專利名稱：造影劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超級(jí)順磁顆粒造影劑，特別是用于磁共振成像(尤其是血管磁共振成像)的造影劑，還涉及它們的制備。
背景技術(shù)：
在診斷成像方法中，如X-射線和磁共振(MR)成像中，使用造影劑以增強(qiáng)不同組織或器官之間或健康與損傷組織之間的對比，是非常成熟的技術(shù)。對于不同成像模式，通過造影劑以不同的方式增強(qiáng)對比。因此，(例如)在質(zhì)子MR成像中，造影劑通過改變成像核子(通常為水質(zhì)子)的特征弛豫時(shí)間(T1和T2)達(dá)到其對比強(qiáng)化效果，獲得用于生成影像的MR信號(hào)。
當(dāng)具有磁性如順磁性、超順磁性、鐵磁性和亞鐵磁性的物質(zhì)注射入活體中時(shí)，會(huì)造成組織中水質(zhì)子的T1和T2(或T2*)值降低，盡管T1降低在T2(或T2*)不降低時(shí)不會(huì)出現(xiàn)，但T1部分的降低與T2(或T2*)部分的降低不同。若T1的降低部分大于T2(或T2*)的降低部分，則MR成像的強(qiáng)度增加，該材料稱為T1造影劑，或正造影劑。若T1的降低部分低于T2(或T2*)的降低部分，則MR成像的強(qiáng)度降低，該物質(zhì)稱為T2造影劑，或負(fù)造影劑。
具有順磁性、超順磁性、亞鐵磁性和鐵磁性的顆粒以下稱為磁性顆粒。
在文獻(xiàn)中第一個(gè)提出使用磁性材料作為MR造影劑是1978年由Labuterbur提出的，該文獻(xiàn)提出可以使用錳鹽作為造影劑。在專利文獻(xiàn)中Schering在EP-A-71564(和其同族專利US-A-4647447)中第一個(gè)提出可以使用順磁金屬離子(如鑭系離子Gd(Ⅲ))的螯合配合物。
早期用于MR成像的市售造影劑如購自Schering、Nycomed和Bracco的GdDTPA、GdDTPA-BMA和GdHP-D03A(商標(biāo)為MAGNEVIST、OMNISCAN和PROHANCE)都是順磁性鑭系離子的可溶性螯合配合物，并用作增強(qiáng)其分布區(qū)域的影像強(qiáng)度的正造影劑。
此后，提出將鐵磁性、高鐵磁性和超順磁性顆粒劑用作負(fù)MR造影劑。這些顆粒試劑的口服制劑(以下通常稱為磁性顆粒)已是市場上可獲得的用于消化道成像的制劑，例如購自Nycomed Imaging的產(chǎn)品ABDOSCAN。然而，這些顆粒試劑的非腸胃給藥已被建議廣泛用于肝和脾成像，因?yàn)檫@些器官起到從血液中相當(dāng)快地除去外來顆粒物質(zhì)的作用。例如，Widder在US-A-4859210中提出用這些試劑進(jìn)行肝和脾成像。
例如，最近Pilgrimm在US-A-5160725和WO/21240中建議，可阻止網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)從血液中攝取非腸胃給藥的磁性顆粒，從而通過將穩(wěn)定劑物質(zhì)化學(xué)鍵合到磁性顆粒表面使血液停留時(shí)間延長。
可按此方式用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)的例子包括碳水化合物如低聚糖或多糖，以及聚氨基酸、寡核苷酸和多核苷酸、和聚氧化亞烴(包括聚羥體(poloxamers)和聚羥胺體(poloxamine))，以及由Pilgrim在US-A-5160725和WO-94/21240中、由Nycomed在PCT/GB94/02097中、由Brscco在US-A-5464696中和由Illum在US-A-4904479中提出的其它物質(zhì)。
用這種方式涂布的磁性顆粒可用作血池劑(即用于血管成像)或用于淋巴結(jié)成像，或它們還可與生物目標(biāo)試劑綴合并用于目標(biāo)組織或器官成像。
當(dāng)作為血池劑給藥時(shí)，已發(fā)現(xiàn)若使用磁性顆粒，血質(zhì)子的T1部分降低可大于T2(或T2*)部分降低，因此這些試劑可用作血管成像的正MR試劑。
對于非腸胃給藥，復(fù)合物顆粒的粒度和粒度分布及整個(gè)顆粒的表面化學(xué)性質(zhì)對于確定對比生成的效率、血液半衰期以及造影劑的生物分布和生物降解都是非常重要的。理想的是顆粒粒度(即磁性物質(zhì)的晶粒大小)在單一區(qū)域結(jié)構(gòu)大小范圍內(nèi)(該顆粒為超順磁性，因此無滯后性并具有降低附聚的趨勢)，且總顆粒粒度分布窄，這樣該顆粒具有均勻的生物分布、生物消除和對比作用。優(yōu)選的是該磁性顆粒的表面應(yīng)當(dāng)涂有一種物質(zhì)用以改善顆粒的生物分布(即通過延長血液半衰期、或通過提高穩(wěn)定性)或起到導(dǎo)向介質(zhì)的作用，使導(dǎo)向位點(diǎn)(如腫瘤點(diǎn))具有最優(yōu)的分布。
磁性的核心物質(zhì)的平均晶體粒度通常應(yīng)為1至50nm，優(yōu)選1至20nm，特別優(yōu)選2至15nm。對于用作血池劑，包括任何涂布物質(zhì)的平均總顆粒粒度優(yōu)選應(yīng)低于30nm(顆粒粒度可通過電子顯微鏡測定)。生產(chǎn)具有如此粒度的超順磁晶體或復(fù)合物顆粒本身實(shí)際上不存在問題。但是，生產(chǎn)具有所需粒度、可接受的粒度分布且無過多的晶體附聚的顆粒的確存在問題，本發(fā)明的一個(gè)方面就是涉及解決這些問題。
磁性晶體的生產(chǎn)方法通常是通過在聚合物涂布試劑的溶液中進(jìn)行液相沉淀(例如采用共沉淀技術(shù)，如Molday在US-A-4452773中描述的)。該技術(shù)結(jié)果生產(chǎn)出的顆粒是相對多分散性的，這些顆粒隨后需要(例如)通過離心或色譜法進(jìn)行顆粒大小的分級(jí)。例如，高磁性的產(chǎn)品AQMI227就是通過該技術(shù)生產(chǎn)的。
我們現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)具有特別好性能的磁性顆粒，可通過在含支化聚合物的水介質(zhì)中沉淀，然后使聚合物裂解釋放出包括磁性顆粒和被裂解聚合物涂層的復(fù)合顆粒。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供用于生產(chǎn)復(fù)合磁性顆粒的方法，所述方法包括在含親水性支化有機(jī)聚合物的水介質(zhì)內(nèi)形成磁性顆粒，優(yōu)選超順磁顆粒；和使所述聚合物裂解以釋放所述的復(fù)合顆粒，優(yōu)選主要是單一的磁性顆粒。
附圖的簡要描述

圖1、2和3顯示對兔子使用本發(fā)明造影劑的強(qiáng)化前和強(qiáng)化后的T1加權(quán)MR影像。
發(fā)明詳細(xì)描述用于本發(fā)明方法的親水性支化有機(jī)聚合物可以是任何的天然、合成或半合成支化聚合物，并且(若需要)可通過對線性親水聚合物接枝或交聯(lián)來生產(chǎn)。
如果支化的親水聚合物是大范圍交聯(lián)的聚合物，則本發(fā)明方法中的聚合物裂解將使交聯(lián)聚合物母體破碎。因此，優(yōu)選的是該交聯(lián)鍵在不造成磁性顆粒顯著降解的條件下應(yīng)當(dāng)易發(fā)生化學(xué)或生化裂解。因此，形成酯交聯(lián)的水凝膠聚合物(例如通過交聯(lián)帶有羥基的聚合物，如線性碳水化合物(如葡聚糖)或聚乙烯醇)特別適合被選擇作為這些交聯(lián)聚合物。若需要，可適當(dāng)?shù)靥鎿Q該聚合物以對酯裂解速率進(jìn)行控制。關(guān)于酯裂解方面，可通過堿處理進(jìn)行，例如用氨或堿金屬氫氧化物處理。
盡管如此，在本發(fā)明方法中，親水性支化聚合物特別優(yōu)選為天然、合成或半合成碳水化合物，尤其是能夠形成水凝膠的物質(zhì)，更優(yōu)選多糖物質(zhì)，如糖元，或進(jìn)一步更優(yōu)選淀粉。若需要，在本發(fā)明方法中，可以使用親水性聚合物的混合物，所述聚合物中至少一種為支化的。當(dāng)?shù)矸塾米骶酆衔飼r(shí)，它可為天然淀粉或加工過的淀粉，例如酸處理、酶處理或加溶淀粉。天然淀粉，特別是植物衍生的淀粉如玉米、土豆、稻米或小麥淀粉是特別優(yōu)選的。
天然淀粉是一般的線性直鏈淀粉和支化的支鏈淀粉多糖的混合物。為實(shí)施本發(fā)明，盡管含有直鏈淀粉是可接受的，但含量最好不要太高，因?yàn)檫@會(huì)使其變稠，即從分散狀態(tài)不可逆地大量轉(zhuǎn)化為基本上不可溶的微晶狀態(tài)。因此，使用富支鏈的土豆淀粉優(yōu)于玉米或小麥淀粉。
當(dāng)本發(fā)明使用的聚合物材料是受溶于水介質(zhì)和在其中進(jìn)行熱處理影響的物質(zhì)時(shí)，例如顆粒淀粉物質(zhì)，首先溶脹和部分溶解，這種反應(yīng)介質(zhì)的熱過程可影響最終產(chǎn)品的性質(zhì)。在這些情況下，可優(yōu)選一種能更好地控制介質(zhì)的粘度和結(jié)構(gòu)的熱過程。因此，對于淀粉，優(yōu)選的是例如通過在60-95℃下形成水分散體，冷卻至5至80℃(例如5至60℃)，然后再加熱至45-85℃(例如45-80℃)的方式，使該反應(yīng)介質(zhì)生成、冷卻、然后再加熱。按照這種方式，可使該沉淀介質(zhì)達(dá)到有益的結(jié)構(gòu)。
一般認(rèn)為支化親水性有機(jī)聚合物在反應(yīng)介質(zhì)中具有分散的沉淀種子形成點(diǎn)，由此形成均勻的沉淀小顆粒。使用非支化的親水聚合物，如明膠或葡聚糖，或使用無機(jī)凝膠如硅膠是無效的。
親水性聚合物的濃度應(yīng)足以使沉淀介質(zhì)在室溫或環(huán)境溫度下(例如0至60℃)下為凝膠形式。使用的濃度還應(yīng)適合于在高達(dá)80℃的溫度下形成凝膠。對于淀粉，濃度優(yōu)選為1至200g/L，更優(yōu)選2至150g/L，特別優(yōu)選20至100g/L，更特別優(yōu)選40至90g/L。
當(dāng)沉淀介質(zhì)是水時(shí)，還可以含水和助溶劑(如水混溶性醇、醚或酮)的混合物。
