納米金剛石顆粒及其制造方法以及熒光分子探針和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米金剛石顆粒及其制造方法以及熒光分子探針和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分 析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)等生物分子的結(jié)構(gòu)分析、功能分析中使用的熒光分子 探針，已知有各種探針。例如，可列舉出與伯胺發(fā)生特異性反應(yīng)而表現(xiàn)出熒光性的熒光胺 等。此外，通過(guò)利用熒光分子探針標(biāo)記靶蛋白質(zhì)并使用熒光顯微鏡等進(jìn)行觀測(cè)，從而能夠收 集靶蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)、取向等之類的與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的各種信息。此外，最近，作為這種熒光 分子探針?biāo)褂玫臒晒馕镔|(zhì)，納米金剛石顆粒受到關(guān)注（例如，日本特開(kāi)2011-180570號(hào)公 報(bào)（專利文獻(xiàn)1))。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0004] 專利文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)2011-180570號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明耍解決的問(wèn)題
[0007] 在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)密切參與生命現(xiàn)象。此外，追蹤蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化 在揭示蛋白質(zhì)的功能、乃至揭示疾病的表現(xiàn)、進(jìn)展的機(jī)理上極其重要。一直以來(lái)，蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)分析僅在"體外（in-vitro)"即試管內(nèi)進(jìn)行。但是，實(shí)際上蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的生物體內(nèi) "in-vivo"與試管內(nèi)相比，環(huán)繞蛋白質(zhì)的環(huán)境大大不同，因此試管內(nèi)觀測(cè)到的結(jié)果能夠直接 應(yīng)用于生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)、功能的情況有限，期望盡快建立生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方 法。
[0008] -直以來(lái)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中主要使用基于核磁共振的分子結(jié)構(gòu)分析法〔以下 也記作"NMR(Nuclear Magnetic Resonance)法"〕、利用熒光顯微鏡的熒光分子觀察法等。
[0009] NMR法由于能夠進(jìn)行非侵入性的測(cè)量，并且具有原子級(jí)別的高空間分辨率，因此能 夠收集與立體結(jié)構(gòu)相關(guān)的許多信息。然而，在另一方面，靈敏度低，時(shí)間分辨率也低，因此難 以進(jìn)行實(shí)時(shí)的觀測(cè)。
[0010] 熒光分子觀察法能夠進(jìn)行一分子測(cè)量，并且能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察/測(cè)量。然而，在另 一方面，空間分辨率低，極難測(cè)量所謂結(jié)構(gòu)的波動(dòng)、結(jié)構(gòu)變化。進(jìn)而，熒光分子探針?biāo)褂玫?熒光物質(zhì)也常常具有毒性，不適于非侵入性的測(cè)量。
[0011] 如此，利用現(xiàn)有的方法，在生物體內(nèi)非侵入性且實(shí)時(shí)地觀測(cè)1分子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 變化是不可能的。
[0012] 已知光檢測(cè)磁共振法〔以下也記作"ODMR(Optically-Detected Magnetic Resonance)法"〕作為高靈敏度地檢測(cè)試驗(yàn)體的磁共振的手段。ODMR法通過(guò)對(duì)試驗(yàn)體同時(shí) 照射激發(fā)光和高頻磁場(chǎng)并檢測(cè)熒光發(fā)光量的變化，從而高靈敏度地檢測(cè)磁共振。在此之后， 本說(shuō)明書(shū)中也將這種測(cè)量手段記作ODMR測(cè)量。
