞分泌的細胞因子，其主要影響單核細胞、巨噬細胞和B細胞。前體蛋白質(zhì)的頭 20個氨基酸對應(yīng)于信號肽，并且在加工后的蛋白質(zhì)中不存在。已經(jīng)描述了小鼠序列(Brown K. D.等，J. Immunol. 142 :679-687 (1989))。根據(jù)表達宿主，IL-13構(gòu)建體將含有(例如對于 在真核生物宿主中表達和分泌)前體蛋白質(zhì)的序列，或者(例如對于在大腸桿菌中細胞質(zhì) 表達)由成熟蛋白質(zhì)組成。為了在大腸桿菌周質(zhì)中表達，可以用細菌信號肽置換IL-13信 號肽。IL-13是最近發(fā)現(xiàn)涉及變應(yīng)性氣道應(yīng)答(哮喘)的T輔助細胞2來源的細胞因子 (象IL-4，IL-5)。在許多腫瘤類型(例如，霍奇金淋巴瘤)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-13和IL-13受 體被上調(diào)。白細胞介素13可以由霍奇金和里-斯細胞分泌并且刺激這些細胞的生長(Kapp U.等，J Exp Med. 189 :1939-46 (1999))。因此，抗IL-13免疫提供了治療諸如上述狀況，如 哮喘或霍奇金淋巴瘤的方法。在一個實施方式中，組合物包含含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，該接頭融合到 成熟IL-13序列的N或C末端以在蛋白質(zhì)中引入第二附著位點。在其它實施方式中，因 為根據(jù)IL-13的NMR結(jié)構(gòu)，成熟形式的IL-13的N端可以自由接近，所以將含有半胱氨酸 的氨基酸接頭添加到成熟形式蛋白質(zhì)的N末端(Eisenmesser，Ε. Ζ.等，J. Mol. Biol. 310 231 (2001))。在其它實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應(yīng)于加工后的蛋白 質(zhì)的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質(zhì)序列的N末端。在其它實 施方式中，將含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭添加到蛋白質(zhì)的C-末端。
可以在大腸桿菌(Eisenmesser Ε. Z.等，Protein Expr. Purif. 20 :186-95(2000)) 中或在 NS-O 細胞(真核細胞系)(Cannon-Carlson S.等，Protein Expr. Purif. 12 239-48(1998))中表達 IL-13。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是白細胞介素-5(IL_5)。IL_5是促嗜酸性 粒細胞生成的譜系特異性細胞因子，在與增加數(shù)量的嗜酸性粒細胞有關(guān)的疾病，諸如哮喘 中起重要作用。在幾個研究中已經(jīng)證明了 IL-5的生物學(xué)功能(Coffman R. L.等，Science 245 308-10(1989) ；Kopf等，Immunity 4 15- (1996))，其中指出在嗜酸性粒細胞介導(dǎo)的疾病 中抑制IL-5功能的有益作用。因此，對IL-5作用的抑制提供了治療與嗜酸性粒細胞有關(guān) 的哮喘和其它疾病的方法。IL-5形成通過二硫鍵共價連接的二聚體。已經(jīng)報道了單鏈(sc)構(gòu)建體，其中通過 肽接頭連接IL-5的兩個單體。在本發(fā)明一個實施方式中，在加工形式的IL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸 的肽接頭。也設(shè)想在加工形式的scIL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的接頭。在其它 實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末 端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式的蛋白質(zhì)序列的N末端。在其它實施方式中，含有半胱氨酸的接頭融合到IL-5序列的C末端，或者融合到 scIL-5序列的C末端。已經(jīng)描述了用于IL-5的大量表達系統(tǒng)，并且可以在制備本發(fā)明組合物時使用這 些表達系統(tǒng)。Proudfoot等(Biochem J. 270 :357-61 (1990))描述了利用大腸桿菌的細菌 表達系統(tǒng)。在大腸桿菌胞質(zhì)中表達IL-5的情況下，IL-5構(gòu)建體無信號肽。昆蟲細胞也可 以用于產(chǎn)生用于制備本發(fā)明組合物的IL-5構(gòu)建體(Pierrot C.等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 253 :756-60(1998))。同樣地，也可以使用桿狀病毒表達系統(tǒng)(sf9細胞Jngley E.等，Eur. J Biochem. 196 :623-9(1991)禾口 Brown P.M.等，Protein Expr. Purif. :6: 63-71 (1995))。最后，也已報道了哺乳動物表達系統(tǒng)(CH0細胞)，并且在制備本發(fā)明組合物 時也可以使用這些表達系統(tǒng)(Kodama S 等，J. Biochem. (Tokyo)IlO =693-701 (1991)) 也已經(jīng)描述了用于小鼠IL-5的桿狀病毒表達系統(tǒng)(Mitchell等，Biochem. Soc. Trans. 21 :332S (1993)，Kunimoto DY 等，Cytokine 3 :224-30(1991))和利用 CHO 細胞的哺 乳動物表達系統(tǒng)(Kodama S 等，Glycobiology2 :419-27 (1992))。其中IL-5序列在其N末端融合了包含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的鼠IL_5構(gòu)建 體的表達適于IL-5偶聯(lián)AP205VLP。根據(jù)這里的教導(dǎo)可以產(chǎn)生人類構(gòu)建體，得到適于偶聯(lián) AP205VLP的蛋白質(zhì)人C-IL-5-E、人C-IL-5-F和人C-IL-5-S，其為本發(fā)明的其它實施方式。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是CCL-21，CCL-21是CC亞家族的趨化因 子，也稱為小誘導(dǎo)型細胞因子A21，exodus-2, SLD (次級淋巴細胞細胞因子)，TCA4(胸腺來 源的趨化劑4)或6Ckine。