如上所述，特別優(yōu)選的是本發(fā)明使用的沉淀介質(zhì)為膠體狀態(tài)的物質(zhì)，稱為凝膠。在這樣的介質(zhì)中，形成聚合物凝膠的物質(zhì)形成一種被含水分散介質(zhì)互穿的網(wǎng)絡(luò)。這種凝膠通常比水分散介質(zhì)本身更粘，但對于本發(fā)明，為使其處于剛性或半剛性自支撐狀態(tài)，該凝膠不需要太粘。實(shí)際上，凝膠結(jié)構(gòu)非常弱，以致于可將該沉淀介質(zhì)簡單視為可自由流動(dòng)的溶液。而對于這種情況，該介質(zhì)的凝膠性能容易從其觸變性能(即介質(zhì)的粘度通過攪拌降低)得到證實(shí)。
盡管沉淀介質(zhì)必須含上述支化聚合物，但它還可含其它(例如)形成凝膠的線性聚合物。用于此目的的合適聚合物的例子包括蛋白質(zhì)、多糖、蛋白多糖和形成凝膠的表面活性劑，如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)和四聚醇胺(Tetronic)系列嵌段共聚物表面活性劑，如F-127、F-108和F-68。這些表面活性劑在水介質(zhì)中在適合本發(fā)明方法的高溫和pH值下形成凝膠。例如，膠體形式的沉淀介質(zhì)可用形成凝膠的線性嵌段共聚物表面活性劑和支化有機(jī)聚合物如支鏈淀粉的水分散體制備。
然而，沉淀介質(zhì)的凝膠基體應(yīng)為這樣的凝膠，即可使至少一種聚合物組分發(fā)生化學(xué)(或生化)裂解，釋放磁性顆粒，該聚合物優(yōu)選至少一種支化聚合物。因此，使用過度交聯(lián)的聚合物是不合適的。
以剛性或半剛性凝膠形式的水介質(zhì)可發(fā)生顆粒沉淀，例如用堿浸漬凝膠的介質(zhì)。但最優(yōu)選沉淀是在加熱的、攪拌的水介質(zhì)中發(fā)生，該水介質(zhì)與水相比可以呈現(xiàn)或不呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的粘度。特別優(yōu)選的沉淀在40至95℃溫度下在輕微攪拌下發(fā)生。
通過控制含水沉淀介質(zhì)的觸變性能，可生產(chǎn)具有一定粒度范圍的復(fù)合顆粒。
在本發(fā)明方法中磁性顆粒形成被認(rèn)為可以分兩步過程，其中首先形成無定形物質(zhì)區(qū)域，然后例如在高溫下，如在40至95℃，優(yōu)選50至93℃下轉(zhuǎn)化為磁性顆粒。因此已發(fā)現(xiàn)，顆粒磁性的形成可控制在1分鐘至1小時(shí)內(nèi)，至多3小時(shí)內(nèi)。然而實(shí)際上，已發(fā)現(xiàn)磁性形成在兩小時(shí)內(nèi)完成，并且在20分鐘內(nèi)明顯發(fā)生磁化。
在水介質(zhì)中形成的磁性顆?？蔀槿魏慰沙恋淼拇判越饘傺趸锘驓溲趸?，包括混合的金屬化合物，例如在US-A-4827945(Groman)、EP-A-525189(Meito Sangyo)、EP-A-580878(BASF)和PCT/GB94/02097(Nycomed)中或由Pilgrimm(supra)討論的化合物。對此特別提及如下通式的磁性氧化鐵化合物(MⅡO)n(MⅢ2O3)其中MⅡ和MⅢ處于Ⅱ或Ⅲ價(jià)態(tài)的過渡金屬或鑭系金屬，其中至少一個(gè)為Fe，和n為0或正數(shù)，或尤其是如下通式的磁性氧化鐵化合物(MⅡO)nFe2O3(MⅢ2O3)其中MⅡ?yàn)槎r(jià)金屬，如Fe、Mg、Be、Mn、Zn、Co、Ba、Sr和Cu，MⅢ為三價(jià)金屬如Al、Yb、Y、Mn、Cr或鑭系，n和m各自為0或正數(shù)。
磁性顆粒優(yōu)選的是通式(FeO)nFe2O3的鐵氧化物，其中n為0至1，(通常由磁赤鐵礦(γ-Fe2O3)或磁鐵礦(Fe3O4)表示)，或是這些磁性鐵氧化物的混合物。
許多種鐵鹽可用作FeⅢ和FeⅡ離子源，所述鐵鹽的例子為FeCl2、FeCl3、檸檬酸FeⅢ、葡糖酸FeⅡ、FeSO4、Fe2(SO4)3、草酸FeⅡ、Fe(NO3)3、乙酰丙酮酸FeⅡ、硫酸乙酯二銨FeⅡ、富馬酸FeⅡ、磷酸FeⅢ、焦磷酸FeⅢ、檸檬酸銨FeⅢ、硫酸銨FeⅡ、硫酸銨FeⅢ和草酸銨FeⅡ。FeⅡ與FeⅢ的比例優(yōu)選應(yīng)為1∶5至5∶1。
沉淀的引發(fā)是通過設(shè)定水介質(zhì)的pH高于沉淀引發(fā)臨界值，通常用加入堿的方法，優(yōu)選的堿是含水堿如堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰)或氫氧化銨，特別優(yōu)選濃氫氧化銨，加入的堿的pKb應(yīng)足以使水介質(zhì)的pH值高于沉淀引發(fā)臨界值(例如達(dá)到10以上)。
優(yōu)選將堿加入含金屬離子和聚合物的水介質(zhì)中?；蛘?，可將堿和聚合物合并，然后加入金屬離子。這些加料可方便地在高溫，如40至95℃，優(yōu)選50至60℃下攪拌混合這些組分的水溶液來進(jìn)行。
人們認(rèn)為沉淀開始后，在由支化聚合物界定的金屬離子或金屬氫氧化物的無定形順磁區(qū)域內(nèi)形成種子磁性顆粒晶體，并認(rèn)為這些無定形區(qū)域轉(zhuǎn)化為完全形成磁性顆粒。因此，顆粒形成所需的時(shí)間可以選擇數(shù)分鐘至數(shù)天，例如1分鐘至24小時(shí)，優(yōu)選20分鐘至10小時(shí)，特別是1至5小時(shí)。
在溫度趨于上述范圍的上限(例如90℃)時(shí)形成顆粒的情況下，該介質(zhì)優(yōu)選在此高溫下僅保持相當(dāng)短的時(shí)間，例如至多2小時(shí)。
若將堿、可沉淀的金屬離子和聚合物在較低溫度下混合，然后將該介質(zhì)加熱至更高的溫度以形成磁性顆粒，則溫度升高速率應(yīng)小心控制在例如10-100℃/小時(shí)下。因此在顆粒形成期間，對含水介質(zhì)的溫度升高速率要進(jìn)行控制(例如，溫度升高基本上與時(shí)間呈線性關(guān)系)，例如在2小時(shí)內(nèi)將混合溫度從55℃升至最終溫度90℃。
在顆粒形成之后，特別優(yōu)選將反應(yīng)介質(zhì)中和以使其pH值變?yōu)槔?.0-8.5。例如，這可通過冷卻介質(zhì)以生產(chǎn)預(yù)定凝膠，可將該凝膠洗滌至中性，用酸(可接受的酸包括例如鹽酸、硫酸和硝酸)或固體二氧化碳中和介質(zhì)，或通過真空除去堿(若其具有高蒸氣壓，例如氫氧化銨)。中和后的介質(zhì)可立即進(jìn)一步處理。
對于此中和步驟，當(dāng)已使介質(zhì)形成預(yù)定的凝膠并用于除去過量的金屬鹽和堿時(shí)，洗滌是特別有效的。洗滌可方便地用優(yōu)選預(yù)冷卻至3-15℃的去離子水進(jìn)行，并優(yōu)選連續(xù)進(jìn)行直至pH變?yōu)榇蠹s中性。
由于可簡單地超聲處理洗滌過的凝膠使凝膠基體破碎而不使聚合物裂解，同時(shí)破碎釋放的聚合物涂布的磁性顆粒，由于破壞聚合物分子結(jié)構(gòu)使聚合物裂解釋放出該涂布的顆粒，則該顆粒產(chǎn)品具有特別有利的性能?；瘜W(xué)破壞可用活性化學(xué)試劑如氧化劑或堿進(jìn)行，但也可用生化試劑(如酶)進(jìn)行。對于碳水聚合物如淀粉，可用淀粉酶(如α-淀粉酶)進(jìn)行酶促裂解該聚合物。然而，用氧化劑進(jìn)行聚合物裂解是特別優(yōu)選的。痕量氧化劑本身是生物耐受的，或其還原產(chǎn)品是類似生物耐受的，所述氧化劑的例子是鹵氧陰離子(如堿金屬次氯酸鹽(如次氯酸鈉和次氯酸鈣))、高碘酸鹽(如高碘酸鈉)、高錳酸鹽(如KMnO4)、過氧化物(如H2O2)、和酶氧化劑是優(yōu)選的。使用的任何過量氧化劑優(yōu)選隨后(例如)通過加入尿素(當(dāng)用次氯酸鹽作為氧化劑時(shí))失活。當(dāng)用氧化劑進(jìn)行聚合物裂解時(shí)，由此釋放的磁性顆粒具有負(fù)表面電荷，因此進(jìn)一步降低顆粒附聚。
用于聚合物裂解的化學(xué)試劑優(yōu)選的應(yīng)不是會(huì)腐蝕磁性顆?；?qū)е逻@些顆粒的磁性減弱的試劑。因此，使用酸性試劑是不合適的。
聚合物裂解的程度可按需要變化，以便將少量或大量的聚合物殘余物作為顆粒上的涂料。還應(yīng)注意的是，通常顆粒被包覆后，使復(fù)合顆粒的總顆粒粒度大于磁性顆粒核的粒度。根據(jù)選用的裂解技術(shù)，在顆粒上以涂料形式留下的殘余物可以是聚合物、低聚物、或甚至單體。
聚合物裂解后，將產(chǎn)品優(yōu)選用膜過濾技術(shù)(如超濾或離析過濾)洗滌至無污染物。
所得總的顆粒粒度通常為1至300nm，優(yōu)選4至30nm，特別優(yōu)選8至20nm。在這種情況下可注意到，該聚合物的氧化裂解法與酶解方法相比能得到更小粒度的顆粒，同時(shí)這兩種方法與簡單的凝膠膠體超聲處理相比，都得到更小的粒度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合顆?？捎靡桓磻?yīng)法制備，該方法可降低總反應(yīng)時(shí)間、免去中間體的制備和處理并降低磁性顆粒芯上的熱應(yīng)力。在本實(shí)施方案中，將FeⅢ和FeⅡ鹽(例如氯化物)溶于淀粉-水溶液中并通過加入堿(例如氨水)使氧化鐵顆粒沉淀。反應(yīng)在70-90℃下進(jìn)行1至3小時(shí)，然后降低過量的堿(例如，當(dāng)使用氨時(shí)，用真空和/或用氮?dú)馇逑礋岱磻?yīng)混合物)。然后將pH降至8.2以下或降至反應(yīng)混合物喪失其緩沖能力的pH值。然后在混合物仍熱時(shí)(例如70-90℃)加入氧化劑(例如次氯酸鈉)，并使氧化在70-90℃下進(jìn)行，直至復(fù)合顆粒達(dá)到可接受的粒度。對于復(fù)合顆粒粒度10至20nm，反應(yīng)時(shí)間為約30至120分鐘，在0.47泰斯拉(tesla)和40℃時(shí)，磁飽和動(dòng)量應(yīng)適當(dāng)高于50EMU/g FeOx,r1大于15mM-1.s-1,r2/r1小于2.3。然后將反應(yīng)混合物用尿素淬滅并通過0.2μm過濾器過濾。然后通過離析過濾(例如用具有20至200kD分子的UF膜)除去淀粉殘余物。
