專利名稱：用陰離子交換樹脂從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離方法，尤其涉及一種采用離子交換樹脂從核糖核酸(RNA)酶解液中分離核苷酸的方法。
核苷酸，如5’-腺苷酸(簡稱5′-AMP)、5’-鳥苷酸(簡稱5′-GMP)、5’-胞苷酸(簡稱5′-CMP)和5’-尿苷酸(簡稱5′-UMP)及其衍生物為重要的生物化工原料，可以作為食品添加劑、保健食品和醫(yī)藥中間體。一般，通過連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)高核酵母，然后從中提取分離可獲得RNA，亦可從啤酒酵母或其他酵母中分離獲得RNA。將RNA用核酸酶P1(或磷酸二酯酶)酶解，然后對酶解液進行分離，即可獲得所說的5’-腺苷酸、5’-鳥苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸。目前，已有一些文獻報道了分離方法，如文獻核苷酸類物質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用，中國科學(xué)院微生物研究所編，科學(xué)出版社1971，報道了一種分離方法，該方法通過陽-陰離子樹脂結(jié)合的方法，進行核苷酸的分離，該方法雖然可以一次分離出大量的5’-腺苷酸，但5’-鳥苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸的分離效果并不理想，5’-尿苷酸的損失將近50％，5’-鳥苷酸和5’-胞苷酸的損失將近40％，生產(chǎn)周期長，料液容易變質(zhì)，分離總收率約為65％；該文獻同時報道了另一種分離方法，該方法直接采用陰離子交換樹脂進行分離，該方法分離周期長，氣溫高時上柱液容易長霉，流出液體積大，耗水量多，沒有工業(yè)應(yīng)用價值。
發(fā)明者等曾報道用陽陰離子交換樹脂組合分離的方法，中國專利申請?zhí)?0119589.1，解決了分離的關(guān)鍵問題，使產(chǎn)品收率和純度大幅度地提高。但是，其缺陷是樹脂用量大，能耗和用水量較大。
隨著核苷酸及其衍生物藥物療效的發(fā)掘和作為保健晶的應(yīng)用，其需求量日益增大，原有的生產(chǎn)方法已不能滿足人們的需要，有關(guān)的產(chǎn)業(yè)部門希望提供更為有效的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于公開一種用陰離子交換樹脂從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法，包括5’-腺苷酸、5’-鳥苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足人們的需要。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的本發(fā)明采用二根陰離子交換樹脂柱，將酶解液串聯(lián)上柱，分段洗脫。由于5′-AMP、5′-GMP、5′-CMP和5′-UMP具有磷酸基，在中性的條件下，如pH＝6.5～7.5的條件下，磷酸基被離解，帶有負電荷，故與陰離子交換樹脂進行離子交換，被吸附。
二根陰離子交換樹脂柱洗脫的基本原理是這樣的由于5′-AMP、5′-GMP和5′-CMP氨基的離解常數(shù)分別為3.70、2.30和4.24，5′-AMP、5′-GMP、5′-CMP、5′-CMP的磷酸基離解常數(shù)分別為0.89、0.70、0.80、1.02。當(dāng)用酸性溶液洗時，5′-CMP帶負電荷較弱，因此先被洗脫下來；改用較強酸性溶液可將5′-AMP洗脫下來。用較強酸性和鹽溶液先脫時，由于嘌呤與苯乙烯樹脂有親和性原因，5′-UMP先于5′-GMP被洗脫下來。
因此采用分段洗脫的方法，可依次將5′-CMP、5′-AMP、5′-UMP、5′-GMP洗脫下來，四種洗脫液分別吸附于四個炭柱上，然后再用堿性溶液分別將4種核苷酸洗脫下來，故而可一次性地高收率分離出純度較高的核苷酸。
以前，用陰離子交換樹脂分離方法，由于為了獲得較好的分離效果，核苷酸上柱總量往往很低，一般為總交換量的5％。而本發(fā)明為了節(jié)約成本，提高柱效，采用二根陰柱串聯(lián)的方法，上樣時，第一根柱交換量達到飽和狀態(tài)，第二根柱主要作用是增加5′-CMP、5′-AMP和5′-UMP的分離效果，并采用分段洗脫的和炭性濃縮的方法，從而彌補了以前陰離子交換樹脂分離的缺陷。
本發(fā)明的主要特征是，通過陰離子交換樹脂和炭柱的有序排列組合，一次分離純化得到高純度單核苷酸，并且具有樹脂用量少，成本低，所分離的單核苷酸濃度高，分離時間短，產(chǎn)品不易污染等優(yōu)點。
