專利名稱：具有抑制血管生成及抗腫瘤作用的強化融合蛋白Fv-LDP-AE的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抑制血管生成作用、強烈殺傷腫瘤細(xì)胞活性和抗腫瘤治療效果的新型抗體導(dǎo)向藥物。
高活性的“彈頭”藥物力達(dá)霉素(LDM)，亦稱C-1027或C1027，是從我國湖北省潛江縣土壤中分離得到的由一株球孢鏈霉菌(Streptiomyces globisporus，菌種保藏號為CGMCC No.0704)產(chǎn)生的烯二炔類抗生素，是迄今報道過的對腫瘤細(xì)胞殺傷作用最強的大分子肽類抗腫瘤抗生素。體內(nèi)動物實驗表明，LDM對小鼠結(jié)腸癌26有非常顯著的療效，對移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲腸癌Hce-8693等多種人體移植腫瘤均有顯著療效(中國抗生素雜志1994，19<2>164-168)。LDM的分子由兩部分組成其一為烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)，具有細(xì)胞毒作用，但不穩(wěn)定；其二為110個氨基酸殘基組成的輔基蛋白(LDP)，對發(fā)色團(tuán)的穩(wěn)定性起保護(hù)作用。LDM分子中的發(fā)色團(tuán)以兩種形式存在活性型發(fā)色團(tuán)(即活性型烯二炔活性形式active enediyne，AE)和失活型發(fā)色團(tuán)(inactivatedchromophore)，前者易于經(jīng)過芳構(gòu)化變?yōu)楹笳摺DM分子中AE含量的高低決定其作用的強度。由于LDM分子中的發(fā)色團(tuán)由活性型向失活型的轉(zhuǎn)化，為使LDM具有高強度的生物活性，必須保持高含量的AE。發(fā)色團(tuán)與輔基蛋白通過非共價鍵結(jié)合，兩者的結(jié)合具有特異性和牢固性。LDM可以拆分和進(jìn)行分子強化，并以其獨特的分子結(jié)構(gòu)可以成為構(gòu)建新型單抗導(dǎo)向藥物的理想的“彈頭”藥物(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報2001，23<6>563-567)。
單抗靶向藥物的小型化、高效化以及尋找新的特異性腫瘤靶標(biāo)是解決當(dāng)前單抗治療劑存在問題的主要有效途徑。運用基因工程技術(shù)構(gòu)建獲得的單鏈抗體scFv與力達(dá)霉素制備的免疫導(dǎo)向融合蛋白能夠有效地將效應(yīng)分子導(dǎo)向特異性腫瘤靶部位，較用化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)獲得的免疫偶聯(lián)物更具有分子均一性及高效小型化等優(yōu)點。本實驗室以往制備了組裝型融合蛋白LDM-Fv(藥學(xué)學(xué)報2000，35<7>488-491)，但由于當(dāng)時使用的發(fā)色團(tuán)來源于一般的LDM，未能獲得具有更強殺傷腫瘤細(xì)胞活性的融合蛋白，未能觀察到對血管生成的抑制作用，亦未能在動物實驗證明其療效。研究證明，強化融合蛋白對腫瘤細(xì)胞顯示強烈的殺傷活性，有高度的抑制血管生成作用，動物實驗有非常顯著的治療效果。經(jīng)檢索，迄今國內(nèi)外尚未見有類似的強化融合蛋白的有關(guān)報道。
本發(fā)明的目的是在構(gòu)建新的融合蛋白Fv-LDP的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格控制所用發(fā)色團(tuán)的質(zhì)量，使用具有極強活性的活化型烯二炔(AE)進(jìn)行分子強化，以制備強化型融合蛋白Fv-LDP-AE，作為抗腫瘤效果更佳的新型抗體導(dǎo)向藥物。
1.力達(dá)霉素輔基蛋白LDP/抗明膠酶單鏈抗體scFv基因的克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC-9kFv1027和pIJ1027GRGDS分別含有scFv基因和LDP基因，由本實驗室保存。pGEM-T vector為美國Promega公司產(chǎn)品，大腸桿菌菌種E.coli DH5a系本實驗室保存。PCR引物由賽百盛公司合成，分別引入相應(yīng)的酶切位點。scFv 5’端引物(PH1)5’CGCATATGCAGGTGAAGCTGCAGCAGTCT3’Nde I VHscFv 3’端引物(PL2)5’CGGAATTCTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTCCAG3’EcoR IspacerVLLDP 5’端引物(PLD 1)5’CGGAATTCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTCCC3’EcoR ILDPLDP 3’端引物(PLD2)5’CCGCTCGAGTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG3’Xho I LDP以重組質(zhì)粒pPIC-9kFv1027為模板，PH1為5’引物，PL2為3’引物進(jìn)行PCR擴增，獲得C端帶有一段小肽spacer的單鏈抗體scFv基因片段；同時以重組質(zhì)粒pIJ1027GRGDS為模板，PLD1為5’引物，PLD2為3’引物進(jìn)行PCR擴增，獲得LDP基因片段。PCR反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)行25輪PCR循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃(scFv基因的擴增)或58℃(LDP基因的擴增)退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后一個循環(huán)后在72℃保溫10分鐘。
