專利名稱：具有抗菌作用的免疫活性肽(Trpi)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
乳品生物技術(shù)背景技術(shù)乳是新生哺乳動物的主要食物來源，也是成年人飲食的一個重要組成部分。長期以來，乳蛋白僅僅被人們視為一種營養(yǎng)蛋白，為新生哺乳動物提供充足的能量和各種氨基酸，然而，近年來的研究結(jié)果表明，乳蛋白除其營養(yǎng)價值外，還是生物活性肽的重要來源。這些生物活性肽，均以無活性的狀態(tài)存在于乳蛋白前體物中，只有用適當(dāng)?shù)拿杆夂?，它們的活性才被釋放出來，從而才能發(fā)揮其生理功能。
乳蛋白生物活性肽的研究始于1979年。1979年，德國的Brantl.等人通過酶解牛乳酪蛋白得到了一些多肽產(chǎn)物，并證明它們具有類嗎啡活性，從此，人們展開了生物活性肽方面的研究。經(jīng)過20多年的逐步探索，到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種生物活性肽，如類嗎啡活性肽(Opioid peptides)，是研究最早的一類生物活性肽，具有類嗎啡受體配體活性，能與機體內(nèi)的類嗎啡受體結(jié)合，具有止痛、止瀉、抑制胃腸蠕動、增強機體對氨基酸和其它營養(yǎng)物質(zhì)的吸收的功能；免疫活性肽(Immunopeptides)，能夠增強機體免疫力，刺激機體淋巴細胞的增殖，增強巨嗜細胞的吞噬功能，提高機體抵御外界病原物質(zhì)感染的能力，降低機體發(fā)病率，并具有抗腫瘤功能；抗血栓活性肽(Antithromboticpeptides)，能抑制血纖維蛋白原與血小板表面的特異性受體結(jié)合，具有抗凝血、抑制血栓形成的生理功能；酪蛋白磷酸肽(Caseinphosphopeptides，簡稱CPP)，能與多種礦質(zhì)元素結(jié)合形成可溶性的有機磷酸鹽，充當(dāng)許多礦質(zhì)元素特別是鈣離子在體內(nèi)運輸?shù)妮d體，促進小腸對鈣離子和其他礦質(zhì)元素的吸收；抗菌肽(Antimicrobial peptides)，是近年來發(fā)現(xiàn)并開始研究的一類生物活性肽，體外條件下能抑制細菌的生長，在體內(nèi)具有類似抗生素的活性，能抑制小鼠感染致病的金黃色葡萄球菌；抗血栓轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Inhibitors ofantigiotensin-converting enzyme，簡稱CEI)，是一種多功能肽，具有調(diào)節(jié)血壓、免疫防御和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能的活性。此外，近幾年還有抗高血壓肽(Antihypertensive peptides)、抗遺忘肽(Antiamnestic peptides)等生物活性肽的報道。
免疫活性肽是繼類嗎啡活性肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性肽，免疫活性肽的研究始于1981年。1981年，Jolles.等首次報道，用胰蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中分離得到一種具有免疫活性的肽段，它的氨基酸序列是Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，相當(dāng)于人乳β-酪蛋白54-59的氨基酸殘基序列，這個短肽，在體外試驗中能增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊紅細胞的吞噬作用，靜脈注射，則能增強小鼠抵抗肺炎克氏桿菌(Klebsiella.Pneumoniae)感染的能力。此后，科學(xué)家進行了大量免疫活性肽方面的研究。據(jù)報道，已從牛乳、人乳及植物蛋白中獲得了39種不同序列的免疫活性肽，其中，牛乳蛋白來源的免疫活性肽有9種，其序列及來源如下

(備注CN代表酪蛋白，LA代表乳清蛋白)
從廣義上講，免疫活性肽不僅指免疫活性肽(Immunopeptids)，還應(yīng)該包括具有免疫活性的其他類生理活性肽，例如類嗎啡肽，它是一種多功能肽，除了具有類嗎啡活性外，它還具有免疫刺激活性，能夠刺激機體淋巴細胞的增殖，增強機體免疫功能，此外，抗菌肽、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白B、抗血栓轉(zhuǎn)換酶抑制劑等生物活性肽也具有較強的免疫活性。
免疫活性肽發(fā)揮其生理功能的濃度極低，例如，二肽Tyr-G1y，在10-11mol/L的濃度下，就能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊紅細胞的吞噬作用，刺激淋巴細胞的增殖，提高小鼠抵抗肺炎克氏桿菌(Klebsiella.pneumoniae)感染的能力；Tyr-Gly-Gly作用的濃度更低，僅為10-12mol/L。
自免疫活性肽被發(fā)現(xiàn)和得到系統(tǒng)研究以來，由于其活性檢測方法比較麻煩，需要大做量的動物試驗才能得出結(jié)論，而做動物試驗的首要條件是要獲得足夠量的純品。但是，到目前為止，免疫活性肽的研究仍處于實驗水平，還沒有一套較為有效的制備方法。所以，二十年來，免疫活性肽方面的研究進展比較緩慢。德國以Hans Meisel為首的聯(lián)邦乳品研究中心(Federal Diary ResearchCenter)物化研究所(Institute for Chemistry and Physics)在這方面做了大量工作，發(fā)現(xiàn)了多種免疫活性肽并對其部分生物活性做了一定的檢測，目前，正在進行深入研究。本發(fā)明專利利用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，在此復(fù)合多肽中經(jīng)超濾、冷乙醇提取、色譜等技術(shù)分離出一種具有抗菌作用，同時具有免疫活性的生物活性肽，對其序列進行了分析，經(jīng)查詢屬于新型生物活性肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用蛋白酶水解牛乳酪蛋白的方法制備免疫活性肽。