CCL21抑制血細胞生成，并且刺激胸腺細胞的趨化性，激活T細胞和樹突細胞，但 是不激活B細胞、巨噬細胞或嗜中性粒細胞。它顯示了對幼稚T細胞優(yōu)先的活性。它也是 有效的腎小球系膜細胞(mesangia cell)化學(xué)引誘物。(根據(jù)物種)CCL21結(jié)合趨化因子受 體CCR7和CXCR3。在生理學(xué)剪切下，它可以觸發(fā)快速的依賴于整聯(lián)蛋白的淋巴細胞滾動抑制作用，并且其被高內(nèi)皮小靜脈(high endothelial venules)高度地表達。在人月市癌 SCID 小鼠模型(Arenberg 等，Cancer Immunol. Immunother. 49 587-92(2001))和小鼠結(jié)腸癌腫瘤模型中(Vicari 等，J. Immunol. 165 :1992-2000 (2001)), 鼠CCL21抑制腫瘤生長和血管生成。在大鼠角膜微囊試驗中也檢測到鼠CCL21的 angiostatic 活性(Soto 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :8205-10 (1998)。也證明在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4被上調(diào)，并且在代表乳 腺癌轉(zhuǎn)移的第一目的地的器官中高度表達CCL21和CXCL12及各自的配體(MUller 等· (Nature410 :50-6 (2001))。體外，通過中和性抗CCL21抗體可以阻斷CCL21介導(dǎo)的趨 化性，同樣地CXCR4介導(dǎo)的趨化性也可以被相應(yīng)抗體阻斷。因此，抗CCL21免疫提供了治療 癌癥，更特別是乳腺癌中瘤轉(zhuǎn)移擴散的方法。在小鼠和人類中分泌的CCL21分別具有110或111個氨基酸。在Swissprot :SY21_ 人類中和在Swissprot SY21_小鼠中示出了各自的序列。與其它CC細胞因子不同，CCL21 確實在C末端延伸區(qū)域中多包含2個半胱氨酸。推測所有半胱氨酸都參與了二硫鍵。在下文中，描述了用于制備包含CCL21抗原決定簇的本發(fā)明組合物的構(gòu)建體和表 達系統(tǒng)。在同源蛋白質(zhì)Eotaxin的NMR結(jié)構(gòu)中，N和C末端都暴露于溶劑。在一些實施方 式中，在蛋白質(zhì)C末端添加包含作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭。已經(jīng)表 達了(在CCL21的C末端)與堿性磷酸酶融合的蛋白質(zhì)，并且證明其是功能性的，表明在 CCL21的C末端的融合與受體結(jié)合相容。在具體實施方式
中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融 合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋 白質(zhì)序列的N末端。已經(jīng)描述了用于CCL21產(chǎn)生的幾種表達系統(tǒng)(例如，Hedrick等，J. Immunol. 159 1589-93(1997))。例如，可以在桿狀病毒系統(tǒng)中表達CCL21 (Nagira等，J. Biol. Chem. 272 19518-24(1997))ο在相關(guān)實施方式中，抗原決定簇是基質(zhì)來源的因子I(SDF-I)，現(xiàn)在稱為CXCL12。 CXCL12是骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生的趨化因子，并且最初被鑒定為前B細胞的刺激因子。如上所述，已經(jīng)證明在乳腺癌細胞中趨化因子受體CCR7和CXCR4上調(diào)，并且在代 表乳腺癌轉(zhuǎn)移的第一個目的地的器官中高度表達CCL21和SDF-I及各自的配體(MUller 等.Nature 410:50-6(2001))。體外，通過中和性抗SDF-I和抗CXCR4抗體，可以抑制 SDF-1/CXCR-4介導(dǎo)的趨化性。在利用人MDA-MB-231乳腺癌細胞系的SCID小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中，當用抗CXCR4 抗體治療小鼠時觀察到了顯著減少的肺轉(zhuǎn)移。在引流淋巴結(jié)中，觀察到了向腹股溝淋巴結(jié) 和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的減少(38%而不是在對照中的100%的轉(zhuǎn)移)。因此，抗CXCL12免疫提供 了抗癌，更具體地抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療方法。已經(jīng)證明SDF-1/CXCR4趨化因子-受體對可以增加更原始的造血祖先細胞歸巢成 為骨髓的效力。此外，推測CXCR4和SDF-I影響慢性淋巴細胞性白血病細胞的分布。這些 細胞總是浸潤患者的骨髓，并且證明這些細胞在骨髓中的遷移是CXCR4依賴性的。如果慢 性淋巴細胞性白血病細胞不與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，它們將出現(xiàn)細胞程序死亡。SDF-I阻斷性抗 體可以抑制基質(zhì)細胞的這種保護性作用(Burger等，Blood96 =2655-63 (2000)) 0因此，抗 CXCL12免疫提供了抗慢性淋巴細胞性白血病的治療方法。
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已經(jīng)證明CXCR4是HIV進入到T細胞的共同受體。SDF-I抑制X4 (依賴于CXCR4) HIV 株系對 CD4+細胞的感染(Oberlin 等，Nature 382 :833-5(1996) ；Bleul 等，Nature 382 :擬9-33 (1996) ,Rusconi 等，Antivir. Ther. 5 :199-204 (2000)) 已經(jīng)證明 SDF-1 的合成 肽類似物有效地抑制HIV-I借助于CXCR受體的進入和感染(W0059928A1)。因此，抗CXCL12 免疫提供了阻斷HIV進入T細胞的方法和由此治療AIDS的方法。也報道了 SDF-1-CXCR4相互作用在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜內(nèi)⑶4+T細胞聚積中起重 要作用(Nanki等，2000)。