兩種PCR產(chǎn)物利用DNA片段玻璃奶回收試劑盒(BioDev公司產(chǎn)品)純化回收后，依Promage公司試劑盒提供方法與Promage公司的pGEM-T載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選出重組T載體pGEM-T-Fv和pGEM-T-LDP進(jìn)行酶切鑒定(

圖1)，分別由上海生工生物公司進(jìn)行序列測定，scFv基因全長738bp，編碼246個氨基酸，LDP基因全長345bp，編碼115個氨基酸，二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個氨基酸，編碼羧基端的組胺酸六聚體尾的基因為18bp，編碼6個氨基酸以及終止密碼子3bp，基因總數(shù)1119bp，編碼372個氨基酸。
2.融合蛋白大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL的構(gòu)建本發(fā)明選用的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)(Invitrogen公司產(chǎn)品)為本實驗室保存。將重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-Fv用Nde I和EcoR I、重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-LDP用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切獲得酶切后片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離回收。將上述兩個片段克隆至經(jīng)Nde I和Xho I酶切的表達(dá)載體pET30a(+)內(nèi)，轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)starTM(Invitrogen公司產(chǎn)品)的感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化子并提取重組質(zhì)粒。將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，表明其中含有正確的插入片段(圖2)。應(yīng)用兩條T7通用引物進(jìn)行測序，結(jié)果表明該融合基因Fv-LDP序列與預(yù)期的序列完全一致。本發(fā)明使用的表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)，在其多克隆位點的3’端融合有一段編碼組氨酸六聚體尾(His6-Tag)的基因序列，經(jīng)翻譯表達(dá)后，His6-Tag便于融合蛋白的表達(dá)鑒定與分離純化。
3.融合蛋白Fv-LDP在大腸桿菌BL21(DE3)starTM中的誘導(dǎo)表達(dá)從LB平板上挑取上述轉(zhuǎn)化子接種到含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；次日按1∶50轉(zhuǎn)種，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600為0.9，向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG(中文含義)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6小時，取1ml培養(yǎng)液，12000rpm離心1分鐘收集菌體，去上清，菌體細(xì)胞重懸在300μl PBS中，超聲破碎菌體后，12000rpm離心10分鐘，分別收集上清，沉淀重懸在300μl PBS中；以12％SDS-PAGE電泳分析外源蛋白的表達(dá)情況，融合蛋白以不可溶的包涵體形式得到表達(dá)(圖3)。凝膠成像系統(tǒng)定量分析顯示，以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白的表達(dá)量占轉(zhuǎn)化子菌株總蛋白的30％以上，最終挑選出最優(yōu)表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化菌株，其中含有能夠表達(dá)融合蛋白Fv-LDP的pEFL質(zhì)粒，命名為CAMS/FLDFP，于2003年7月××日送交位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號CGMCC No.0960。