磁性顆?！靶尽眱?yōu)選具有單一范圍粒度的特性，該粒度例如1至50nm，特別是1至20nm，尤其是2至15nm，最優(yōu)選4至12nm，實(shí)際上，在通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的復(fù)合顆粒中，芯晶體一般基本上為單一粒度的，通常為4至12nm。
本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)具有足夠窄粒度分布不必再進(jìn)行粒度分級(jí)的復(fù)合顆粒(即裂解聚合物涂布的磁性顆粒)，例如，其中平均粒度至少90％的顆粒在10nm內(nèi)、優(yōu)選5nm內(nèi)和特別優(yōu)選2nm內(nèi)，通過光子相干譜測定。然而，這些顆粒通常通過相當(dāng)大直徑過濾器(如0.1至0.2μm過濾器)過濾，除去任何偶然出現(xiàn)的大聚合物部分或任何生物和顆粒污染物(顆粒度可通過電子顯微鏡測定)。
通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的復(fù)合顆粒本身是新的，并形成本發(fā)明的另一方面。在該方面，本發(fā)明提供的復(fù)合顆粒(優(yōu)選是帶電顆粒)具有總平均顆粒粒度在4至30nm，該顆粒包括具有裂解親水性聚合物涂布的物質(zhì)(優(yōu)選氧化的碳水化合物，特別是裂解淀粉)的超順磁無機(jī)芯粒。大部分復(fù)合顆粒優(yōu)選含超順磁單芯晶體。
在另一方面中，本發(fā)明提供的一種造影劑含有對比有效量的復(fù)合顆粒，所述復(fù)合顆粒包括超順磁金屬氧化物晶體芯和有機(jī)涂層，所述晶體芯的平均直徑為2至10nm，優(yōu)選4至8nm，所述顆粒的平均直徑至多30nm，優(yōu)選至多15nm，所述涂層包括氧化裂解淀粉，優(yōu)選與官能化的聚氧化亞烴(如磷氧化物末端的聚乙二醇，例如甲氧基PEG磷酸鹽)并用。
本發(fā)明方法可按兩個(gè)分離的階段進(jìn)行，其中首先制備復(fù)合顆粒，例如通過用于制備磁性淀粉微球(MSM)的常規(guī)共沉淀技術(shù)(例如，參見SchorderWO89/03675)，然后將聚合物裂解產(chǎn)生本發(fā)明的復(fù)合顆粒。用這種方式處理的復(fù)合顆粒，每一顆粒都含許多磁性晶體，其中聚合裂解步驟通常起到釋放涂布的單晶體的作用。這種方法構(gòu)成本發(fā)明的再一方面。
對于某些應(yīng)用，還需要從磁性顆粒中除去基本上所有裂解的聚合物涂料，并有可能用不同的表面改性劑取代。在這種情況下，可使用氧化劑(優(yōu)選非離子氧化劑，如過氧化氫)或能夠分解該裂解聚合物的酶(如淀粉酶)。使用離子氧化劑不十分優(yōu)選，因?yàn)樗鼈兘档挽o電穩(wěn)定性并促進(jìn)磁性顆粒附聚，原因在于除去了空間穩(wěn)定的裂解聚合物涂料。除去裂解聚合物之前，需要加入與磁性顆粒結(jié)合并使懸浮液具有靜電穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑，如靜電穩(wěn)定劑(例如二磷酸鈉或三磷酸鈉)。pH應(yīng)合適地維持中性或輕微堿性(例如，通過加入氫氧化鈉)，因?yàn)樗嵝詐H會(huì)因磷酸鹽穩(wěn)定劑的質(zhì)子化而造成絮凝。已發(fā)現(xiàn)用二磷酸鈉和過氧化氫在50-60℃下將淀粉衍生的裂解聚合物涂布的磁性材料(通過下面的實(shí)施例方法生產(chǎn))培養(yǎng)3至24小時(shí)，足以除去基本上所有的殘余淀粉衍生的裂解聚合物涂料。所得顆粒的平均顆粒直徑約9nm，并且在室溫和蒸汽消毒條件下在懸浮液中是穩(wěn)定的。
這些靜電穩(wěn)定的磁性顆粒的穩(wěn)定懸浮液是新的并構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。在該方面，本發(fā)明提供一種超順磁無機(jī)芯顆粒的水懸浮液，具有平均顆粒粒度為4至30nm，所述顆?；旧蠠o有機(jī)涂料并有結(jié)合無機(jī)靜電穩(wěn)定劑的表面。
聚合物裂解、并進(jìn)行任何所需的洗滌和過濾后的這些顆粒優(yōu)選的是有第二種物質(zhì)的涂層，這是為了提高由于互補(bǔ)活化作用的減小而引起的增強(qiáng)生物耐受性，延長血池存留時(shí)間，提供組織靶向能力，增強(qiáng)貯存穩(wěn)定性或改進(jìn)可加壓加熱性。
或者，第二種涂層可在更早階段加入，例如在磁性顆粒形成前或磁性顆粒形成后且聚合物裂解前加入。
特別優(yōu)選的是，第二種涂層材料是為天然或合成結(jié)構(gòu)型多糖、合成聚氨基酸或生理耐受的合成聚合物，如PCT/GB94/02097中描述的，或者是穩(wěn)定劑物質(zhì)，如Pilgrimm或Illum(supra)描述的。第二種涂層材料特別優(yōu)選的是聚氧化亞烴(如聚羥體、聚羥胺、聚乙二醇等)，或肝素(heparinoid)，尤其優(yōu)選那種帶一個(gè)官能團(tuán)的化合物，如含氧酸(例如硫酸、碳酸或硫酸)官能團(tuán)的物質(zhì)，該官能團(tuán)可使涂料化學(xué)結(jié)合或吸附在復(fù)合顆粒上，特別是磁性顆粒芯上。對此，特別提及Pilgrimm在US-A-5160725和WO-94/21240中描述的甲氧基-PEG-磷酸鹽(MPP)和其它聚氧化亞烴物質(zhì)。MPP的有益效果還可使用MPP的磷酸鹽基團(tuán)以外的其它親鐵基團(tuán)末端官能化的親水性聚合物來達(dá)到。這樣的基團(tuán)是水楊酸酯?？捎眠@種親鐵基團(tuán)通過與4-氨基-水楊酸或5-氨基-水楊酸共軛對PEG進(jìn)行官能化，該兩種酸基本上無毒，在生物學(xué)上已使用很長時(shí)間。
另一合適的第二種涂布試劑為在吡啶氮原子上帶有3-羥基-4-吡啶酮的親水性聚合物如PEG。簡單的類似物，例如1,2-二甲基-3-羥基-4-吡啶酮，已在臨床上用于排除人體(例如輸入過量的紅細(xì)胞的人)的過量鐵，這些物質(zhì)具有對于FeⅢ有最大已知結(jié)合常數(shù)，即logβ(3)達(dá)到35。這里可方便地使用多種合成路線?？赏ㄟ^對2-甲基-3,4-二羥基吡啶的氮烷基化而連接聚合物(PEG)。還可通過烷基化2-甲基-3-羥基吡啶，所得產(chǎn)品接著在4位氧化而連接聚合物(PEG)。還可通過將帶有伯氨基的PEG與3-羥基-2-甲基-4-吡喃酮的反應(yīng)而連接聚合物(PEG)，其中的環(huán)氧原子在一個(gè)步驟中用氮取代并形成所需的3-羥基-4-吡啶酮。
1-PEG-2-甲基-3-羥基-4-吡啶酮將PEG聚合物連接到氧化鐵表面上的另一些方式是將這些聚合物連接至細(xì)菌含鐵細(xì)胞(例如鐵氧化還原蛋白/鐵草氨菌素)的一個(gè)大基團(tuán)上。鐵草氨菌素具有一個(gè)氨基末端官能團(tuán)，該官能團(tuán)可通過?；蛲榛糜谶B接合適的PEG衍生物。
將第二種涂料連接至氧化物表面的另一種方式是使用結(jié)合鐵基團(tuán)的低聚物或聚合物，例如用磷酸鹽，如二磷酸鹽、三磷酸鹽和其更高級(jí)聚合物，而不是MPP的單磷酸鹽。這些低聚和多聚磷酸鹽非常強(qiáng)地與氧化鐵顆粒結(jié)合(可能是由于存在多個(gè)結(jié)合點(diǎn))，并且共軛反應(yīng)簡單且容易進(jìn)行。因此，例如在下面的例子中，可以使用甲氧基-PEG-二磷酸鹽或甲氧基-PEG-三磷酸鹽取代這里的所謂甲氧基-PEG-磷酸鹽。低聚和多聚磷酸鹽、硫酸鹽和磺酸鹽還可用于將其它載體或報(bào)道基團(tuán)(在下面討論)共軛到磁性顆粒上。
作為使用上述各種磷酸鹽結(jié)合基團(tuán)將第二種涂料或其它載體和報(bào)道基團(tuán)結(jié)合至氧化物表面上的另一方式，(例如)可以使用甲氧基-PEG-磷酸鹽代替磷酸鹽結(jié)合基團(tuán)。這種方式提供多種可能的優(yōu)點(diǎn)，特別是由于用P-C鍵取代MPP的P-O-C鍵提高了水解穩(wěn)定性，有可能更緊密地與氧化物表面結(jié)合，并增加了化學(xué)穩(wěn)定性，使得可更自由地生產(chǎn)雜雙官能PEG-磷酸鹽，該磷酸鹽在生產(chǎn)磁性晶體-連接劑-載體/報(bào)道基團(tuán)共軛物。
因此，例如下面這些雜雙官能連接劑
可容易地用于將磁性顆粒偶合到蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、低聚肽和其它肽載體上。因此，通式A至E的連接劑可通過活性硫醇或胺基團(tuán)偶合至這些肽化合物上，然后通過磷酸鹽基團(tuán)偶合至磁性顆粒上。
用于將PEG或其它載體/報(bào)道基團(tuán)連接至活性顆粒上的合適鍵合基團(tuán)包括具有對鐵離子有高鍵合親合性的其它基團(tuán)，例如異羥肟酸鹽、兒茶酚、抗壞血酸鹽和去鐵草氨菌素基團(tuán)。
已發(fā)現(xiàn)第二種涂料的分子量不特別重要，通?？梢允?.1至1000kD，但優(yōu)選的是具有分子量0.3至20kD，特別是0.5至10kD，尤其是1至5kD的物質(zhì)，如具有至少60個(gè)氧化亞烴重復(fù)單元的聚氧化亞烴物質(zhì)。
第二種涂料與無機(jī)芯粒的重量比優(yōu)選為0.02至25g/g，特別是0.4至10g/g，尤其是0.5至8g/g。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法生產(chǎn)的二次涂布的復(fù)合顆粒的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是它們可用壓熱法消毒(例如在121℃下消毒15分鐘)，而無不可接受的對顆粒粒度或粒度分布的損害。這是特別重要的，因?yàn)樵搩?yōu)點(diǎn)意味著前面方法的這些步驟不必在無毒條件下進(jìn)行，因此大大改進(jìn)了生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。