因此，抗SDF-I免疫提供了抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方法。已知人和鼠SDF-I通過單基因的不同剪接，以兩種形式SDF-I α和SDF-I β出 現(xiàn)。它們有4個C末端氨基酸不同，SDF-I β (74個氨基酸)中存在這4個C末端氨基酸，而 SDF-I α (70個氨基酸)中不存在這4個C末端氨基酸。在Swissprot :SDF1_人類中示出 了人類SDF-I序列，在Swissprot :SDF1_小鼠中示出了小鼠SDF-1序列。SDF-1含有形成2 個分子內(nèi)二硫鍵的4個保守性半胱氨酸。SDF晶體結(jié)構(gòu)顯示非共價連接的二聚體(Dealwis 等，PNAS 95 :6941-46(1998)) ο SDF-I結(jié)構(gòu)也顯示了長N末端延伸。丙氨酸掃描誘變被用于鑒定SDF-I上的受體結(jié)合位點(部分)(Ohnishi等， J Interferon Cytokine Res. 20 :691_70(K2000))，Elisseeva 等·(J. Biol. Chem. 275 26799-805(2000))和 Heveker 等.(Curr. Biol. 8 :369-76(1998))描述了抑制受體結(jié)合(和 HIV進入)的SDF-I衍生肽。在下文中，描述了適于產(chǎn)生與SDF-I有關(guān)的本發(fā)明組合物的構(gòu)建體和表達系統(tǒng)。 SDF-I的N和C末端均暴露于溶劑。因此，在具體實施方式
中，含有作為第二附著位點的半 胱氨酸的氨基酸接頭融合到蛋白質(zhì)序列C末端，而在其它具體實施方式
中，含有作為第二 附著位點的半胱氨酸的氨基酸接頭融合到蛋白質(zhì)序列N末端。含有半胱氨酸的氨基酸接頭 可以融合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟 形式蛋白質(zhì)序列的N末端?？梢栽谶m宜的表達載體中克隆編碼這些特異構(gòu)建體的基因。已經(jīng)描述了 SDF-I在雞胚成纖維細胞中在仙臺病毒系統(tǒng)中的表達(Moriya等， FEBS Lett. 425 :105-11 (1998))，此外大腸桿菌中(Holmes 等，Prot. Expr. Purif. 21 367-77 (2001)) SDF-I 的表達，和 SDF-1 的化學(xué)合成(Dealwis 等，PNAS 95 :6941-46(2001)) 也已有描述。在本發(fā)明另一個實施方式中，抗原決定簇是B淋巴細胞化學(xué)引誘物(BLC， CXCL13)。BLC在脾臟、淋巴集結(jié)和淋巴結(jié)中表達(Gurm等，1998)。在生發(fā)中心中其表達最 強，B細胞在此經(jīng)受體細胞突變和親和力成熟。BLC屬于C)(C趨化因子家族，并且它的最接近 同系物是 GRO α (Gunn 等，Nature 391 :799-803 (1998))。人 BLC 與鼠 BLC 具有 64% 同源性。 它的受體是CXCR5。BLC也與IL-8有同源性。在次級淋巴器官諸如脾臟和淋巴集結(jié)中，BLC 向濾泡募集B細胞。BLC對于向富含濾泡樹空細胞(FDCs)的淋巴結(jié)區(qū)室募集B細胞也是必 需的(Ansel等，Nature 406 :309-314 Q000) )。BLC也誘導(dǎo)在募集的B細胞上增加的淋巴毒 * α 1 β 2 (LT α 1 β 2)表達。由于LT α 1 β 2促進BLC表達，這就提供了正反饋循環(huán)(Ansel 等，Nature 406 :309-314 (2000)) 也已證明 BLC 能誘導(dǎo)淋巴新生(Lymphoidneogenesis) (Luther 等，Immunityl2 :471-481 (2000))?？雌饋?FDCs 也表達 BLC。因此，抗 BLC 免疫 可以提供涉及淋巴新生的自身免疫病諸如類風(fēng)濕性滑膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或I型糖尿 病的治療方法。已經(jīng)描述了具有C末端His標簽的BLC構(gòu)建體，并且該構(gòu)建體是功能性的(Ansel, K. Μ.等，J. Exp. Med. 190 :1123-1134(1999))。在本發(fā)明一個實施方式中，組合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的 接頭，并且該接頭融合在BLC序列的C末端。在與BLC同源的IL-8中，N和C末端都是游離的。含有作為第二附著位點的半胱 氨酸殘基的氨基酸接頭和BLC的N末端融合產(chǎn)生了本發(fā)明的一個實施方式。在本發(fā)明其它實施方式中，組合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且該接頭 融合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式 蛋白質(zhì)序列的N末端?？梢栽谶m宜表達載體中克隆和相應(yīng)地表達編碼這些特定構(gòu)建體的基 因。在記錄號NP_006410中示出了人類BLC序列。該序列的氨基酸1_22是信號肽。在記 錄號NP_061354中示出了小鼠序列。氨基酸1-21是信號肽。在一些實施方式中，具有BLC 做為抗原決定簇的本發(fā)明組合物利用了成熟形式的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。在另一個具體實施方式
中，抗原決定簇是Eotaxin。Eotaxin是對嗜酸性粒細胞、 嗜堿性粒細胞和Th2細胞上存在的趨化因子受體3特異的趨化因子。然而，看起來Eotaxin 對嗜酸性粒細胞具有高度特異性(ZimmermanJ. Immunol. 165 :5839-46 (2000))。盡管在剔 除Eotaxin-I的小鼠中，嗜酸性粒細胞遷移減少70%，但是其還可以發(fā)生嗜酸性粒細胞增 多(Rothenberg 等，J.Exp. Med 185:785-90(1997))。IL-5 看起來負責(zé)嗜酸性粒細胞從 骨髓向血液的遷移，而Eotaxin與組織中的局部遷移有關(guān)(Humbles等，J. Exp. Med. 186 601-12(1997))。人類基因組含有3種Eotaxin基因，Eotaxinl-3。它們相互有30%同源性。 目前在小鼠中己知 2 種基因=Eotaxinl 禾口 Eotaxin2 (Zimmerman 等，J. Immunol. 165 5839-46(2000))。它們有38%同源性。鼠Eotaxin2與人Eotaxin2有59 %同源性。在 小鼠中，看起來Eotaxinl在胃腸道中普遍地表達，而Eotaxin2似乎主要在空腸中表 達(Zimmerman 等，J. Immunol. 