專利名稱：制備取代的二硫化衍生物及其靶形式的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮镃N 90102101.6-4的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及LL-33288復(fù)合物的α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ、δ和假糖苷配基組份的二硫化合物以及它們的衍生物，本發(fā)明也涉及稱為BBM-1675、F R-900405、F R-900406、PD114759、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 D、CL-1577 E、CL-1724 抗生素的二硫化物化合物以及它們的衍生物，通過(guò)使抗生素與未取代或取代的烷基硫醇反應(yīng)而制得這些衍生物。這些二硫化物化合物是有效的抗腫瘤劑。
本發(fā)明也闡述了由上列材料制得的二硫化物類似物的載體藥物配對(duì)物。配對(duì)物的載體(具靶向性的)部分可以是下列形式單克隆或多克隆抗體;它們的碎片化學(xué)或基因處理過(guò)的對(duì)應(yīng)物生長(zhǎng)因子;或類固醇。本發(fā)明包括載體藥物配對(duì)物的使用方法及其制備方法。


圖1稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的紫外光譜。
圖2稱為N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的紅外光譜。
圖3稱由N-乙?；鵏L-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的質(zhì)子核磁共振光譜。
圖4稱為N-乙酰基LL-E33288 δI1的抗腫瘤抗生素的C-13核磁共振光譜。
圖5稱為碘代LL-E33288 假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的紫外光譜。
圖6稱為碘代LL-E33288 假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的紅外光譜。
圖7稱為碘代LL-E33288 假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的質(zhì)子核磁共振光譜。
圖8稱為碘代LL-E33288 假糖苷配基的抗腫瘤抗生素的C-13核磁共振光譜。
1986年5月28日公開(kāi)的歐洲專利公報(bào)第0182152 A3號(hào)描述了稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的抗菌素和抗腫瘤劑族，并表明對(duì)其的專利。它們可用來(lái)制備二硫化物抗腫瘤劑，而二硫化物抗腫瘤劑也是本發(fā)明用作制備相應(yīng)靶形式的一些起始物料。
歐洲專利公報(bào)第0182152 A3 號(hào)闡述了LL-E33288復(fù)合物、它的組份，即LL-E33288αBr1、LL-E33288αIi、LL-E33288 αBr2、LL-E33288αI2、LL-E33288αBr3、LL-E33288αI3、LL-E33288αBr4、LL-E33288βBr1、LL-E33288βI1、LL-E33288βBr2、LL-E33288βI2、LL-E33288γBr1、LL-E33288γI1和LL-E33288δI1，以及它們的制備方法，即采用Micromonospora echinospora ssp calichensis的新菌株或采用它們的天然突變體或派生的突變體通過(guò)需氧發(fā)酵生產(chǎn)出上述復(fù)合物及它的組份。歐洲專利公報(bào)第0182152 A3號(hào)也揭示了一些上列組份的可能結(jié)構(gòu)式。這結(jié)構(gòu)式列于表1中。
表1從自然界中分離得到的CH3-SSS-W的結(jié)構(gòu)式(其中W是附在CH3-SSS-下面的取代基) 名稱 R1R2R3R4R5R6R7XE33288α21Ar1R2'H H C2H5IE33288α31Ar1H H R4'IE33288β11Ar1R2'H R4'(CH3)2CH IE33288γ11Ar1R2'H R4'C2H5IE33288δ11Ar1R2'H R4'CH3IE33288β1BrAr1R2'H R4'(CH3)2CH BrE33288γ1BrAr1R2'H R4'C2H5BrE33288α2BrAr1R2'H H C2H5BrE33288α3BrAr1H H R4'BrEsperamlcln A1CH3R2'R3'(CH3)2CH H Ar2Esperamlcln A2CH3R2'R3'(CH3)2CH Ar2HEsperamlcln A1bCH3R2'R3'CH3CH2H Ar2
在于1988年8月3日公開(kāi)的歐洲專利公報(bào)第027485A2號(hào)中闡述并要求保護(hù)LL-E33288復(fù)合物族中的其它組成對(duì)于制備二硫化物衍生物和本發(fā)明抗腫瘤劑的靶形式同樣是有用的。該申請(qǐng)闡述了LL-E33288系列中溴代-和碘代-假糖苷配基物，它們已經(jīng)化學(xué)方法制得。該申請(qǐng)也闡述了通過(guò)硼氫化鈉還原反應(yīng)使C11位上的酮還原成羥基而從所有上列的抗腫瘤抗生素中得到二氫衍生物。后面物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式列于表2中。
在我們同時(shí)提交的相關(guān)申請(qǐng)(30，553-01)中闡述并要求保護(hù)抗腫瘤抗生素LL-E33288族中的另一些組成，這些物質(zhì)對(duì)于制備本發(fā)明中抗腫瘤劑另外一些靶型也是有用的。該申請(qǐng)闡述了用化學(xué)方法制得的LL-E33288復(fù)合物N-?；苌锏囊恍┙M成。它們的結(jié)構(gòu)式同樣列于表2中表2從表1化合物通過(guò)化學(xué)方法得到的CH3-SSS-W的結(jié)構(gòu)式(其中W是附于CH3-SSS-下面的取代基) 名稱 R1R2R3R4R5R5'R6R7R8R9X二氫 LL-E33288α21Ar1R2'H H C2H5H OH H IN-?；?LL-E33288α21Ar1R2'H H C2H5RCO =O I二氫 LL-E33288α31Ar1H H R4'OH H I二氫 LL-E33288β11Ar1R2'H R4'(CH3)2CH H OH H IN-酰基 LL-E33288β11Ar1R2'H R4'(CH3)2CH RCO =O I二氫 LL-E33288γ11Ar1R2'H R4'C2H5H OH H IN-?；?LL-E33288γ11Ar1R2'H R4'C2H5RCO =O I二氫 LL-E33288δ11Ar1R2'H R4'CH3H OH H IN-?；?LL-E33288δ11Ar1R2'H R4'CH3RCO =O I碘 LL-E33288 Ar1H H H4'=O I假糖苷配基二氫- 碘 LL-E33288 Ar1H H H OH H I假糖苷配基二氫 LL-E33288β1BrAr1R2'H R4'(CH3)2CH H OH H BrN-?；?LL-E33288β1BrAr1R2'H R4'(CH3)2CH RCO =O Br二氫 LL-E33288γ1BrAr1R2'H R4'C2H5H OH H BrN-?；?LL-E33288γ1BrAr1R2'H R4'C2H5RCO =O Br二氫 LL-E33288α2BrAr1R2'H H C2H5H OH H BrN-?；?LL-E33288α2BrAr1R2'H H C2H5RCO =O Br二氫 LL-E33288α3BrAr1H H R4'OH H Br溴 LL-E33288 Ar1H H H =O Br假糖苷配基二氫- 溴 LL-E33288 Ar1H H H假糖苷配基N-乙?；鵈speramicim A1CH3R2'R3'(CH3)2CH CH3CO H Ar2N-乙酰基Esperamicim A1CH3R2'R3'(CH3)2CH CH3CO Ar2HN-乙?；鵈speramicim A1bCH3R2'R3'CH3CH2CH3CO H Ar2R＝二氫或支鏈或非支鏈烷基(C1-C10)或亞烷基(C1-C10)、芳基或雜芳基、或任意地被一個(gè)或多個(gè)羥基、氨基、羧基、鹵素、低級(jí)(C1-C2)烷氧基或低級(jí)(C1-C6)硫代烷氧基所取代的烷基(C1-C6)或雜芳基-烷基(C1-C6)基團(tuán)。
在本發(fā)明中某些其它的抗腫瘤化合物和抗生素化合物是有用的，即1)埃斯波霉素(esperamicin)BBM-1676，一種強(qiáng)有力抗腫瘤抗生素的新種類。見(jiàn)J.Antibiotis，38，1605(1985)中M.Konishi，et，al作I物理化學(xué)數(shù)據(jù)和部分結(jié)構(gòu)式。一種新的抗腫瘤抗生素復(fù)合物，見(jiàn)M.Kenishi et.al.，英國(guó)專利申請(qǐng)GB2，141，425 A，1984年5月15日。
2)新的抗腫瘤抗生素，F(xiàn)R-90045和FR-90046 I.Taxonomy of the producing strain.M·Iuami，et.al.，J，Antiobiotics 38，835(1985)。新的抗腫瘤抗生素FR-900405和FR-90046。Ⅱ.生產(chǎn)、分離、特征以及抗腫瘤活性。B，Kiyoto et.al.，J.Antibiotics，38，340(1985)。
3)PD114759和PD115028，有出眾效力的新穎的抗腫瘤抗生素。I.分離和特征。R.H.Bunge，et.al.，J，Antibiotics，37，1566(1984)。新穎的抗腫瘤抗生素PD114759和相關(guān)衍生物的生物和生化活性。D.W.Fry et.al.，Investigational New Drugs，壬，3(1986)。
4)用Streptomyoes sp.ATCC 39363生產(chǎn)的新的抗生素復(fù)合物CL-1577A、CL-1577 B。歐洲專利申請(qǐng)0，132，082，A2。
5)CL-1577 D和CL-1577 E抗生素抗腫瘤化合物，它們的生產(chǎn)及使用。美國(guó)專利4，539，203。
6)CL-1724抗生素化合物，它們的生產(chǎn)及使用。美國(guó)專利4，554，162。
7)從具疣的放線菌族(actinomodura verrucosopora strains)H964-92(ATCC 39334)或AB27Y(ATCC39638)中發(fā)酵得到的新的抗腫瘤抗生素BBM-1675-A3和BBM-1675-A4。美國(guó)專利4，675，187。
8)具有抗微生物活性和抗腫瘤活性的新的N-乙?；?埃斯波霉素A1、A2和A1b衍生物。歐洲專利第289，030。
上面所有關(guān)于BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD-114659、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 D、CL-1577 E和CL-1724的信息，這些列出，僅供參考。愛(ài)斯波霉素A1、A1和A1b(BBM-1675復(fù)合物)以及它們相應(yīng)的N-乙酰基衍生物的完整結(jié)構(gòu)已在表1和表2中列出，上列的其它抗腫瘤抗生素的物理性質(zhì)表明它們與愛(ài)斯波霉素的結(jié)構(gòu)相同或極其相似，都含有一個(gè)甲基三連硫基官能團(tuán)。