除了提供第二種涂料的涂層外，還可對本發(fā)明的生產(chǎn)的復(fù)合顆粒進(jìn)行其它生產(chǎn)后改性。因此，這些顆粒特別可用官能試劑處理，以共軛或偶合殘余碳水化合物涂料，同時(shí)，可用常規(guī)化學(xué)技術(shù)將生物導(dǎo)向部分(如抗體、抗體片段、肽或生物分子如胰島素)或報(bào)道基團(tuán)(如在診斷成像模式如X-射線、MR、超聲、光成像等中可檢測的基團(tuán))共軛至一種涂料上。另一些合適的導(dǎo)向載體或免疫反應(yīng)性基團(tuán)描述于(例如)WO-93/21957中。
通常，磁性顆粒與所述生物導(dǎo)向載體和報(bào)道基團(tuán)之間的軛合物可由如下通式表示MP-X-L-V其中MP為磁性顆粒(非必要地具有如上所述除去的裂解聚合物涂料)；X為能夠與顆粒表面鍵合的基團(tuán)(支撐點(diǎn))(例如磷酸鹽、低聚或多聚磷酸鹽、膦酸鹽、羥肟酸鹽或其它親鐵鹽，如上面討論的)；L為將至少一個(gè)X基團(tuán)與至少一個(gè)V基團(tuán)連接的一個(gè)鍵或更優(yōu)選一個(gè)連接劑基團(tuán)(優(yōu)選分子量1000至106D的有機(jī)鏈，例如分子量2至50kD的PEG基團(tuán))；V為載體或報(bào)道基團(tuán)，即改進(jìn)磁性顆粒生物分布(例如在選取的器官、組織或病變點(diǎn)形成最優(yōu)積累)或可通過診斷成像技術(shù)檢測的基團(tuán)(例如一種螯合的重金屬離子、重金屬原子簇、順磁金屬離子或金屬放射性核素，或一種氣體微泡或微泡生成劑，一種非金屬放射性核素、一種除氫外非金屬非零核自旋原子(例如F原子)，非金屬重原子(例如Ⅰ)、生色團(tuán)、熒光團(tuán)、藥物等)。
可按這種方式將各種載體和報(bào)道基團(tuán)與磁性顆粒共軛。導(dǎo)向載體的例子包括PEG(造成延遲的血池停留)；t-PA、鏈激酶、和尿激酶，或者作為整個(gè)蛋白質(zhì)，或者作為選取的含鍵合區(qū)域的肽片段；含RGD的肽和結(jié)合類似血小板受體的基元；和結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化噬斑的肽(例如載脂蛋白B片段SP-4)。t-PA購自Genentech。RGD肽描述于專利文獻(xiàn)如US-A-45489881、US-A-4661111、US-A-4614517和US-A 5041380中?？梢允褂玫腞GD肽的一個(gè)例子是Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Lys-Lys-CONH2，它可通過Lys-Lys-CONH2末端共軛。這可通過標(biāo)準(zhǔn)的低聚肽合成技術(shù)(如固態(tài)肽合成技術(shù))生產(chǎn)。(Tyr)-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys-CONH2(其中加入(Tyr)以便用碘進(jìn)行放射性標(biāo)記)形式的SP-4可用于通過Lys-CONH2末端共軛。同樣這可通過標(biāo)準(zhǔn)工藝生產(chǎn)。
當(dāng)V為螯合金屬時(shí)，連接劑含有合適的螯合部分，如DTPA、EDTA、TMT、DO3A等殘余物。這些基團(tuán)是診斷成像造影劑領(lǐng)域公知的，并可通過主鏈連接官能度(例如CH2ΦSCN)或通過一個(gè)金屬配位基團(tuán)(如CH2COOH)共軛。
金屬離子本身根據(jù)成像方式選取，例如通過TMT螯合的90Y(對于閃爍照相)或TMT螯合銪(對于熒光成像)。
對于X-射線成像，使用碘代有機(jī)磷酸鹽(或膦酸鹽或低聚或多聚磷酸鹽)是合適的，因?yàn)檫@些化合物既穩(wěn)定磁性顆粒，又起到X-射線造影劑的作用(通過提高顆粒的放射性能)。合適的碘代有機(jī)磷酸鹽的例子包括
其中R1和R2是非必要的，但優(yōu)選為羥基化的C1-6烷基，R3為連接劑基團(tuán)，例如提供1至6個(gè)碳原子的鏈。
特別優(yōu)選的是X-L-V化合物應(yīng)提供用于連接至磁性顆粒上的多個(gè)固定點(diǎn)。因此優(yōu)選的X-L-V化合物為如下通式的化合物
或
其中L1和L2為連接劑L的組分，p為2或更大，例如2、3、4或5。因此，例如基于具有1至4個(gè)固定基團(tuán)的結(jié)構(gòu)的PEG可為V-(PEG)-OC-CH2-N(CH2X)CH2(CH2N(CH2X)CH2)rCO(PEG)-v[x(CH2)s]-CH2-Y-(PEG)-VV-PEG-CONH(CH2)5N(OH)CO(CH2)2CONH(CH2)5N(OH)CO-(CH2)2CONH(CH2)2N(OH)COCH3其中r為1、2或3s為1至6，Y為CONH或NHCO，(PEG)為聚乙二醇鏈，和X為CONHOH、-CONH-雙羥苯基或-CO-O-雙羥苯基(其中兩個(gè)羥基處于連接碳原子上)。
當(dāng)報(bào)道分子或載體按這種方式共軛時(shí)，要明確選取每種顆粒的數(shù)目和每種劑量的數(shù)目，以便有足夠的載體能有效地導(dǎo)向這些顆粒和/或有足夠的報(bào)道分子以使這些顆粒可通過選取的方式檢測。
因此，本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括如下順序步驟(ⅰ)將淀粉、亞鐵鹽和鐵鹽及堿在加熱的水溶液中混合，(ⅱ)非必要地將所述溶液冷卻至15℃以下使膠體凝固；(ⅲ)將pH降低至6.0-8.5，該步驟可以在步驟(ⅱ)之前非必要地進(jìn)行；(ⅳ)用氧化劑，如鹵氧陰離子氧化劑處理使淀粉裂解并釋放所述顆粒；(ⅴ)洗滌并過濾釋放的顆粒；(ⅵ)非必要地將釋放的顆粒與官能化的聚氧化亞烴衍生物反應(yīng)，使所述衍生物與所述顆粒結(jié)合；和(ⅶ)非必要地高壓釜消毒釋放的顆粒。
步驟(ⅲ)例如可通過在步驟(ⅱ)之前在減壓下除去過量的水和堿(例如氫氧化銨)或通過在步驟(ⅳ)之前加入酸(如HCl)調(diào)節(jié)過量的堿的方式進(jìn)行。
已發(fā)現(xiàn)，裂解的親水聚合物涂料和延長血液壽命的親水聚合物與無機(jī)顆粒表面結(jié)合，這樣的具有無機(jī)芯的復(fù)合顆粒與僅具有這兩種涂料之一的顆粒相比，血液壽命明顯延長。這是由于如下原因引起的裂解聚合物屏蔽延長血液壽命的聚合物的顆粒表面結(jié)合點(diǎn)，由此在體內(nèi)使延長血液壽命的聚合物延緩自無機(jī)顆粒上裂解，這樣的顆粒形成本發(fā)明的一個(gè)方面。
因此，本發(fā)明提供一種可注射的復(fù)合顆粒試劑，含有一個(gè)無機(jī)顆粒芯(優(yōu)選金屬或混合金屬氧化物，特別是超順磁氧化鐵顆粒)，在其表面鍵合有親水性延長血液壽命的聚合物(優(yōu)選官能化的聚氧化亞烴，如甲氧基-PEG-磷酸鹽，特別優(yōu)選末端官能化的線性聚合物，并優(yōu)選其分子量低于腎臟閾值，例如分子量0.2至30kD，特別是1至10kD)，并具有屏蔽結(jié)合點(diǎn)的親水性有機(jī)聚合物涂料(如裂解的支化碳水化合物，例如氧化淀粉)。
這些顆?？捎米餮貏┗蚩膳c上述生物導(dǎo)向載體共軛。此外，這些顆?？捎糜陂g接淋巴成像，例如在靜脈注射或皮下注射之后。盡管這些顆粒的無機(jī)芯優(yōu)選為超順磁氧化鐵，但若需要，其它金屬化合物顆粒也可使用，所述金屬化合物的例子包括含放射性核素或另一種治療上或診斷上有效的金屬的化合物。
含本發(fā)明顆粒的超順磁晶體的弛豫性隨顆粒芯和涂布后顆粒的粒度和組成(以及溫度和施加的磁場)而變化。T1弛豫值(r1)可低至5和高達(dá)200，而T2弛豫值(r2)在0.5T時(shí)可為5至500(弛豫值單位(mMFe)-1(sec)-1)。r2/r1在0.47T和40℃時(shí)可為1至100以上，例如1至10，優(yōu)選1.2至3。小單晶顆粒的r2/r1比在更低范圍內(nèi)，而大顆粒和多晶顆粒顯示更高的比例。若顆粒顯示超順磁性，則0T至約1T內(nèi)的顆粒的磁化強(qiáng)度取決于晶體粒度，較大的晶體具有明顯較大的磁化強(qiáng)度，在1T時(shí)，磁化強(qiáng)度為約20-100，優(yōu)選30-90emu/g氧化鐵。
當(dāng)順磁顆粒通過FeⅡ和FeⅢ的堿沉淀而生產(chǎn)時(shí)，比例r2/r1在0.47T和40℃時(shí)通常低于3。因此，在T1-加權(quán)重成像中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的顆粒作為正造影劑是有效的。同時(shí)，這些顆粒的懸浮液的磁化強(qiáng)度曲線顯示，即使在磁場強(qiáng)度高達(dá)4T時(shí)，顆粒也未充分磁化。顆粒在通常用于MR成像儀器的磁場強(qiáng)度下不完全磁化，這就意味著在MR影像中存在的磁化率的大小降低了。同時(shí)，本發(fā)明顆粒的弛豫值不隨磁場強(qiáng)度增加而快速降低(與常規(guī)氧化物顆粒不同)。
在常規(guī)MR成像中，多年以來，傾向于使用初始磁場強(qiáng)度1至1.5T的高磁場強(qiáng)度儀器。然而，較低磁場強(qiáng)度儀器的使用正在增加，因此目前需要開發(fā)可在某些市購成像儀的低磁場強(qiáng)度下，如在0.1至0.3T下使用的正MR造影劑。這種需求可通過本發(fā)明顆粒滿足，該顆粒在這些磁場強(qiáng)度下效果至少是基于正MR造影劑(如Mgnevist)的常規(guī)金屬螯合物的三倍，因此本發(fā)明再一方面，提供一種受體對比增強(qiáng)的磁共振成像方法，其中給受體使用正造影劑，并用MR成像儀生成所述受體的至少一部分的影像，其特征在于所述儀器具有低于0.3T的初始磁場強(qiáng)度，所述正造影劑包括涂有生理耐受涂料的磁性顆粒，所述顆粒在所述磁場強(qiáng)度下不完全磁化(例如磁化到其最大可能磁化的至多90％)且優(yōu)選在磁場強(qiáng)度高達(dá)2T，特別是高達(dá)4T下不完全磁化。
再一方面，本發(fā)明提供診斷用的組合物，包括根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的顆粒和至少一種生理可接受的載體或賦形劑，如用于注射的水。