本發(fā)明的方法依次包括如下步驟①將含有四種5-核苷酸、少量其他核苷酸(如5’-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、肌苷)等雜質(zhì)的酶解液按序流過兩根強堿陰離子交換樹脂柱、使4種5’-核苷酸被吸附在兩根強堿陰離子交換樹脂柱中，5′-AMP、5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP被吸附在第一根強堿陰離子交換樹脂柱中。
②用酸性溶液洗滌兩根強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第一炭柱，使其中的5′-CMP吸附于第一炭柱中，然后用堿性醇溶液洗脫第一炭柱，收集洗脫液，即可獲得純度較高的5′-CMP溶液；
③用較強酸性溶液洗滌兩根強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第二炭柱，使其中的5′-AMP吸附于第二炭柱，然后用堿溶液洗脫，即可獲得純度較高的5′-AMP溶液；④用較強酸性和鹽溶液洗滌二根強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第三炭柱，使其中的5′-UMP吸附于第三炭柱，然后用堿溶液洗脫，可得到純度較高的5′-UMP溶液。
⑤用離子強度更強的溶液洗滌第一根陰離子交換樹脂，洗脫液流入第四炭柱，使其中的5′-GMP吸附于第四炭，然后用堿性溶液洗脫，可得到純度較高的5′-GMP溶液。
將分離出的含有四種核苷酸的溶液通過常規(guī)的方法進行濃縮和精制，即可獲得純度為98％以上的高純度產(chǎn)品。
通過上述的分離過程，可高收率、高濃度地獲得5’-AMP、5’-GMP、5′-CMP和5′-UMP四種核苷酸，分離總收率可達90％，酶解液中的大部分雜質(zhì)被截留在陰離子交換樹脂中，或被分離時洗脫掉。
本發(fā)明所說的方法，具有樹脂用量少、成本低、收率高、分離效果好、所得產(chǎn)品純度高以及適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。


圖1為流程圖。
由圖1可見，本發(fā)明所說的方法依次包括如下步驟①含有四種5’-核苷酸核、少量其他核苷酸(如5’-肌苷酸)以及核苷(如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、肌苷)等雜質(zhì)pH值為5～8的酶解液按序流過第一強堿陰離子交換樹脂柱1和第二強堿陰離子交換樹脂柱2。
上柱總量為樹脂總交換量的16-30％，(摩爾比)，最佳為20～25％，即10升陰離子交換樹脂約可交換1.2～2公斤核苷酸，最佳為1.6-1.8公斤，柱1和柱2的體積比為1～(2∶1)；上柱線速度為0.11～0.45米/小時，最佳為0.3～0.36米/小時；上柱液中核苷酸含量約為0.5-2％，最佳為0.8-1.2wt％。
上柱完畢后，最好用去離子水充分淋洗，使殘留在兩根強堿陰離子交換樹脂柱中的核苷等雜質(zhì)洗掉。
②用酸性溶液如0.005mol/L～0.02mol/L甲酸洗滌強堿陰離子交換樹脂柱，當(dāng)有5′-CMP溶液流出時，立即連接第一炭柱3，使5′-CMP全部吸附于第一炭柱中，當(dāng)5′-CMP全部從柱1、柱2洗至炭柱3后，斷開柱2、柱3，并用堿性溶液洗滌柱3，便可得5′-CMP溶液。
③用較強酸性溶液，0.05mol/L～0.2mol/L甲酸串聯(lián)洗滌兩根強堿陰離子交換樹脂柱1和2，當(dāng)流出液為5′-AMP時，連接第二炭柱4，當(dāng)柱2出口沒有5′-AMP時，停止洗脫，并用堿性溶液洗滌柱4，便可得5′-AMP溶液。
④用較強酸性的鹽溶液如0.05mol/L～0.2mol/L甲酸和0.05mol/L～-0.2mol/L甲酸鈉洗脫柱1、柱2，當(dāng)柱2出口出現(xiàn)5′-UMP時，立即與第三炭柱5連接，并用堿性溶液洗滌柱5，可得5′-UMP溶液。
⑤用更強離子強度溶液如pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化鈉溶液洗滌柱1，洗脫5’-GMP，將洗滌液送入第四炭柱6，使5’-GMP吸附于第四炭柱6，并用堿性溶液洗滌柱6，便可得5′-GMP溶液。
所說的堿性溶液包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀等無機堿溶液，其濃度為0.1-1mol/L。
所得四種單核苷酸略經(jīng)濃縮，結(jié)晶，即可得純度為98％以上的5’-核苷酸。
所說的陰離子交換樹脂為上海合成樹脂廠生產(chǎn)的717或201X8、美國Amberlite IRA-900等強堿性苯乙烯陽離子交換樹脂中的一種，目數(shù)以80-200目為適宜，優(yōu)選的為100-120目，炭柱3、4、5、6所用的炭可優(yōu)選上?；钚蕴繌S生產(chǎn)的769炭或北京光華木材廠生產(chǎn)的K15炭，目數(shù)為15-50目。
