專利名稱：植物源性醇溶蛋白基質(zhì)、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用植物源成份的醇溶蛋白基質(zhì)、制備方法及用途。涉及將植物源性醇溶蛋白制備成基質(zhì)的方法，該基質(zhì)呈現(xiàn)微粒子和膜的形狀。該醇溶蛋白基質(zhì)有良好的生物相容性。
目前，有機(jī)合成材料已用于組織工程領(lǐng)域，但它們本身生物相容性不理想；或是降解后，其產(chǎn)物容易引起機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。如PLGA，其酸性降解物引起了機(jī)體的炎癥反應(yīng)[Hollinger et al.，1996]；PLA和PGA植入人體后也有遲發(fā)性炎癥反應(yīng)[Bergsma et al.，1995]；羥基磷灰石在生物體內(nèi)很難被吸收。而一些天然生物性材料多數(shù)不能同時具有良好的各項生物學(xué)性能。目前這類材料如膠原(Nakahara etal.1989)、纖維蛋白(Kawamura et al.，1988)、明膠和甲殼素等作為生物材料，特別是在組織的修復(fù)和再生方面的應(yīng)用已被廣泛研究[Grzesiak et al.，1997；sofia et al.，2001；Pamela et al.，2002；Coombes etal.，2002]，但它們自身多數(shù)機(jī)械強(qiáng)度差，往往須經(jīng)修飾或同其它材料形成復(fù)合物，來增加機(jī)械強(qiáng)度和生物穩(wěn)定性，但這同時又會引起了機(jī)體的免疫反應(yīng)。如用戊二醛修飾后的膠原，在動物機(jī)體內(nèi)引起了心臟瓣膜的鈣化[Schoen et al.，1984]。
玉米醇溶蛋白具有極好的機(jī)械強(qiáng)度，用120℃高溫處理3小時后，經(jīng)圓二相色散和電泳分析得其組成沒有發(fā)生變化，證明了玉米醇溶蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，可以承受苛刻的加工工藝。此外，玉米醇溶蛋白經(jīng)過修飾、加工形成可降解的薄膜，要比直接應(yīng)用具有更強(qiáng)的韌性[Padgett et al.，1998]。
本發(fā)明的目的還提供一種上述植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述植物源性醇溶蛋白基質(zhì)的用途。
本發(fā)明是一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)，醇溶蛋白基質(zhì)主要形態(tài)是不同粒徑的微粒子，也可以是由微粒子連成的薄膜。
所述的微粒子為50-500nm的微粒子，所述的薄膜為50-2000nm的微粒子聯(lián)成一片的薄膜。
所述的植物源性醇溶蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白。
所述的醇是C1-4的脂肪醇，推薦乙醇。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法，是由所述的植物源性醇溶蛋白用醇溶解，并進(jìn)一步在醇溶液中形成微粒子，或者將上述醇溶解液，在板上干燥后成微粒子或膜。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法中，最好將上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液用超聲波處理，可以獲得均勻大小顆粒的微粒子，或者獲得由均勻大小顆粒聯(lián)成一片的膜。也可以采用離心的方法，除去上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液中較大的顆粒，使獲得均勻大小顆粒的微粒子。
本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法可以采用下述一次加醇或多次加醇的方法分別獲得將植物源性醇溶蛋白中加入20-60％醇的水溶液，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，最好是每毫升溶液中含有0.5-5mg的植物源性醇溶蛋白，該溶液在板或片上，經(jīng)干燥，形成微粒子?；蛘邔⒅参镌葱源既艿鞍兹芙庠?0-100％的醇溶液中，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，再加1-100倍10-40％的醇，最好加入2-10倍10-40％的醇，形成50-500nm的微粒子。
或者將植物源性醇溶蛋白溶解在50-90％的乙醇(0.5-100mg/ml)中，再加2-5倍50-90％的乙醇。超聲波室溫處理2-10分鐘。離心2-10分鐘，干燥形成微粒子聯(lián)成一片的膜，是一種50-2000nm的微粒子連成一片的膜。
所述的離心機(jī)為100-800rpm。