本發(fā)明的組合物可為任何常規(guī)藥物形式，如懸浮液、乳液、粉末等，并可以是含水載體(如用于注射的水)，和/或用于調(diào)節(jié)滲透壓、pH、粘度和穩(wěn)定性的組分。理想的是該組合物為與血液等壓和等氫離子的懸浮液形式。例如，等壓懸浮液可通過加入鹽如氯化鈉、低分子量糖如葡萄糖(右旋糖)、乳糖、麥芽糖、或甘露糖醇或涂布劑的可溶部分或這些組分的混合物制備。若僅需要微調(diào)pH，則等氫離子可通過加入酸如鹽酸、或堿如氫氧化鈉實(shí)現(xiàn)。還可以使用緩沖試劑如檸檬酸酯、乙酸酯、硼酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、兩性離子和Tris。顆粒懸浮液的化學(xué)穩(wěn)定性可通過加入抗氧劑如抗壞血酸或焦亞硫酸鈉改性。還可加入賦形劑改進(jìn)制劑的物理穩(wěn)定性。最通常使用的非腸胃給藥賦形劑是表面活性劑如聚山梨酯、卵磷脂或脫水山梨(糖)醇酯，粘度改性劑如甘油、丙二醇和聚乙二醇(macrogols)，或濁點(diǎn)改性劑，優(yōu)選非離子試劑(濁點(diǎn)改性劑在非離子表面活性劑組合物進(jìn)行可導(dǎo)致絮凝的相分離時(shí)改變溫度)。
本發(fā)明組合物有利的是含診斷有效的金屬濃度(通常為0.1至250mgFe/ml，優(yōu)選0.5至100mg Fe/ml，特別優(yōu)選1至75mg Fe/ml)的磁性金屬氧化物。
本發(fā)明還提供一種使人體或動(dòng)物體(優(yōu)選哺乳動(dòng)物體)產(chǎn)生對比增強(qiáng)影像的方法，所述方法包括對所述人體或動(dòng)物體，優(yōu)選以非腸胃或特別優(yōu)選血管內(nèi)給藥形式使用本發(fā)明的造影劑懸浮液，并通過MR或磁力測定(例如使用SQUID檢測器或一組SQUID檢測器)使其中分布有所述試劑的所述人體或動(dòng)物體的至少一部分產(chǎn)生影像。
另一方面，本發(fā)明還提供一種測定本發(fā)明造影劑在人體或動(dòng)物人體(優(yōu)選哺乳動(dòng)物體)內(nèi)分布的方法，所述方法包括對所述人體或動(dòng)物體優(yōu)選以非腸胃形式使用所述試劑，并檢測受所述試劑輻射或改性的人體或動(dòng)物體的信號(hào)，如放射活性衰減輻射、磁場畸變或磁共振信號(hào)。
特別優(yōu)選的是，本發(fā)明方法涉及血管成像，特別是使用T1-加權(quán)MR成像。影像可在肝或脾吸入任何明顯的顆粒之前產(chǎn)生。對于具有延長血液壽命聚合物涂料，例如甲氧基PEG磷酸鹽涂料的顆粒，通常在血管內(nèi)給藥的24小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選4小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生影像。在本方法的另一實(shí)施方案中，局部注射后，可產(chǎn)生淋巴系統(tǒng)的T2加權(quán)影像，或在注射入血管之后，可進(jìn)行肝或脾的T2-加權(quán)重研究或T2加權(quán)擴(kuò)散研究。
對于本發(fā)明方法，使用的劑量是所用成像方式的對比有效劑量。通常該劑量為0.05至30mg Fe/kg體重，優(yōu)選0.1至15mg Fe/kg，特別優(yōu)選0.25至8Fe/kg。
本發(fā)明還提供了該新磁性晶體材料用于制備診斷用造影劑組合物的用途，該組合物用于對用了該組合物的人體或動(dòng)物體進(jìn)行診斷方法中。
除了用作造影劑外，本發(fā)明的復(fù)合顆粒還可用于局部熱治療或發(fā)熱涂敷-利用它們的核磁性能，將能量轉(zhuǎn)移至體內(nèi)的顆粒上(例如通過暴露于變化方向或磁場強(qiáng)度的磁場中)，并且從顆粒至周圍組織的能量損失可用于治療目的，例如獲得細(xì)胞毒性作用。當(dāng)其中顆粒與確定目標(biāo)的載體(例如通過雙官能連接劑如雙官能聚氧化亞烴)共軛時(shí)，這是特別重要的。
同樣，該顆?？捎糜阼F療法中-在這種情況下不必使顆粒芯晶體產(chǎn)生磁性，并且這些顆粒可以是具有裂解的聚合物涂料和非必要的第二種涂料(例如MPP的)的順磁氧化鐵。
現(xiàn)有技術(shù)制備的各種氧化鐵制劑是已知的，當(dāng)進(jìn)行血管內(nèi)給藥時(shí)有明顯不良的作用。最常見的是抑制系統(tǒng)血壓和血小板嚴(yán)重減少?？雌饋磉@些副作用可能是對誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)活化的顆粒起生理的和血液的反應(yīng)。盡管常規(guī)氧化鐵顆粒(如磁性淀粉微球(MSM))可強(qiáng)烈活化補(bǔ)體級(jí)連系統(tǒng)，但本發(fā)明的顆粒對循環(huán)血小板的數(shù)量無或僅具有微弱影響，而常規(guī)的制劑會(huì)引發(fā)急性的瞬時(shí)血小板明顯減少癥。
本發(fā)明的顆粒無論有或無第二種涂料(如MPP)，都已令人吃驚地證明對補(bǔ)體系統(tǒng)或補(bǔ)體相關(guān)的參數(shù)如血壓和血小板數(shù)量無影響。選取的涂料在顆粒表面不與常規(guī)顆粒類似的方式觸發(fā)補(bǔ)體活化。
這些顆粒可容易用第二種涂料涂布，例如使用與氧化鐵(FeOx)表面發(fā)生化學(xué)或物理締合的聚合物(如MPP)。這些顆粒特別適合表面進(jìn)一步改性或涂布，原因在于其大表面積和薄碳水化合物涂層，該涂層允許末端官能化的親水聚合物(如MPP)浸入或結(jié)合至或吸附在芯磁性顆粒上。
FeOx顆粒具有比常規(guī)氧化鐵試劑低的磁化強(qiáng)度，因此磁化強(qiáng)度在成像磁場范圍內(nèi)不完全飽和。此特點(diǎn)在高磁場強(qiáng)度時(shí)將減少磁性偽影的出現(xiàn)。
已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的顆粒與通過淀粉與FeOx共沉淀生產(chǎn)的常規(guī)MSM顆粒相比，在小鼠中具有明顯延長的血液半衰期(延長2倍或更長)。
加第二種涂層可進(jìn)一步改善顆粒的血液動(dòng)力學(xué)性能。因此，已證明MPP涂布的顆粒(即二次涂布顆粒)與無MPP涂料或具有甲氧基-PEG(MeO-PEG)作為賦形劑加入(MeO-PEG用作賦形劑且不與FeOx表面相互作用)的產(chǎn)品相比，明顯延長小鼠的血液半衰期(延長2倍或更長)。
已證明MPP涂布的顆粒，與涂有MPP但無裂解聚合物初始涂層的納諾粒度的FeOx顆粒相比，在小鼠中具有明顯延長的血液半衰期(延長2倍或更長)。
已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單一涂布和二次涂布的顆粒對大鼠血液無影響，而常規(guī)多糖FeOx制劑產(chǎn)生明顯的血小板減少。
此外，已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的單一涂布和二次涂布的顆粒對人補(bǔ)體無影響，而常規(guī)淀粉-FeOx(MSM)顆粒為有效的補(bǔ)體活化劑。
本發(fā)明的單晶芯粒是特別有利的，因?yàn)樗鼈兏骄鄣内厔轀p少，如此可減少本發(fā)明組合物中所需的穩(wěn)定劑(如葡聚糖)量，因此減少了可能出現(xiàn)的毒性問題。
為最大限度地減少貯存和運(yùn)輸問題，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的特殊造影劑可以干粉形式，例如通過噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選在無菌條件下生產(chǎn)。該干燥的造影劑形成本發(fā)明又一方面。
本文涉及的各種專利文獻(xiàn)作為參考引入。
下面參考非限制性的實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明實(shí)施例1凝膠的制備步驟是制備淀粉溶液并加熱至50℃，將氯化鐵加入淀粉溶液中，將氫氧化銨加入鐵/淀粉溶液中，將該反應(yīng)混合物加熱至87-90℃并將產(chǎn)品冷卻/中和凝膠。A．制備淀粉溶液1．將50g可溶性土豆淀粉(CAS No.9005-84-9)溶于850g煮沸的去離子水中并混合。2．煮沸并立即趁沸騰將淀粉溶液放入55℃的水浴中。B．將鐵和氫氧化銨加入淀粉中1．將9.0gFeCl3.6H2O和3.3g FeCl2.4H2O(FeⅢ與FeⅡ摩爾比2∶1)溶于總體積50mL去離子水中。2．淀粉溶液冷卻至穩(wěn)定55℃后，將鐵溶液倒入淀粉溶液中，充分混合并加入50ml 30％(濃度)的NH4OH。3．加熱所得溶液以使其溫度在2小時(shí)內(nèi)升至89℃，并在89℃下再保持50分鐘。4．在水浴上加熱170分鐘后，a)在4℃下冷凍過夜以使凝膠凝固，或b)冷卻至室溫并用酸中和(見下面)。C．凝膠洗滌工藝(當(dāng)凝膠不是酸中和的時(shí))用泵抽入冷卻的去離子水使其通過沉降的凝膠懸浮液，洗滌凝固的凝膠直至pH低于8.5。D．另一中和方法將混合物冷卻至40℃以下，用酸中和。E．用次氯酸鈉進(jìn)行凝膠氧化裂解可對一份新樣進(jìn)行每克凝膠的劑量滴定次氯酸鈉(hypo)的量以優(yōu)化生產(chǎn)。通過光子相干光譜(PCS)和通過測定水質(zhì)子馳豫速率評估生產(chǎn)的磁性顆粒粒度和分散性。
a．例如，1.8ml 5％次氯酸鹽/12.5mg Fe/5g凝膠。調(diào)節(jié)次氯酸鹽的體積以在5g凝膠中調(diào)節(jié)氯的濃度和Fe的濃度(單位mg)b．稱量凝膠，加入次氯酸鹽并在70℃的水浴中加熱45分鐘。
c．加熱后，加入8M尿素(0.8ml/5g凝膠)。尿素使過量的次氯酸鹽失活。
d．用膜進(jìn)行離析過濾(MW＜100kD)直至除去所有的游離Fe和CHO。F．分析然后對樣品進(jìn)行分析，按這種方式制備的物質(zhì)具有表1中所列的特征
表1