165 :5839-46 (2000)) Eotaxinl 存在于支氣管肺泡液中 (Teixeira 等，J. Clin. Invest. 100 1657-66 (1997))。Eotaxin 具有 8. 3kDa 的 MW。在多種 條件下，它在單體和二聚體之間保持平衡，在37°C具有估算的1. 3mM Kd(Crump等，J. Biol. Chem. 273 :2M71_9 (1998))。然而，單體形式是主要的。通過NMR光譜學(xué)已經(jīng)闡述了 Eotaxin 的結(jié)構(gòu)。與受體CCR3的結(jié)合位點在N末端，并且第一個半胱氨酸之前的區(qū)域是至關(guān)重要的 (Crump 等，J. Biol. Chem. 273 :22471-9 (1998))。結(jié)合 Eotaxin 的趨化因子受體肽證實了該 發(fā)現(xiàn)。Eotaxin具有形成2個二硫鍵的4個半胱氨酸。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明組 合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，并且在一個實施方式中， 該接頭融合到Eotaxin序列C末端。在另外的實施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接頭融 合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋 白質(zhì)序列的N末端?？梢栽谶m宜的表達載體中克隆編碼這些特定構(gòu)建體的基因。可以化學(xué)合成Eotaxin (Clark-Lewis 等，Biochemistry 30 :3128-3135 (1991))。 已經(jīng)描述了大腸桿菌細胞質(zhì)中Eotaxinl的表達(Crump等，J. Biol. Chem. 273 22471-9(1998))。也已描述了大腸桿菌中Eotaxin2作為包函體的表達，及隨后的重折疊 (Mayer 等，Biochemistry 39 ；8382—95 (2000))，禾口 Eotaxin2 的昆蟲細胞表達(Forssmann 等，J. Exp. Med. 185 :2171-6 (1997))，并且這些可以用于達到本發(fā)明具體的實施方式。在本發(fā)明另一個具體實施方式
中，抗原決定簇是巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-I是巨噬細胞和其骨髓祖先細胞增殖、分化和生存的調(diào)節(jié)物。M-CSF 的受體是原癌基因cFMS編碼的細胞表面酪氨酸激酶受體。M-CSF和其受體升高的表達與 幾種上皮癌(諸如乳腺癌、子宮癌和卵巢癌)中的不良預(yù)后有關(guān)。在由易患乳腺癌的轉(zhuǎn)基 因小鼠(PyMT)和含有csf-Ι基因隱性無效突變的小鼠雜交得到的小鼠株系中，研究了腫 瘤進展。這些小鼠與PyMT小鼠比較顯示了減弱的晚期侵入性癌和肺轉(zhuǎn)移(Lin等，J.Exp. Med. 193 :727-739(2001)) 0原因看起來是缺少向腫瘤組織募集巨噬細胞。在csf. 1無效小 鼠中Lewis肺癌的表下生長也受損。推測腫瘤生長的巨噬細胞增強機理是通過巨噬細胞產(chǎn) 生的血管生成因子、生長因子和蛋白酶實現(xiàn)的?？梢缘玫組-CSF可溶形式的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(晶體結(jié)構(gòu)=Pandit等，Science258 1358-62(199 )，并且表明蛋白質(zhì)N和C末端是可以接近的。然而，N末端接近與受體相互 作用的位點。此外，M-CSF以可溶和細胞表面形式存在，其中跨膜區(qū)域在其C末端。因此， 本發(fā)明的一些實施方式包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且在一個實施方式中，該接頭 添加在M-CSF或其片段的C末端、可溶形式M-CSF的C末端。在其它實施方式中，含有半胱 氨酸的氨基酸接頭融合到對應(yīng)于加工后的蛋白質(zhì)或可溶形式的蛋白質(zhì)的序列的N末端，或 者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質(zhì)或可溶形式蛋白質(zhì)序列的N末端。M-CSF是二聚 體，其中兩個單體通過鏈間二硫鍵連接。已經(jīng)描述了用于M-CSF N末端149個氨基酸(功能性)片段的大腸桿菌表達系統(tǒng) (Koths等，Mol. Reprod. Dev. 46 :31-37 (1997))。按上述進行修飾的這個M-CSF片段代表根 據(jù)本發(fā)明實施方式的一個抗原決定簇。在記錄號NP_000748中示出了人類序列。本發(fā)明 其它抗原決定簇包含對應(yīng)于可溶形式受體的、由上述序列的殘基33-181或33-185組成的 N末端片段。在記錄號NP_031804中示出了小鼠序列。成熟序列在氨基酸33開始。因此，本發(fā) 明一個抗原決定簇包含氨基酸33-181或33-185。在一個實施方式中，抗原決定簇是抵抗素(Res)。用兔多克隆抗體進行被動免疫 研究，其中該多克隆抗體抗細菌中表達的GST與小鼠抵抗素(mRes)的融合蛋白質(zhì)而產(chǎn)生。 該被動免疫在肥胖癥/11型糖尿病動物模型中導(dǎo)致改進的葡萄糖攝取(St印pan等，Nature 409 :307-12(2001))。抵抗素(Res)是約12KD的114個氨基酸的肽激素。它含有11個半胱氨酸，其中 已證明最N端的半胱氨酸負責(zé)蛋白質(zhì)的二聚化，而其它10個半胱氨酸被認為參與分子內(nèi)二 硫鍵形成(Banerjee 和 Lazar, J. Biol. Chem. 276 =25970-3 (2001)) 第一個半胱氨酸突變 為丙氨酸將廢止mRes的二聚化。動物模型中，在其C末端具有FLAG標簽的mRes保留了活性(St印pan等，Nature 409:307-12(2001)).相似地，C末端HA標記(血凝素標簽)的抵抗素在組織培養(yǎng)測定中 也顯示了活性(Kim等，J.Biol. Chem. 276 =11252-6 (2001)) 因此，在一個實施方式中，本發(fā) 明組合物包含含有作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接頭，并且該接頭融合在抵 抗素序列的C末端。在另一個實施方式中，包含半胱氨酸的氨基酸接頭融合到對應(yīng)于加工 后的蛋白質(zhì)序列的序列的N末端，或者插入到信號肽C末端，即成熟形式蛋白質(zhì)序列的N末 端。