專利名稱：抗癌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有輕微副作用且在腫瘤內(nèi)良好積聚，因而有非常強的抗癌效應(yīng)的抗癌劑，以及其制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及含有與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物作為活性成分的抗癌劑。本發(fā)明還涉及這類抗癌劑的高效制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明的發(fā)明者研究了有關(guān)癌癥生長或其抑制過程與血紅素加氧酶活性之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)該種血紅素加氧酶可在腫瘤組織內(nèi)高度表達。血紅素加氧酶可在腫瘤或正常組織中降解血紅素并產(chǎn)生膽綠素(bilverdin)、一氧化碳和游離態(tài)鐵。
膽綠素在細胞內(nèi)很容易轉(zhuǎn)化為膽紅素，這種膽紅素是十分強力的抗氧化物。從而，膽紅素能夠在宿主(癌癥患者)體內(nèi)起著抵抗白血細胞產(chǎn)生的各種活性氧(如超氧化物、H2O2或一氧化氮等)的防衛(wèi)物質(zhì)的作用。也就是說，這樣產(chǎn)生的膽紅素，可抵消能夠在宿主體內(nèi)抵抗癌癥細胞或感染的微生物的毒性氧化防衛(wèi)能力。因而，一旦阻遏了血紅素加氧酶，就不再有膽紅素產(chǎn)生，腫瘤細胞也就會被白血細胞固有的防衛(wèi)能力所產(chǎn)生的各種氧化物質(zhì)所殺死。
本發(fā)明的發(fā)明者曾探索了鋅原卟啉(ZnPP)這種血紅素加氧酶抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)。他們將該抑制劑質(zhì)注入患腫瘤大鼠的腫瘤供血動脈，使之定向選擇性傳輸入腫瘤部位，從而確證了其在大鼠中的抗腫瘤作用(K.Doi等Br.J.Cancer 80，1945-54，1999)。
不過，使用ZnPP作為抗腫瘤藥物在其性質(zhì)上還存在一些問題。首先，它本身幾乎不容于水，因而我們采用油性配方來溶解ZnPP，以至這種油性方劑只能選定腫瘤供血動脈施行注射，如此操作，與通常的靜脈內(nèi)或皮下注射相比較，要求具備相當熟練精細的技巧。其次，對于原生的或原始的ZnPP，無法保證其(ZnPP)在癌癥組織內(nèi)具有選擇性積聚作用，并產(chǎn)生腫瘤選擇性抗癌效應(yīng)，該藥物會在除了腫瘤之外的全身廣泛分布。因而，就要關(guān)注其各種意外的副作用。
相反，本發(fā)明的發(fā)明者都是在實體腫瘤的血管滲透性方面具有專門研究的腫瘤生物學(xué)專家，對于大分子治療藥劑對腫瘤組織(由于其獨有的解剖學(xué)特性以及多種血管滲透性因素的作用，而)具有較大的選擇性滲透作用方面，具備豐富的知識而且，還了解可在各種腫瘤組織內(nèi)長期長期滯留的各種大分子物質(zhì)。因而，這種現(xiàn)象被定名為“增強的滲透性和滯留(EPR)效應(yīng)”(Y.Matsumura，H.MaedaCancer Res476387-92，1986；H.Maeda《酶調(diào)節(jié)作用進展》(Advances in Enzyme Regulation)(G.Weber編)，Elsevier科學(xué)有限公司，阿姆斯特丹，41，189-207，2001)。
根據(jù)EPR效應(yīng)的觀點，凡是其分子量大于40,000的各種藥物，都可在血漿中長時間保持高濃度存在，可在靜脈注射后滯留數(shù)小時甚至數(shù)天之久；而在腫瘤內(nèi)的濃度更可在24-48小時內(nèi)提高數(shù)倍之多。這意味著，如果藥物的分子量更大于40,000，這類大分子藥物就有可能對腫瘤部位進行定向選擇。