1gFeOx為約70wt％的Fe*核磁馳豫分散體**晶格條紋成像***以較大規(guī)模生產(chǎn)++在對1200xg離心5分鐘時(shí)低于5％的沉淀物沉降。％面積=HPLC圖形下的總面積用NMRD在2.35高斯至1.2泰斯拉范圍內(nèi)測量作為磁場強(qiáng)度的縱向馳豫速率(1/T1)。例如，參見Koenig等人，細(xì)胞和有機(jī)體的NMR譜，Vol.Ⅱ,p75,R.K.Gupta(編),CRC press,1 987，和Koenig等人，NMR光譜進(jìn)展22:487-567(1990)。實(shí)施例2按照實(shí)施例1制備磁性顆粒，但用玉米淀粉取代土豆淀粉。
應(yīng)注意，使用除可溶性土豆淀粉外的物質(zhì)需要改變用于凝膠形成和降解的物質(zhì)用量。實(shí)施例3按照實(shí)施例1制備磁性顆粒，但用稻米淀粉代替土豆淀粉。實(shí)施例4按照實(shí)施例1制備磁性顆粒，但它們不用次氯酸鹽處理(D項(xiàng))。取而代之的是，用磷酸鹽緩沖飽和鹽水溶液稀釋凝膠樣品(4、8、12g)并用100μg(每μg0.7-1.4個(gè)活性單元)α淀粉酶(EC3.2.1.1)在室溫下對淀粉凝膠進(jìn)行酶水解16小時(shí)。將所得釋放顆粒以低速度進(jìn)行離心除去大的附聚物并通過0.45μm過濾器進(jìn)行過濾。本方法生產(chǎn)具有總粒度較大(范圍10-110nm)但具有6nm氧化鐵芯的顆粒。實(shí)施例5按照實(shí)施例1制備磁性顆粒，但它們不用次氯酸鹽處理(D項(xiàng))。取而代之的是，用裝有1/4英寸探針的Branson聲波發(fā)生器對10g凝膠進(jìn)行聲波處理連續(xù)15分鐘。以低速度離心除去大的附聚物并通過0.45μm過濾器進(jìn)行過濾后，發(fā)現(xiàn)所得釋放的顆粒具有非常大的總粒度(范圍30-800nm)但具有與實(shí)施例4類似粒度的氧化鐵芯。實(shí)施例6將甲氧基PEG磷酸鹽(MPP)(分子量5kD)以MPP與氧化鐵(FeOx)的所需比例(通常為1至2gMPP/g Fe)加入按照實(shí)施例1制備的顆粒的水懸浮液中，在37℃下在恒定旋轉(zhuǎn)下保溫15小時(shí)并在4℃下貯存至使用。
若需要，將這些顆粒在121℃下進(jìn)行高壓釜消毒15分鐘。
將這些顆粒類似地用硫酸軟骨素涂布。
或者，可將MPP涂布的顆粒在75℃下保溫12小時(shí)或可直接在121℃下進(jìn)行高壓釜消毒10-20分鐘。實(shí)施例7與實(shí)施例6相似，用不同分子量的MPP(1.1、2.1、5.0和10.0kD)和不同涂料比(0.02、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.6、2、2.5、3、4和8gMPP/g FeOx)生產(chǎn)MPP涂布的顆粒。實(shí)施例8對實(shí)施例1、6、7的顆粒范圍進(jìn)行動(dòng)物和人血漿試驗(yàn)的結(jié)果對具有某一范圍MPP涂布密度的本發(fā)明顆粒測定小鼠血液半衰期(T1/2)。通過尾靜脈對小鼠注射100μL樣品(以1mg Fe/mL實(shí)施例1、6和7的制劑)。在時(shí)間間隔時(shí)，使動(dòng)物安樂死，并從兩只小鼠中收集血液樣品。由1/T1值，測定半衰期T1/2。結(jié)果在下表2中給出，包括與未涂布的顆粒和常規(guī)MSM顆粒的結(jié)果進(jìn)行對比表2
*分子量5kD。#±表示在T1/2曲線擬合線性關(guān)系中的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。MSM常規(guī)共沉淀磁性淀粉顆粒。
從表2中顯而易見，MPP涂料明顯延長了血液半衰期，而本發(fā)明即使未涂布的顆粒與常規(guī)顆粒相比也具有更長的血液半衰期。
當(dāng)使用非締合二次涂布劑取代MPP時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠的血液半衰期未明顯延長。通過對未涂布和MPP涂布顆粒及用甲氧基PEG(分子量5kD)和用淀粉衍生物Hetastarch處理的顆粒，對比檢測的小鼠血液半衰期證明了這一點(diǎn)。與MPP不同，甲氧基PEG不與顆粒化學(xué)鍵合或締合，因此僅以賦形劑形式存在。比較的結(jié)果在表3中給出表3
在大鼠中對MPP涂布和未涂布MPP的顆粒進(jìn)行血液影響試驗(yàn)。
通過室內(nèi)喂養(yǎng)給藥并將取樣管插入右靜脈中準(zhǔn)備公大鼠。給藥之前約24小時(shí)和給藥后3、10和60分鐘和/或24小時(shí)后，收集血液樣品。測量的血液參數(shù)包括白血細(xì)胞和血小板數(shù)。
與葡聚糖磁鐵礦或MSM顆粒不同，用本發(fā)明的MPP涂布和未涂布MPP的顆粒未觀察到暫時(shí)性血小板減小癥發(fā)病率。
對人血漿試驗(yàn)MPP涂布的和未涂布MPP的顆粒以確定末端補(bǔ)體配合物的活化程度。實(shí)施例9將實(shí)施例6生產(chǎn)的MPP涂布顆粒以1mg Fe/kg的劑量在15分鐘后以2mg Fe/kg的劑量對大鼠給藥。在1.5T、3D TOF、TR/TE 25/5.6、倒轉(zhuǎn)角60°下記錄前后對照T1加權(quán)影像，得到附圖中的圖1、2和3。血管強(qiáng)化在兩個(gè)后對照影像中都是明顯的，盡管高劑量和高磁場并用，但圖3的影像顯示出血管與組織的高對比，沒有磁性偽影。實(shí)施例10后復(fù)合顆粒形成聚合物裂解(a)合成MSM將具有平均分子量70kD的淀粉(3g,Reppe Glycose,Sweden)溶于水(10mL)中。在溫度60℃時(shí)，將FeCl3.6H2O(2.7g)和FeCl2.4H2O(4.5g)溶于碳水化合物溶液中，然后將混合物在60℃下在超聲處理下慢慢沉淀入1.2MNaOH(50mL)中。將超聲處理再繼續(xù)進(jìn)行10分鐘，接著在5000rpm下離心5分鐘。收集上層清液并相對于0.9％NaCl進(jìn)行離析。磁化強(qiáng)度曲線顯示所得淀粉顆粒是超順磁的并顯示400nm的平均流體半徑。(b)用次氯酸鈉處理MSM將平均顆粒粒度400nm的MSM顆粒(15.5mgFe/mL，1.70mL)加入次氯酸鈉(Fluka#71696,13.8％游離氯)。將容器密封緊并在70℃下加熱45分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻，加入8M尿素(0.17mL)并將懸浮液過濾(0.2μm)。將顆粒用Macrosep離心濃縮機(jī)(截止100K)在3000rpm下用水純化。在下表4中給出作為次氯酸鈉加入量函數(shù)所記錄的顆粒粒度。
表4用次氯酸鈉處理前后的MSM的顆粒粒度
1)所有淀粉都裂解，裸露氧化鐵晶體附聚物實(shí)施例11按照實(shí)施例1和7配制產(chǎn)品表5給出按照實(shí)施例1生產(chǎn)并用用于給藥的賦形劑(Tris(50mM)、甘露糖醇(2.5％)和氫氧化鈉至pH6-8)配制的的顆粒(組合物A)和(1.2gMPP(2kD)/gFeOx)(組合物B)的詳細(xì)性能。
表5
注NMRD=核磁弛豫分散體％面積=在HPLC圖下的％總面積實(shí)施例12(MPP涂布前制備顆粒的最佳方式)(A)在裝有頂部攪拌器和冷凝器的22L三頸燒瓶中，將12.8L去離子水加熱至95℃，然后在攪拌速率80-100rpm下加入800g可溶性土豆淀粉(Sigma,No.S-2630)在1.6L去離子水中的懸浮液。將所得輕微渾濁溶液在室溫下攪拌10分鐘然后在30分鐘內(nèi)冷卻至55℃。加入144g FeCl3.6H2O和52.8gFeCl2.4H2O在1.2L去離子水中的溶液，然后在3分鐘后一次加入800mL28％氫氧化銨。將攪拌速率降至約60rpm，并將黑色反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15分鐘，然后在60分鐘內(nèi)逐漸加熱至92℃。將溫度在92-94℃下保持60分鐘，并在反應(yīng)期間和反應(yīng)后通過磁敏感性測量值測定反應(yīng)進(jìn)展。通過真空蒸餾除去過量的氫氧化銨。將濃縮物冷卻至約20℃并冷凍形成凝膠。
總之，用800g土豆淀粉的最大批料制備四批凝膠。
表6制備的凝膠
>*XFR-X射線螢光光譜(B)用冷水洗滌凝膠以除去在氧化鐵形成和殘余氫氧化銨中獲得的氯化銨。或者將這些化合物與在步驟(C)中用于分解淀粉的次氯酸鈉反應(yīng)，對于次氯酸鹽步驟需要更大量的次氯酸鹽。
凝膠洗滌通過在攪拌反應(yīng)器中反復(fù)加水/除水進(jìn)行，反應(yīng)器保持接近5℃以最大限度地降低淀粉溶解。將凝膠在約2體積冷卻的去離子水中(輕輕和慢慢地)攪拌，然后沉降(約1小時(shí))。通過抽吸除去從非常黑的凝膠層中分離的上層黑色清液。重復(fù)加入等量的水、輕輕和慢慢地?cái)嚢?、沉降和分離，最終獲得0.5mmho的導(dǎo)磁率。需要總計(jì)約8體積的水洗滌凝膠，鐵的回收率為約80％。
表7洗滌過的凝膠
C)本步驟涉及將洗滌過的凝膠通過氧化淀粉基體轉(zhuǎn)化為顆粒分散體。這通過用次氯酸鈉處理凝膠完成。用于氧化的次氯酸鹽量通過小規(guī)模(50-100g凝膠)氧化實(shí)驗(yàn)并測量弛豫性(r1、r2和r2/r1)和顆粒粒度。
將洗滌過的凝膠加熱至45℃并用12％的次氯酸鈉溶液處理。反應(yīng)混合物的溫度降低幾度(由于加入冷凍的次氯酸鹽)。將反應(yīng)混合物的溫度升至約45℃。將反應(yīng)混合物在30分鐘內(nèi)加熱至55℃，在此點(diǎn)觀察到放熱反應(yīng)。放熱減退后，將反應(yīng)混合物的溫度調(diào)節(jié)至70℃并保持45分鐘。用RCI量熱計(jì)證實(shí)此步驟的危險(xiǎn)性評估為適中的(15℃)，但該反應(yīng)的放熱是可控制的。
將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫并經(jīng)Millipore 0.2μm標(biāo)準(zhǔn)過濾器濾芯過濾。對15kg凝膠(34g Fe)進(jìn)行最大氧化，回收率是定量的。表8顆粒分散體
(D)本步驟涉及在次氯酸鹽氧化后除去殘余淀粉、游離鐵和其它反應(yīng)物。使用Millipore,prescale TM TFF 100K再生纖維素膜濾芯過濾器獲得所需的結(jié)果。顆粒純度由GPC監(jiān)測。超濾后的最終產(chǎn)品純度為97-99％(GPC)。
