專利名稱：制備有生物活性的α-β肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備包含α -氨基酸殘基和β -氨基酸殘基的多肽化合物的方法，由此制備的化合物以及所述化合物作為藥學(xué)活性劑在治療包括人在內(nèi)的動(dòng)物的疾病中的用途。背景許多天然存在的生物活性化合物是基于α -氨基酸的蛋白或肽(即其中一個(gè)氨基酸的α-羧基通過(guò)酰胺鍵與鄰接氨基酸的α-氨基連接的α-氨基酸序列)。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)新的藥學(xué)活性藥物的途徑已轉(zhuǎn)向合成肽文庫(kù)并繼而針對(duì)該文庫(kù)中具有所需活性(例如所需結(jié)合活性)的化合物進(jìn)行測(cè)定。然而，α-氨基酸肽對(duì)于藥物應(yīng)用并非完全令人滿意，尤其是因?yàn)樗鼈兺詹畈⑶以隗w內(nèi)受到蛋白水解降解。關(guān)于β-氨基酸和由β-氨基酸合成的肽的許多工作已在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中報(bào)道。參見(jiàn)例如，由當(dāng)前共同發(fā)明人Samuel H. Gellman帶領(lǐng)的小組進(jìn)行的工作， 包括,Application of Microwave Irradiation to the Synthesis of 14-helical Beta-P印tides (微波輻射在14-螺旋β -肽的合成中的應(yīng)用)”，Murray和Gellman， "Organic Letters (2005) 7 (8) , 1517-1520 ；"Synthesis of 2,2-Disubstituted Pyrrol idine-4-carboxylic Acid Derivatives and Their Incorporation into Beta-Peptide Oligomers 0，2- 二取代的吡咯烷_4_甲酸衍生物的合成及其摻入 β -肽寡聚物)” · Huck 和 Gellman，J. Org. Chem. (2005) 70 (9)，3353-62 ；"Effects of Conformational Stability and Geometry of Guanidinium Display on Cell Entry by Beta-Peptides (β肽對(duì)細(xì)胞進(jìn)入的胍鹽展示的構(gòu)象穩(wěn)定性和幾何學(xué)的影響)” Potocky、 Menon 禾口 Gellman, Journal of the American Chemical Society (2005) 127(11) 3686-7 ； " Residue requirements for helical folding in short alpha/ beta-peptides :crystallographic characterization of the 11一helix in an optimized sequence (對(duì)于短α/β肽中的螺旋折疊的殘基需求優(yōu)化序列中11_螺旋的晶體學(xué)表征)“，Schmitt、Choi、Guzei 禾P Gellman, Journal of the American ChemicalSociety(2005)，127(38)，13130-1 禾口 ‘‘ Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation (用微波福身寸對(duì) β-月太組合文庫(kù)的有效合成)，，，Murray、Farooqi、Sadowsky、Scalf、Freund、Smith、Chen 禾口 Gellman, Journal of the American Chemical Society (2005)，127 (38)，13271-80。由瑞士蘇黎世的 Dieter kebach帶領(lǐng)的另一小組也已在β-多肽領(lǐng)域廣泛發(fā)表文章。參見(jiàn)例如jeekich等(1996) Helv. Chim. Acta. 79 :913-941 和 Seebach 等(1996) Helv. Chim. Acta. 79 :2043_2066。在這兩篇文章的第一篇中kebach等描述了名為(H-β-HVal-β-HAla-β-HLeu) 2-0H的β-六肽的合成和表征。引人關(guān)注的是，該文章特別指出關(guān)于肽結(jié)構(gòu)的現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道已自相矛盾并且“部分具有爭(zhēng)議的”。在第二篇文章中，Seekich等探索了以上提及的β-六肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及殘基變化對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。Dado 和 Gel Iman (1994) J.Am. Chem. Soc. 116 :1054-1062 描述了 β 丙氨酸和 Y 氨基丁酸的衍生物中的分子內(nèi)氫鍵合。