同時，還對對于血紅素加氧酶具有抑制作用的金屬卟啉衍生物及其改良的施用方法，一起配套進行了研究。其研究結(jié)果是，將兩性或水溶性聚合物與金屬卟啉相結(jié)合，就可能使之形成水溶性金屬卟啉衍生物，從而具有多能性并便于臨床使用，不必進行動脈內(nèi)施用，而且可施行靜脈注射。其通過聚合過程所呈現(xiàn)的EPR-效應(yīng)，可產(chǎn)生在腫瘤內(nèi)高度有效的積聚作用，以及長期保持對血紅素加氧酶的酶抑制活性。據(jù)在小鼠中的實驗結(jié)果表明，只要注射2-3次，就可能完全抑制腫瘤的生長，這是一個顯著的結(jié)果。
有關(guān)對于血紅素加氧酶具有抑制活性的金屬卟啉衍生物與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的問題，在過去尚未見過報道，此前更未曾見到關(guān)于其制備方法的介紹。本發(fā)明的發(fā)明者研究制定了一種通過酰胺鍵將兩性或水溶性聚合物與金屬卟啉相結(jié)合的合成方法。由此種方法制成的與聚合物相結(jié)合的金屬卟啉衍生物，都是過去未曾報道過的新的化合物系列。
發(fā)明概述本發(fā)明是以對血紅素加氧酶具有抑制活性的金屬卟啉衍生物作為活性成分的抗癌劑，尤其是與水溶性和脂溶性兩性聚合物或水溶性聚合物結(jié)合的鋅-原卟啉(ZnPP)。
本發(fā)明還涉及用兩性或水溶性聚合物通過酰胺鍵與不同的血紅素抑制性金屬卟啉衍生物相結(jié)合，可用作抗癌劑配料的一類新穎有效化合物系列，以及這類化合物的制備方法。
附圖簡述

圖1所示是與乙二胺偶合的原卟啉以及與聚乙二醇(PEG)結(jié)合的原卟啉的凝膠過濾層析圖象。
圖2所示是血紅素加氧酶PEG-ZnPP抑制作用的Lineweaver-Burk曲線圖。
圖3所示是流式細胞儀分析數(shù)據(jù)，其中，培養(yǎng)的癌細胞經(jīng)聚乙二醇-鋅原卟啉處置后呈現(xiàn)更強的氧化物曝光特性。
圖4所示是PEG-ZnPP在患有實體瘤的小鼠模型中的抗腫瘤效應(yīng)。
圖5所示是經(jīng)靜脈內(nèi)施用PEG-ZnPP時或施用后體重的變化情況。
實施本發(fā)明的最佳實施方案被結(jié)合的兩性或水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、各種明膠、以及上述各種物質(zhì)的衍生物，例如，琥珀?；苌?、聚氨基酸衍生物(如聚合型的天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸等)，羥丙基和其他烷基丙烯酸酯聚合物、苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)和它們的衍生物。在這些具有兩性和水溶性特征的聚合物中，更加優(yōu)選的是PEG和SMA。優(yōu)先采用的聚乙二醇的分子量為2000-5000。
SMA是苯乙烯與馬來酸的可變順序的共聚物，其中馬來酸的羧基可供直接或間接與金屬卟啉相結(jié)合。SMA共聚物本身或其衍生物中的馬來酸可部分酯化。
金屬卟啉衍生物是一種復(fù)雜的化合物，其中的金屬以穩(wěn)定的配位作用與卟啉環(huán)螯合，優(yōu)選采用原卟啉是因為其在各類卟啉化合物中容易取得。
在可供協(xié)調(diào)的金屬成分中，對于血紅素加氧酶并無抑制作用的鐵，具有毒性的汞，以及不能形成協(xié)調(diào)性螯合作用的各種單價金屬，都不可采用。除上述之外的其他金屬，例如，鋅、錫、鈷和銅等都可以使用，其中優(yōu)選采用的是錫和鋅復(fù)合物。不過，已知錫也具有毒性。因而，最理想的就是ZnPP，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖(B)所示。

本發(fā)明的抗癌劑是將金屬卟啉與兩性或水溶性聚合物結(jié)合而獲得的任何大分子化合物。然而，據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，由于金屬卟啉是非水溶性的，因而這類聚合物很難與金屬卟啉進行直接結(jié)合。為了實現(xiàn)這類化學(xué)結(jié)合過程，最好在金屬配位之前使聚合物與卟啉結(jié)合，然后將金屬配合。