在本發(fā)明一個實施方式中，MRes或huRes也可以表達為Fc融合分子(其中在構(gòu)建體的抵抗素和Fc部分之間插入蛋白酶切割位點)，諸如C末端為真核生物表達系統(tǒng)中融合 蛋白的Fc部分的鉸鏈區(qū)之一個或多個半胱氨酸殘基，或者諸如這里所述的融合方式。切割 融合蛋白可以釋放抵抗素，此時抵抗素還包含含有半胱氨酸殘基的氨基酸接頭或者融合蛋 白R部分的全部或部分鉸鏈區(qū)(其在C末端包含適于偶聯(lián)AP205VLP的半胱氨酸殘基)。在 記錄號AF323081中示出了人類抵抗素序列。在記錄號AF323080中示出了鼠序列。本發(fā)明 有利的實施方式是在其C末端融合了包含半胱氨酸殘基的氨基酸接頭的人抵抗素蛋白質(zhì)。 可以根據(jù)這里公開的教導(dǎo)產(chǎn)生人抵抗素構(gòu)建體，并且通過在蛋白質(zhì)序列比對中比較鼠和人 抵抗素序列可以鑒定將要克隆到這里所述載體或其它適合表達載體中的人抵抗素序列部 分。適于產(chǎn)生本發(fā)明組合物的人抵抗素構(gòu)建體的例子是人抵抗素-C-Xa，人抵抗素-C-EK和 人抵抗素-C。這樣產(chǎn)生的人抵抗素構(gòu)建體是本發(fā)明的一個實施方式。因此，利用本發(fā)明上述組 合物接種以對抗抵抗素，可以提供治療II型糖尿病和肥胖癥的方法。在另一個實施方式中，抗原決定簇是淋巴毒素，抗淋巴毒素免疫可以用于 治療朊病毒介導(dǎo)的疾病。朊病毒是在大多數(shù)哺乳動物物種中存在的細胞蛋白質(zhì)。朊病毒蛋 白質(zhì)以兩種形式存在，通常存在于健康個體中的正常折疊形式(PrF)和引起疾病的錯誤折 疊形式(PrPse)。目前朊病毒假說假設(shè)錯誤折疊的朊病毒能催化健康朊病毒重 折疊為引起疾病的PrPse (A. Aguzzi，Haematologica 85, 3-10 (2000)) 在一些罕見的例子 中，這種轉(zhuǎn)換也可以自發(fā)出現(xiàn)，在人類中引起經(jīng)典的CJD。I^rF中一些突變與這種自發(fā)轉(zhuǎn)換 的增加有關(guān)，從而引起各種形式的家族性CJD。然而，PrPsc也可以具有傳染性，可以通過輸 血或通過食物鏈傳遞。后一種形式的朊病毒介導(dǎo)的疾病稱為庫魯病(Kuru Kuru)，過去該病 出現(xiàn)在食人者中。然而，因為以自己個體為食的物種不多，所以這種通過口傳遞的疾病形式 太罕見以致于沒有有關(guān)其它物種的文獻記載。整個歐洲用牛肉產(chǎn)品大量飼養(yǎng)奶牛改變了受押！^可傳染形式感染(引起B(yǎng)SE)的 奶牛的狀況和數(shù)量，最近幾年奶牛感染數(shù)量急劇增加，幾十萬奶牛受到這種感染。這種大量 BSE患病奶牛的突然出現(xiàn)在人群中引起了可以在人類中誘導(dǎo)相似疾病的極大恐慌。實際上， 在1996年，已報道了第一例變異形式的CJD，其由食用Pri^e感染的牛肉引起。到現(xiàn)在，這 種恐慌繼續(xù)增加，因為在接下來的幾年里受感染的人的數(shù)量持繼地增加，并且沒有治愈前 景。而且，因為綿羊會死于稱為瘙癢病的朊病毒介導(dǎo)的疾病，且因為其它哺乳動物物種也可 以受IM3se感染，所以BSE樣疾病也可能在其它物種中發(fā)生。據(jù)認為瘙癢病(朊病毒介導(dǎo)的疾病)因子的復(fù)制主要發(fā)生在淋巴組織中，并且 已證明其依賴于表達朊病毒-蛋白質(zhì)的濾泡樹空細胞(FDCs) (Brown等，Nature Med 11 1308-1312(1999))。已經(jīng)很詳細地研究了朊病毒傳遞的機制?，F(xiàn)在清楚朊病毒首先在 感染的小鼠的淋巴器官中復(fù)制，隨后向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運。已證明在缺少功能性濾泡樹 空細胞的小鼠中，朊病毒在脾臟中的復(fù)制會受損且神經(jīng)侵入出現(xiàn)(小)延遲(Montrasio 等，Science 288 1257-1259 (2000)) 0這通過用可溶性淋巴毒素β受體-Fe-融合蛋白 (LTiBR-Fc)注射小鼠而達到。該可溶性受體構(gòu)建體通過干擾Τ，B或NK細胞上的淋巴毒 素β和FDC前體細胞上的淋巴毒素β受體的重要相互作用，可以抑制FDCs發(fā)育。FDC 是很少研究的細胞類型，但是現(xiàn)在清楚它們的發(fā)育依賴于B細胞產(chǎn)生的淋巴毒素和/或 TNF (F. Mackay, J.L.Browning，Nature 395, 26-27 (1998)) 實際上，淋巴毒素缺陷的小鼠不顯示 FDCs (M. S. Matsumoto 等，Science 264，703-707 (1996))。除了 FDCs 外，抗體也可 以在疾病的進展中起作用(S. Brandner, M.A.Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6， 17-23(1999))。因此，從淋巴器官消除FDCs的抗淋巴毒素β (也稱為TNF γ )，LT α或LT β受體 的接種可以提供用于治療或預(yù)防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導(dǎo)的疾病，諸 如牛海綿狀腦病(BSE)的疫苗，并且由此預(yù)防朊病毒的復(fù)制和神經(jīng)侵入?？沽馨投舅卅碌拿庖咭部梢蕴峁┲委熖悄虿〉姆椒?。非肥胖型糖尿病NOD小鼠中 可溶性LTiiR-Fc融合蛋白的轉(zhuǎn)基因表達阻斷了糖尿病發(fā)生而不阻斷胰島炎^ttinger等， J. Exp. Med. 193 1333-40Κ (2001))。Wu 等·(J. Exp. Med. 193 1327-32 (2001))也利用 NOD 小鼠研究了淋巴毒素β的參與，但是代替利用轉(zhuǎn)基因動物，他們在試驗中注射LT β R-Fc融 合蛋白。他們觀察到對糖尿病發(fā)生的強抑制和對胰島炎的抑制。最有趣地，通過融合蛋白 治療，他們甚至逆轉(zhuǎn)了先前存在的胰島炎。因此，在胰腺中，可以逆轉(zhuǎn)淋巴濾泡結(jié)構(gòu)的形成。 因此，抗淋巴毒素β的接種可以提供抗I型糖尿病的治療方法。在一個實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接頭，并且該接頭 被添加到對應(yīng)于加工形式的淋巴毒素β的序列的N末端，或者插入到對應(yīng)于成熟形式蛋白 質(zhì)的序列的N末端和信號肽之間，即信號肽C末端。在本發(fā)明相關(guān)實施方式中，淋巴毒素β 的細胞外部分表達為融合蛋白，其中該融合蛋白具有在淋巴毒素β的N端融合的谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶，或者該融合蛋白具有在淋巴毒素β細胞外部分的N端融合的6個組氨酸標 簽及隨后的myc標簽。