從上面揭示的結(jié)構(gòu)中可以看出，α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ1、δ和LL-E33288復(fù)合物的假糖苷配基組份、它們的二氫和N-?；鶎?duì)應(yīng)物、以及BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 DCL-1577 E和CL-1724抗生素以及它們的N-酰基對(duì)應(yīng)物在其結(jié)構(gòu)上各自包含一個(gè)甲基三連硫代基團(tuán)。
已經(jīng)揭示使上述任一種抗生素與非取代或取代的烷基硫醇或芳基硫醇反應(yīng)結(jié)果在三硫化物部分的甲基過(guò)硫化陰離子被取代形成了穩(wěn)定的下面的二硫化物(反應(yīng)式Ⅰ)。在1989年5月3日公開(kāi)的歐洲專利第0313874 A2號(hào)中揭示了適合于該轉(zhuǎn)化形式的其它化合物。
反應(yīng)式Ⅰ根據(jù)反應(yīng)式Ⅰ用含巰基的有機(jī)分子將表1和2中的化合物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)出用作抗生素和抗癌劑的新的化合物，在其右側(cè)中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2'、R3'、R4'、R5'、Ar1、Ar2和X的定義與表1和表2中的定義相同，Sp是直鏈或支鏈的二價(jià)或三價(jià)(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)或三價(jià)的芳基或芳雜基、二價(jià)或三價(jià)的(C1-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價(jià)或三價(jià)的芳基(C1-C18)、或雜芳烷基(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)或三價(jià)環(huán)烷基(C1-C18)或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)，或是二價(jià)或三價(jià)(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價(jià)基團(tuán)，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳雜氨基、羧基、低級(jí)烷氧基、羥基、巰基或低級(jí)烷硫基團(tuán)所取代;Q是氫、鹵(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、雜芳氨基、哌啶子基、吡咯烷基、哌嗪基、羰基、硝基苯氧基羰基、羰醛基、低級(jí)氧基、羥基、硫羥基、低級(jí)烷基二羧酸基，或者Q是從下列基團(tuán)中選出來(lái)的基團(tuán)-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;只要Sp是亞乙基，Q不能是氫;如果CH-SSS-W是LL-33288α1-Br、α1-1、α2-Br、α2-1、α3-Br、α3-1、α4-Br、β1-Br、β1-1、β2-Br、β2-1、γ1-Br、γ1-1、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-90046、PD114759、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 D、CL-1577 E或CL-1724且Sp是二價(jià)基團(tuán)時(shí)，Q不能是氫、鹵(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、芳雜氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羰基。
作為本發(fā)明一個(gè)較好的實(shí)例，以名稱為L(zhǎng)L-E33288(CH-SSS-W)的抗腫瘤抗生素中制備式為Q-Sp-SS-W的二硫化物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2;X是碘原子或溴原子;R5是氫或RCO基團(tuán)(其中R是氫、CH3或單取代的芳基)，Sp和Q的定義同上。
用多種含巰基的有機(jī)分子使列于表1和表2的化合物轉(zhuǎn)化成各種二硫化物以得到新穎的抗腫瘤劑和抗生素。此外，從反應(yīng)本身所得的產(chǎn)物可進(jìn)一步引入新的側(cè)鏈產(chǎn)生具有生物活性的更為新穎的化合物。
本發(fā)明的化合物除了用于抗腫瘤劑和抗生素外，它們對(duì)于在細(xì)胞水平評(píng)估抗瘤活性的新模式也是有用的。上列申請(qǐng)和專利闡述的天然取得的抗生素不含有充分強(qiáng)的發(fā)色單元所以它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的區(qū)域不能定量表示。當(dāng)使天然的三硫代甲基衍生物與含巰基分子反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生對(duì)于研究DNA雙鏈裂解及這類化合物的細(xì)胞定域有用的生化工具，含巰基分子另外還含有在電磁譜區(qū)域吸收或發(fā)射光而不被細(xì)胞發(fā)色團(tuán)所遮掩的發(fā)色單元。相似地，通過(guò)該反應(yīng)引入同位素標(biāo)記也在本發(fā)明的范圍里。因此，例如，當(dāng)使E-33288C1-I與7-(2-硫代乙氨基)-4-甲基香豆素反應(yīng)時(shí)，得到一個(gè)衍生物它在紫外光的照射下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，從而定位化合物處于細(xì)胞小室的區(qū)域。
在本發(fā)明的具體例子中，根據(jù)反應(yīng)式Ⅰ用含巰基的有機(jī)分子將表1和表2中的化合物轉(zhuǎn)變成另外用作分子探針的新組合物，其中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2'、R3'、R4'、R5'、Ar1、Ar2和X的定義與前面表1和表2的定義相同，Sp是直鏈或支鏈二價(jià)(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)芳基或雜芳基、二價(jià)(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價(jià)芳基或雜芳基烷基(C1-C18)、二價(jià)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)以及二價(jià)(C2-C18)不飽和芳基;Q是未取代或取代的二苯并噁嗪、若丹明、喹諾酮、甲基香豆素、熒光素或吖啶的發(fā)熒光核，或者Q是含有3H、14C、35S或32P同位素作為其結(jié)構(gòu)式一部分的取代基。
也已發(fā)現(xiàn)列于表1和表2化合物及反應(yīng)式Ⅰ描記的化合物的甲基三連硫代單元的取代可用來(lái)引入隔離物(Sp)，明智的選擇是將靶單元引入到本申請(qǐng)的二硫化物衍化物中。在歐洲專利公報(bào)第0313873A號(hào)(1989年5月3日公開(kāi))中揭示了將靶單元引入到其它二硫化物衍生物中。因此，參照反應(yīng)式Ⅰ，式CH3SSS-W化合物可首先與式Q-SP-SH化合物反應(yīng)，(其中CH3SSS-W是名稱為L(zhǎng)L-33288αBr1、αI1、αBr2、αBr2、αI3、αBr3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γBr2、δI1、碘代或溴代的假糖配基，它們的二氫對(duì)應(yīng)物或N-乙?；鶎?duì)應(yīng)物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 D、CL-1577 E、CL-1724或它們的乙?；鶎?duì)應(yīng)物的抗腫瘤抗生素)產(chǎn)生一個(gè)中間產(chǎn)物
其中Sp是直鏈或支鏈的二價(jià)或三價(jià)(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)或三價(jià)芳基或雜芳基、二價(jià)或三價(jià)的(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價(jià)或三價(jià)的芳烷基(C1-C18)或雜芳烷基(C1-C18)、二價(jià)或三價(jià)的環(huán)烷基烷基(C1-C18)或雜環(huán)烷基烷基(C1-C18)或是二價(jià)或三價(jià)(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價(jià)基團(tuán)，它另外還可被氨基、烷氨基、芳氨基、雜芳基氨基、羧基、低級(jí)烷氧基、羥基、巰基或低級(jí)烷硫基所取代，如果CH3-SSS-W是作為抗腫瘤抗生素LL-E-33288，α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577 A、CL-1577 B、CL-1577 D、CL-1577 E或CL-1724的母體，Sp不能是二價(jià)基團(tuán);Q是，或可被轉(zhuǎn)化為，鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、巰基、α-鹵代乙酰氨基、低級(jí)烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3
條件是Sp 并且W如上述表1和表2所示。
只要從反應(yīng)式中得到的產(chǎn)物含有至少一個(gè)官能團(tuán)，它能轉(zhuǎn)變成上列專利和申請(qǐng)的抗腫瘤抗生素的靶形式或直接與靶單元(Tu)反應(yīng)形成上列專利的抗腫瘤抗生素的靶形式，就可有如下面反應(yīng)流程Ⅱ所示的應(yīng)用。