直接地以及引入合適的功能性間隔物基團都可容易地使卟啉與聚合物相結(jié)合。
例如，在對ZnPP進行合成時，可將聚合物與原卟啉中的兩個羧基團直接相結(jié)合，但是這種直接結(jié)合方法并不合適，因為所述的各羧基團在這種反應(yīng)過程的活性很差。本發(fā)明的研究人員已經(jīng)探索出了對于PEG與ZnPP相結(jié)合的幾種有效的合成方法，并且已經(jīng)成功地通過酰胺鍵使ZnPP與PEG相結(jié)合的合成過程(式(A))。
(上式中的R是指兩性或水溶性聚合物，Me是金屬)聚合物結(jié)合的ZnPP(B)可按如下連續(xù)反應(yīng)程序進行合成(1)在原卟啉IX中引入一個氨基；(2)使之與聚合物相結(jié)合；最后(3)將鋅成分配位進卟啉環(huán)內(nèi)。
例如，PEG與ZnPP相結(jié)合的反應(yīng)步驟圖解程序如下[反應(yīng)(a)]用溶于四氫呋喃的氯甲酸乙酯(化合物(2))活化原卟啉IX(化合物(1))；[反應(yīng)(b)]添加乙二胺就可獲得帶有二氨基的原卟啉(化合物(3))；[反應(yīng)(c)]添加活化的PEG(化合物(4))將PEG引入原卟啉環(huán)；[反應(yīng)(d)]最后，在反應(yīng)(c)的產(chǎn)物中添加乙酸鋅而獲得PEG-ZnPP(化合物(5))。
如果添加乙酸錫，就可以錫替代鋅，而獲得聚乙二醇-錫原卟啉(PEG-SnPP)。
在兩性或水溶性聚合物中，除了PEG之外，例如將化合物(3)和SMA進行類似的縮合也可使SMA與原卟啉相結(jié)合。
在式(A)所示的與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬原卟啉可選擇性地在實體瘤中積聚，并表現(xiàn)良好的抗腫瘤活性作用。因而這是一類新穎有效的抗腫瘤物質(zhì)?？勺鳛榛衔?A)的一個范例的化合物(5)(其中的金屬成分是鋅，R則是聚乙二醇)，是按照(a)至(d)所示的程序進行合成的。該反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過下列分析步驟進行了驗證。
首先，對于導(dǎo)入原卟啉(化合物(3))的乙二胺的氨基的證據(jù)，是通過如下程序驗證的(1)在1641厘米-1、1552厘米-1的紅外吸收光譜顯示了該化合物中有一個新形成的酰胺鍵(化合物3的結(jié)構(gòu))；(2)以質(zhì)譜儀分析法(MS)檢測該化合物的分子量是646，與根據(jù)化合物3的分子式計算的數(shù)值相同；然后，將PEG(分子量約為5000)與氨基偶合，并引入原卟啉(化合物3)，再與鋅螯合。由此獲得的ZnPP的結(jié)構(gòu)在分子量和吸收光譜(UV/Vis)方面都相同。
據(jù)采用TOF/MS(射程時間-質(zhì)譜儀分析法)進行分子量檢測，顯示其質(zhì)量接近11,000道爾頓。據(jù)紫外線吸收光譜顯示其最大峰值為425、543和583，說明式(5)是PEG-ZnPP。
利用原卟啉IX作為起始原料通過反應(yīng)步驟(a)-(d)進行PEG-ZnPP合成的操作程序，是一種新的加工方法。由此獲得的與金屬卟啉相結(jié)合的一種聚合物容易在水中溶解，可作為經(jīng)靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射用的注射溶液。
有關(guān)PEG-ZnPP的制備程序、PEG-ZnPP對于血紅素加氧酶的抑制活性、以及本發(fā)明的靜脈注射方法施用PEG-ZnPP的抗癌效果等問題，都將在以下各項實例中詳細論述。不過，要注意的是，本發(fā)明并不限于這些實施例。