含有蛋白酶切割位點的氨基酸間隔區(qū)及含有作為附著位點的半胱氨 酸的接頭序列(蛋白酶切割位點C端)融合到淋巴毒素β細胞外部分序列的N末端。在 一個實施方式中，淋巴毒素β細胞外部分由對應(yīng)于淋巴毒素β氨基酸49-306或126-306 的片段組成?？梢栽赑CEP-Pu真核載體中克隆和表達本發(fā)明的這些特定的組合物。在一 些實施方式中，本發(fā)明組合物包含含有適于作為第二附著位點的半胱氨酸殘基的氨基酸接 頭，并且該接頭融合到淋巴毒素β或淋巴毒素β片段的C末端。在特別有利的實施方式 中，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接頭ACGG，該接頭本身含有用于偶聯(lián)AP205VLP的半胱氨 酸殘基，將該氨基酸序列融合到淋巴毒素β細胞外部分或淋巴毒素β細胞外部分的片段 的N末端，用腸激酶切割在載體pCEP-SP-GST-EK或載體pCP-SP-his-myc-EK中表達的相應(yīng) 融合蛋白后，產(chǎn)生人C-LT β 49_306和人C-LT β 126_3Q6蛋白質(zhì)。在一個實施方式中，抗原或抗原決定簇是朊病毒蛋白，其片段，特別是朊病毒蛋白 的肽。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗原決定簇是朊病毒蛋白或其片段。抗朊病毒蛋白的免 疫可以提供治療或預(yù)防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導(dǎo)的疾病的方法。對應(yīng)于 鼠朊病毒蛋白片段和序列 CSAMSRPMIHFGNDTODRYYRENMYR(SEQ ID NO :17) (〃 cprplong") 和 CGNDTODRYYRENMYR( “ cprpshort “ ) (SEQ ID NO 18)的鼠肽包含用于化學(xué)偶聯(lián) AP205VLP的添加的N末端半胱氨酸殘基，并且產(chǎn)生了本發(fā)明一個實施方式。在一個實施 方式中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋白。在整個申請中給出了如何修飾人朊病毒蛋白以連接 AP205VLP的指導(dǎo)。公開了小鼠朊病毒蛋白構(gòu)建體，并且也可以制備人朊病毒蛋白構(gòu)建體。包 括整個人朊病毒蛋白序列和人朊病毒蛋白的其它片段的其它構(gòu)建體也是本發(fā)明的組合物。 抗朊病毒蛋白的免疫可以提供治療或預(yù)防克-雅氏病(變異體形式)或其它朊病毒介導(dǎo)的 疾病的方法。利用包含朊病毒蛋白的本發(fā)明組合物進行免疫也可以提供治療其他動物中朊
40病毒介導(dǎo)的疾病的方法。對應(yīng)于上述鼠肽和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(〃 人類 cprplong" ) (SEQ ID NO :19)禾口 CGSDYEDRYYRENMHR( 〃 人類 cprpshort 〃 ) (SEQ ID NO 20)的人朊病毒蛋白肽產(chǎn)生了本發(fā)明的實施方式。這些肽包含被添加用于偶聯(lián) AP205VLP的N末端半胱氨酸殘基。相應(yīng)的牛和綿羊肽是CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(" 牛 cprplong “ )(SEQ ID NO 21)禾口 CGNDYEDRYYRENMHR(“牛 cprpshort “ )(SEQ ID NO 22)禾Π CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(“綿羊 cprplong “ ) (SEQ ID NO 23)和 CGNDYEDRYYRENMYRC綿羊cprpshort" ) (SEQ ID NO J4)，所用這些都構(gòu)成本發(fā)明實施方 式。在本發(fā)明一個實施方式中，抗原決定簇是腫瘤壞死因子(TNF-α)，其片段或 TNF-α肽。特別地，通過用分別包含本發(fā)明的這種肽或片段的疫苗和組合物免疫人和動 物，TNF-α肽或片段可以用于誘導(dǎo)抗整個蛋白質(zhì)的自身特異性免疫應(yīng)答。下面的鼠肽是 人肽的鼠源同系物，已經(jīng)證明該肽可以與中和TNF-α活性的抗體結(jié)合Wone等.J. Biol. Chem. 270 :19509-19515)，并且在本發(fā)明另一個實施方式中，該肽用半胱氨酸殘基修飾以便 與AP205VLP偶聯(lián)。MuTNF α肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸殘基22_32組成的表位的N末端添加序列 cgg，產(chǎn)生了序列cggveeqle^wlsqr(seq id no :25)。3’ TNFII肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸殘基4-22組成的表位的C末 端融合序列GGC，并且將谷氨酰胺21突變?yōu)楦拾彼?。由此得到的肽序列?SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC(SEQ ID NO :26)。5’ TNFII肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸殘基4-22組成的表位的N末 端融合半胱氨酸殘基，并且將谷氨酰胺21突變?yōu)楦拾彼?。由此得到的肽序列?CSSQNSSDKPVAHVVANHGV(SEQ ID NO :27)。與4-22 表位對應(yīng)的人類序列是 SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ ID NO :28)。對于 鼠源序列，在一個實施方式中，半胱氨酸融合在該表位N末端或者序列GGC融合在該表位C 末端以便共價偶聯(lián)本發(fā)明AP205VLP。然而，將含有半胱氨酸的其它序列融合在表位的N或 C末端，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。一般地，在一個實施方式中，將一個或兩個甘氨酸殘基插在添加 的半胱氨酸殘基和表位序列之間。然而，也可以插入其它氨基酸而不是甘氨酸，并且這些氨 基酸殘基包括小氨基酸，諸如絲氨酸。