表9最終產(chǎn)品批次 投入的 過濾介質(zhì)總水量最終Fe, Fe體積(L) 重量 通過ICP 回收率(L) (kg)(g)(％)1 2 Millpore 25 670 2.267100K,1ft3再生纖維素2 6 Millpore 45 671 8.870100K,1ft3再生纖維素312 Millpore 60 980 13.773100K,1ft3再生纖維素418 Millpore 100 1674 27.782100K,1ft3再生纖維素對于所有4批的最終分析數(shù)據(jù)概列于下表10中。(E)后續(xù)PEG涂布若需要，將通過上面步驟(A)至(D)生產(chǎn)的顆粒用PEG涂布，優(yōu)選用分子量2000D的甲氧基PEG磷酸鹽(MPP)按涂布比例1.2gMPP/g FeOx涂布。
將具有或無這種PEG涂料的顆粒用50mM Tris緩沖液和2.5％甘露糖醇進(jìn)行配藥(用氫氧化鈉將pH調(diào)至6-8)。
表10
實(shí)施例13制備二乙基2-(3,5-二乙酰氨基-2,4,6-三碘代苯甲酰氧基)乙基膦酸鹽在室溫下在氬氣氣氛下向攪拌的泛影酸鈉(7.1g,11.2mmol)在干燥二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液中加入二乙基2-溴甲基膦酸酯(3.02g,12.3mmol,1.1當(dāng)量)在三甲基甲酰胺(10ml)中的溶液。攪拌12小時(shí)后，在真空下蒸出溶劑，得到白色晶體，將其用300ml飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用氯仿與乙醇的1∶2混合物(3×200ml)洗滌。將有機(jī)萃取物干燥(MgSO4)，過濾，并在真空下蒸發(fā)，得到3.16g(41％)白色固體產(chǎn)品。用乙醇重結(jié)晶得到分析純物質(zhì)；mp249-251℃；MH+(779)。1H-NMR(300Mhz)與所需物質(zhì)一致。C17H22I3PN2O7的計(jì)算值C26.24；H2.85；I48.93；N3.60；測定值C26.26；H2.70；I49.05；N3.50。實(shí)施例14制備二乙基2-(3,5-二乙酰氨基-2,4,6-三碘代苯甲酰氧基)乙基膦酸在室溫下在氮?dú)鈿夥障孪驍嚢璧亩一?-(3,5-雙乙酰氨基-2,4,6-三碘代苯甲酰氧基)乙基膦酸酯(3.1g,3.98mmol)在干燥二氯甲烷(40ml)中的懸浮液加入1.5ml(10.56mmol,2.65當(dāng)量)三甲基甲硅烷基碘。攪拌12-14小時(shí)后，觀察到粘性淤漿，接著加入40ml二氯甲烷并連續(xù)攪拌6小時(shí)。然后加入水(4ml)并將反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。加入甲醇(40ml)并將所得紅色溶液在真空下濃縮得到3.42g所需粗產(chǎn)品，為黃色固體。將粗產(chǎn)品溶于20ml 10％甲醇-90％水的溶液中并將所得溶液通過C18離子交換柱，用50ml甲醇水溶液洗脫。將濾液在真空下濃縮，得到0.48g(14％)所需膦酸，為白色固體，mp＞220℃(分解～250℃)；MH+(723)。1H-NMR(300Mhz)譜與所需物質(zhì)符合。C13H14I3PN2O7的計(jì)算值C21.63；H1.95；I52.73；N3.88；P4.29；測定值C21.29；H1.95；I52.44；N3.71；P4.31。
實(shí)施例14的化合物可用于涂布本發(fā)明生產(chǎn)的磁性顆粒。
實(shí)施例15合成甲氧基-PEG(2K)-膦酸酯步驟1將甲氧基-PEG(2K)-OH(21.60g)在108ml甲苯中回流數(shù)小時(shí)恒沸除水。將冷卻的溶液通過滴加入酰氯(7.88mL)與DMF(0.313mL)的混合物進(jìn)行處理，然后加熱回流4小時(shí)。將反應(yīng)混合物在減壓下濃縮并將剩余的淺黃色固體倒入108mL水中，用乙醚洗滌兩次。將水溶液用氯仿萃取兩次，將合并的萃取物在無水硫酸鎂上干燥并濃縮得到19.90g甲氧基-PEG(2K)-Cl。步驟2將甲氧基-PEG(2K)-Cl(18.51g)與亞磷酸三乙酯(185mL)的混合物回流4天。經(jīng)冷卻至室溫后形成沉淀物；將沉淀物通過過濾收集、用乙醚洗滌并真空干燥獲得18.16g甲氧基-PEG(2K)-P(O)(OEt)2。1H NMR(CDCl3；300MHz)；4.10ppm(m,-P(O)(OCH2CH3)2)；3.65ppm(s,(-CH2CH2O-)n)；3.38ppm(s,OCH3)；2.13ppm(兩個(gè)三重峰，-CH2CH2P(O)(OCH2CH3)2)；1.33ppm(t,-P(O)(OCH2CH3)2)。步驟3將甲氧基-PEG(2K)-P(O)(OEt)2(5.02g)在100mL二氯甲烷中的溶液通過滴加入28mL由24.15g溴三甲基硅烷和157mL二氯甲烷制備的溶液進(jìn)行處理。將該反應(yīng)混合物在室溫下冷卻16小時(shí)，然后濃縮得到4.57g產(chǎn)品。為白色固體。1H NMR(CDCl3；300MHz)；8.20ppm(br s，-P(O)(OH)；3.65ppm(s,(-CH2CH2O-)n)；3.38ppm(s,OCH3)；2.17ppm(兩個(gè)三重峰，-CH2CH2P(OH)2)。實(shí)施例16制備甲氧基-PEG(2K)-膦酸酯/超順磁氧化鐵共軛物將甲氧基-PEG(2K)-膦酸酯(0.448g)、3.42mL 93.7mg Fe/mL實(shí)施例12的氧化鐵產(chǎn)品懸浮液和水的混合物在37℃下保溫20小時(shí)。將反應(yīng)混合物放入裝有YM-30膜的50mL Amicon攪拌室中；并對水離析過濾，然后經(jīng)0.2μm尼龍過濾器過濾。通過ICP分析發(fā)現(xiàn)樣品含13.3mg Fe/ml；0.34mg/ml未鍵合的甲氧基-PEG(2K)-膦酸酯和1.42mg/ml鍵合的甲氧基-PEG(2K)-膦酸酯。實(shí)施例17制備甲氧基-PEG(5K)-膦酸酯/超順磁氧化鐵共軛物將甲氧基-PEG(5K)-硫醇(0.438g)、1.67mL 93.7mg Fe/mL實(shí)施例12的氧化鐵產(chǎn)品的懸浮液和水(10mL)的混合物在37℃下保溫22小時(shí)。將反應(yīng)混合物放入裝有YM-30膜的50mL Amicon攪拌室中；并對水離析過濾，然后經(jīng)0.2μm尼龍過濾器過濾。通過ICP分析發(fā)現(xiàn)樣品含13.47mg Fe/ml；0.23mg/ml未鍵合的甲氧基-PEG(5K)-膦酸酯和5.46mg/ml鍵合的甲氧基-PEG(5K)-膦酸酯。實(shí)施例18制備有和無MMP涂料的氧化鐵顆粒無MPP首先將～70％批體積的注射用水加入玻璃或玻璃襯里的制備容器中。在恒定攪拌下，加入并溶解甘露糖醇。最終濃度可為1至5％w/v,3.5％w/v是典型的。在恒定攪拌下，加入并溶解三甲醇氨基甲烷。三甲醇氨基甲烷的最終濃度可為10至100mM,50mM是典型的。在恒定混合下，加入氧化鐵本體溶液(根據(jù)實(shí)施例12生產(chǎn))。氧化鐵的最終濃度可為0.1至10％w/v,3％w/v是典型的。測定本體懸浮液的pH。若必要，用0.1N NaOH或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.1-8.3(目標(biāo)8.2)。在連續(xù)混合下，用注射用水將本體懸浮液調(diào)節(jié)至100％最終體積。將制備的懸浮液在121℃下通過蒸汽加熱消毒，達(dá)到10至50Fo,15Fo是典型的。制備的最終懸浮液可具有pH5至8,7至7.5是典型的范圍。有MPP首先將～25％總批體積的注射用水加入合適配衡的制備容器中。在連續(xù)混合下，加入甲氧基．聚乙二醇(2000)磷酸酯并溶解。最終MPP/Fe濃度可為0.1至5％,2.5％是典型的。在連續(xù)混合下，加入并溶解三甲醇氨基甲烷。三甲醇氨基甲烷的最終濃度可為10至100mM,50mM是典型的。在混合下，加入并溶解甘露糖醇。最終濃度可為1至5％w/v,25％w/v是典型的。在合適的容器中稱取合適量的氧化鐵懸浮液(根據(jù)實(shí)施例12生產(chǎn))。在混合下，將含MPP、甘露糖醇和三甲醇氨基甲烷的溶液加入氧化鐵懸浮液中。氧化鐵的最終濃度可為0.1至10％w/v鐵，3％w/v是典型的。測定懸浮液的pH。用0.4N NaOH調(diào)節(jié)pH至8.4-9.0。在連續(xù)混合下，用注射用水將本體懸浮液調(diào)節(jié)至100％最終體積。將上述制備的懸浮液在121℃下通過蒸汽加熱消毒，達(dá)到10至50Fo,15Fo是典型的。在蒸汽消毒期間完成MPP與氧化鐵結(jié)合。此外，可將懸浮液在60至95℃下保溫2-4小時(shí)完成MPP與氧化鐵結(jié)合。最終懸浮液可具有pH5至8,7至7.5是典型的范圍。實(shí)施例19制備裸露氧化鐵納諾晶體(a)在不加穩(wěn)定劑下除去淀粉衍生的聚合物涂料進(jìn)行試驗(yàn)以確定由實(shí)施例12生產(chǎn)的氧化鐵懸浮液起始，在無任何取代的穩(wěn)定劑下是否可制備無聚合物涂料的氧化鐵納諾晶體的穩(wěn)定懸浮液。將樣品在恒定混合下在55℃下保溫并用pH電極監(jiān)測其pH值。隨著氧化反應(yīng)的進(jìn)行，樣品的pH值向下偏移。通過加入1N NaOH使樣品的pH保持在6.5-7.5范圍內(nèi)。保溫3小時(shí)后，樣品絮凝，說明將其聚合物涂料剝離后，氧化鐵顆粒不穩(wěn)定并形成大附聚體。(b)用單磷酸酯試驗(yàn)為試驗(yàn)單磷酸酯作為穩(wěn)定裸露氧化鐵納諾晶體(nions)的改性劑的效果，進(jìn)行研究，其中將0.5等分試樣的氧化鐵懸浮液與各種濃度的磷酸三鈉混合。然后將0.5ml的過氧化氫加入各樣品中。將這些樣品在50℃下保溫以氧化淀粉衍生的聚合物涂料(SDPC)。