該文章假定若多聚體骨架上的最鄰近酰胺基之間的分子內(nèi)氫鍵合是非偏愛(ài)的，則β肽將以類似于α-氨基酸多聚體的方式折疊。Suhara 等(Igge)iTetrahedron Lett. 37(10) 1575-1578 報(bào)道了 β 肽的多糖類似物，其中D-葡基胺衍生物彼此經(jīng)由C-I β -羧酸基團(tuán)和C-2 α -氨基連接。此類化合物已有慣用名“碳類肽(carbop印toid) ”。關(guān)于產(chǎn)生組合文庫(kù)的方法，可得到數(shù)篇綜述。參見(jiàn)例如Ellman(1996)Acc. Chem. Res. 29 :132-143 和 Lam 等(1997)Chem. Rev. 97 :411_448。在近來(lái)關(guān)于β-多肽的專利文獻(xiàn)中，參見(jiàn)例如美國(guó)已發(fā)表的專利申請(qǐng) 2008/0166388，標(biāo)題為“Beta-P 印 tides with Antifungal Activity (具抗真菌活性的 β _ 肽)“；2008/0058548，標(biāo)題為 Concise Beta2_Amino Acid Synthesis via Organocatalytic Aminomethylation(經(jīng)由有機(jī)催化氨甲基化的簡(jiǎn)明β2_氨基酸合
) “ ；2007/0154882, feH ^ “ Beta-polypeptides that inhibit cytomegalovirus infection(抑制巨細(xì)胞病毒感染的β-多肽)“；2007/0123709，標(biāo)題為"Beta-amino acids(0-氨基酸)〃以及 2007/0087404，標(biāo)題為〃 Poly-beta-p印tides from functionalized beta-lactam monomers and antibacterial compositions containing same (來(lái)自官能化β _內(nèi)酰胺單體的β _多肽和含有所述β _多肽的抗菌組合物)“。還參見(jiàn)美國(guó)已公布的專利申請(qǐng)2003/0212250，標(biāo)題為〃 P印tides(肽)"。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及一種制備有生物活性的、抵抗蛋白水解的非天然多肽的方法。所述方法包括選擇具有基本由α-氨基酸殘基組成的氨基酸序列的生物活性多肽或藥理活性多肽或其生物活性片段(“靶標(biāo)”)。然后，制備具有與靶標(biāo)α-氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽。然而在所述合成多肽中，靶標(biāo)中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基被β-氨基酸殘基置換。更優(yōu)選靶標(biāo)中存在的約20%-約50%的α-氨基酸殘基被β-氨基酸殘基置換。將氨基酸殘基置于所述合成多肽中，使得在整個(gè)所述合成多肽的氨基酸序列中氨基酸殘基和α-氨基酸殘基以重復(fù)模式分布。所得非天然多肽的長(zhǎng)度優(yōu)選為約10-約100個(gè)殘基、更優(yōu)選為約20-約50個(gè)殘基。優(yōu)選至少兩個(gè)殘基為β -氨基酸殘基ο在本發(fā)明的一個(gè)方案中，靶標(biāo)中的至少一個(gè)α-氨基酸殘基被至少一個(gè)β-氨基酸殘基置換，所述β-氨基酸殘基經(jīng)由包含其β2和β 3碳原子的環(huán)而環(huán)狀約束。在本發(fā)明的另一方案中，大部分或全部被插入的氨基酸殘基經(jīng)由包含其β2和β3碳原子的環(huán)而環(huán)狀約束。在本發(fā)明的另一方案中，至少一個(gè)氨基酸殘基在其β2和β3碳原子處不被取代。或者，所有的氨基酸殘基可在其β2和β 3碳原子處被取代(用直鏈、支鏈或環(huán)狀取代基取代)。在本發(fā)明的另一方案中，靶標(biāo)中存在的約14% -約50%的α-氨基酸殘基被 β -氨基酸殘基置換，其中各個(gè)β -氨基酸殘基具有至少一條與其所置換的α -氨基酸殘基相同的側(cè)鏈。因此在該方案中，所述方法包括選擇待模擬的靶標(biāo)，接著制備具有與所述靶標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽，但其中靶標(biāo)中存在的約20% -約50%的α -氨基酸殘基被類似的氨基酸殘基置換。在本發(fā)明的該方案中，各個(gè)類似的氨基酸殘基具有至少一條與其置換的α-氨基酸殘基相同的側(cè)鏈。此外，β-氨基酸殘基和α-氨基酸殘基在所述合成多肽的氨基酸序列中以重復(fù)模式分布。還包括在本發(fā)明中的是，包含如SEQ. ID. NO :4_11、16-22和25-30中所示的一級(jí)氨基酸序列的分離的非天然多肽。這些非天然多肽可用于抑制人免疫缺陷病毒與人細(xì)胞的融合的方法中。