反應(yīng)式Ⅱ其中Q、Sp和W與前面的定義相同，Tu是單克隆抗體或多克隆抗體、它的碎片、它的化學(xué)處理對(duì)應(yīng)物或基因處理對(duì)應(yīng)物、或是生長(zhǎng)因子或類固醇;Y是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基、羧基或巰基、從碳水化合物殘留物中衍生出來(lái)的醛或是酰氨烷基硫代基;n是從1至100的一個(gè)整數(shù);讓基團(tuán)Q和Y直接進(jìn)行或在以后的還原反應(yīng)后進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)形成Z，Z是-CONH-，-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-，-NHCONHN＝CH-、-NHCONHNHCH2、-NHC SNHN＝CH-，-NHCSNHNHCH2-，-ON＝CH-，-NH-，-NHCH2-，-N＝CH-，-CO2-，-NHCH2CO2-，-SS-， m是0.1至15作為例子并參照上述反應(yīng)式Ⅱ，當(dāng)N-乙?；鵈-33288 γ21(Q＝CO2H，Sp＝-CH2CH2-)的3-巰基丙酸衍生物轉(zhuǎn)化成它的活化的羥基琥珀酰亞胺形式時(shí)，在pH7.0-9.5水緩沖溶液中及在4℃-40℃溫度間它可與賴氨酸殘基的氨基(例如，Tu＝單克隆抗體，Y＝-NH2其中n＝50-100它能從賴氨酸殘基中得到)發(fā)生作用產(chǎn)生抗生素的靶形式，它附屬在蛋白質(zhì)骨架鏈上的無(wú)規(guī)位置上(Tu＝單克隆抗體，Z＝-NHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝1-10)。由于高負(fù)載常被認(rèn)為不利于抗體的免疫活性，所以用該方法只對(duì)一部分賴氨酸殘基進(jìn)行取代。用其它的羧基活化劑諸如各種碳化二亞胺或相關(guān)的酰基疊氮化物從3-巰基丙酸衍生物中也可制備相同的無(wú)規(guī)取代的免疫結(jié)合物。可替換的是，如美國(guó)專利第4，671，958號(hào)所述的，在pH4-7間的緩沖水溶液內(nèi)并在4℃-40℃間的溫度下使N-乙?；鵏L-E33288 δ21的3-巰基丙酰肼衍生物(Q＝H2NNHCO-，Sp＝-CH2CH2-)與氧化的高碘酸鹽抗體(Tu＝單克隆抗體，Y＝-CHO，n＝1-15)反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)只發(fā)生在醛官能團(tuán)上(從位于抗體Fc端上碳?xì)浠衔餁埢贫?Vic、diols)的裂解中衍生出來(lái))產(chǎn)生單克隆抗體結(jié)合物，它包含取代在蛋白質(zhì)骨架特定位點(diǎn)上的藥物(Tu＝單克隆抗體，乙＝-CH＝NHNCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。為了封閉抗體上未反應(yīng)的醛基團(tuán)從而避免交聯(lián)，以及使易水解西佛氏堿(Schiff's)鍵合穩(wěn)定，最好(但不是必需的)使產(chǎn)生的結(jié)合物首先與諸如乙酰肼或酪氨酰肼反應(yīng)，然后用氰硼氫化鈉或硼氫化鈉還原產(chǎn)生該發(fā)明穩(wěn)定的構(gòu)成物(Tu＝單克隆抗體，Z＝-CH2NHNHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。其它作為藥物構(gòu)成物部分的醛活性基團(tuán)也在我們發(fā)明內(nèi)以產(chǎn)生反應(yīng)式Ⅱ的產(chǎn)物。這類官能團(tuán)最好(雖然不限于)只能在酸性水溶液條件下與醛反應(yīng)的基團(tuán)。在堿性條件下蛋白質(zhì)賴氨酸的活性足夠強(qiáng)，結(jié)果它們的胺能與反應(yīng)式Ⅱ產(chǎn)物共同競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體的醛。可替換的醛活性基團(tuán)是，例如，氨基脲、硫代氨基脲和O-取代的羥基胺官能團(tuán)。
列于表1和表2化合物靶形式不只限于反應(yīng)式Ⅱ所概括的順序。首先可將靶單元(Tu)修飾成含有一個(gè)巰基，然后根據(jù)下列反應(yīng)式Ⅲ使它與表1和表2的化合物反應(yīng) 其中Tu、Y、Q、Sp、W、n和m的意義如前，P是氫或2-(吡啶硫基)，如果Y是Tu的氨基酸殘基骨架上衍生出來(lái)的巰基，結(jié)合在一起的Z-Sp是共價(jià)鍵。
作為例子，參照上面反應(yīng)式Ⅲ，可將單克隆抗體與3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)通過(guò)賴氨酸殘基來(lái)修飾蛋白質(zhì)(Tu＝單克隆抗體，Y＝NH2，n＝50-100，Q＝-CO2Su，Sp＝-CH2-CH2-，P＝2-吡啶硫基)。與譬如二硫蘇糖醇還原反應(yīng)后就生成一個(gè)中間產(chǎn)物(Tu＝單克隆抗體，Z＝-NHCO-，Sp＝-CHCH，m＝1-15)該中間產(chǎn)物可與表1和表2的化合物反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫結(jié)合物。相似地，可將2-亞氨基巰基烷(2-iminothiolane)與單克隆抗體反應(yīng)在蛋白質(zhì)的表面直接引入巰基，而不需要還原步驟(Tu＝單克隆抗體，Z＝-NHCO-，Sp＝-(CH2)3-，m＝1-15)，該中間產(chǎn)物可與前面表1和表2的化合物反應(yīng)?？商鎿Q的是，在單克隆抗體結(jié)構(gòu)內(nèi)部的巰基呈半胱氨酸殘基二聚的形式，它可直接用來(lái)參加反應(yīng)式Ⅲ的反應(yīng)。這類巰基傳統(tǒng)上通過(guò)酶消化和天然單克隆抗體還原反應(yīng)的結(jié)合使之露出，但是，同樣可期望使用含未成對(duì)半胱氨酸殘基的單克隆抗體的遺傳變化結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明靶衍生物的較好例子是下式的蛋白質(zhì)一藥物配對(duì)物 它是從一類稱為L(zhǎng)L-E33288(CH3SSS-W)的抗腫瘤抗生素中制得的，包括用式為Q-Sp-SH的化合物取代二硫代甲基部分(其中Sp是直鏈或支鏈的二價(jià)或三價(jià)(C2-C10)基團(tuán)或是二價(jià)或三價(jià)的(C2-C5)芳烷基或雜芳烷基，其中如果Sp是三價(jià)基團(tuán)，則它另外還可被氨基、雜芳氨基、羥基或巰基所取代;Q是羰基、低級(jí)烷基二羧酸、酐、-CO2Su、-CONHNH2，或
產(chǎn)生一個(gè)通式為Q-Sp-SS-W的中間產(chǎn)物(其中Q、Sp和W的定義同前所述)，使Q-Sp-SS-W與式為T(mén)u-(Y)n的分子反應(yīng)(其中Tu是單克隆抗體，它對(duì)人體的腫瘤相關(guān)抗原表現(xiàn)出優(yōu)良的反應(yīng)性;Y是抗體上的側(cè)鏈氨基，或是通過(guò)使抗體上的碳水化合物基團(tuán)氧化而形成的醛;n是1-100的整數(shù))產(chǎn)生下式化合物 其中Tu、Y、Sp、W和n的定義如前所述，Z是使基團(tuán)Q和Y直接進(jìn)行或經(jīng)還原后進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)而形成的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-或 m是0.1-15。
許多不同的單克隆抗體(Mo Abs)可用作甲基三鏈硫代抗癌化合物的靶。Mo Abs Lyml和Lym2可認(rèn)出在成熟的B-淋巴細(xì)胞和其引起的淋巴癌上的不同抗原。在A.L.Epstein，et.al.“癌癥研究”47 830(1987)中闡述了這些Mo Abs的生產(chǎn)及特征。雖然已注意到Mo Ab B72.3對(duì)胰腺癌、卵巢癌和肺癌的反應(yīng)，但它主要是乳腺癌和結(jié)腸癌為目標(biāo)的。該抗體已在T.L.Klug，et.al.，“Int，J.Cancer”38 661(1986)中進(jìn)行了揭示。1986年7月3日提交的歐洲專利申請(qǐng)86401482.4中闡述了Mo Ab CT-M-01，它主要是識(shí)別乳腺腫瘤，通過(guò)使產(chǎn)生CT-M-01的雜交系次級(jí)克隆生產(chǎn)MAC-68，它可識(shí)別乳腺癌和結(jié)腸癌。在實(shí)驗(yàn)部分闡述了主題化合物的中間產(chǎn)物以及化合物抗體配對(duì)物。但是，不能就此斷言本發(fā)明僅限于前述抗體。相反，該方法適用于所有的抗體而不管它們的分類，它們的酶促派生碎片、它們的化學(xué)處理及化學(xué)穩(wěn)定碎片以及它們相應(yīng)的嵌合和人工的配對(duì)物。靶單元也不是僅限于單克隆抗體。其它蛋白質(zhì)以及感受器在靶出口上的小分子，這些都在我們揭示的靶整體的范圍里。
本發(fā)明的Q-Sp-SS-W化合物是活性的抗生素。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋法能測(cè)定它們?cè)隗w外對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性。將含有各種濃度抗生素的Mueller-Hinton瓊脂放在佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中抗生素的濃度以稀釋二倍依次遞減。用Steer折轉(zhuǎn)裝置將1-5×104細(xì)菌菌落構(gòu)成單位接種到瓊脂的表面。在約36℃下接種約18小時(shí)后記錄抑制菌株生長(zhǎng)的化合物的最低濃度為那種菌株的最小抑制濃度(MIC)。
上述的二硫化物化合物是活性的抗腫瘤劑。
國(guó)家癌癥機(jī)構(gòu)(National Cancer Institute)已制定了特定的體外試驗(yàn)系統(tǒng)和草案以測(cè)試化合物作為抗瘤劑時(shí)的穩(wěn)定性。在“Caneer Chemotherapy Reports”第Ⅲ部分，第3卷，No.2(1972)，Geran.et al.中已經(jīng)進(jìn)行報(bào)告。這些草案建立了標(biāo)準(zhǔn)化篩選試驗(yàn)，而這些試驗(yàn)在抗腫瘤劑的試驗(yàn)領(lǐng)域中通常是需要的。在這些系統(tǒng)中，淋巴細(xì)胞白血病P388、黑色素黑瘤B16，L1210白血病和結(jié)腸26腺癌對(duì)本發(fā)明尤為重要。這些腫瘤作為小鼠的可移值腫瘤用于試驗(yàn)?？偟膩?lái)說(shuō)，在這些草案中用被治療過(guò)動(dòng)物(T)的平均存活時(shí)間超過(guò)對(duì)照動(dòng)物(C)的平均存活時(shí)間的百分增長(zhǎng)率來(lái)顯示有效的抗腫瘤活性，它表明人類白血病和固體腫瘤有相似的結(jié)果。
淋巴細(xì)胞白血病P388試驗(yàn)使用的動(dòng)物是BDF雌性小鼠。每試驗(yàn)組有5或6個(gè)小鼠。在第0天腹膜內(nèi)注射0.5毫升含1×10淋巴細(xì)胞白血病P388的細(xì)胞的稀腹水液體來(lái)移植腫瘤，在第1天、第5天和第9天(相應(yīng)于腫瘤接種)以指示的劑量用0.5毫升體積的無(wú)菌無(wú)發(fā)熱原的鹽水溶液腹腔內(nèi)注射試驗(yàn)化合物。給小鼠稱重并按30天記錄的規(guī)律記錄存活者。計(jì)算存活時(shí)間中值及被治療動(dòng)物(T)/對(duì)照動(dòng)物(C)的存活時(shí)間比率。當(dāng)T/C大于或等于125時(shí)它被認(rèn)為具有有效的抗腫瘤活性。結(jié)果如表3所示。
表3淋巴細(xì)胞白血病P338試驗(yàn)化合物劑量存活中值T/C×100(mg/kg)(天)%LL-E33288 γ1-I 0.005 145的丙酸二硫化物0.0025125(從實(shí)施例7中得到)LL-E33288 γ1-I 0.010 135的4-硝基苯基丙酸酯二硫化物0.005185(從實(shí)施例8中得到)0.00251500.00125130LL-E33288 γ1-I 0.010 24.5 223的7-(2-巰基乙氨基)-4-0.00528.5259甲基香豆酮二硫化物0.002526.0236(從實(shí)施例9中得到)0.0012521.01910.000618.51680.000316.5150對(duì)照-11.0-LL-E33288 γ1-I 0.005 18.0 164的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.002525.0125(從實(shí)施例10中得到)0.0012519.01730.000615.5141對(duì)照-11.0-LL-E33288 α3-I 0.040 15.0 136的3-巰基丙酰肼二硫化物0.020123(從實(shí)施例12中得到)對(duì)照-11.0-