聚乙二醇結(jié)合的鋅原卟啉(PEG-ZnPP)的合成將100毫克原卟啉IX溶于20毫升四氫呋喃，再在該溶液內(nèi)加入2.45毫升三乙基胺。將溶液保存在0℃冰浴中，然后對溶液邊攪拌邊逐滴加入1.7毫升氯甲酸乙酯，令其持續(xù)反應(yīng)2小時。隨后進行過濾，除去其中形成的三乙基胺的鹽酸鹽，并加入1.2毫升乙二胺，再置于室溫下24小時令其持續(xù)反應(yīng)。然后將該反應(yīng)混合液進行真空蒸發(fā)處理，以除去四氫呋喃，再用50毫升蒸餾水將所得固體物質(zhì)清洗7次，可得到60毫克卟啉衍生物，其中每個分子含有2個氨基(反應(yīng)a和b)。
將5毫克化合物(3)溶于25毫升氯仿，再在溶液中加入800mg聚乙二醇的琥珀酰亞胺酯(Shearwater；PEG，分子量5000)，室溫下放置持續(xù)攪拌令其反應(yīng)24小時[反應(yīng)c]。
將由此獲得的PEG-結(jié)合的原卟啉在Sephadex LH60上以氯仿作為洗脫劑，進行凝膠過濾層析處理。經(jīng)凝膠過濾層析法處理的結(jié)果表明，在制備所得的PEG-結(jié)合的原卟啉中，完全不含有未經(jīng)反應(yīng)的胺化的化合物(3)。而是顯示了所有經(jīng)胺化的原卟啉都與聚乙二醇發(fā)生反應(yīng)而形成聚合型原卟啉。未修飾的原卟啉(如果有的話)將在20號組分中洗出，其洗脫體積與胺化的原卟啉相仿。
取40毫克乙酸鋅加入PEG-PP溶液，室溫下放置2小時，就可產(chǎn)生聚乙二醇結(jié)合型原卟啉(PEG-Zn-PP)(反應(yīng)d)。
PEG-ZnPP對于血紅素加氧酶的抑制活性在這方面采用取自大鼠脾臟的血紅素加氧酶提純物進行檢測。方法是，在37℃下，在含有氯高鐵血紅素、血紅素加氧酶底物、輔因子(NADPH，煙堿腺嘌呤二核苷酸)、以及含有膽紅素還原酶的細胞溶質(zhì)組分((其中由氧化酶形成的膽綠素被轉(zhuǎn)化為膽紅素)的條件下進行檢驗。
以氯仿萃取法提取膽紅素，并在465納米波長下測定其吸光值進行定量。在添加PEG-ZnPP或未修飾的ZnPP，或沒有抑制劑的情況下，檢測其對于血紅素加氧酶的作用。繪制在PEG-ZnPP產(chǎn)生抑制作用時血紅素加氧酶活性的Lineweaver-Burk曲線圖。其結(jié)果如圖2所示，表明PEG-ZnPP對于血紅素加氧酶的抑制作用具有劑量依賴性方式，其抑制常數(shù)(Ki)是0.13μM。這種抑制作用方式具有競爭性，其數(shù)值與未修飾的ZnPP相等。(Ki＝0.12μM)[試驗性實施例2]PEG-ZnPP對培養(yǎng)的腫瘤細胞的作用在塑料培皿中接種A549肺腺癌細胞系細胞，培育過夜，在各培皿中添加溶于蒸餾水中的5μM和10μM PEG-ZnPP。然后，在37℃下培育8小時之后，在該細胞培養(yǎng)物中添加一種定量氧化抑制試劑二氯二氫熒光素二乙酰酯(DCDHF)，再培育30分鐘。在氧化作用壓力條件下，該DCDHF試劑就會發(fā)生氧化過程，并且在氧壓作用條件下，會在細胞內(nèi)形成熒光素而發(fā)生熒光現(xiàn)象。
對于這種熒光強度進行定量，就可反映出在細胞內(nèi)氧化作用壓力的程度。然后，對培養(yǎng)的細胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，回收細胞進行流式細胞儀方法分析，并對產(chǎn)生熒光的細胞群定量。其結(jié)果顯示如圖3，其中表明，在5μM和10μM劑量時PEG-ZnPP的作用，與無藥物時的情況相仿。據(jù)此圖3所示的這組數(shù)據(jù)表明，PEG-ZnPP是以劑量依賴性方式在細胞內(nèi)產(chǎn)生高度的PEG-ZnPP氧化作用過程的。
血紅素加氧酶對小鼠實體瘤模型的抑制。
對平均體重35克的雄性ddY小鼠，在背部皮膚植入S180肉瘤細胞經(jīng)過大約1周后，形成橫徑約為5毫米大小的實體瘤時，將溶于蒸餾水的PEG-ZnPP按每千克體重0.5毫克ZnPP的劑量，經(jīng)尾靜脈內(nèi)(i.v.)注射。經(jīng)24小時之后摘取其實體瘤，定量測定其血紅素加氧酶，與實例1所述施用不含有PEG-ZnPP的蒸餾水的對照組小鼠的結(jié)果相仿。其腫瘤標本的獲取和處理方法都相同。如表1所示，經(jīng)靜脈內(nèi)(尾部)施用PEG-ZnPP時，顯示出血紅素加氧酶活性顯著下降。未經(jīng)改型處理的ZnPP則由于其難溶性就不能作靜脈內(nèi)施用。