該方法包括將人細(xì)胞與包含如SEQ. ID. NO :4-11、16-22和25-30中所示的一級(jí)氨基酸序列的分離的非天然多肽接觸，從而使所述細(xì)胞抵抗HIV通過(guò)其細(xì)胞膜的進(jìn)入。本發(fā)明的另一個(gè)方案涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)與人細(xì)胞的融合的方法。所述方法包括首先選擇具有包含α -氨基酸殘基且對(duì)HIV體內(nèi)融合所必需的氨基酸序列的天然生物活性多肽或其生物活性片段。然后制備具有與所述生物活性多肽或其片段的序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽。在該合成多肽中，所述生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基被β-氨基酸殘基置換。再進(jìn)一步地，在所述合成多肽中氨基酸殘基和α-氨基酸殘基以重復(fù)模式分布。然后將人細(xì)胞與所述合成多肽接觸。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，通常優(yōu)選(盡管并不必需)所述重復(fù)模式使氨基酸殘基在采用螺旋構(gòu)象的非天然多肽中的螺旋一側(cè)排布。換言之，在多肽采用的折疊結(jié)構(gòu)中，當(dāng)所述非天然多肽采用螺旋構(gòu)象時(shí)，α-殘基和殘基的重復(fù)模式使氨基酸殘基沿折疊分子結(jié)構(gòu)的一側(cè)排布。氨基酸殘基和α-氨基酸殘基的重復(fù)模式可為長(zhǎng)度在 2-7 個(gè)殘基的模式,例如(ααααααβ)、(αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、 (ααβ)、(ααβαααβ)、(ααβαβαβ)禾口(αβ)。長(zhǎng)度在 2-7 個(gè)殘基的 α -氨基酸殘基和β-氨基酸殘基的所有獨(dú)特模式明確在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述方法可用于通過(guò)現(xiàn)已知或?qū)?lái)開發(fā)的多肽合成的任何方法來(lái)制備多肽化合物。使用肽合成的現(xiàn)有方法，依照本方法制備的多肽通常長(zhǎng)度小于約100個(gè)殘基、更優(yōu)選總約10個(gè)殘基-總約50個(gè)殘基、還更優(yōu)選總約20個(gè)殘基-約50個(gè)殘基。高于和低于這些所示范圍的范圍在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。很多商業(yè)服務(wù)公司，例如Abgent (San Diego, California, USA)提供了多至約100個(gè)殘基的肽合成服務(wù)。沿寡聚體的側(cè)鏈序列優(yōu)選基于具有針對(duì)疾病狀態(tài)的所需生物活性的原型α -肽 (靶標(biāo))。側(cè)鏈序列還可在翻譯至α / β -肽骨架上后經(jīng)修飾以使化合物的所需性質(zhì)最優(yōu)化。被引入非天然α/β-肽骨架的各個(gè)β-殘基可在兩個(gè)骨架碳之一(β3或β2)或這兩個(gè)骨架碳處攜帶側(cè)鏈。所述側(cè)鏈還可經(jīng)由連接所述兩個(gè)骨架碳的環(huán)而環(huán)狀約束。
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本發(fā)明中尤其值得注意的是將原型靶序列中的α -殘基用載有側(cè)鏈的β -殘基取代使得在不破壞沿寡聚體的側(cè)鏈序列的情況下修飾骨架。環(huán)狀殘基使骨架剛化并促成螺旋結(jié)構(gòu)。優(yōu)選殘基沿著全長(zhǎng)序列平均間隔以便使因骨架修飾賦予寡聚體的蛋白酶抗性最大化。有規(guī)律的重復(fù)骨架模式的實(shí)例包括但不限于(α α α α α α β), (αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、(ααβ)、(ααβαααβ)、 (ααβαβαβ)禾口(αβ)。終化合物的所需性質(zhì)包括調(diào)節(jié)在一般疾病狀態(tài)的發(fā)生或進(jìn)程中和特別是HIV進(jìn)入人細(xì)胞中涉及的蛋白-蛋白相互作用的能力，和相對(duì)于靶α-肽序列改善了的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和藥效性質(zhì)(例如更好的體內(nèi)半衰期、生物分布等)。很多終化合物在溶液中呈螺旋結(jié)構(gòu)，但并不必需是螺旋結(jié)構(gòu)。無(wú)論是否具體公開，本文所用的數(shù)字范圍旨在包含每個(gè)數(shù)字以及該范圍內(nèi)所含數(shù)字的子集。此外，這些數(shù)字范圍應(yīng)理解為針對(duì)涉及該范圍內(nèi)的任何數(shù)字或數(shù)字子集的權(quán)利要求提供支持。例如，公開1-10應(yīng)理解為支持2-8、3-7、5、6、1-9、3. 6-4. 6、3. 5-9. 9等范圍。