表3(續(xù))淋巴細(xì)胞白血病P338試驗(yàn)化合物劑量存活中值T/C×100(mg/kg)(天)%N-乙酰基0.08021.0175LL-E33288 γ1-I 0.040 18.0 150的3-巰基丙酰肼二硫化物0.02015.0125(從實(shí)施例13中得到)對(duì)照-12.0-LL-E33288 α2-I 0.010 16.5 230的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.00521.0183(從實(shí)施例14中得到)0.002518.51610.0012518.5161LL-E33288 γ1-I 0.005 28.5 190的3-巰基丁酰肼二硫化物0.002523.0153(從實(shí)施例16中得到)0.0012521.01400.000619.5130LL-E33288 q1-I 0.010 26.5 252的3-巰基丙酰肼的二硫化物0.00518.0171(從實(shí)施例17中得到)0.002517.01620.0012516.01520.000613.01240.000314.0133LL-E33288 q1-I 0.005 24.0 200的4-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物0.002528.0233(從實(shí)施例18中得到)0.0012525.52130.000618.51540.000317.5146對(duì)照-12.0-
黑色素黑瘤B16試驗(yàn)動(dòng)物使用BDF雌性小鼠。每組有5或6個(gè)小鼠。在10毫升冷平衡的鹽溶液中使1克黑色素黑瘤B16均勻并取0.5毫升均勻的水液腹膜內(nèi)移植每個(gè)試驗(yàn)小鼠。在第1-9天(相應(yīng)于腫瘤接種而言)以指定的劑量腹膜內(nèi)注射試驗(yàn)化合物。給小鼠稱重并按60天的規(guī)律記錄存活者。計(jì)算存活時(shí)間中值以及被治療動(dòng)物(T)/對(duì)照(C)動(dòng)物的存活時(shí)間比率。T/C值大于或等于125時(shí)被認(rèn)為具有有效的抗腫瘤活性。
用本發(fā)明的種種方法(用來(lái)生產(chǎn)與表1和表2化合物結(jié)合的稱為 的單克隆抗體共軛物)能得到一些結(jié)構(gòu)物，它們與靶細(xì)胞系保持了良好的免疫反應(yīng)性，正如下列體外測(cè)定所述靶細(xì)胞將所有靶細(xì)胞保存在RPMI 1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基以5%Fetal Calf血清(FCS)、IST(Collaborative Research，Cat＃40351)、鏈霉素(50 μg/ml)、青霉素(50國(guó)際單位/毫升)、硫酸慶大霉素(50 μg/ml)和谷酰胺(0.03%)作為供給。將細(xì)胞保存在濕潤(rùn)的含5%CO2，37℃的孵箱內(nèi)。
Ⅰ.免疫反應(yīng)測(cè)定方法Ⅰ-Elisa收集合適的靶細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使之懸浮在對(duì)測(cè)定單克隆抗體(Mo Ab)最佳濃度的Dulceco's磷酸鹽緩沖鹽溶液中。在無(wú)菌組織培養(yǎng)聚苯乙烯96-坑體板的每個(gè)坑里加入0.1毫升細(xì)胞。讓平板在1，000轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘并彈去浮在表層的物質(zhì)。讓平板空氣干燥過(guò)夜并可在4℃下貯存3個(gè)月。
通過(guò)在每個(gè)坑里加入200 μl1%的明膠DPBS溶液，并將平板放在濕潤(rùn)的孵箱中在37℃下孵化1小時(shí)來(lái)封閉非特定結(jié)合位點(diǎn)(在相似的條件下進(jìn)行所有其它的孵化)。用250 μl的0.05%吐溫-20DPBS溶液(洗滌溶液)將平板洗滌一次，洗滌用來(lái)自Dyna tech(超級(jí)洗滌Ⅱ)的ELISA自動(dòng)洗滌系統(tǒng)。在0.1%明膠-DPBS溶液中，將試驗(yàn)樣品稀釋成最終濃度為3 μg/mlMo Ab當(dāng)量。從每個(gè)3μg/ml樣品中另制備六個(gè)三倍系列的稀釋物，并將100μl-式三份地加到適當(dāng)?shù)目又小５紫碌囊慌趴又环?00 μ10.1%的明膠液作為背景。讓平板孵化45分鐘然后洗滌三次。將堿性磷酸酶配對(duì)的親合純化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Cappel Cat＃8611-0231)以1∶125的比率在0.1%的明膠溶液中稀釋，并取100 μl加至每個(gè)坑里。將平板孵化45分鐘，然后洗滌三次。將200μl磷酸對(duì)一硝基苯酯基質(zhì)溶液(見(jiàn)下面)加到每個(gè)坑中。室溫下保持45分鐘后，通過(guò)加入50μl 3MNa OH來(lái)停止反應(yīng)。在從Dynatech來(lái)的自動(dòng)化分光光度儀(EIAAutoreader＃EL-310)上，在405mm下讀出每個(gè)坑內(nèi)含物的吸收值。
基質(zhì)二乙醇胺緩沖液(10%)97毫升二乙醇胺800毫升水0.2克Na N3100毫克Mg Cl2·6H2O通過(guò)連續(xù)攪拌使試劑溶解并加入1 MHCl直至pH達(dá)9.8。用水將總體積調(diào)整至1升并用0.2μ濾紙過(guò)濾滅菌。將緩沖液在4℃下黑暗中貯存。在使用前夕才將磷酸對(duì)-硝基苯酯溶于二乙醇胺的緩沖液中(必須在室溫下)使最終濃度為1mg/ml。
光密度值的計(jì)算用下列等式計(jì)算每個(gè)樣品的結(jié)合百分率(A-B)/(C-B) ×100＝結(jié)合%A＝試驗(yàn)樣品的平均光密度B＝背景的平均光密度C＝濃度為3μg/ml來(lái)處理Mo Ab對(duì)照物的平均光密度在半對(duì)數(shù)圖的非對(duì)數(shù)軸上劃分結(jié)合%并在對(duì)數(shù)軸上劃分Mo Ab濃度。從圖中找出每個(gè)試驗(yàn)樣品的BD50(即造成50%結(jié)合所需的抗體劑量)，通過(guò)下式算出免疫反應(yīng)性的保留量。
(對(duì)照的Mo Ab 的BD50)/(試驗(yàn)樣品的BD50) ×100＝保留的免疫反應(yīng)活性％方法2-非直接放射免疫分析法(RIA)將適當(dāng)量的在0.2毫升10%FCS培養(yǎng)基中的靶細(xì)胞分裝到4毫升聚苯乙烯試管中。使試驗(yàn)樣品稀釋成在10%FCS培養(yǎng)基中的2 μg/mlMo Ab當(dāng)量濃度。在每個(gè)2 μg/ml樣品中僅制備5個(gè)三倍系列的稀釋物，每個(gè)稀釋物0.2ml一式二份加到試管內(nèi)。背景樣品僅含細(xì)胞和基質(zhì)。在4℃下使細(xì)胞孵化1小時(shí)，然后用2%FCS培養(yǎng)基洗滌2次(所有RIA洗滌都用3毫升2%的FCS基質(zhì))。在每個(gè)試管內(nèi)加入0.05毫升含有約500，000CPM′S綿羊F(ab')抗小鼠Ig G[125I](Dupont，Cat＃NEX 162-0142);使細(xì)胞在4℃下再孵化1小時(shí)，用2%FCS洗滌一次，用PBS洗滌二次。在每個(gè)試管中加入0.5毫升PBS，讓細(xì)胞打旋，轉(zhuǎn)移到清潔的試管中并在Packard Gamma 500上計(jì)數(shù)1分鐘。
除了用CPM′s取代光密度單位，C＝1μg/ml(未處理Mo Ab對(duì)照的平均CPM's外，用與前述ELI SA等式相同的方法測(cè)定并作圖測(cè)出每個(gè)結(jié)合%值，每個(gè)樣品的保留免疫反應(yīng)性%如前面討論的那樣計(jì)算。
方法3-直接RIA取適當(dāng)量的在1毫升10%FCS培養(yǎng)基中的靶細(xì)胞分裝到4毫升的聚苯乙烯試管中，離心并棄去浮在上面的東西。稀釋試驗(yàn)樣品使其在10% FCS培養(yǎng)基中的濃度為200 μg/ml Mo Ab當(dāng)量。從每個(gè)200μg/ml樣品中另制得五個(gè)五倍量系列的稀釋物，0.05ml各稀釋物兩份地加入試管中。向每個(gè)試管內(nèi)加入0.05毫升125I-Mo Ab(對(duì)于每個(gè)Mo Ab和每一批應(yīng)分別決定其用量)。陽(yáng)性對(duì)照樣品中含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和125I-Mo Ab。背景樣品中含有非特定的細(xì)胞、培養(yǎng)基和125I-Mo Ab。在40℃下將細(xì)胞孵化1小時(shí)，用2%FCS培養(yǎng)基洗滌一次，用PBS洗滌二次，用前述相同的方法轉(zhuǎn)移并計(jì)數(shù)。
用下式計(jì)算每個(gè)樣品125I-Mo Ab結(jié)合抑制%(A-B)/(C-B) ×100＝125I-Mo Ab結(jié)合抑制%A＝樣品的平均CPM′SB＝背景的平均CPM′SC＝陽(yáng)性對(duì)照的平均CPM′S除了BD50實(shí)際上是BID50外(造成50% I-Mo Ab結(jié)合抑制所需的Mo Ab劑量)，用前面討論的方法計(jì)算劃分每個(gè)樣品保留的免疫反應(yīng)性。
注解1)在放射免疫分析中加入每種試劑后馬上強(qiáng)力旋轉(zhuǎn)試管。
2)在每套分析中引入相當(dāng)于50%未處理的Mo Ab對(duì)照的內(nèi)部對(duì)照樣品以確證在推斷免疫反應(yīng)的配對(duì)物保留中每個(gè)過(guò)程是否都是定量的。
這些分析的結(jié)果列于表4表4Mo Ab配對(duì)物的免疫反應(yīng)性用LL-E33288 α3I未修飾Mo Ab對(duì)照物的3-巰基丙酸二硫的免疫反應(yīng)性%化物的酰肼產(chǎn)物的非特定制備配對(duì)物(實(shí)施例6)與下列物質(zhì)配對(duì)Lym178CT-M-0181N-乙?；?LL-E33288 δ1I的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例7)與下列物質(zhì)配對(duì)制備未修飾Mo Ab對(duì)照物的免疫反應(yīng)性%Lym182CT-M-01100B72.3100LL-E33288 α2I的-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例8)與下列物質(zhì)配對(duì):
CT-M-0156
表4(續(xù))Mo Ab配對(duì)物的免疫反應(yīng)性碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例9)與下列物質(zhì)配對(duì)CT-M-0150LL-E33288 δ1I的3-巰基丁酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例10)與下列物質(zhì)配對(duì)Lym173LL-E33288 δ13的3-巰基異戊酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例11)與下列物質(zhì)配對(duì)制備未修飾Mo Ab對(duì)照物的免疫反應(yīng)性%Lym164%LL-E33288 δ1I的對(duì)-巰基二羥基內(nèi)桂酸二硫化物的酰肼(實(shí)施例12)與下列物質(zhì)配對(duì):