所述的板可以是玻璃板、陶瓷板、不銹鋼板等，也可以是生物技術(shù)所用的培養(yǎng)板，如24孔培養(yǎng)板，50-300l/孔。
附

圖1中，采用含有不同濃度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液形成基質(zhì)后，在放大15000倍掃描電子顯微鏡下進(jìn)行分析的結(jié)果。其中1-1～1-4是顆粒型基質(zhì)掃描電鏡照片，1-5～1-8是顆粒型膜基質(zhì)掃描電鏡照片，它們的濃度分別如下1-10.2％(w/v)，1-20.4％(w/v)，1-30.8％(w/v)，1-41。6％(w/v)，1-502％(w/v)，1-60.4％(w/v)，1-70.8％(w/v)，1-81.6％(w/v)。
附圖2中，表示L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上的對貼壁率，其中；縱坐標(biāo)-相對貼壁率，橫坐標(biāo)-0.康尼細(xì)胞培養(yǎng)板，基質(zhì)準(zhǔn)備過程中，植物源性醇溶蛋白乙醇的濃度分別為1.200ul 0.2％(w/v)；2.200ul 0.4％(w/v)；3.200ul 0.8％(w/v)；4.200ul 1.6％(w/v)。
附圖3中采用含有不同濃度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液形成基質(zhì)后，L-02肝細(xì)胞在本發(fā)明的不同基質(zhì)上結(jié)果3天(3-1)和6天(3-2)后的活力。其中縱坐標(biāo)-相對活性，橫坐標(biāo)不同濃度的植物源性醇溶蛋白乙醇溶液-1.200ul 0.2％(w/v)；2.200ul 0.4％(w/v)；3.200ul 0.8％(w/v)；4.200ul 0.1.6％(w/v)。
附圖2和3中，小顆粒表示顆粒型基質(zhì)，大顆粒表示顆粒型簿膜基質(zhì)。
本發(fā)明不僅制備方法簡便，而且本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)是一種適合細(xì)胞生長需要的可降解的生物相容性材料。具體地說，利用體外培養(yǎng)技術(shù)鑒定植物源性醇溶蛋白的生物相容性，提供一種利于細(xì)胞貼附，增殖和分化的新型植物源的生物相容性的生物醫(yī)用材料。該材料的原料來源廣、價格低廉、工藝要求低。
實施例1玉米醇溶蛋白膜制備及細(xì)胞黏附將玉米蛋白溶解80％的乙醇配制成2、4、8、16mg/ml，加4倍體積20％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成小顆粒型基質(zhì)。
70％的乙醇溶液配制玉米蛋白成2、4、8、16mg/ml，加三倍體積70％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成大顆粒型基質(zhì)膜。
載有玉米醇溶蛋白膜的蓋玻片置于掃描電子顯微鏡樣品分析柱上，噴金3分鐘，在4-5KeV條件下、放大15000倍進(jìn)行分析(小顆粒型基質(zhì)見圖1-1，1-2，1-3，1-4；大顆粒型基質(zhì)膜見圖1-5，1-6，1-7，1-8)。
用含10％FBS，100g/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝細(xì)胞。將培養(yǎng)至滿瓶的細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分鐘，收集細(xì)胞，活細(xì)胞染色和記數(shù)將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺盼藍(lán)混合，滴到記數(shù)板上，2分鐘后記數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。用RPMI-1640調(diào)細(xì)胞密度至2.5×105個細(xì)胞/ml。1ml/孔的細(xì)胞懸液接種到含有上述玉米醇溶蛋白的24孔板中，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于3小時MTT法測定細(xì)胞活力，計算黏附率(結(jié)果見圖2)。
實施例2玉米醇溶蛋白膜制備及細(xì)胞生長將玉米蛋白溶解80％的乙醇配制成2、4、8、16mg/ml，加4倍體積20％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成小顆粒型基質(zhì)。
70％的乙醇溶液配制玉米蛋白成2、4、8、16mg/ml，加三倍體積70％的乙醇，室溫超聲波處理5分鐘，加入24孔培養(yǎng)板(200ul/孔供細(xì)胞培養(yǎng)用)或蓋玻片(100ul/片供表面分析用)300rpm離心5分鐘，室溫干燥，形成大顆粒型基質(zhì)膜。