[0013] 近年來(lái)，正在進(jìn)行例如像專利文獻(xiàn)1中記載的熒光顯微鏡裝置那樣將融合磁共振 法和熒光分子觀察法而成的ODMR法應(yīng)用于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析的研宄。于是，其 中顯示出納米金剛石顆粒作為熒光分子探針的可能性。
[0014] 已知，包含由金剛石晶體中的氮原子和空穴構(gòu)成的復(fù)合缺陷（以下也記作"NV色 心"）的納米金剛石顆粒在NV色心發(fā)生熒光發(fā)光，并且因磁共振而使熒光發(fā)光量變化。此 處，NV色心表示如圖1所示由取代了金剛石晶體中的碳原子1的氮原子2 (N ;Nitrogen)和 與氮原子2相鄰的空穴3(V ;Vacancy)構(gòu)成的復(fù)合缺陷。
[0015] 關(guān)于NV色心的熒光，熒光的褪色、閃爍較少，向熒光分析的適應(yīng)性高。進(jìn)而，納米 金剛石顆粒為包含碳原子的物質(zhì)，因此認(rèn)為其對(duì)生物體的毒性極低，而且用于標(biāo)記靶蛋白 質(zhì)的顆粒表面的化學(xué)修飾容易，因此作為在生物體內(nèi)使用的熒光分子探針被視為有前景。
[0016] 進(jìn)行包含如上所述的NV色心的納米金剛石顆粒的ODMR測(cè)量，以將熒光發(fā)光量作 為縱軸、磁場(chǎng)頻率作為橫軸的二維坐標(biāo)表示時(shí)，在特定的高頻磁場(chǎng)中觀測(cè)到熒光發(fā)光的減 少峰。此處，本說(shuō)明書(shū)中，也將以上述二維坐標(biāo)表示的譜圖記作"0DMR譜"，也將上述減少峰 記作" ODMR信號(hào)"。
[0017] 此外，ODMR測(cè)量中，將照射高頻磁場(chǎng)時(shí)的發(fā)光量設(shè)為L(zhǎng) (ON)、未照射磁場(chǎng)時(shí)的發(fā)光 量設(shè)為L(zhǎng) (OFF)時(shí)，將根據(jù)下述式（I)算出的熒光發(fā)光量的減少率定義為"0DMR強(qiáng)度"。
[0018] (0DMR 強(qiáng)度）=1-{L(0N)/L(OFF)}…（I)
[0019] 上述減少峰（0DMR信號(hào)）在放置于靜態(tài)的外部磁場(chǎng)中的NV色心發(fā)生分裂，峰的分 裂寬度隨NV色心的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而變化，因此，通過(guò)使用包含NV色心的納米金剛石顆粒作為熒 光分子探針，利用該熒光分子探針標(biāo)記靶蛋白質(zhì)，并且測(cè)量ODMR譜，從而有可能實(shí)現(xiàn)依靠 上述現(xiàn)有方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的精細(xì)且實(shí)時(shí)的結(jié)構(gòu)分析。
[0020] 此處，為了實(shí)現(xiàn)如上所述的生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法，具有極高的ODMR 強(qiáng)度的包含NV色心的納米金剛石顆粒成為必需。
[0021] 然而，現(xiàn)狀是，包含NV色心的納米金剛石顆粒的ODMR強(qiáng)度不足以穩(wěn)定地進(jìn)行生物 體內(nèi)的測(cè)量，尚未建立如上所述的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法。此外，至今尚無(wú)報(bào)道有提高包含 NV色心的納米金剛石顆粒的ODMR強(qiáng)度的方法的例子。
[0022] 本發(fā)明是鑒于這種現(xiàn)狀而做出的，其目標(biāo)在于提供包含提高了 ODMR強(qiáng)度的NV色 心的納米金剛石顆粒，使用對(duì)該納米金剛石顆粒進(jìn)行化學(xué)修飾而成的熒光分子探針來(lái)提供 新型的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法。
[0023] 用于解決問(wèn)題的方案
[0024] 本發(fā)明的納米金剛石顆粒通過(guò)利用特定的官能團(tuán)修飾顆粒表面，從而提高了存在 于顆粒內(nèi)部的NV色心的ODMR強(qiáng)度（光檢測(cè)磁共振強(qiáng)度）。
[0025] 即，本發(fā)明的納米金剛石顆粒的特征在于，包含利用含雜原子的官能團(tuán)修飾了表 面而提高了 ODMR強(qiáng)度的NV色心。
[0026] 此處，上述含雜原子的官能團(tuán)優(yōu)選為給電子性官能團(tuán)。另外，上述含雜原子的官能 團(tuán)優(yōu)選為羥基和羥基烷基中的至少任一種。另外，上述含雜原子的官能團(tuán)也可以為羧基。
[0027] 另外，上述納米金剛石顆粒的平均粒徑優(yōu)選為Inm以上且50nm以下。
[0028] 此外，上述ODMR強(qiáng)度是指，表示照射1~5GHz的高頻磁場(chǎng)時(shí)的由激發(fā)光造成的熒 光發(fā)光量的減少率。