通過上述的分離過程，可高收率、高濃度地獲得5’-AMP、5’-GMP、5′-CMP和5′-UMP四種核苷酸，分離總收率可達90％，酶解液中的大部分雜質(zhì)被截留在柱1和柱2中，或被分離時洗脫掉。將分離出的含有四種核苷酸的溶液通過常規(guī)的方法進行濃縮和精制，即可獲得純度為98％以上的高純度產(chǎn)品。
實施例1將3000毫升重量百分比為1％的RNA溶液加入300毫升核酸酶P1(酶活力為110u/ml)，于65℃下酶解反應(yīng)2小時，過濾，超濾去除固體顆粒和蛋白，用6N NaOH調(diào)節(jié)濾液的pH至8.0，其中，含4.6克5′-AMP，6.4克5’-GMP，4.6克5’-CMP，4.8克5′-UMP，然后按序流過串聯(lián)的二根陰離子交換柱，線速度為0.36m/h；柱1、2的尺寸分別為①16X1000mm，①16X700mm，分別裝填再生過的201X8強堿陰離子樹脂(C1型)150毫升和60毫升，柱3、4、5、6的尺寸為①16X700mm，分別裝769炭80毫升。
上柱完畢，用500毫升去離子水洗柱，然后用2000毫升0.02mol/L甲酸溶液洗滌柱1、2，當(dāng)流出液含有5’-CMP時，立即與第一炭柱3連接，使5′-CMP吸附于炭柱3，當(dāng)柱2出口5’-CMP不再流出時，用0.1mol/LNaOH洗脫炭柱，收集洗脫液150ml，其中含4.2克5’-CMP。
將柱3與柱2斷開，用0.1mol/L甲酸到洗滌柱1、2，當(dāng)柱2出口出現(xiàn)5′-AMP時與第二柱4連接，使5′-AMP吸附于柱4，用0.1mol/LNaOH將5′-AMP從柱4洗脫，收集洗脫液，其中含4.3克5′-AMP。
再用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸鈉洗滌柱1、2，使柱2的流出的5′-UMP吸附于第三柱5，同上法，收集洗脫液，其中含有4.3克5′-UMP。
改用pH＝3.0的3％NaCl洗脫柱1，當(dāng)柱1出口有5’-GMP流出時，立即與第四炭柱6連接，以后同上，收集洗脫液，其中含有5.8克5’-GMP。
5’-核苷酸分離總收率為91％，其中，5′-AMP收率為93.4％，5’-GMP為90.6％，5’-CMP為91.3％，5′-UMP為90％。
將上述的收集的各部分溶液分別通過濃縮、結(jié)晶、干燥后，可得3.87克5′-AMP，6.1克5’-GMP(鈉鹽含15％結(jié)晶水)，3.78克5’-CMP，5.1克5′-UMP(鈉鹽含25％結(jié)晶水)，其含量均為98％以上。
實施例2將3000毫升的酶解液(其中，含4.6克5′-AMP，6.4克5’-GMP，4.6克5’-CMP，4.8克5′-UMP)按序流過串聯(lián)通過二根離子交換柱，線速度為0.6m/h；
柱1、2的尺寸分別為①16X1000mm，①16X700mm，分別裝填再生過的Amberlite IRA-900(120目)強堿陰離子樹脂，裝填150毫升，柱2裝填60毫升，柱3、4、5、6的尺寸為①16X700mm，分別裝K15活性炭90ml。
上柱完畢，用500毫升去離子水洗柱。其余操作同上。于柱3可得4.3克5′-CMP，收率為93.4％；柱4可得4.18克5′-AMP，收率為91％；柱5可4.41克得5′-UMP，收率為92％；柱6可得5.765′-GMP克，收率為90％。
將上述的收集的各部分溶液分別通過濃縮、結(jié)晶、干燥后，可獲得3.76克5′-AMP，6.1克5′-GMP(鈉鹽含15％結(jié)晶水)，3.95克5′-CMP，5.3克5′-UMP(鈉鹽含25％結(jié)晶水)，其含量均為98％以上。
權(quán)利要求
1.用陰離子交換樹脂從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法，其特征在于依次包括如下步驟①將含有四種5’-核苷酸的酶解液按序流過兩根強堿陰離子交換樹脂柱、使4種5’-核苷酸被吸附在兩根強堿陰離子交換樹脂柱中；②用酸性溶液洗滌強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第一炭柱，使其中的5′-CMP吸附于第一炭柱中，然后用堿性醇溶液洗脫第一炭柱，收集洗脫液，收集5′-CMP溶液；③用較強酸性溶液洗滌強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第二炭柱，使其中的5′-AMP吸附于第二炭柱，然后用堿溶液洗脫，收集5′-AMP溶液；④用較強酸性和鹽溶液洗滌強堿陰離子交換樹脂柱，洗脫液流入第三炭柱，使其中的5′-UMP吸附于第三炭柱，然后用堿溶液洗脫，收集5