Lym161%本發(fā)明的單克隆抗體配對(duì)物是活性的抗癌劑。下面所述的分析用于分析體外的細(xì)胞毒性，它顯示相對(duì)于非靶細(xì)胞而言靶細(xì)胞系構(gòu)成物的顯著適用性，它提供了比較與化合物非靶形式的化合物靶形式的利用方法。
細(xì)胞毒性分析體外將樣品稀釋成與母體藥物等當(dāng)量濃度，即0.2或0.02μg/ml(起始濃度視待試驗(yàn)的細(xì)胞系及母體藥物的效力而定)。從每個(gè)原始樣品稀釋液中另制得三份或四份五倍量的稀釋液并取出0.2毫升加到消毒的15毫升聚苯乙烯試管中。在每次分析中至少包括一個(gè)由母體藥物與不相關(guān)的Mo Ab組成的相似配對(duì)物以測(cè)定相關(guān)配對(duì)物的特異性。將105個(gè)在0.2毫升10%CFS培養(yǎng)基中的靶細(xì)胞等分加入各試管內(nèi)并旋轉(zhuǎn)。另外，上述試驗(yàn)用不相關(guān)細(xì)胞作為靶來(lái)進(jìn)行以進(jìn)一步確證相應(yīng)配對(duì)物的特異性。收集到的Mo Ab對(duì)照物與在10%FCS培養(yǎng)基中收集到的Mo Ab和陽(yáng)性對(duì)照樣品等當(dāng)量。
將細(xì)胞在37℃下孵化7分鐘，然后用8毫升2%FCS培養(yǎng)基洗滌4次。在每個(gè)試管中加入0.1毫升10%FCS，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，然后在無(wú)菌的96-坑聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)平板的每個(gè)坑內(nèi)加入0.2ml。
將平板在濕潤(rùn)的37℃孵卵器中用5%CO2孵化2天。除去一半培養(yǎng)基并用含有2微居里/毫升3H胸腺嘧啶脫氧核苷(Dupont，NEN，Cat＃NET-027)的新鮮培養(yǎng)基而取代。繼續(xù)孵化24小時(shí)，將細(xì)胞冷凍、解凍并用PHD細(xì)胞收集器(Cambridge Technology，Inc.)收集。在Beckman L S5800閃爍記數(shù)器的第1道上使每個(gè)樣品記數(shù)1分鐘。
如下計(jì)算生長(zhǎng)抑制%(試驗(yàn)值的平均CPM)/(培養(yǎng)基對(duì)照的平均CPM) ×100＝生長(zhǎng)%100-生長(zhǎng)%＝抑制%在半對(duì)數(shù)圖上將抑制%劃在非對(duì)數(shù)軸上，將母體藥物濃度劃分在對(duì)數(shù)軸上。從圖上找出每個(gè)試驗(yàn)樣品的IC50(引起50%抑制的母體藥物濃度)，用下式計(jì)算出細(xì)胞毒性的殘留量。
(母體藥物的I C50)/(試驗(yàn)樣品的I C50) ×100＝殘留的細(xì)胞毒性％將體外細(xì)胞毒性分析的結(jié)果制成下表5。
表5Mo Ab配對(duì)物的體外細(xì)胞毒性Mo Ab細(xì)胞毒性用實(shí)施例6的產(chǎn)物 % LL-E33288 α3I與:Lym1500的酰肼配對(duì)物CT-M-01300用實(shí)施例7的% N-乙酰基LL-E33288 δ1I產(chǎn)物與:Lym1400的酰肼配對(duì)物CT-M-01700Mo Ab細(xì)胞毒性用實(shí)施例8的% 實(shí)施例8產(chǎn)物產(chǎn)物與:CT-M-01-18的酰肼配對(duì)物用實(shí)施例9的% 實(shí)施例9的產(chǎn)物產(chǎn)物與:CT-M-01100的酰肼配對(duì)物用實(shí)施例10的% 實(shí)施例10的產(chǎn)物產(chǎn)物與:Lym1400的酰肼配對(duì)物用實(shí)施例11的% 實(shí)施例11的產(chǎn)物產(chǎn)物與:Lym1320
的酰肼配對(duì)物用實(shí)施例12的% 實(shí)施例12的產(chǎn)物產(chǎn)物與:Lym1560的酰肼配對(duì)物下列分析系統(tǒng)用來(lái)測(cè)量本發(fā)明配對(duì)物的體內(nèi)活性。
在無(wú)胸腺(裸)小鼠上異種移植人體腫瘤來(lái)進(jìn)行藥物-單克隆抗體配對(duì)物抗腫瘤活性的體內(nèi)試驗(yàn)。
從培養(yǎng)燒瓶中采集Burkitt淋巴瘤細(xì)胞(Raji)和骨髓瘤細(xì)胞(HS Sultan)并使之在試驗(yàn)小鼠內(nèi)皮下孵化(≥80×106Raji細(xì)胞或40×106HS Sultan細(xì)胞)。讓固體腫瘤、卵巢癌(CA73，Ovcar-3)、乳腺癌(MX-1)和結(jié)腸癌(L S174 T)在無(wú)胸腺小鼠內(nèi)繁殖、切除，割成2mm3大小的碎片再皮下移植到試驗(yàn)小鼠內(nèi)(每只小鼠5-8個(gè)碎片)。
移植在腫瘤植入后第2、3、4、6、7或8天起，對(duì)動(dòng)物每3天腹腔內(nèi)分別注射藥物、單克隆抗體和藥物-單克隆抗體配對(duì)物，總共作三次或五次。用Fowler ultra CAL II電子卡尺在植入腫瘤的4-6周內(nèi)每隔7天測(cè)量腫瘤(腫瘤的長(zhǎng)度和寬度)。從下式算出腫瘤的質(zhì)量(長(zhǎng)度(mm)×高度(mm))/2計(jì)算每試驗(yàn)組的控制百分率[治療過(guò)(T)的平均mg除以對(duì)照(C)的平均(mg)×100]，作為腫瘤生長(zhǎng)的抑制指標(biāo)。T/C值≤42%，并且存活動(dòng)物率≥65%被認(rèn)為具有活性。
該分析結(jié)果列于表6中。
表6體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果劑量(mcq)腫瘤大小S/TMo Ab藥物(T/C)控制LL-E33288 α3I2.8 0.75 1.3 6/6的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lym1配對(duì)物只有LL-E33288 α3I- 0.75 365 6/6只有酰肼-0.753306/6只有Mo AbLym28-686/6腹腔內(nèi)注射對(duì)人體Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji TC進(jìn)行治療,治療在腫瘤植入后7天起開(kāi)始,共進(jìn)行三次注射,在腫瘤植入后28天時(shí)進(jìn)行測(cè)量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMo Ab藥物(T/C)控制%LL-E33288 α3I0.3 2.0 0.02 6/6的3-巰基丙酸二硫化物酰肼與CT-M-01配對(duì)物只有LL-E33288 α3I- 2.0 - 0/6只有Mo AbCT-M-0183-755/6長(zhǎng)春新堿(陽(yáng)性對(duì)照)-201.25/5對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞系M×01腹腔內(nèi)注射治療,腫瘤植入后2天起開(kāi)始共三次,在腫瘤植入后35天進(jìn)行測(cè)量。
LL-E33288 δ1I的N- 50 0.22 23 7/7{[(4-甲基香豆素-7-基)-氨基]乙?；鶀半胱氨酸二硫化物的酰肼與Lyml配對(duì)物只有酰肼-0.222284/7只有Mo AbLym150-617/7混合物、酰肼加Mo Ab500.22567/7Lym1對(duì)人體Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji TC腹腔內(nèi)注射治療在植入腫瘤后7天起開(kāi)始,共三次,在腫瘤植入后的35天測(cè)量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMo Ab藥物(T/C)控制%N-乙?；鵏L-1251.006/6E33288 δ1I的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lyml配對(duì)物只有酰肼-2.0713/6混合物,N-乙?；?251.051/6LL-E33288 δ1I加上Mo AbCT-M-01N-乙?；鵏L--1.0462/6E33288 δ1I對(duì)人體乳腺癌系MX-1靜脈注射治療在植入腫瘤后的第2天開(kāi)始,共計(jì)三次,在腫瘤植入后的42天開(kāi)始測(cè)量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMo Ab藥物(T/C)控制%
N-乙?；鵏L-371.0116/6E33288 δ1I的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與Lyml配對(duì)物只有酰肼-1.05176/6只有N-乙酰基LL--0.52266/6E33288 δ1I只有Mo AbLym137-1786/6對(duì)人體Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji TC靜脈注射治療,植入腫瘤后第7天開(kāi)始共三次,腫瘤植入后第35天進(jìn)行測(cè)量。
N-乙?；鵏L-1272.7616/6E33288 δ1I的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與B72.3配對(duì)物只有N-乙酰基-2.0321/6LL-E33288 δ1I只有Mo AbB72.3127-1256/6長(zhǎng)春新堿(陽(yáng)性對(duì)照)-20236/6對(duì)人體結(jié)腸癌細(xì)胞系L S174 T靜脈注射治療,在腫瘤注入后第8天開(kāi)始共三次,腫瘤植入后第21天進(jìn)行測(cè)量。
表6(續(xù))劑量(mcq)腫瘤大小S/TMo Ab藥物(T/C)控制%N-乙?；鵏L-1122.7405/6E33288 δ1I的3-巰基丙酸二硫化物的酰肼與
CT-M-01配對(duì)物只有N-乙?；鵏L--2.0321/6E33288 δ1I長(zhǎng)春新堿(陽(yáng)性對(duì)照)-20236/6對(duì)人體結(jié)腸癌系L S174 T靜脈注射治療植入腫瘤后第8天開(kāi)始,共三次,腫瘤植入后第21天進(jìn)行測(cè)量。
LL-E33288 α1I的 24 1.0 0.33 2/63-巰基丙酸二硫化物的酰肼與CT-M-01配對(duì)物只有酰肼-1.0-0/6對(duì)人體乳腺癌細(xì)胞系MX-1靜脈注射治療,植入腫瘤后第2天開(kāi)始,共三次,注入后第35天進(jìn)行測(cè)量。
本發(fā)明將結(jié)合下列不被限制的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1LL-E33288 γI1的3-巰基丙酸二硫化物將106毫克3-巰基丙酸在1毫升乙腈中的物質(zhì)加到90毫克LL-E33288 γI1在90毫升乙腈中的溶液中。旋轉(zhuǎn)溶液，然后在-20℃下貯存6天。真空除去溶劑，殘留物用10毫升硅膠(二氯甲烷內(nèi)裝柱)進(jìn)行色譜層析。色柱依次用50毫升二氯甲烷、50毫升含4%甲醇的二氯甲烷中及100毫升含8%甲醇的二氯甲烷進(jìn)行洗脫。將最后的洗脫劑餾分蒸干得到殘留物，使之溶于輔于少量丙酮的乙酸乙酯中，向內(nèi)滴加入過(guò)量己烷。收集沉淀物并干燥給出39毫克所需的產(chǎn)物(FABMS，M+H 1394)。