以Western Blot檢測分析，12％SDS-PAGE電泳后在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移槽中進(jìn)行半干電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)移條件為恒電流0.65mA/cm2，時間約1.5-2小時。電轉(zhuǎn)結(jié)束后的PVDF膜分別與含有封閉液稀釋的一抗F9或抗His-Tag單抗孵育，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行顯色分析，轉(zhuǎn)化菌株CAMS/FLDFP成功表達(dá)了融合蛋白Fv-LDP(圖4)。
4.融合蛋白Fv-LDP的親和層析純化及分離制備采用His·bind純化試劑盒(Novagen公司產(chǎn)品)于變性條件下純化蛋白樣品。經(jīng)預(yù)處理親和柱后，以3體積含6M尿素的1×Binding Buffer平衡層析柱，再以變性蛋白樣品上柱后，依次以10體積的含尿素1Xbinding buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，6M Urea，pH7.9)，6體積含尿素1Xwashing buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，60mM咪唑，6M Urea，pH7.9)洗滌層析柱，最后以6體積含6M尿素的1xElute Buffer進(jìn)行洗脫，收集洗脫組份獲得純化后的融合蛋白(圖5)。繼而行透析復(fù)性，蛋白樣品依次對復(fù)性緩沖液I(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，3M Urea，5mM EDTA，pH8.0)、復(fù)性緩沖液II(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1M Urea，5mM EDTA，0.2mM GSSG，2mM GSH，0.4M L-Arg，pH8.0)和復(fù)性緩沖液III(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM EDTA，pH8.0)進(jìn)行透析，再以PBS(pH7.4)透析、濃縮，經(jīng)PD-10(Sephadex G25商業(yè)柱)脫鹽、冷凍干燥，于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.強化融合蛋白Fv-LDP-AE的制備分離取AE高含量的LDM凍干品10mg，加5ml冷甲醇振搖5min，-20℃放置1h，中間振搖1次；在0℃，12000r/min離心20min，上清液富含AE，沉降物為肽鏈，重復(fù)提取2次。自然蒸發(fā)濃縮甲醇溶液，實驗需低溫(具體溫度？)、避光進(jìn)行。取一定體積和濃度的Fv-LDP溶于0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(體積比為1∶50)，混合振搖，室溫放置12小時，將混合液以PD-10柱(商業(yè)化的Sephadex G-25柱，Pharmacia產(chǎn)品)層析分離，經(jīng)A280nm紫外監(jiān)測后棄過量未反應(yīng)的AE，收集強化融合蛋白Fv-LDP-AE(圖6)。
6.融合蛋白Fv-LDP的免疫學(xué)活性用間接ELISA檢測，以10μg/ml明膠酶(溶于PBS中)100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，置4℃過夜作為抗原；以104/孔的密度將HT-1080細(xì)胞或HT-29細(xì)胞接種于96孔板中37℃培養(yǎng)過夜；棄上清后，以0.25％戊二醛固定細(xì)胞，作為細(xì)胞抗原；以100μl 10％脫脂奶粉進(jìn)行封閉，每孔加入100μl不同濃度梯度的融合蛋白Fv-LDP，37℃孵育后以100μl 1μg/ml的抗LDM單抗F9為一抗，HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，每孔加入100μl OPD底物反應(yīng)液進(jìn)行顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定490nm處吸光值。結(jié)果顯示，融合蛋白與明膠酶、HT-29和HT-1080腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性均為陽性(圖7)。
7.融合蛋白Fv-LDP與人體腫瘤組織的免疫學(xué)活性采用博士德免疫組化試劑盒提供的鏈霉卵白素-生物素-酶聯(lián)復(fù)合物(SABC)染色方法，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘；吸取多余液體，不洗，直接滴加適當(dāng)稀釋的一抗融合蛋白Fv-LDP，室溫孵育；再依次滴加適當(dāng)稀釋的二抗F9單抗和生物素化的羊抗鼠IgG抗體，最后滴加試劑SABC，以DAB試劑盒室溫顯色，常規(guī)蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片。觀察染色結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v-LDP可與人體結(jié)腸腺癌組織中的MMP-2/MMP-9發(fā)生免疫反應(yīng)而呈陽性染色，其陽性染色顆粒位于結(jié)腸腺癌腺細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)。