除非另外指出或其中作出引用的上下文明確暗示相反，否則本發(fā)明對(duì)單數(shù)特征或限制的所有引用應(yīng)包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)個(gè)特征或限制，并且反之亦然。除非另外指出或其中進(jìn)行引用組合的上下文明確暗示相反，否則本文所用方法或過(guò)程步驟的所有組合可以任何順序進(jìn)行。本發(fā)明的方法、化合物和組合物可包含、由或基本由以下組成本文所述的本發(fā)明必需元素和限制，以及本文所述或另外可用于合成有機(jī)化學(xué)的任何另外的或任選的成分、 組分或限制。附圖簡(jiǎn)述圖IA描述了 α -肽1-3和α / β -肽4_11的序列。粗體殘基表示與其α -氨基酸對(duì)應(yīng)物對(duì)應(yīng)的β3_殘基粗體且?guī)聞澗€的殘基為環(huán)狀約束的β-氨基酸殘基ACPC (X) 和APC(Y)。圖IB描述了 α-氨基酸、相應(yīng)的β3_氨基酸類似物以及環(huán)狀β-殘基ACPC (X) 和APC (Z)的結(jié)構(gòu)。圖2Α描述了由三個(gè)NHR區(qū)段和兩個(gè)CHR區(qū)段組成的gp41_5蛋白。圖2B描述了熒光CHR肽，其用作競(jìng)爭(zhēng)性FP測(cè)定中的示蹤物(Flu = 5-羧基熒光素)。圖2C是Flu-CHR 肽和由gp41_5形成的5-螺旋束之間的相互作用的示意圖。圖 3A、3B、3C 和 3D 描述了 NHR 肽 1 與 CHR 類似物 3 (圖 3A)、4(圖 3B)、5(圖 3C) 和9(圖3D)之間形成的復(fù)合體的圓二色性(CD)譜。實(shí)線為在25°C下于PBS中對(duì)總濃度為 20 μ M的所示寡聚體的1 1混合物觀察到的光譜。虛線為根據(jù)單獨(dú)組分的⑶對(duì)1 1非相互作用的混合物計(jì)算的光譜。圖4Α和4Β是在α -肽1和3之間的新表征復(fù)合體(圖4Α)和α -肽1和2之間的先前表征復(fù)合體(圖 4Β) (Chan、Fass、Berger 和 Kim，Cell 1997，89，263-273)的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的6-螺旋束的比較。兩種結(jié)構(gòu)之間Ca原子的RMSD為0.7人。圖4C描述了 1+3 復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。圖4D描述了解析至2.8 A分辨率的1+10復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。圖4E 描述了解析至2.8 A分辨率的1+8復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。圖4F和4G描述了 1+3形成的所有 a -肽螺旋束與1+10(圖4F)和1+8(圖4G)形成的所有a -肽螺旋束的疊加。
圖5A、5B和5C描述了圓二色性(CD)譜。圖5A描述了在25°C下于PBS中，在20 μ M 濃度時(shí)，NHR肽1與CHR肽3、4、5、8和10的疊加⑶數(shù)據(jù)。圖5Β描述了在25°C下于PBS中總濃度為20 μ M的所示1 1混合物的CD譜(實(shí)線)，以及根據(jù)對(duì)單獨(dú)組分的CD測(cè)量對(duì) 1 1非相互作用混合物計(jì)算的光譜(虛線)。圖5C描述了在PBS中，在濃度為20 μ M時(shí)， 所示復(fù)合體在222nm處的溫度依賴性摩爾橢圓率。圖6的圖描述了在PBS中，以20 μ M總肽的1+3、1+4、1+5和1+9的1 1混合物在222nm處的溫度依賴性摩爾橢圓率。圖7A描述了 Puma BH3肽(1)和α / β -肽類似物2-8的一級(jí)序列(灰色的環(huán)和粗體字母表示β 3殘基)。圖7Β描述了 1的螺旋輪圖。圖7Α和圖7Β的加框殘基表示基于序列同源性對(duì)結(jié)合最重要的疏水位置。圖7C呈現(xiàn)了以與如圖7Β中相同方向畫出的1-8 的示意圖；白環(huán)和灰環(huán)表示分別由α-殘基和β3-殘基占據(jù)的7個(gè)位置。圖7D表示一般 α-氨基酸和一般β 3_氨基酸的結(jié)構(gòu)；“R”取代基常規(guī)被稱為“側(cè)鏈”。圖8是描述結(jié)合于Bel-、或Mcl-I的熒光標(biāo)記Bak ΒΗ3肽被化合物1_8置換的抑制常數(shù)的柱狀圖。打斷的條表示比測(cè)定中可識(shí)別的更緊密結(jié)合的化合物。對(duì)于兩種蛋白而言8的值弱于100 μ Μ。圖9Α、9Β和9C分別描述了 3、4和10的蛋白水解穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)在圖9D中示出。 將含20 μ M肽的TBS溶液在室溫下與10 μ g/mL的蛋白酶K溫育。圖9A、9B和9C描述了時(shí)間依賴性降解數(shù)據(jù)和由擬合至簡(jiǎn)單指數(shù)式衰減所得的曲線。圖9D描述了化合物3、4和10 的結(jié)構(gòu)并且還描述了在所示時(shí)間點(diǎn)通過(guò)質(zhì)譜觀察到的蛋白水解產(chǎn)物。垂直線表示與所示殘基之間的骨架酰胺鍵的水解一致的一種或兩種產(chǎn)物通過(guò)MALDI-MS的觀察結(jié)果。