在本發(fā)明組合物的其它優(yōu)選實施方式中，抗原或抗原決定簇是腫瘤壞 死因子(TNF-α )、其片段或突變蛋白質(zhì)，或者TNF-α肽或其片段或突變蛋白 質(zhì)的肽，其中具有所述第二附著位點的所述抗原或抗原決定簇具有選自如下 的氨基酸序列a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ IDNO :100)氨基酸序列；b) SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGC (SEQID NO :101)氨基酸序列；和 c) CGGQLQWLNRRANA (SEQ ID NO 102)氨基酸序列。對應(yīng)于氨基酸殘基22-32的人類序列是QLQWLNRRANA (SEQ IDNO 29)。在一個相 關(guān)實施方式中，序列CGG融合在該表位N末端以便共價偶聯(lián)本發(fā)明AP205VLP。適于本發(fā)明 中使用的其它TNF-α表位也已經(jīng)例如，由^ne等.(J. Biol. Chem. 270:19509-19515)描述 和公開。本發(fā)明還包括含有這里所述的抗原或抗原決定簇的模擬表位的組合物。本發(fā)明的一個特定組合物包含呈遞在病毒樣顆粒上用于誘導(dǎo)抗抗體免疫應(yīng)答的抗體或抗體片段。在一個實施方式中，選擇淋巴瘤細胞產(chǎn)生的抗體或抗體片段，將其和用于 免疫的病毒樣顆粒附著，以便誘導(dǎo)抗淋巴瘤的保護性免疫應(yīng)答。在其它進一步實施方式中，將模擬抗原的抗體或抗體片段附著在AP205VLP 上。這些模擬抗體或抗體片段可以通過免疫及隨后分離此模擬抗體或抗體片段，或者通 過本領(lǐng)域任何已知的方法諸如雜交瘤技術(shù)(Gherardi, E.等，J. Immunol. Methods 126 61-68 (1990))，噬菌體展示(Harrison 等，Methods Enzymo 1. 267 :83-109 (1996))，核糖體 展示(Hanes, J.等，Nat. Biotechnol. 18 1沘7_1四2 (2000)，酵母雙雜交(Visintin,M.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 11723-117 (1999))，酵母表面展示(Boder，ET. &ffittrup, KD. Methods. Enzym. 328 :430-444 (2000)),細菌表面展示(Daugherty, PS.等，Protein Eng. 12 :613-621(1999))產(chǎn)生。也可以利用本領(lǐng)域已知的方法從抗體文庫或幼稚抗體文庫 (na'ive antibody library)分離模擬抗體。在進一步實施方式中，使用識別另一個抗體的結(jié)合位點的抗體，S卩，抗獨特型抗 體，也稱為免疫性抗體(immunizing antibody) 0抗獨特型抗體識別的抗體也稱為中和抗 體。因此，通過免疫以抵抗抗獨特型抗體，可以在原位產(chǎn)生具有中和抗體特異性的分子；我 們也將這些產(chǎn)生的抗體稱為誘導(dǎo)型抗體。在另一個實施方式中，選擇免疫性抗體使它與免 疫作用所要對抗的靶分子的配體分子相互作用。配體分子可以是與靶分子相互作用的任何 分子，但是在一個實施方式中，優(yōu)選地，配體分子與這樣的靶分子位點相互作用，其中為了 抑制該靶分子的功能而產(chǎn)生的抗體應(yīng)針對該靶分子位點。配體分子可以是靶分子的天然配 體或者可以是具有適宜結(jié)合特性的基因工程改造的、設(shè)計的或分離的任何配體。免疫性抗體可以來自于人，諸如從幼稚或免疫人類抗體文庫分離，或者可以從產(chǎn) 生自其它動物來源，例如鼠源的文庫分離。通過暴露的二硫鍵(例如，F(xiàn)ab片段中CHl和C κ或C λ之間的鏈間二硫鍵)的 有限還原，或者在另一個實施方式中，通過在抗體或抗體片段C末端融合含有半胱氨酸殘 基的接頭，實現(xiàn)抗體或抗體片段與AP205VLP的偶聯(lián)。在另一實施方式中，含有半胱氨酸殘 基的接頭融合到抗體或抗體片段的N末端以附著VLP或菌毛蛋白質(zhì)。如同產(chǎn)生和鑒定特定表位的模擬表位的方法，利用模擬表位的大量疫苗組合物也 是本領(lǐng)域已知的。例如，Arnon等，Immunology 101 :555-562 Q000)(這里將整個公開文獻 并入為參考文獻)描述了抗曼氏裂體吸蟲(Schistosoma Mansoni)的基于模擬表位肽的 疫苗。這些疫苗中使用的模擬表位通過篩選固相Smer隨機肽文庫以鑒定抗曼氏裂體吸蟲 保護性單克隆抗體識別的表位的模擬表位而獲得。相似地，Olszewska等，Virology 272 98-105 Q000)(這里將整個公開文獻并入為參考文獻)描述了 f小鼠。此外，Zuercher等， Eur. J. Immunol. 30 =128-135(2000)(這里將整個公開文獻并入為參考文獻)描述了利用表 位展示噬菌體進行口服抗IgE免疫的組合物和方法。具體地，表位展示M13噬菌體用做口服 抗IgE疫苗的載體。試驗的疫苗組合物含有單克隆抗IgE抗體BSW17的模擬表位和表位。本發(fā)明的實施方式包括含有引發(fā)針對特定抗原的免疫應(yīng)答的模擬表位的疫苗組 合物，及組成這些疫苗組合物的單個模擬表位/AP205VLP綴合物，及這些疫苗組合物在引 發(fā)抗特定抗原或抗原決定簇的免疫應(yīng)答中的用途。模擬表位也可以是多肽，諸如抗獨特型 抗體。因此，在本發(fā)明另一實施方式中，抗原或抗原決定簇是抗獨特型抗體或抗獨特型抗體 片段。
本發(fā)明還包括含有這里所述的抗原或抗原決定簇的模擬表位的組合物?？梢酝ㄟ^ 大量方法(包括篩選隨機肽噬菌體展示文庫(參見，例如WO 97/31948，這里將整個公開文 獻并入為參考文獻))產(chǎn)生和鑒定特定抗原的模擬表位。常常會進行這種文庫的篩選以鑒 定結(jié)合一種或多種對特定抗原具有特異性的抗體的肽。適于用在本發(fā)明疫苗組合物中的模擬表位可以是線性或環(huán)狀肽。線性或環(huán)狀肽模 擬表位可以通過非肽鍵連接非天然分子支架或核心顆?；騐LP。如上所述，已經(jīng)鑒定了可以引發(fā)抗人IgE分子的免疫應(yīng)答的大量人IgE模擬表位 和表位(參見，例如WO 97/31948)。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明疫苗組合物包括引發(fā) 抗免疫球蛋白分子(例如，IgE分子)的免疫應(yīng)答的組合物。可以用于激發(fā)這種免疫應(yīng)答的肽包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)亞基、IgE分子結(jié)構(gòu)域和能激 發(fā)對IgE分子具有特異性的抗體產(chǎn)生的模擬表位。一般地，用于制備疫苗組合物的IgE分 子部分將來源于組合物將要施用的物種的IgE分子。例如，打算給予人類的疫苗組合物將 常常含有人類IgE分子的一個或多個部分，和/或能激發(fā)抗人類IgE分子的免疫應(yīng)答的一 種或多種模擬表位。在具體實施方式