在研究中，首先對不同蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶)水解酪蛋白的規(guī)律進行研究。通過測定不同的底物濃度下，水解度隨酶解時間的不同，繪制出不同底物濃度下酪蛋白的酶解曲線，然后通過對所繪出的曲線的分析，來尋找酪蛋白酶解底物濃度與水解度的關(guān)系，從而得出水解底物濃度與水解度的關(guān)系曲線。通過研究發(fā)現(xiàn)(1)蛋白質(zhì)類底物的水解與小分子類的底物的水解是不同的。因為蛋白質(zhì)類底物水解的部分是肽鍵。(2)當(dāng)?shù)孜餄舛雀邥r，粘度增加，蛋白質(zhì)的活度降低。(3)識別的位點不同(蛋白質(zhì)有許多個水解位點)，而和酶是多位點結(jié)合的，因而需要很多的酶來作用與底物，因而底物濃度要低一些。(4)通過酶的水解曲線來尋找最佳的底物濃度，該實驗結(jié)果可為水解營養(yǎng)蛋白、貯藏蛋白并由此生產(chǎn)生物活性肽提供理論依據(jù)。
在免疫活性肽的制備、分離研究中，探索了多種蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶和這幾種蛋白酶的不同組合來篩選具有免疫刺激作用的酶解液，找到了具有免疫刺激作用的酶解液即酪蛋白的胰蛋白酶酶解液，進一步比較了不同酪蛋白濃度的胰蛋白酶酶解液抑菌活性大小，篩選出了最合適的底物濃度，結(jié)果表明，當(dāng)酪蛋白的底物濃度為9％(w/v)，E∶S＝1∶120時，酶解液的抑菌作用最強。確定了具有免疫刺激作用的免疫活性肽肽分離純化方法酶解液→加熱滅酶→80％乙醇沉淀→離心→透析→兩次SephadexG凝膠柱層析。通過該方法可分離純化到了具有免疫刺激作用的免疫活性肽，并經(jīng)電泳證明了其純度為單一組分。通過氨基酸組成分析，根據(jù)該免疫活性肽酪氨酸含量較高的特征，將此免疫活性肽命名為“富含酪氨酸多肽(Try-rich polypeptide，簡寫為Trpi)。其氨基酸序列為Cys-Glu-Lys-Asp-Glu-Arg-Phe-Phe-Ser-Asp-Lys-Ile-Ala-Lys-Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn-Tyr-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Val-Ala-Leu-Ile-Asn-Asn-Gln-Phe-Leu-Pro-Tyr-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Lys從其氨基酸序列及其來源來看，這個免疫活性肽與以前所報導(dǎo)的過各種免疫活性肽序列不同，是一種新的免疫活性肽。另外，該免疫活性肽同時還具有抗菌作用，體外條件下能夠較強地抑制大腸桿菌等細菌的生長。
具體實施例方式
通過對酪蛋白酶解液中分離Trpi條件研究，找出最佳的除雜條件，并研究了乙醇提純Trpi方法。其工藝過程為酪蛋白→粉碎→60目過篩→溶解→調(diào)整pH值為7.5→加熱恒溫45℃→加酶水解→水解液調(diào)整pH值為4.5→離心→上清液→調(diào)整pH值為7.5→加無水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空濃縮→冷凍真空干燥→粉碎→包裝工藝參數(shù)酪蛋白純度≥90％以上粉碎粒度 ≤60目溶解液濃度10％(w/v)酶與底物之比 1∶120水解溫度 45℃水解時間 90-120min
權(quán)利要求
1.改具有抗菌功能的免疫活性肽(Trpi)序列Cys-Glu-Lys-Asp-Glu-Arg-Phe-Phe-Ser-Asp-Lys-Ile-Ala-Lys-Tyr-Ile-Pro-Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg-Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn-Tyr-Tyr-Gln-Gln-Lys-Pro-Val-Ala-Leu-Ile-Asn-Asn-Gln-Phe-Leu-Pro-Tyr-Pro-Tyr-Tyr-Ala-Lys及其同源性達到85％以上的序列都應(yīng)得到保護，不得用于商業(yè)目的。
2.其高純度Trpi制備工藝(用于標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn))牛乳酪蛋白→胰蛋白酶酶解→加熱滅酶→80％乙醇沉淀→離心→透析→兩次SephadexG凝膠柱層析
3.其生產(chǎn)工藝(工業(yè)化生產(chǎn))酪蛋白→粉碎→60目過篩→溶解→調(diào)整pH值為7.5→加熱恒溫45℃→加酶水解→水解液調(diào)整pH值為4.5→離心→上清液→調(diào)整pH值為7.5→加無水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空濃縮→冷凍真空干燥→粉碎→包裝。
全文摘要
利用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白，篩選出具有抗菌活性的免疫活性肽，其分離純化方法為酶解液→加熱滅酶→80％乙醇沉淀→離心→透析→兩次SephadexG凝膠柱層析。因其酪氨酸含量較高，命名為“富含酪氨酸多肽(Try－rich polypeptide，簡寫為Trpi)，分析確定了其氨基酸序列。其工藝過程為酪蛋白→粉碎→60目過篩→溶解→調(diào)整pH值為7.5→加熱恒溫45℃→加酶水解→水解液調(diào)整pH值為4.5→離心→上清液→調(diào)整pH值為7.5→加無水乙醇沉淀→上清液→薄膜真空濃縮→冷凍真空干燥→粉碎→包裝。
文檔編號C07K14/435GK1566152SQ0313730
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月10日
發(fā)明者龐廣昌, 胡志和, 陳慶森, 王秋韞, 閻亞麗, 劉劍虹 申請人:天津商學(xué)院