′-UMP溶液；⑤用離子強度更強的溶液洗滌陰離子交換樹脂，洗脫液流入第四炭柱，使其中的5′-GMP吸附于第四炭，然后用堿性溶液洗脫，收集5′-GMP溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶解液的pH值為5～8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上柱總量為樹脂總交換量的16-30％(摩爾比)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于上柱總量為樹脂總交換量的20～25％(摩爾比)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上柱線速度為0.11～0.45米/小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上柱線速度為0.3～0.36米/小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上柱液中核苷酸含量為0.5-2wt％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于上柱液中核苷酸含量為0.8-1.2wt％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其特征在于上柱完畢后，用去離子水充分淋洗。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其特征在于酸性溶液為0.005mol/L～0.02mol/L的甲酸，較強酸性溶液為0.05mol/L～0.2mol/L甲酸，較強酸性鹽溶液如0.05mol/L～0.2mol/L甲酸和0.05mol/L～-0.2mol/L甲酸鈉，更強離子強度溶液為pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化鈉溶液。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于酸性溶液為0.005mol/L～0.02mol/L的甲酸，較強酸性溶液為0.05mol/L～0.2mol/L甲酸，較強酸性鹽溶液如0.05mol/L～0.1mol/L甲酸和0.05mol/L～0.2mol/L甲酸鈉，更強離子強度溶液為pH＝1.0～3.0的1％～5％氯化鈉溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一所述的方法，其特征在于所說的堿性溶液為無機堿溶液，其濃度為0.1-1mol/L。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所說的堿性溶液為無機堿溶液，其濃度為0.1-1mol/L。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所說的堿性溶液為無機堿溶液，其濃度為0.1-1mol/L。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一所述的方法，其特征在于陰離子交換樹脂為強堿性苯乙烯陽離子交換樹脂。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于陰離子交換樹脂為強堿性苯乙烯陽離子交換樹脂。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于陰離子交換樹脂為強堿性苯乙烯陽離子交換樹脂。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于陰離子交換樹脂為強堿性苯乙烯陽離子交換樹脂。
全文摘要
用陰離子交換樹脂從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法。本發(fā)明通過陰離子交換樹脂和炭柱的有序排列組合，一次分離純化得到高純度單核苷酸。本發(fā)明的方法可高收率、高濃度地獲得5’－AMP、5’－GMP、5′－CMP和5′－UMP四種核苷酸，分離總收率可達90％，酶解液中的大部分雜質(zhì)被截留在陰離子交換樹脂中，或被分離時洗脫掉。本發(fā)明方法，具有樹脂用量少、成本低、收率高、分離效果好、所得產(chǎn)品純度高以及適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
文檔編號C07H1/00GK1408719SQ02136839
公開日2003年4月9日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月5日
發(fā)明者邱蔚然, 閻蓬勃, 丁慶豹 申請人:上海秋之友生物科技有限公司