圖10A、10BU0C和IOD的圖描述了所示病毒株對(duì)TZM_bl細(xì)胞的感染的抑制情況， 作為gp41衍生的融合阻斷肽的濃度的函數(shù)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士S. E. M0 圖IOA描述了 NL4-3感染的抑制情況。圖IOB描述了 CC1/85感染的抑制情況。圖IOC描述了 HC4感染的抑制情況。圖IOD描述了 DJ258感染的抑制情況。發(fā)明詳述以下縮寫用于整個(gè)說(shuō)明書中Ac2O =醋酸酐、氧化乙酰、乙酰乙酸酯。ACPC =反式-2-氨基環(huán)戊烷甲酸。APC =反式-3-氨基吡咯烷-4-甲酸。Boc =叔丁氧羰基。BOP =六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷鏘。β-Gal = β半乳糖苷酶。CD=圓二色性。CHR = C端七殘基重復(fù)序列。DIEA = N, N- 二異丙基乙胺。DMF= 二甲基甲酰胺。DMSO = 二甲基亞砜。EDTA=乙二胺四乙酸。FKBP = FK506 結(jié)合蛋白。
Fmoc = 9-芴甲基甲?；?。FP =熒光偏振。Halogen = F、Cl、Br 禾口 I。HBTU = 2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲銨六氟-磷酸鹽。HIV =人免疫缺陷病毒。HOBT = N-羥基苯并三唑。HPLC =高效液相色譜。iPr2EtN = N, N- 二異丙基乙胺。IPTG =異丙基β -D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷。MALDI-T0F-MS =基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜。MeOH =甲醇。NHR = N端七殘基重復(fù)序列。NMP = 1-甲基-2-吡咯烷酮。PTHlR和PTH2R =甲狀旁腺激素受體1和甲狀旁腺激素受體2。RMSD =均方根差。RTK =受體酪氨酸激酶。TNF=腫瘤壞死因子。PBS =磷酸鹽緩沖鹽水。TBS = tris-緩沖鹽水。Tris =三(羥甲基)氨基甲烷。TFA =三氟乙酸。TNBS = 2,4,6-三硝基苯-磺酸。在本描述中，除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)例如“本發(fā)明的化合物”包括鹽形式和游離堿形式的化合物并且還包括在化合物與固相連接時(shí)。當(dāng)存在堿性取代基例如胺取代基時(shí)， 鹽形式可為酸加成鹽，例如二鹽酸鹽。鹽包括但不限于得自無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的那些，明確地包括氫商化物例如鹽酸鹽和氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、氨基磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、亞甲基雙_b-羥基萘甲酸鹽、龍膽酸鹽、羥乙基磺酸鹽、二對(duì)甲苯?；剖猁}、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、環(huán)己基磺酸鹽、奎尼酸鹽等。堿加成鹽包括來(lái)自堿金屬堿或堿土金屬堿或常規(guī)有機(jī)堿的那些，例如三乙胺、吡啶、哌啶、嗎啉、N甲基嗎啉等。 其它的適合鹽參見(jiàn)例如 Handbook of Pharmaceutical Salts，P. H. Mahl 和 C. G. Wermuch 編輯， 2002，Verlag Helvitica Chemica Acta (Zurich, Switzerland)禾口 S. Μ· Berge 等，“Pharmaceutical Salts, “ J. Pharm. Sci.，66 :第 1-19 頁(yè)(1977 年 1 月)，其兩者通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明肽的β-氨基酸殘基為特征性β-氨基正丙酸衍生物，通常在骨架中2位的碳原子(β2碳)和/或3位的碳原子(β3碳)被進(jìn)一步取代，并可在例如N端的氨基氮原子進(jìn)一步被取代。β2、β 3和氨基取代基可包括含1-43個(gè)碳原子、任選含有羰基(即-C(O)-)基團(tuán)和任選進(jìn)一步被多至6個(gè)選自以下的取代基取代的取代基鹵素、 NO2、-OH、C1^4 烷基、-SH、-SO3、-NH2、C1^4-?；1^4-酰氧基、C1^4-烷基氨基、C1^4- 二烷基氨