實(shí)施例2LL-E33288 γI1的對(duì)-硝基苯基3-巰基丙酸二硫化物A)3-巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯的制備將含催化量濃硫酸在二氯甲烷中的市售的3-巰基丙酸用異丁烯處理20分鐘。然后該溶液用IN碳酸氫鈉萃取。在這之后用無(wú)水硫酸鎂干燥二氯甲烷溶液。蒸發(fā)溶液得到一種無(wú)色流動(dòng)的液體，其NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明它是S-叔丁基巰基丙酸，叔丁酯。
該酯的等分部分在用6N鹽酸的二噁烷液的回流2.5小時(shí)蒸去溶劑，加入乙酸乙酯并用碳酸鈉萃取該溶液。用6N鹽酸處理碳酸鈉萃取物直至懸浮液的pH為2.0。然后懸浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液用無(wú)水硫酸鎂干燥，蒸去溶劑得到一種無(wú)色液體，其1H NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明它是S-叔丁基巰基丙酸。
在四氫呋喃中用等摩爾的對(duì)-硝基苯酚和二環(huán)己基碳化二亞胺處理4小時(shí)使該化合物轉(zhuǎn)變成對(duì)-硝基苯酯。通過(guò)過(guò)濾除去產(chǎn)生的二環(huán)己基脲素，蒸干濾液得油狀產(chǎn)物，并用中性硅膠以己烷∶二氯甲烷(50∶50)溶劑系統(tǒng)純化。純將的對(duì)-硝基苯酯衍生物是淡黃色的、流動(dòng)的油狀物質(zhì)。
下列方法可以暴露游離的硫醇。將S-叔丁基巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯溶于三氟乙酸并加入摩爾稍過(guò)量(10%)的乙酸汞。讓混合物攪拌30分鐘，然后蒸去三氟乙酸并讓殘留物溶于二甲基甲酰胺中。用硫化氫將溶液處理15分鐘，然后濾去黑色的硫化汞，減壓蒸發(fā)濾液以除去99%的二甲基甲酰胺。所得的淡褐色流體狀的液體經(jīng)中性硅膠用己烷∶二氯甲烷(50∶50)純化。經(jīng)1H NMR所顯示主要成分是含有少量叔丁基巰基衍生物。在串聯(lián)的二根Perkin-Elmer Pecosphere C18柱上用37.5/62.5-47.5/52.5的乙腈梯度系統(tǒng)和pH為6.5(乙酸)的0.1M乙酸銨緩沖液在12分鐘內(nèi)進(jìn)行高壓液相色譜分析，結(jié)果表明產(chǎn)物是88%3-巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯和10%低極性S-叔丁基巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯。也有少量的游離對(duì)-硝基苯酚存在。
(B)3-巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯與LL-E33288 γI1反應(yīng)將100毫克LL-E33288 γI1溶于毫升乙腈中。將25.7毫克3-巰基丙酸對(duì)-硝基苯酯在1毫升乙腈中的溶液加進(jìn)去。在-20℃下讓反應(yīng)進(jìn)行48小時(shí)。HPLC指示反應(yīng)完全。讓溶液蒸發(fā)至干并用聲波作用使殘留物溶于4-5毫升乙酸乙酯中。讓混合物過(guò)濾，將濾液滴入45毫升攪拌著的己烷中，收集所得的淡黃色固體并減壓干燥得到93毫克由1H NMR測(cè)定的LL-E33288 γI1的丙酸對(duì)-硝基苯酯衍生物。在FABMS測(cè)定中[M+H]離子出現(xiàn)在m/z＝1515。
用50%乙腈/0.1M乙酸銨水液的C18反轉(zhuǎn)相HPLP的保留時(shí)間是18分鐘(LL-E33288 δI1是8分鐘，酯水解產(chǎn)物是1.5分鐘)。
實(shí)施例3LL-E33288 γI1的N-羥基琥珀酰亞氨基3-巰基丙酸二硫化物在5毫克3-巰基丙酸二硫化物(歐洲專利公報(bào)中已知的LL-E33288 γI1的類似物)在0.5毫升四氫呋喃中的溶液內(nèi)，先加入0.45毫克N-羥基琥珀酰亞胺在0.1ml四氫呋喃中的溶液，后再加入1.8mg三環(huán)己基碳基二亞胺在0.2ml四氫呋喃中的溶液。讓反應(yīng)在室溫下攪拌4小時(shí)，然后用大量己烷中止反應(yīng)。過(guò)濾分離固體并使之溶于乙酸乙酯中。所得的溶液用鹽水洗滌三次，用硫酸鎂干燥并蒸發(fā)得到5毫克所需的產(chǎn)物，它為棕褐色粉末不用進(jìn)一步純化。用40%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液的反轉(zhuǎn)相C18HPLC上的保留時(shí)間是15分鐘。(起始物料的保留時(shí)間是6.0分鐘)。
實(shí)施例4LL-E33288 γI1的3-巰基丙酰肼二硫化物在通氬氣下，向回流著的5.4毫升(3 eq)無(wú)水酰肼在100毫升四氫呋喃溶液中，2小時(shí)里，滴加9.2毫升(83毫摩爾)3-巰基丙酸甲酯在50毫升四氫呋喃中的溶液。再讓溶液回流2小時(shí)，蒸干，然后用300毫升甲苯稀釋蒸發(fā)兩次。產(chǎn)物置在用5%乙酸乙酯/氯仿裝柱的硅膠塞上并用20%甲醇/氯仿液洗脫。所得的3-巰基丙酰肼是淡桃紅色油狀產(chǎn)物，冷卻時(shí)它固化但在室溫下融化。
將在1毫升四氫呋喃中的6.6毫克3-巰基丙酰肼加到50毫克LL-E33288 γI1在50毫升乙腈中的溶液內(nèi)。加入1當(dāng)量三乙胺或1當(dāng)量三乙胺和1當(dāng)量乙酸。讓反應(yīng)在0℃下攪拌進(jìn)行1小時(shí)，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上使殘留物進(jìn)行色譜層析得到26毫克所需產(chǎn)物。FABMS，m/z＝1408(M+H);反轉(zhuǎn)相C18HPLC的保留時(shí)間＝5.0分鐘(在41%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液中)。
實(shí)施例5LL-E33288 γI1的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基半胱氨酸酰肼二硫化物將1.0克(5.7毫摩爾)4-甲基-7-氨基香豆素、3.0毫升溴代乙酸乙酯(5eq)、90毫克(0.1eq)碘化鈉和30毫升二甲基甲酰胺的混合物在通氬氣下于80℃加熱5小時(shí)。讓混合物冷卻，用乙醚稀釋，用50%鹽水洗滌三次，用硫酸鎂干燥并蒸干。將粗產(chǎn)品溶于含1%乙酸乙酯的氯仿中并經(jīng)過(guò)硅膠塞子過(guò)濾。用含有痕量氯仿的乙醚重結(jié)晶得到純凈的N-[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酸乙酯。
將10毫升1N的氫氧化鈉水溶液加到1.96克(7.5毫摩爾)上述酯在15毫升甲醇及15毫升四氫呋喃的溶液中。30分鐘后加入4毫升10%鹽酸水溶液。蒸去有機(jī)溶劑并過(guò)濾得到結(jié)晶產(chǎn)物，用冷乙醇然后用醚洗滌。將該物質(zhì)溶于20毫升四氫呋喃和4毫升二甲基甲酰胺中。加入二環(huán)己基羰基二咪唑(1.3克，2.2eq)并讓反應(yīng)攪拌進(jìn)行15分鐘。然后加入半胱氨酸乙酯氫氯化物(1.6克，2.5eq)和三乙胺(1.2毫升)。再過(guò)三小時(shí)后，用含有5%二氯甲烷的醚稀釋反應(yīng)液，用10%鹽酸水液洗滌一次用鹽水洗滌二次。用硫酸鎂干燥后蒸去溶劑，通過(guò)使其溶于含有微量乙醇的氯仿中，然后加入過(guò)量的醚使粗產(chǎn)品結(jié)晶出來(lái)。過(guò)濾結(jié)晶并干燥得到純凈的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸乙酯。
在通氬氣下使5毫升氯仿、20毫升甲醇和0.4毫升酰肼水合物加熱回流。向內(nèi)加入550毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼嵋阴ァ；亓?小時(shí)后讓混合物冷卻并濾得固體產(chǎn)品，用氯仿然后用乙醚洗滌。將粗產(chǎn)品(它含有硫醇和二硫化物)溶于含有二硫代蘇糖醇和三乙胺的二甲基甲酰胺中。30分鐘后用過(guò)量乙醚使產(chǎn)品析出并通過(guò)過(guò)濾收集。用含有二硫蘇糖醇和痕量三乙胺的脫氣乙腈重結(jié)晶使物質(zhì)進(jìn)一步純化得到純凈的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼。
在0℃下將在1.2毫升二甲基甲酰胺中的4毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙?；腚装彼狨ｋ录拥?2毫克LL-E33288 γI1在12毫升乙腈的溶液中。攪拌過(guò)液后再加入0.6毫升二甲基甲酰胺中的2毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼。讓反應(yīng)在0℃下攪拌3天并過(guò)濾。蒸去乙腈，所得的二甲基甲酰胺用過(guò)量1∶1己烷/醚稀釋。過(guò)濾分離產(chǎn)物，用15-20%梯度的甲醇氯仿溶液通過(guò)硅膠色譜層析進(jìn)一步純化得到3毫克所需的產(chǎn)品。用45%乙腈/0.1M乙酸銨水溶液的反轉(zhuǎn)相C18HPLC上的保留時(shí)間為3.5分鐘(在同樣系統(tǒng)中LL-E33288 δI1是15.5分鐘)。
實(shí)施例6LL-E33288 αI3的3-巰基丙酰肼二硫化物在-15℃下將在1毫升乙腈中的6.6毫克3-巰基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI3在9毫升乙腈的溶液中。加入1當(dāng)量三乙胺或1當(dāng)量三乙胺和1當(dāng)量乙酸。讓反應(yīng)在0℃下進(jìn)行1小時(shí)，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%梯度的甲醇氯仿液通過(guò)硅膠色譜層析純化給出所需的產(chǎn)物。
FABMS。m/g-1251(M+H);在45%乙腈/0.1M乙酸銨的系統(tǒng)中，反轉(zhuǎn)相C18HPLC上的保留時(shí)間是2.1分鐘(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 αI55.7分鐘)。
實(shí)施例7N-乙?；鵏L-E33288 γI1的3-巰基丙酰肼在-15℃時(shí)，將在85微升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在10毫升乙腈中。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在0℃下進(jìn)行2小時(shí)并蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析純化得到所需的產(chǎn)品。FABMS，m/z＝1450(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是2.5分鐘(在同樣的系統(tǒng)中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是6.6分鐘)。
實(shí)施例8LL-E33288 αI2的3-巰基丙酰肼二硫化物在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI2在10毫升乙腈中去。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在0℃下攪拌進(jìn)行，然后蒸去溶劑。用5-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析使殘留物純化得到所需的產(chǎn)品。FABMS，m/z＝1248(M+H);用58%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是2.6分鐘(LL-E33288 αI2在相同系統(tǒng)中的保留時(shí)間是7.5分鐘)。