中，施用給人類的本發(fā)明疫苗組合物將含有記錄號AAB59424中 所述IgE重鏈恒定區(qū)的至少一部分。在更具體實施方式
中，用于制備本發(fā)明疫苗組合物的 IgE肽包含或者可替代地其組成為具有下面氨基酸序列的肽￡^VNLTWSRASG(SEQ ID NO: 30)。在其它特定實施方式中，本發(fā)明疫苗組合物將含有至少一種能激發(fā)免疫應(yīng)答從而 導(dǎo)致對特定抗原具有特異性的抗體產(chǎn)生的模擬表位。適于在本發(fā)明疫苗組合物制備中使用 的IgE模擬表位的例子包括具有下面氨基酸序列的肽
權(quán)利要求
1.包含至少一種選自如下的蛋白質(zhì)的病毒樣顆粒(a)具有SEQID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有SEQID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突變蛋白質(zhì)。
2.具有SEQID NO :3中所述氨基酸序列的突變蛋白質(zhì)。
3.SEQ ID NO 1的重組蛋白質(zhì)的突變蛋白質(zhì)。
4.用于產(chǎn)生AP205病毒樣顆粒的載體，其包含與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4的核苷 酸序列至少80 %，優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %，甚至更優(yōu)選地99 %相同的核苷酸 序列。
5.用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的載體，其包含編碼與選自如下的蛋白質(zhì)融合的多肽的核苷酸 序列(a)具有SEQID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有SEQID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(c)所述(a)或(b)多肽的突變蛋白質(zhì)。
6.一種組合物，其包含(a)選自如下的核心顆粒(i)AP205病毒顆粒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；和(b)有機分子，其中有機分子與核心顆粒結(jié)合。
7.一種藥物組合物，其包含(a)權(quán)利要求6所述的組合物和(b)可接受的藥物載體。
8.一種疫苗組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求6所述的組合物。
9.一種用于產(chǎn)生非天然的、有序重復(fù)抗原陣列的方法，該方法包括(a)提供包含核心顆粒的分子支架，該核心顆粒選自(i)AP205病毒；和(ii)AP205病毒樣顆粒；和(b)提供適于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的有機分子；(c)提供連接(a)和(b)的物質(zhì)，所述物質(zhì)可選地包含在(a)和/或(b)中，或者作為 一個單獨分子存在；和(d)組合(a)到(c)的元件，使所述有機分子與所述支架連接以形成有序重復(fù)的抗原陣列。
10.一種核酸分子，其包含SEQ ID NO :125中所述的核苷酸序列。
11.一種宿主細胞，其含有權(quán)利要求10所述的核酸或權(quán)利要求4所述的載體。
12.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟(a)提供權(quán)利要求4所述的核酸或權(quán)利要求11所述的載體；(b)向宿主細胞中引入所述核酸或所述載體；(c)在所述宿主細胞中表達所述核酸或所述載體的序列以獲得能形成權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒的蛋白質(zhì)或突變蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其用于免疫方法中，優(yōu)選地，其中所述組合物還 包含佐劑。
14.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物在制備疫苗中的用途，其中所述疫苗被施用給對 象；優(yōu)選地，其中所述組合物還包含佐劑。
15.如權(quán)利要求6所述的組合物，其用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué)狀況的方 法中，所述方法包括給所述個體施用所述組合物。
16.如權(quán)利要求6所述的組合物在制備用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué)狀況 的組合物中的用途，其中所述組合物被施用給所述個體。
17.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué)狀況 的方法中，所述方法包括給所述個體施用所述組合物。
18.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物在制備用于治療或預(yù)防個體疾病、病癥或生理學(xué) 狀況的疫苗中的用途，其中所述疫苗組合物被施用給所述個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用衍生自AP205外殼蛋白的病毒樣顆粒的分子抗原陣列。本發(fā)明提供了包含AP205病毒樣顆粒(VLP)和抗原的組合物。本發(fā)明也提供了制備結(jié)合AP205VLP的抗原或抗原決定簇的方法。可以使用結(jié)合抗原的AP205VLP制備用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物，其中所述免疫應(yīng)答可以用于預(yù)防或治療疾病、病癥或狀況，包括感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、藥物成癮、中毒，和有效地誘導(dǎo)自身特異性免疫應(yīng)答，特別是抗體應(yīng)答。
文檔編號A61K39/35GK102061288SQ20101015879
公開日2011年5月18日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月17日
發(fā)明者A·蒂索, I·西倫斯, M·F·巴赫曼, P·龐朋斯, R·倫霍法 申請人:希托斯生物技術(shù)股份公司