9基、三鹵代甲基、-CN、C1^4-烷硫基、CV4-烷基亞硫?；駽V4-烷基磺酰基；所述1-43個(gè)碳原子任選被多至4個(gè)雜原子(選自0、N或S)打斷。β-氨基酸殘基的β2和/或β 3碳原子上的取代基可選自天然α-氨基酸的 α -碳原子上存在的取代基，例如-H、-CH3, -CH (CH3) 2、-CH2-CH (CH3) 2、-CH (CH3) CH2CH3^-CH2-苯基、CH2-pOH-苯基、-CH2-吲哚、-CH2-SH、-CH2-CH2-S-CH3、-CH20H、-CH0H-CH3、 -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-CH2-NH-C (NH) NH2、-CH2-咪唑、-CH-C00H、-CH2_CH2-C00H、-CH 2-C0NH2、-CH2-CH2-CONH2,或與鄰接的NH基團(tuán)一起限定吡咯烷環(huán)的取代基，如蛋白質(zhì)生成的 α -氨基酸脯氨酸中所存在的。本發(fā)明中已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物具有所需性質(zhì)。例如，具有約7個(gè)或更多個(gè)殘基 (其中三個(gè)以上是環(huán)狀約束的)的本文所述化合物，能夠在溶液中形成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)。此外本文描述的化合物比其相應(yīng)的α-肽對(duì)肽酶例如胃蛋白酶的作用具有大得多的穩(wěn)定性。 因此，預(yù)期本文所述的化合物表現(xiàn)出比相應(yīng)的α-肽相對(duì)更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，例如血清半衰期。本發(fā)明包括純異構(gòu)體形式的本發(fā)明化合物(例如由至少90%、優(yōu)選至少95%的單一異構(gòu)形式組成)，以及這些形式的混合物。本發(fā)明的化合物還可呈單獨(dú)對(duì)映體形式或可呈外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體混合物或可能異構(gòu)體的任何其它混合物的形式。本發(fā)明的化合物可通過(guò)本文所述的合成化學(xué)方法以及與可用于制備α-氨基酸肽的那些方法相似的其它方法來(lái)制備。這樣的方法包括液相方法和固相方法兩者，例如利用Boc和Fmoc方法學(xué)兩者的方法。因此本文所述化合物可通過(guò)連續(xù)的酰胺鍵形成方法來(lái)制備，其中酰胺鍵在第一 β-氨基酸殘基或其前體的β-氨基與第二 β-氨基酸殘基或α-氨基酸殘基或其前體的α-羧基之間形成。酰胺鍵形成步驟可反復(fù)多次，并用對(duì)得到所需α/ β-多肽所需的特定α-氨基酸殘基和/或β-氨基酸殘基和/或其前體。此外包含兩個(gè)、 三個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基(α或β)的肽可連接在一起以產(chǎn)生更大的α肽。環(huán)狀化合物可通過(guò)在之前合成的線性多肽的N末端和C末端之間形成肽鍵來(lái)制備。β 3_氨基酸可從相應(yīng)的α -氨基酸對(duì)映選擇性地制備；例如，通過(guò)N保護(hù)的α -氨基酸的Arndt-Eisert同系化。適宜地這樣的同系化可后接用β _氨基酸殘基對(duì)Wolff重排的活性重氮酮中間體的偶聯(lián)。本文所述方法可用于建立離散化合物的集合或化合物文庫(kù)，用于針對(duì)具有所需活性、特別是表現(xiàn)特定藥物用途的生物活性的化合物進(jìn)行篩選。因此本發(fā)明還包括含有多種本文所述化合物的離散化合物集合(典型地包含 2-約1000種化合物)和化合物文庫(kù)(典型地包含20-100種化合物直至數(shù)千種化合物，例如100，000種化合物或更多)。具有所需生物活性的化合物可利用以下所述的合適篩選測(cè)定法來(lái)鑒定。HIV蛋白gp41是涉及包膜病毒與哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合的一類蛋白的典型實(shí)例。在病毒-細(xì)胞融合期間，gp41的N端插入宿主細(xì)胞膜內(nèi)，并且三聚體蛋白經(jīng)歷了急劇的結(jié)構(gòu)重排，涉及形成由三拷貝的N端七殘基重復(fù)序列(NHR)結(jié)構(gòu)域和三拷貝的C端七殘基重復(fù)序列(CHR)結(jié)構(gòu)域組成的六-螺旋束。gp41六-螺旋束的形成是病毒-細(xì)胞融合的必需步驟，因而是用合理設(shè)計(jì)的抗病毒劑靶向中斷的具有吸引力的過(guò)程。為了證明本發(fā)明的效用和功能性，制備了與gp41類似但由α-殘基和殘基的混合物組成的非天然多肽(α/CN 102245625 A
說(shuō)明書
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β -肽)，并表明其充當(dāng)HIV-細(xì)胞融合的抑制劑。很多基于gp41 NHR或CHR序列的α -肽，例如化合物1和化合物2 (分別為SEQ. 10.而1和2，參見(jiàn)圖1幻已被研究作為融合抑制劑。最突出的實(shí)例為36個(gè)殘基的α-肽藥物恩夫韋肽(由Hoffmarm-La Roche, Inc.以注冊(cè)商標(biāo)"FUZEON“出售)，其源自CHR結(jié)構(gòu)域。幾個(gè)小組已試圖用短的α-螺旋模擬物抑制gp41六-螺旋束的形成，所述模擬物包括小分子、環(huán)狀肽、三聯(lián)苯類和肽，其旨在以α-螺旋樣方式展示三個(gè)關(guān)鍵的CHR疏水側(cè)鏈；然而，這些分子在基于細(xì)胞的測(cè)定中僅表現(xiàn)出適度的抗HIV活性(IC5Q> ΙμΜ對(duì)比恩夫韋肽為約InM)。