實(shí)施例9碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巰基丙酰肼二硫化物在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到10毫克碘代LL-E33288假糖苷配基在9毫升乙腈中。加入1當(dāng)量三乙胺作為催化劑。讓反應(yīng)在0℃下攪拌進(jìn)行1小時(shí)，然后蒸去溶劑。用殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產(chǎn)物。FABMS，m/z＝1091(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是2.8分鐘。(在同樣系統(tǒng)中碘代LL-E33288假糖苷配基是7.9分鐘)。
實(shí)施例10LL-E33288 γI1的3-巰基丁酰肼二硫化物將18毫升(0.26摩爾)硫代乙酸加到17.2克(0.2摩爾)巴豆酸中。在通氬氣下將該混合物回流加熱6小時(shí)。在吸氣器真空下除去過(guò)量的硫代乙酸，使所得的油溶于100毫升含200μl濃硫酸的無(wú)水乙醇中。讓該反應(yīng)物回流10小時(shí)，然后在抽氣器真空下減少體積。加入己烷，依次用二份飽和的碳酸氫鈉和一份水洗滌所得的溶液。然后用硫酸鎂干燥該溶液、過(guò)濾并減少體積而成油狀產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物溶于含于12毫升肼的250毫升甲醇中，將所得的混合物在通氬氣下回流10小時(shí)。減少反應(yīng)混合物的體積，然后用Kugelrohr快速蒸餾并用氯仿-己烷的混合物結(jié)晶得到3-巰基丁酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq3-巰基丙酰肼加到5毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在0℃下攪拌進(jìn)行1小時(shí)，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度使殘留物進(jìn)行色譜層析得到所需的產(chǎn)物。FABMS，m/e＝1422(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是3.5分鐘。(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是13.4分鐘)。
實(shí)施例11LL-E33288 γI1的3-巰基異戊酰肼二硫化物將9毫升(0.13摩爾)硫代乙酸加到10克(0.1摩爾)3，3二甲基丙烯酸中。將該混合物在通氬氣下回流加熱6小時(shí)。在抽氣器真空下除去過(guò)量的硫代乙酸，將所得的油狀產(chǎn)物溶于含有200微升濃硫酸的100毫升無(wú)水乙醇中。在加入16毫升肼前讓反應(yīng)回流34小時(shí)。在通氬氣下讓所得的混合物回流24小時(shí)。讓反應(yīng)混合物減少體積然后溶于鹽水和飽和碳酸氫鈉的混合物中。用一定體積的氯仿數(shù)次萃取產(chǎn)物。用硫酸鎂干燥合并的氯仿層、過(guò)濾并減少體積得到油狀產(chǎn)物。該油狀產(chǎn)物經(jīng)快速色譜層析用甲醇-氯仿梯度純化，然后用氯仿-己烷結(jié)晶得到3-巰基異戊酰肼。
在-15℃下將在100微升乙腈中的1.5eq 3-巰基異戊酰肼加到15毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1當(dāng)量三乙胺作為催化劑。讓反應(yīng)在室溫下攪拌進(jìn)行3小時(shí)，然后蒸去溶劑。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析殘留物得到所需的產(chǎn)物。FABMS，m/z＝1436(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC的保留時(shí)間是3.9分鐘(在同樣系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是13.4分鐘)。
實(shí)施例12LL-E33288 γI1的對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物將含有一滴濃硫酸的15毫升甲醇加到500毫克對(duì)-巰基二氫肉桂酸中。讓反應(yīng)回流進(jìn)行5小時(shí)，然后冷卻至室溫。加入肼(1.5毫升)并在通氬氣下讓所得混合物回流2小時(shí)，然后在室溫下攪拌10小時(shí)。將200毫克的二硫代蘇糖醇加入以還原尚存的二硫化物并讓反應(yīng)混合物冷至-15℃。濾得所得的結(jié)晶，用醚和甲醇的混合物洗滌，然后在真空爐上干燥150·/5微米/10小時(shí))得到對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 γI1在25毫升乙腈中的物質(zhì)中。殘留物在硅膠上用10-15%在氯仿中甲醇梯度進(jìn)行色譜層析得到所需的產(chǎn)品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是5.4分鐘(在相同系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是13.4分鐘)。
實(shí)施例13N-乙?；鵏L-E33288 γI1的3-巰基異戊酰肼二硫化物在-15℃下將在6.2毫升中的3eq3-巰基異戊酰肼加到20毫升N-乙?；鵏L-E33288 γI1在15毫升乙腈中的物質(zhì)內(nèi)。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在室溫下攪拌進(jìn)行2小時(shí)，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產(chǎn)品。用50%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是2.5分鐘9(在相同系統(tǒng)中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是6.6分鐘)。
實(shí)施例14N-乙?；鵏L-E33288 γI1的3-巰基丁酰肼二硫化物在-15℃下將在5毫升乙腈中的3eq 3-巰基丁酰肼加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物質(zhì)內(nèi)。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在室溫下攪拌進(jìn)行10小時(shí)，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產(chǎn)物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水溶液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是7.3分鐘(在同樣系統(tǒng)中N-乙?；鵏L-E33288 γI1的保留時(shí)間是5.6分鐘)。
實(shí)施例15N-乙?；鵏L-E33288 γI1的對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物在-15℃下將在2.0毫升乙腈中的3.0eq對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物質(zhì)內(nèi)。加入1當(dāng)量三乙胺。讓反應(yīng)在室溫下攪拌進(jìn)行2小時(shí)，然后蒸去溶劑。殘留物在硅膠上用10-15%在氯仿中的甲醇梯度進(jìn)行色譜層析得到所需的產(chǎn)物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是7.3分鐘(在同樣系統(tǒng)中N-乙?；鵏L-E33288 γI1的保留時(shí)間是5.6分鐘)。
實(shí)施例16與蛋白質(zhì)的非特定配對(duì)物在弱堿性條件下將實(shí)施例3所述的羥基琥珀酰胺酯共價(jià)結(jié)合到抗體上。下面是制備列于表7中的抗體配對(duì)物的一般過(guò)程?？贵w在磷酸緩沖液中的濃度為3-5毫克/毫升，該緩沖液含有0.1M氯化鈉，pH為7.5，加入5-20倍摩爾過(guò)量的實(shí)施例3產(chǎn)物，在室溫下攪拌反應(yīng)1-4小時(shí)。蛋白質(zhì)配對(duì)物經(jīng)色譜分離脫鹽，聚集蛋白質(zhì)通過(guò)硅膠過(guò)濾HPLC而與單體物質(zhì)分開(kāi)。將單體部分合并起來(lái)并濃縮。
表7用實(shí)施例3產(chǎn)品制得的非特定配對(duì)物Mo Ab 藥物負(fù)載M/MLyml5.2B72.36.0B72.36.9實(shí)施例17制備特定位點(diǎn)配對(duì)值在T.J.Mckearn，et al.美國(guó)專利第4，671，958號(hào)中闡述了將藥物的酰肼衍生物結(jié)合到氧化抗體上的一般方法。該方法經(jīng)如下所述特定修飾已用來(lái)制備與實(shí)施例4-15的產(chǎn)物結(jié)合的抗體配對(duì)物。表7中綜述了這些反應(yīng)的產(chǎn)物及其特征。
(A)抗體氧化將濃度為5-10毫克/毫升抗體放在200倍體積的50m M乙酸鈉緩沖液中滲析過(guò)夜，該緩沖液的pH為5.5它含有0.1M氯化鈉(緩沖液A)。滲析后，用15mM-200mM過(guò)碘酸在0.2M乙酸鈉中的溶液使Mo Ab氧化。氧化反應(yīng)在黑暗中4℃下攪拌進(jìn)行45分鐘，在此之后使氧化的Mo Ab在≥5容積Sephadex G-25柱上脫鹽。通過(guò)使氧化抗體與對(duì)-硝基苯肼反應(yīng)并比較在280mm蛋白質(zhì)的吸收以及在395mm處對(duì)-硝基苯肼的吸收來(lái)分析抗體的氧化程度。
(B)藥物酰肼配對(duì)物使氧化的Mo Ab與10-200倍量摩爾過(guò)量的藥物酰肼反應(yīng)。將酰肼溶于二甲基甲酰胺中并加入Mo Ab的水溶液。為了避免Mo Ab析出，二甲基甲酰胺的最后體積不要超過(guò)總反應(yīng)體積的10%。讓反應(yīng)在室溫下攪拌進(jìn)行3小時(shí)，為了防止未反應(yīng)的醛交聯(lián)及相應(yīng)的聚集，在加入藥物酰肼3小時(shí)加入100倍摩爾過(guò)量的阻斷劑和乙酰肼。為了穩(wěn)定在醛和藥物酰肼(腙)之間的Schiff′s堿的鍵合，通常加入10mM氰基硼氫化鈉，并讓反應(yīng)多進(jìn)行小時(shí)(總的配對(duì)時(shí)間4小時(shí))使產(chǎn)物還原成烷基肼。配對(duì)物經(jīng)色譜層析脫鹽并在pH6.5磷酸緩沖液中完全滲析(最少時(shí)間為48小時(shí))以供貯存和試驗(yàn)。