8.融合蛋白Fv-LDP抑制腫瘤細(xì)胞分泌明膠酶的活性取對數(shù)生長期的人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞，按1×105/ml/孔加于24孔培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時；棄培養(yǎng)液，加入200μl無血清RPMI 1640(中文含義)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時后，加入100μl的融合蛋白Fv-LDP于37℃孵育24小時后，吸取培養(yǎng)液，500×g離心5分鐘，取少量細(xì)胞上清以Bradford法(中文含義)測定蛋白含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定樣品的濃度，以相應(yīng)體積取上清進(jìn)行非變性PAGE電泳。電泳完畢后將凝膠放入100ml 2.5％Triton X-100溶液中漂洗30分鐘，重復(fù)一次，蒸餾水漂洗2次，加入100ml明膠酶緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2)，37℃孵育16小時；考馬斯亮藍(lán)R250染色脫色后觀察負(fù)染的明膠水解條帶。結(jié)果表明，融合蛋白Fv-LDP明顯地抑制腫瘤細(xì)胞HT-1080分泌明膠酶的活性(圖9)。
9.強化融合蛋白Fv-LDP-AE抑制血管生成作用以雞胚尿囊膜法檢測其對血管生成的抑制作用。將新鮮受精的白皮來航雞種蛋氣室端朝上，37℃，60％濕度的恒溫室中孵育7天后再消毒雞蛋外殼，以針刺入氣室，將2ml空氣吸入氣室內(nèi)以使雞胚尿囊膜與血管卵膜分離，同時以砂輪磨殼小心剝?nèi)ネ鈿ば纬梢粋€2×2cm2小窗，立即用透明膠帶封好，繼續(xù)于37℃，60％濕度的恒溫室中孵育24h。至孵育第九天小心吸取10μl的bFGF(中文含義)滴加于預(yù)先準(zhǔn)備好的二甲基纖維素載體盤中，同時加入不同濃度的強化融合蛋白Fv-LDP-AE，將載體盤置于大血管及胚心遠(yuǎn)端，封窗，繼續(xù)于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h后觀察，結(jié)果顯示，F(xiàn)v-LDP-AE能明顯抑制bFGF刺激雞胚尿囊膜新生血管的生成(圖10)。
10.強化融合蛋白Fv-LDP-AE對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用用克隆形成法測定，取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔50個細(xì)胞/0.2ml，培養(yǎng)24h。10倍稀釋各藥物和組裝偶聯(lián)物，每濃度設(shè)3個平行孔，每孔50μl，37℃溫育1h，無血清PRMI 1640培養(yǎng)液洗2次，加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，第7天于鏡下計數(shù)細(xì)胞集落。結(jié)果表明，F(xiàn)v-LDP-AE的對腫瘤細(xì)胞有強烈的殺傷作用，半數(shù)克隆抑制濃度IC50為1.65×10-16M(圖11)。
11.強化融合蛋白Fv-LDP-AE的動物實驗治療方案根據(jù)劑量初篩結(jié)果設(shè)計動物實驗治療的給藥方式和劑量。領(lǐng)取體重為18-22g的昆明小鼠60只，隨機分為6組，每組10只。實驗第0天，取小鼠肝癌H22腹水，以生理鹽水稀釋成細(xì)胞數(shù)為1.5×106/ml，按0.2ml/只接種于昆明小鼠腋窩皮下。小鼠皮下接種H22腫瘤24h后，分別于實驗第1和第10天給予生理鹽水、Fv-LDP、游離LDM以及三個劑量的Fv-LDP-AE，尾靜脈注射給藥2次。實驗期間每3-4天測定腫瘤大小，以公式1/2ab2(a腫瘤長徑，b腫瘤短徑)計算腫瘤體積和抑瘤率。實驗第21天結(jié)果表明，強化融合蛋白Fv-LDP-AE體內(nèi)有顯著的療效，于0.8、1.6、3.2mg/kg的劑量，可明顯抑制肝癌H22皮下瘤的生長，如下表所示Fv-LDP-AE對小鼠移植性肝癌H22的生長抑制作用體重變劑量 小鼠數(shù)量 腫瘤體積 抑制率組別 化(mg/kg) 實驗開始/結(jié)束 (cm3)x±S) (％)(g)空白對照 - 10/10 22 14.6±4.3LDM 0.05 10/10 19.5 4.3±2.6 70.3*Fv-LDP 2.410/10 15.7 11.9±5.818.7Fv-LDP-AE3.210/10 4.50.6±0.3 95.9*▲Fv-LDP-AE1.610/10 8.71.8±1.2 87.8*▲Fv-LDP-AE0.810/10 9.72.1±1.1 85.7*▲*與空白對照組相比，P＜0.01，▲與LDM組相比，P＜0.05。
從腫瘤生長曲線(圖12)可見，F(xiàn)v-LDP-AE在3.2mg/kg劑量時療效尤其顯著，其第14、17、21天的抑制率分別為92.2％、95.2％、95.9％。治療期間，動物的體重?zé)o明顯變化，一般狀況良好，表明動物可耐受所用劑量。發(fā)明效果本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于，應(yīng)用基因工程技術(shù)和分子強化相結(jié)合的技術(shù)路線制備獲得的強化融合蛋白Fv-LDP-AE是一種新型高效小型化免疫導(dǎo)向藥物，以基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/MMP-9為靶點的scFv片段與力達(dá)霉素構(gòu)成的強化融合蛋白Fv-LDP-AE，基本保留了完整單抗的抗原結(jié)合活性，能抑制腫瘤細(xì)胞對明膠酶的分泌活性，同時顯示對腫瘤細(xì)胞的強殺傷活性以及抑制血管生成作用，在動物體內(nèi)實驗治療有顯著療效，展示其具有良好的應(yīng)用前景。