用相對(duì)短的α-肽發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，該α-肽已針對(duì)α-螺旋性通過(guò)內(nèi)部交聯(lián)化學(xué)預(yù)處理。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，模擬原型α -肽序列的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能性質(zhì)的系統(tǒng)開發(fā)的 α/β-肽折疊體(foldamer，產(chǎn)生對(duì)蛋白水解降解比類似的α -多肽更穩(wěn)定的生物活性非天然多肽。在本文被稱作“基于序列的設(shè)計(jì)”的方法一般涉及在整個(gè)靶序列中將α-殘基用氨基酸殘基系統(tǒng)地取代，并優(yōu)選用載有所置換的α-殘基的側(cè)鏈的β 3_氨基殘基取代。參見(jiàn)圖1Β。α — β修飾改變了肽骨架化學(xué)組成但保留了母體α-肽的側(cè)鏈序列?；谛蛄械脑O(shè)計(jì)的系統(tǒng)使用得到了以下α/β-肽，其表現(xiàn)出復(fù)合體行為例如蛋白樣四元組裝物(quaternary assembly)的形成和涉及凋亡的蛋白螺旋的模擬。將gp41介導(dǎo)的HIV 細(xì)胞融合選作模型系統(tǒng)以證明基于序列的骨架修飾的效用和功能性，因?yàn)樵摪袠?biāo)具有極大的生物醫(yī)學(xué)重要性。簡(jiǎn)而言之，使用可重復(fù)用于其它治療上重要靶標(biāo)的合理且系統(tǒng)的方法設(shè)計(jì)的、抑制gp41介導(dǎo)的HIV細(xì)胞融合的藥理活性劑是非常有用的。該方法提供了以合理的直接模式在更短時(shí)間內(nèi)、用更少試驗(yàn)和誤差的情況下設(shè)計(jì)藥理活性劑的途徑。基于天然gp41的CHR序列的α -肽，例如化合物2已被廣泛研究，并且?guī)讉€(gè)小組已公布了通過(guò)合理的誘變提高CHR α-肽的結(jié)合親和力和生物穩(wěn)定性的成果。為了證明本發(fā)明的效用和功能性，將近來(lái)報(bào)導(dǎo)的gp41 CHR類似物α -肽3(SEQ. ID. NO :3，參見(jiàn)圖1A)選擇作為α — β修飾的起點(diǎn)。α-肽3包含許多預(yù)期通過(guò)工程改造的螺旋內(nèi)鹽橋和Xxx —Ala 取代來(lái)提高螺旋傾向性的側(cè)鏈突變。在之前的研究中，3顯示出相對(duì)于基于野生型CHR序列的肽在細(xì)胞培養(yǎng)中提高的抗病毒功效和增大的半衰期。盡管3中的突變并不預(yù)想改變其與gp41 NHR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合相互作用的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，但尋找到另外的實(shí)驗(yàn)證據(jù)六螺旋束結(jié)構(gòu)未改變。α -肽1和α -肽3的共晶體通過(guò)懸滴蒸汽擴(kuò)散得到，將結(jié)構(gòu)解析至2.0 A分辨率 (參見(jiàn)表1和圖4Α)。所得六螺旋束與天然NHR+CHR肽復(fù)合體形成的基本相同。將圖4Α(1+3 共晶體)和圖4Β(1+2共晶體)進(jìn)行比較。表1 晶體數(shù)據(jù)收集和精修統(tǒng)計(jì)*
權(quán)利要求
1.一種制備有生物活性的非天然多肽的方法，所述方法包括(a)選擇具有含α-氨基酸殘基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段；和(b)制備具有與步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約 14%-約50%的α-氨基酸殘基被β-氨基酸殘基置換；( )在所述合成多肽中，氨基酸殘基和α-氨基酸殘基以重復(fù)模式分布；和 (iii)所述合成多肽具有約10個(gè)殘基-約100個(gè)殘基的長(zhǎng)度并且包含至少兩個(gè)β-氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)(i)包括用至少一個(gè)氨基酸殘基置換所述 α-氨基酸殘基中的至少一個(gè)，所述β-氨基酸殘基經(jīng)由包含其β2和β3碳原子的環(huán)而環(huán)狀約束。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)(i)包括將步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基用β-氨基酸殘基置換，所述β-氨基酸殘基經(jīng)由包含其β2和β 3碳原子的環(huán)而環(huán)狀約束。