經(jīng)尾靜脈內(nèi)施用PEG-ZnPP對于腫瘤內(nèi)的血紅素加氧酶的抑制作用
在患有實體瘤的小鼠中PEG-ZnPP的抗腫瘤效應(yīng)及體重變化。
與上述實驗3類似，在ddY小鼠的背部皮下植入小鼠S180肉瘤，在植入腫瘤經(jīng)10、13、和15天之后，分別以30納摩、30納摩、和50納摩(只要3次)劑量的PEG-ZnPP，分別施行尾靜脈注射(還可參見圖4中箭頭標記所示)。對照組小鼠施用蒸餾水以替代PEG-ZnPP。每個周日測量瘤體的大小，如圖4所示。其中顯示，與對照組相比較，PEG-ZnPP組表現(xiàn)出腫瘤的生長受到明顯的抑制。
同時測定的處理組小鼠和非處理組小鼠的體重如圖5所示，PEG-ZnPP處理組的體重并無明顯的減失。
本發(fā)明在工業(yè)領(lǐng)域的適用性根據(jù)本發(fā)明，抑制血紅素加氧酶的金屬卟啉衍生物可在水溶性和脂溶性方面使用，將其與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合就可制成供靜脈注射用的衍生物。這是一類具有良好的腫瘤定向選擇性積聚作用的新藥。同時還發(fā)現(xiàn)了制備這種化合物的有效方法。
本發(fā)明的抗癌劑具有卓越的抗癌效應(yīng)，且不會產(chǎn)生任何可感知的副作用或毒性作用。
由此可知，本發(fā)明的與聚合物相結(jié)合的抗癌劑是非常有效的具有卓越的腫瘤定向選擇性質(zhì)的藥物，它有著新的不同于已知眾多低分子量抗癌劑的作用方式。
權(quán)利要求
1.含有與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物作為活性成分的抗癌劑。
2.如權(quán)利要求1所述的抗癌劑，其特征在于，所述血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物是復(fù)合化合物，其中有金屬原子以穩(wěn)定的配位作用與原卟啉螯合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗癌劑，其特征在于，兩性或水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)或苯乙烯馬來酸共聚物(SMA)。
4.如權(quán)利要求1-3所述的抗癌劑，其特征在于，所述血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物是通過酰胺鍵與兩性或水溶性聚合物結(jié)合的。
5.如權(quán)利要求1-4所述的抗癌劑，其特征在于，所述金屬是鋅。
6.以通式(A)表示的與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物。 (上式中的“R”是指兩性或水溶性聚合物，“Me”是金屬)
7.制備如權(quán)利要求6所述的與兩性或水溶性聚合物相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括將乙二胺引入原卟啉IX，通過添加活性聚乙二醇將聚乙二醇鏈引入原卟啉，最后再添加一種金屬鹽以將金屬原子引入卟啉環(huán)。
全文摘要
含有與兩性或水溶性聚合物(尤其是與聚乙二醇結(jié)合的鋅－原卟啉(ZnPP))相結(jié)合的血紅素加氧酶抑制性金屬卟啉衍生物作為活性成分的抗癌劑。因為與聚乙二醇之類的兩性或水溶性聚合物相結(jié)合，這類活性成分可通過靜脈注射施用，并且由于它具有腫瘤定向選擇性傳輸作用，因而可產(chǎn)生顯著的抗癌效應(yīng)。
文檔編號C07D487/22GK1549712SQ0281713
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者前田浩, 澤智裕 申請人:前田浩