通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC來(lái)分析配對(duì)物中聚集物的存在，通過(guò)反轉(zhuǎn)相HPLC來(lái)分析配對(duì)物中游離藥物的存在。用抗體和藥物兩者的衰變消光系數(shù)來(lái)確定配對(duì)物中藥物的摩爾濃度從而使藥物負(fù)載能從光譜學(xué)上得到測(cè)定。
表7從實(shí)施例4的產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物Mo Ab制備藥物負(fù)載M/M
CTM-01#13.1#22.3#32.9MAC-68#11.7#23.1#32.4從實(shí)施例5產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物L(fēng)ym1#10.15#20.76#33.2表7(續(xù))從實(shí)施例6產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物Mo Ab制備藥物負(fù)載(M/M)Lym13.0CT-M-01#12.4#22.9從實(shí)施例7產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物L(fēng)ym12.8Lym21.4B72.3#12.1#22.4CT-M-01#11.6#23.6
#32.5#42.4從實(shí)施例9產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物CT-M-014.8從實(shí)施例9產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物CT-M-013.0從實(shí)施例10產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物L(fēng)ym 13.7從實(shí)施例11產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物Mo Ab制備藥物負(fù)載M/MLym 16.2從實(shí)施例12產(chǎn)物中制得的酰肼配對(duì)物L(fēng)ym 13.5實(shí)施例18LL-E33288 γI1的對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼二硫化物將含有一滴濃硫酸的15毫升甲醇加到500毫克(2.75毫摩爾)對(duì)-巰基二氫肉桂酸中。讓該反應(yīng)物回流5小時(shí)，然后冷卻至室溫。加入肼(1.5毫升)，在通氬氣下使所得的混合物回流2小時(shí)，然后在室溫下攪拌10小時(shí)。加入200毫克的二硫代蘇糖醇以還原任何尚存的二硫化物，將反應(yīng)混合物冷卻至-15℃。過(guò)濾得到所得的晶體，用醚和甲醇的混合物洗滌，然后在真空爐中(50·/5微米/10小時(shí))干燥得到對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼。
在-15℃下將在1毫升乙腈中的1.5eq對(duì)-巰基二氫肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 CI1在25毫升乙腈中的物質(zhì)內(nèi)。讓反應(yīng)在0℃下攪拌反應(yīng)10小時(shí)，然后蒸去溶劑。殘留物用10-15%在氯仿中甲醇梯度在硅膠上色譜層析得到所需的產(chǎn)品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氫銨水液在C18反轉(zhuǎn)相HPLC上的保留時(shí)間是5.4分鐘(在同樣的系統(tǒng)中LL-E33288 γI1的保留時(shí)間是13.4分鐘)。
權(quán)利要求
1.制備式CH3-SSS-W化合物的靶衍生物的方法 (其中CH3-SSS-W是抗腫瘤抗生素LL-E33288αBR1、αI1、αBR2、αI2、αBR3、αI3、αBR4、βI4、βBR1、βI1、βBR2、γI2、γI1、δBR1、碘代或溴代假糖苷配基、它們的二氫或N-乙?；鶎?duì)應(yīng)物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它們的N-乙?；鶎?duì)應(yīng)物)，其特征在于它包括在乙腈中在1當(dāng)量三乙胺或1當(dāng)量三乙胺和1當(dāng)量乙酸存在下在-10℃～-30℃溫度下使CH3-SSS-W與或Q-Sp-SH反應(yīng)1～48小時(shí)，其中Sp是直鏈或支鏈的二價(jià)或三價(jià)(C1-C18)基團(tuán)，二價(jià)或三價(jià)芳基或芳雜基，二價(jià)或三價(jià)(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基，二價(jià)或三價(jià)芳基-或雜芳基-烷基(C1-C18)，二價(jià)或三價(jià)環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)或者二價(jià)或三價(jià)(C2-C18)不飽和烷基，其中如果Sp是三價(jià)基團(tuán)，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳雜氨基、羧基、低級(jí)烷氧基、羥基、硫羥基或低級(jí)烷基硫代基所取代，如果當(dāng)CH3-SSS-W是抗腫瘤抗生素LL-E33288α1-Br、α1-I、α2-Br、α3-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724母體時(shí)，則Sp不可是二價(jià)；Q是鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基、低級(jí)烷基二羧基醛基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、NHCSNHNH2、-ONH2或 將式為Q-Sp-SS-W的中間產(chǎn)物分離出來(lái)，(其中Q、Sp和W的定義同前)，然后在pH6.5～9的緩沖水溶液中在4～40℃下直接反應(yīng)或在水溶性碳化二亞胺存在下使式Q-Sp-SS-W(其中Sp和W的定義同前，Q是鹵素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羥基或低級(jí)烷基二羧醛基)與式Tu-(Y)n的分子反應(yīng)(其中Tu是單克隆或多克隆抗體、它的碎片、它的化學(xué)處理或基因處理對(duì)應(yīng)物或生長(zhǎng)因子或類固醇，Y是側(cè)鏈的氨基或羧基官能團(tuán)；n是1～100)，產(chǎn)生化合物 其中Tu、Sp、W、n和Y的定義同前，m是1～15，Z是由基團(tuán)Q和Y共價(jià)反應(yīng)而形成的，它是-CONH-、-NH-、 -N=CH-或是-CO-；或者在諸如碳化二亞胺的羧基活化劑存在下使式Q-Sp-SS-W(Sp和W的定義同前，Q是羧酸)化合物與N-羥基琥珀酰亞胺、2，3，5，6-四氟苯酚、五氟苯酚或4-硝基苯酚反應(yīng)產(chǎn)生式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是 并在pH6.5～9之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃間的溫度下與Tu-(Y)n的分子(其中Tu和n的定義同前，Y是側(cè)鏈氨基)進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生式為 -(Z-Sp-SS-W)m的化合物，其中Tu、Sp、Y和n的定義同前，m是1～15，Z是在Q和Y間共價(jià)反應(yīng)而形成的并定義為-CONH-；或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是-CONHNH)與硝酸在乙腈水溶液中反應(yīng)產(chǎn)生式Q-Sp-SS-W的化合物，(其中Sp和W的定義同前，Q是-CON3)，使之與式Tu-(Y)n反應(yīng)(其中Tu、Y和n的定義同前)產(chǎn)生下式化合物 其中Tu、Z、Sp、W、m、Y和n的定義同前；-或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是羥基)與α-鹵代乙酸酐反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)Q是α-鹵代乙酰氧基的化合物，在pH4.5和7之間的緩沖水溶液條件下在4～40℃之間溫度下使α-鹵代乙酰氧基-Sp-SS-W或式為Q-Sp-SS-W(其中Sp和W定義同前，Q則如下式所示 化合物與-摩爾式Tu-(Y)n反應(yīng)(其中Tu的定義同前、Y是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈硫醇或是在Tu的胺上引入的酰氨基烷硫基，它是通過(guò)先用諸如3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羥基琥珀酰亞胺酯試劑然后用諸如二硫蘇糖醇還原而引入的；或是用2-亞氨基巰基烷(2-imunothlane)在Tu的胺上引入一個(gè)酰氨基烷基硫基。n是1～10)產(chǎn)生下式化合物 其中Tu、Sp、W和n的定義同前，Z是基團(tuán)Q和Y共價(jià)反應(yīng)而形成的且Z是 n是0.1～10；或者，在pH4.0和6.5之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃溫度下使式Q-Sp-SS-W化合物(其中Sp和W的定義同前，Q是-NH、-CONHNH、-NHCONHNH、-NHCSNHNH或-ONH)與式為T(mén)u-(Y)n的分子(其中Tu的定義同前，Y是在堿土過(guò)磺酸鹽存在下使Tu上糖類殘基氧化而成的醛基，n是1～20)產(chǎn)生下式化合物 (其中Tu、Sp、W、Y和n的定義同前，Z是Q和Y共價(jià)反應(yīng)而形成的，它是-ON=CH-、-N=CH-、-CONHN=CH、-NHCONHN=CH-或-NHCSNHN=CH-、m是0.1～15)；或者在pH4.0和6.5之間的緩沖水溶液中在4℃～40℃下馬上用乙酰肼或酷氨酸肼處理下式化合物 (其中Tu、Z、Sp、W、Y、n和m的定義同上)產(chǎn)生下式化合物 (其中Tu、Z、Sp、W、n和m的定義同上，Y是-CH=NHCOCH3或-CH=NNHCO-CH(NH2)- 以及在pH為4.9～6.5的緩沖水溶液中，在4～40℃溫度下，使該化合物與氰基硼氫化鈉或硼氫化鈉反應(yīng)產(chǎn)生下式化合物其中Tu、Sp、W、m和n的定義同上，Z是-NH-CH2-、-CONHNHCH2-、-NHCONHNHCH2-，或-NHCSNHNHCH2-，Y是-CH2NHNHCOCH3或者-CH2NHNHCO-CH(NH2)－
全文摘要
本發(fā)明闡述了抗腫瘤劑和抗生素的二硫化物類似物，它們稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物；以及一種從二硫化物類似物中形成的載體—藥物配對(duì)物和從配對(duì)物中形成的載體—藥物的靶形式的方法。
文檔編號(hào)C07H15/20GK1110280SQ94102679
公開(kāi)日1995年10月18日 申請(qǐng)日期1994年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1989年4月14日
發(fā)明者喬治·A·伊萊斯苔德, 威廉·詹姆斯·麥克加侖, 馬丁·萊昂薩西弗, 菲利普R·漢曼, 洛伊M·西門(mén), 詹尼斯·厄普斯拉克斯 申請(qǐng)人:美國(guó)氰胺公司