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)(i)包括用氨基酸殘基置換步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基，其中所述β-氨基酸殘基中的至少一個(gè)在其β2和β 3碳原子處不被取代。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)(i)包括將步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基用β-氨基酸殘基置換，其中所有的所述 β-氨基酸殘基在其β 2和β 3碳原子處被取代。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)(i)包括將步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14%-約50%的α-氨基酸殘基用β-氨基酸殘基置換，其中各個(gè)β-氨基酸殘基具有至少一條與其所置換的α-氨基酸殘基相同的側(cè)鏈。
7.一種制備有生物活性的、抵抗蛋白水解的非天然多肽的方法，所述方法包括(a)選擇具有含α-氨基酸殘基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段；和(b)制備具有與步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段的序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約 14% -約50%的α -氨基酸殘基被相似的β -氨基酸殘基置換；( )相似的氨基酸殘基各自具有至少一條與其所置換的α-氨基酸殘基相同的側(cè)鏈；(iii)在所述合成多肽中，氨基酸殘基和α-氨基酸殘基以重復(fù)的模式分布；并且(iv)所述合成多肽具有約10個(gè)殘基-約100個(gè)殘基的長(zhǎng)度并且包含至少兩個(gè)β-氨基酸殘基。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的制備有生物活性的非天然多肽的方法，其中在所述多肽所采用的折疊結(jié)構(gòu)中，當(dāng)所述非天然多肽采用螺旋構(gòu)象時(shí)，所述重復(fù)模式使氨基酸殘基沿著折疊分子結(jié)構(gòu)的一側(cè)排布。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的制備有生物活性的非天然多肽的方法，其中β-氨基酸殘基和α-氨基酸殘基的重復(fù)模式選自(ααααααβ)、(αααααβ)、(ααααβ)、(αααβ)、(ααβ)、(ααβαααβ)、(ααβαβαβ)禾口(αβ)0
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的制備有生物活性的非天然多肽的方法，其中步驟(b)包括制備具有約20個(gè)殘基-約50個(gè)殘基的合成多肽。
11.一種分離的非天然多肽，所述多肽包含SEQ. ID. NO 4-11和25-30中所示的一級(jí)氨基酸序列。
12.—種抑制人免疫缺陷病毒與人細(xì)胞融合的方法，所述方法包括將人細(xì)胞與含SEQ. ID. NO 4-11和25-30中所示的一級(jí)氨基酸序列的分離非天然多肽接觸。
13.—種抑制人免疫缺陷病毒(HIV)與人細(xì)胞融合的方法，所述方法包括(a)選擇天然的有生物活性的多肽或其生物活性片段，其具有含α-氨基酸殘基并且對(duì)HIV體內(nèi)融合所必需的氨基酸序列；(b)制備具有與步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段的序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的合成多肽，其中(i)在所述合成多肽中，步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約 14%-約50%的α-氨基酸殘基被β-氨基酸殘基置換；( )在所述合成多肽中，氨基酸殘基和α-氨基酸殘基以重復(fù)模式分布；和 (iii)所述合成多肽具有約10個(gè)殘基-約100個(gè)殘基的長(zhǎng)度，并且包含至少兩個(gè)β -氨基酸殘基；然后(c)將人細(xì)胞與步驟(b)的合成多肽接觸。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種制備有生物活性的非天然多肽的方法。所述方法包括以下步驟選擇具有包含α-氨基酸殘基的氨基酸序列的生物活性多肽或其生物活性片段，和制備具有以下氨基酸序列的合成多肽，所述氨基酸序列與所述生物活性多肽的序列對(duì)應(yīng)，但其中將步驟(a)的生物活性多肽或生物活性片段中存在的約14％-約50％的α-氨基酸殘基用β-氨基酸殘基置換，并且所述α-氨基酸殘基以重復(fù)模式分布。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102245625SQ200980151598
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者L·M·約翰遜, S·H·格爾曼, W·S·霍恩 申請(qǐng)人:威斯康星舊生研究基金會(huì)