3-重組菌株CAMS/FLDFP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前全菌蛋白4-重組菌株CAMS/FLDFP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后全菌蛋白5-重組菌株CAMS/FLDFP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體包涵體沉淀6-重組菌株CAMS/FLDFP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體上清圖5融合蛋白Fv-LDP經(jīng)金屬螯合層析純化的SDS-PAGE分析其中1-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)2、3-未上親和層析柱前樣品4-結(jié)合緩沖液洗柱后收集的液體5-以20mM咪唑漂洗緩沖液洗柱后收集的液體6-10-以1M咪唑洗脫緩沖液洗柱后先后收集的蛋白組分圖6強化融合蛋白Fv-LDP-AE的分離純化其中峰1-純化的強化融合蛋白Fv-LDP-AE峰2-未反應(yīng)的過量的AE圖7ELISA分析融合蛋白Fv-LDP與明膠酶和不同腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)性其中▲明膠酶■HT-29細(xì)胞◆HT-1080細(xì)胞圖8免疫組化染色分析融合蛋白Fv-LDP與人體結(jié)腸癌組織的免疫學(xué)活性其中AFvLDP在人結(jié)腸癌組織中的免疫組化染色B陰性對照，PBS替代FvLDP為一抗放大倍數(shù)為200×，圖中標(biāo)尺為20μm。圖9融合蛋白Fv-LDP對HT-1080細(xì)胞的明膠酶譜分析其中1-PBS2-BL21(DE3)/pET-30a(+)IPTG誘導(dǎo)后全菌蛋白3-完整單抗3G11(6μM)4-融合蛋白Fv-LDP(30μM)圖10強化融合蛋白Fv-LDP-AE對bFGF刺激雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用其中A僅PBS處理后的雞胚尿囊膜血管B以bFGF為刺激物，PBS處理后的雞胚尿囊膜血管
C以bFGF為刺激物，LDM(0.1μg/雞胚)處理后的雞胚尿囊膜血管D以bFGF為刺激物，F(xiàn)v-LDP-AE(0.4μg/雞胚)處理后的雞胚尿囊膜血管圖11強化融合蛋白Fv-LDP-AE對腫瘤細(xì)胞HT-29的殺傷活性其中◆Fv-LDP-AE■LDM圖12強化融合蛋白Fv-LDP-AE對小鼠體內(nèi)肝癌H22生長的抑制作用其中◆對照 ▲FvLDP組■LDM組 △Fv-LDP-AE3.2組◇Fv-LDP-AE1.6組□Fv-LDP-AE0.8組<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>具有抑制血管生成及抗腫瘤作用的強化融合蛋白Fv-LDP-AE<140><141><160>1<170><210>1<211>1119<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222><223><400>1atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag 60ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag120acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa180tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc240tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg300gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat cgagctcact420cagtctccag cttctttggc tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatatc ctgcagagcc480agtgaaagtg ttgatactta tggcgatact tttatgtact ggtaccagca gaaaccagga540cagccaccca aactcctcat ctatcttgca accaacctag gatctggggt ccctgccagg600ttcagtggca gtgggtctag gacaaacttc accctcacca ttgatcctgt ggaggctgat660gatgctgcaa cctattactg tcagcaaaat aatgaggatc cgtacacgtt cggagggggc720accaagctgg aaatcaaacg tggtggaggc ggttcaccat