[0029] 作為本發(fā)明的納米金剛石顆粒的具體的利用形態(tài)，例如可列舉出包含納米金剛石 顆粒的粉末狀試劑、將納米金剛石顆粒分散于液體而成的試劑等。
[0030] 進(jìn)而，本發(fā)明也涉及上述納米金剛石顆粒的制造方法，該制造方法為如下的提高 了 ODMR強(qiáng)度的納米金剛石顆粒的制造方法，即，其包括以下的工序：準(zhǔn)備納米金剛石顆粒 的工序；以及，進(jìn)行選擇性地提高該納米金剛石顆粒表面上存在的官能團(tuán)中的1種以上的 含雜原子的官能團(tuán)的修飾率的處理的工序。
[0031] 此處，優(yōu)選的是，上述1種以上的含雜原子的官能團(tuán)為羥基和/或羥基烷基（羥基 和羥基烷基中的至少任一種），并且進(jìn)行上述處理的工序?yàn)檫M(jìn)行還原處理的工序。
[0032] 另外，也可以是：上述1種以上的含雜原子的官能團(tuán)為羧基，并且進(jìn)行上述處理的 工序?yàn)檫M(jìn)彳丁氧化處理的工序。
[0033] 另外，本發(fā)明也涉及使用了上述納米金剛石顆粒的熒光分子探針，該熒光分子探 針的特征在于，對(duì)上述包含提高了 ODMR強(qiáng)度的NV色心的納米金剛石顆粒進(jìn)行化學(xué)修飾。該 熒光分子探針例如可以以粉末狀的試劑、分散于液體而成的試劑的形式來(lái)利用。
[0034] 進(jìn)而，本發(fā)明也涉及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法，該結(jié)構(gòu)分析方法為：對(duì)利用上述熒光 分子探針標(biāo)記了的靶蛋白質(zhì)照射激發(fā)光和1~5GHz的高頻磁場(chǎng)，檢測(cè)熒光發(fā)光量減少的峰 值磁場(chǎng)頻率，從而檢測(cè)該靶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法。即，該結(jié)構(gòu)分析方 法具備以下的工序：利用熒光分子探針標(biāo)記靶蛋白質(zhì)的工序；以及，對(duì)所標(biāo)記的靶蛋白質(zhì) 照射激發(fā)光和1~5GHz的高頻磁場(chǎng)，檢測(cè)熒光發(fā)光量減少的峰值磁場(chǎng)頻率，從而檢測(cè)靶蛋 白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化的工序。
[0035] 此處，上述峰值磁場(chǎng)頻率在靜態(tài)的外部磁場(chǎng)下發(fā)生分裂，可以由其分裂寬度的大 小檢測(cè)熒光分子探針中所含的NV色心的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
[0036] 發(fā)明的效果
[0037] 本發(fā)明的納米金剛石顆粒表現(xiàn)出極高的ODMR強(qiáng)度。因此，可以用作生物體內(nèi)的熒 光分子探針，通過(guò)使用其而有可能實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)的精細(xì)且實(shí)時(shí)的結(jié)構(gòu)分析。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為金剛石晶體中的NV色心的示意概念圖。
[0039] 圖2為示出金剛石晶體中的氮原子和空穴的配置的一例的示意概念圖。
[0040] 圖3為示出NV色心的能級(jí)的一例的概念圖。
[0041] 圖4為示出金剛石晶體中的NV(_)的示意概念圖。
[0042] 圖5為示出金剛石晶體中的NV(O)的示意概念圖。
[0043] 圖6為示出NV(_)的能級(jí)的一例的示意概念圖。
[0044] 圖7為示出NV(_)進(jìn)行熒光發(fā)光時(shí)的能級(jí)的一例的示意概念圖。
[0045] 圖8為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的ODMR譜的一例的圖。
[0046] 圖9為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法中的ODMR譜的一例的圖。
[0047] 圖10為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的納米金剛石顆粒的IR光譜的一例的圖。
[0048] 圖11為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的ODMR強(qiáng)度的評(píng)價(jià)所使用的熒光顯微鏡裝置的一 例的示意概念圖。
[0049] 圖12為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的包含提高了 ODMR強(qiáng)度的NV色心的納米金剛石 顆粒的制造方法的流程圖。
[0050] 圖13為示出本發(fā)明的實(shí)施方式的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法中的分析裝置的示意概