所有樣品在55℃下保溫5小時(shí)后絮凝，表明單磷酸鹽是裸露的氧化鐵晶體(ferron)的不令人滿意的表面改性劑和穩(wěn)定劑。(c)二磷酸鹽作為表面改性劑和穩(wěn)定劑用焦磷酸四鈉(無水)和類似于使用單磷酸鹽時(shí)的方法研究二磷酸鹽(又稱為焦磷酸鹽)作為氧化鐵顆粒的表面改性劑的效果。將樣品在55℃下保溫以氧化淀粉衍生的聚合物涂料(SDPC)。在55℃下保溫5小時(shí)后，樣品2-7保持懸浮。測量它們的平均顆粒粒度并在下表中給出
*樣品絮凝。
樣品顆粒粒度反映除去了淀粉衍生的聚合物涂料。該數(shù)據(jù)表明濃度約2至60mM的焦磷酸鹽是裸露氧化鐵樣品晶體的滿意表面改性劑和穩(wěn)定劑。(d)三磷酸鹽作為表面改性劑和穩(wěn)定劑進(jìn)行研究以試驗(yàn)三磷酸鹽作為穩(wěn)定劑，使用購自Sigma的六水合三磷酸五鈉。向3.75ml氧化鐵懸浮液中加入5.25mM三磷酸鈉、3.75ml水和7.5ml 30％的過氧化氫。將該混合物在60℃下保溫3小時(shí)。該懸浮液未顯示任何絮凝跡象，顆粒粒度測量為9nm。較小的平均顆粒粒度同樣反映除去的涂布淀粉衍生物。該數(shù)據(jù)表明三磷酸鈉是用于氧化鐵晶體的滿意表面改性劑和穩(wěn)定劑。(e)四磷酸鈉作為表面改性劑和穩(wěn)定劑進(jìn)行類似研究以試驗(yàn)四磷酸鹽。使用購自Sigma的四聚磷酸六銨。結(jié)果概列于下表中。
*樣品絮凝保溫后樣品2-4小顆粒粒度反映除去了淀粉衍生的涂料。該數(shù)據(jù)表明三磷酸鹽也是用于裸露氧化鐵晶體的滿意表面改性劑和穩(wěn)定劑。裸露氧化鐵納諾晶體的特征用焦磷酸鈉制備裸露氧化鐵納諾晶體的懸浮液。完成氧化后，將懸浮液相對于水離析過濾以除去淀粉片段和殘余過氧化氫。所得懸浮液通過如下分析數(shù)據(jù)表征。(a)GPC凝膠滲透色譜(GPC)表明裸露氧化鐵納諾顆粒(NION)顯示無淀粉衍生的聚合物痕跡的尖峰。(b)總有機(jī)碳分析兩種單獨(dú)的納諾制劑顯示僅有基線量的總有機(jī)碳，表明基本上完全除去聚合物涂料。
樣品 TOC(ppb)Fe濃度水空白159 -Nion 156 2.6μg/ml樣品 TOC(ppb)Fe濃度水空白144 -Nion 211 30μg/ml實(shí)施例12 406018μg/ml(c)毛細(xì)電泳分析納諾顆粒顯示電泳遷移率為-3.4×10-4cm2v-1s-1，它比實(shí)施例12的產(chǎn)品的電泳遷移率(-3.0×10-4cm2v-1s-1)稍負(fù)。這與通過聚磷酸鹽加入的顆粒的負(fù)靜電荷一致。(d)弛豫性和磁性飽和測定磁弛豫性。r1和r2分別為22.5和34.4mM-1s-1，得到r1/r2值為1.53。這些值一般與實(shí)施例12的產(chǎn)品的那些值非常類似。(e)在蒸汽消毒下的穩(wěn)定性將納諾懸浮液在121℃下蒸汽消毒20分鐘，顆粒粒度未顯示可檢測到的變化。
權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)復(fù)合磁性顆粒的方法，所述方法包括(ⅰ)在含親水性支化有機(jī)聚合物的水介質(zhì)內(nèi)形成磁性顆粒；和(ⅱ)使所述聚合物裂解以釋放復(fù)合顆粒。
2．如權(quán)利要求1的方法，其中所述介質(zhì)為凝膠。
3．如權(quán)利要求2的方法，其中所述凝膠含陰離子位點(diǎn)。
4．如權(quán)利要求1的方法，其中所述磁性顆粒為氧化鐵顆粒。
5．如權(quán)利要求1的方法，其中所述所述顆粒為超順磁性的。
6．如權(quán)利要求1的方法，其中所述支化聚合物為淀粉。
7．如權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物為氧化裂解的。
8．如權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物的裂解是通過處理在所述聚合物基體內(nèi)包括的多個(gè)所述磁性顆粒進(jìn)行。
9．如權(quán)利要求1的方法，其中對所述復(fù)合顆粒進(jìn)一步處理使其上涂布親水性延長血液停留的聚合物。
10．如權(quán)利要求1的方法，其中所述親水性延長血液停留的聚合物在步驟(ⅱ)之前存在于所述介質(zhì)中。
11．如權(quán)利要求9和10任何一項(xiàng)的方法，其中所述延長血液停留的聚合物為官能化的聚氧化亞烴。
12．如權(quán)利要求1的方法，其中所述含水介質(zhì)還含有線性聚合物。
13．如權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物在磁性顆粒-聚合物復(fù)合顆粒形成后發(fā)生裂解。
14．如權(quán)利要求1的方法，包括如下后續(xù)步驟(ⅰ)將淀粉、亞鐵鹽和鐵鹽及堿在加熱的水溶液中混合，(ⅱ)非必要地將所述溶液冷卻至15℃以下使膠體凝固；(ⅲ)將pH降低至6.0-8.5，該步驟非必要地在步驟(ⅱ)之前進(jìn)行；(ⅳ)用氧化劑處理使淀粉裂解并釋放所述顆粒；(ⅴ)洗滌并過濾釋放的顆粒；(ⅵ)非必要地將釋放的顆粒與官能化的聚氧化亞烴衍生物反應(yīng)使所述衍生物與所述顆粒結(jié)合；和(ⅶ)非必要地高壓釜消毒釋放的顆粒。
15．如權(quán)利要求1的方法，其中如此釋放的大部分所述復(fù)合顆粒含單一磁性顆粒。
16．如權(quán)利要求1的方法，其中所述裂解步驟(ⅱ)按兩個(gè)步驟進(jìn)行，第二個(gè)裂解步驟從磁性顆粒中除去基本上所有的所述聚合物，所述第二個(gè)裂解步驟是在與磁性顆粒結(jié)合的穩(wěn)定劑存在下或加入后進(jìn)行的。
17．如權(quán)利要求1的方法，其中所述方法步驟(ⅰ)和(ⅱ)在相同的反應(yīng)器中進(jìn)行。
18．復(fù)合顆粒，其平均顆粒粒度為4至30nm并包括具有裂解的親水性聚合物涂料的超順磁無機(jī)核的顆粒。
19．如權(quán)利要求18的顆粒，其中所述涂料為氧化的碳水化合物。
20．如權(quán)利要求18和19任何一項(xiàng)的顆粒，其中所述涂料為裂解淀粉。
21．如權(quán)利要求18的顆粒，還包括親水性延長血液停留的聚合物涂料。
22．一種顆粒平均粒度為4至30nm的超順磁無機(jī)芯粒的水懸浮液，所述顆?；旧蠠o有機(jī)涂料并具有結(jié)合靜電穩(wěn)定劑的表面。
23．如權(quán)利要求22的懸浮液，其中所述試劑為低聚或多聚磷酸鹽。
24．如權(quán)利要求18的顆粒，其總平均顆粒粒度為4至30nm，包括具有與芯粒表面結(jié)合的生物分布改性劑的超順磁無機(jī)芯粒，通過多個(gè)鐵離子結(jié)合基團(tuán)或通過低聚或多聚磷酸鹽基團(tuán)或與所述改性劑連接的膦酸鹽基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合。
25．如權(quán)利要求24的顆粒，其中所述生物分布改性劑包括聚氧化亞烴部分。
26．如權(quán)利要求24和25任何一項(xiàng)的顆粒，還包括裂解的親水性聚合物涂料。
27．如權(quán)利要求18至26任何一項(xiàng)的顆粒，具有與芯粒表面結(jié)合的可在診斷成像方法中檢測的報(bào)道基團(tuán)。
28．如權(quán)利要求27的顆粒，具有與芯粒表面結(jié)合的碘化有機(jī)磷酸鹽。
29．一種可注射的復(fù)合顆粒試劑，含有無機(jī)粒芯，其表面有化學(xué)或物理結(jié)合的親水性延長血液停留的聚合物和具有屏蔽結(jié)合點(diǎn)的親水性有機(jī)聚合物涂料。
30．如權(quán)利要求29的試劑，其中所述屏蔽聚合物涂料為裂解的支化碳水化合物。
31．如權(quán)利要求29和30任何一項(xiàng)的試劑，其中所述親水性延長血液停留的聚合物為官能化的聚氧化亞烴。
32．一種診斷組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至31任一項(xiàng)的顆?；蚱浞椒ㄋa(chǎn)的顆粒和至少一種生理上可接受的載體或賦形劑。
33．一種造影介質(zhì)組合物，包括造影有效量的含超順磁金屬氧化物芯晶體和有機(jī)涂料的復(fù)合顆粒，所述芯晶體平均直徑為2至10nm，所述顆粒平均直徑至多30nm，所述涂料包括氧化裂解的淀粉。
34．如權(quán)利要求33的組合物，其中所述涂料包括官能化的聚氧化亞烴。
35．如權(quán)利要求33和34任何一項(xiàng)的組合物，其中所述芯晶體具有平均直徑4至8nm，所述顆粒具有平均直徑至多15nm。
36．一種使人體或動(dòng)物體產(chǎn)生對比增強(qiáng)影像的方法，所述方法包括給所述人體或動(dòng)物體使用權(quán)利要求32至35任何一項(xiàng)的組合物，并使其中分布所述試劑的人體或動(dòng)物體的至少部分產(chǎn)生影像。
37．一種測定造影劑在人體或動(dòng)物體內(nèi)分布的方法，所述方法包括給所述人體或動(dòng)物體使用權(quán)利要求32至35任何一項(xiàng)的組合物，并檢測由所述顆粒放射或改性的來自所述人體或動(dòng)物體的信號(hào)。
38．權(quán)利要求1至31任何一項(xiàng)的或其方法所生產(chǎn)的復(fù)合磁性顆粒用于制造診斷造影劑組合物的用途，所述組合物用于對服用了所述組合物的人體或動(dòng)物體進(jìn)行診斷的方法中。
全文摘要
本發(fā)明涉及含復(fù)合的納諾顆粒的MR造影劑,優(yōu)選包含具有涂層的超順磁氧化鐵芯,該涂層含氧化裂解的淀粉涂料和含或不含起延長血液停留作用的官能化聚氧化亞烴。
文檔編號(hào)C01G49/00GK1212629SQ9719272
公開日1999年3月31日 申請日期1997年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月10日
發(fā)明者沃爾夫?qū)? 肯尼斯·凱勒, 丹尼斯·K·富吉伊, 維納·達(dá)薩, 克里斯托弗·布萊克, 馬歇爾·畢勃, 珍妮弗·韋倫斯, 安妮·K·費(fèi)爾維克, 安妮·內(nèi)維斯塔德, 喬治·納, 巴巴拉·苑, 杰克·史蒂文斯, 布賴恩·威克利, 托格里姆·恩格爾, 邁克爾·蓋賽克, 戴維·L·拉德, 賈斯比·辛, 愛德華·R·培根, 格雷戈里·L·麥克英泰爾, 羅伯特·A·斯諾 申請人:耐克麥德英梅金公司