gggcgcccgc cttctccgtc780agtcccgcct cgggtctgag tgacggacag agcgtgtcgg tgtcggtcag cggtgccgcc840gccggcgaga cctactacat cgcccagtgc gctccggtcg gtggccagga cgcgtgcaac900ccggcgaccg cgacgtcctt caccacggac gcgtccggag cggcgtcgtt cagcttcgtc960gtgcgcaagt cgtacacggg ctccacgccc gaaggcacgc cggtcggcag cgtcgactgc 1020gccacggccg cctgtaacct cggcgccggc aactccgggc tcgacctcgg ccacgtggct 1080ctgaccttcg gcctcgagca ccaccaccac caccactga* 1119
權(quán)利要求
1.一種強化融合蛋白Fv-LDP-AE，其特征在于它是由抗明膠酶單鏈抗體scFv、.力達(dá)霉素輔基蛋白LDP和羧基端的組氨酸六聚體尾形成的融合蛋白Fv-LDP(分子量約為38.7kDa)以及活化型烯二炔發(fā)色團(tuán)AE(分子量為843kDa)構(gòu)成的，基因全長1119bp，編碼372個氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的強化融合蛋白Fv-LDP-AE，其特征在于其中的scFv基因全長738bp，編碼246個氨基酸；LDP基因全長345bp，編碼115個氨基酸；二者之間的柔性肽基因15bp，編碼5個氨基酸；羧基端的組氨酸六聚體尾基因為18bp編碼6個氨基酸；終止密碼子為3bp。
3.強化融合蛋白Fv-LDP-AE的制備方法，其特征在于所說方法主要采用DNA重組和分子強化兩條技術(shù)路線，具體步驟如下A.力達(dá)霉素輔基蛋白LDP與抗明膠酶單鏈抗體scFv的融合基因構(gòu)建；B.融合蛋白大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL的構(gòu)建；C.融合蛋白Fv-LDP在大腸桿菌CAMS/FLDFP(保藏編號CGMCC No.0960)中的誘導(dǎo)表達(dá)；D.融合蛋白Fv-LDP的親和層析純化及分離；E.強化融合蛋白Fv-LDP-AE的制備分離。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是運用基因工程技術(shù)分別克隆得到力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因和抗基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9單鏈抗體scFv基因，將二者以編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構(gòu)建成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同時在spacer區(qū)引入特異性酶切位點。
5.如權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征是將所得到的融合基因克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL。
6.如權(quán)利要求3或5所述的制備方法，其特征是將pEFL轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體形式的融合蛋白Fv-LDP，并進(jìn)行條件優(yōu)化獲得最佳表達(dá)。
7.如權(quán)利要求3或6所述的制備方法，其特征是通過親和層析純化融合蛋白Fv-LDP，再進(jìn)行透析復(fù)性，濃縮凍干，制備功能性融合蛋白。
8.如權(quán)利要求3或7所述的制備方法，其特征是將純化分離得到的融合蛋白Fv-LDP與經(jīng)甲醇提取制備的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)的活性型烯二炔AE，按一定分子比和時間進(jìn)行分子強化，獲得強化融合蛋白Fv-LDP-AE。
9.強化融合蛋白Fv-LDP-AE在制備抑制血管生成和抗腫瘤新型抗體導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的強化融合蛋白Fv－LDP－AE，主要通過融合蛋白的基因工程構(gòu)建和分子強化兩條技術(shù)路線制備而成，融合蛋白Fv－LDP的基因全長1119bp，編碼372個氨基酸，分子量為38.7kDa，它對腫瘤細(xì)胞有強烈的殺傷作用，能明顯抑制雞胚尿囊膜新生血管的生成，動物實驗證實，其對小鼠移植性肝癌H22有非常顯著的療效，使用可耐受劑量，其抑瘤率可達(dá)95.9％(P＜0.001)，該強化融合蛋白顯示了抗體靶向藥物的小型化與高效化特點，可望成為一種用于臨床治療腫瘤的新型靶向藥物。
文檔編號C07K16/30GK1475506SQ03150240
公開日2004年2月18日 申請日期2003年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月22日
發(fā)明者李亮, 甄永蘇, 苗慶芳, 尚伯楊, 劉秀均, 江敏, 亮 李 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所