用含10％FBS，100g/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肝細(xì)胞。將培養(yǎng)至滿瓶的細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化4分鐘，收集細(xì)胞，活細(xì)胞染色和記數(shù)將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺盼藍(lán)混合，滴到記數(shù)板上，2分鐘后記數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。用RPMI-1640調(diào)細(xì)胞密度至2.5×105個細(xì)胞/ml。1ml/孔的細(xì)胞懸液接種到含有上述玉米醇溶蛋白的24孔板中，于37℃，5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于3天、6天用MTT法測定細(xì)胞活力(結(jié)果見圖3)。
權(quán)利要求
1 一種植物源性醇溶蛋白基質(zhì)，其主要形態(tài)為不同粒徑的微粒子組成，或由微粒子連成的薄膜。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)，其特征在于所述的微粒子為50-500nm的微粒子，所述的薄膜為50-2000nm的微粒子聯(lián)成一片的薄膜。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)，其特征在于所述的植物源性蛋白是小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米的醇溶性蛋白。
4 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)的本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法，其特征在于由所述的植物源性醇溶蛋白用醇溶解，并在醇溶液中形成微粒子，或者將上述醇溶解液，在板上干燥后成膜。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物源性蛋白基質(zhì)的本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法，其特征在于將上述的溶解植物源性醇溶蛋白的醇溶液用超聲波處理或離心的方法。
6 根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物源性蛋白基質(zhì)的本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法，其特征在于分別下述加醇或多次加醇的方法1)將植物源性醇溶蛋白中加入20-60％醇的水溶液，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，該溶液在板或片上，經(jīng)干燥，形成微粒子；2)或者將植物源性醇溶蛋白溶解在40-100％的醇溶液中，每毫升溶液中含有0.5-100mg的植物源性醇溶蛋白，再加1-100倍10-40％的醇，形成50-500nm的微粒子；或者3)將植物源性醇溶蛋白溶解在50-90％的乙醇(0.5-100mg/ml)中，再加2-5倍50-90％的乙醇，超聲波室溫處理2-10分鐘，培養(yǎng)板，離心2-10分鐘，干燥形成50-2000nm的微粒子連成一片的膜。
7 根據(jù)權(quán)利要求6述的植物源性蛋白基質(zhì)的本發(fā)明的植物源性醇溶蛋白基質(zhì)制備方法，其特征在于所述的板可以是玻璃板、陶瓷板、不銹鋼板或生物技術(shù)所用的培養(yǎng)板。
8 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物源性蛋白基質(zhì)的用途，其特征在于所述的植物源性蛋白用于細(xì)胞生長的醫(yī)用材料和細(xì)胞因子載體。
9 根據(jù)權(quán)利要求8述的所述的植物源性蛋白基質(zhì)用途，其特征在于所述細(xì)胞因子是刺激細(xì)胞貼壁、生長和分化的各類細(xì)胞因子。
全文摘要
本發(fā)明是一種包括小麥、大麥、裸麥、燕麥或玉米在內(nèi)的醇溶性蛋白植物源性醇溶蛋白基質(zhì)，是形態(tài)為不同粒徑的微粒子或由微粒子連成的薄膜。系由所述的植物源性醇溶蛋白，用醇溶解，并進(jìn)一步在醇溶液中形成微粒子，或者將上述醇溶解液，在板上干燥后成微粒子或膜。本發(fā)明的原料來源廣、價格低廉、工藝要求低，可用于細(xì)胞生長的醫(yī)用材料和細(xì)胞因子載體。找到了一種新的可降解，低免疫原性，抗菌性，具有適當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度生物材料。
文檔編號C07K1/00GK1401659SQ0213708
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月20日
發(fā)明者王瑾曄, 董健 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所