本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)肥料領域，具體涉及一種酶解法制備含寡糖海藻有機肥的方法。

背景技術(shù)：

目前，針對海藻有機肥的生產(chǎn)方法主要有化學法、物理法以及生物法。化學法主要是利用酸、堿及有機溶劑處理海藻細胞，使細胞消解釋放內(nèi)源物質(zhì)，該方法操作簡單，容易實現(xiàn)，也是國內(nèi)外絕大多數(shù)海藻肥生產(chǎn)企業(yè)采用的方法。但是，化學試劑對海藻細胞內(nèi)的活性物質(zhì)成分的破壞是相當大的，并且殘留的有機試劑對環(huán)境也是潛在的危害。物理法的原理是控制壓力，溫度等物理環(huán)境條件，利用機械力使海藻細胞破碎，內(nèi)容物釋放。該方法雖然工藝清潔、環(huán)境友好，但是對于儀器設備的要求嚴苛，反應條件變化劇烈，成本較高，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。生物法包括酶法降解和微生物發(fā)酵兩種方法，其主要原理是破壞海藻細胞壁結(jié)構(gòu)并降解大分子物質(zhì)為植物容易吸收利用的小分子物質(zhì)，該方法反應溫和，整個生產(chǎn)過程安全環(huán)保無污染。

酶解法比微生物發(fā)酵的優(yōu)勢在于過程可控性更高，目標更明確，而且生產(chǎn)效率更高。目前國內(nèi)利用酶解法法生產(chǎn)海藻肥料的研究很少，僅有的幾例研究普遍存在產(chǎn)酶效率不高，酶解產(chǎn)物不明確，有效物質(zhì)含量低等問題，大大影響了產(chǎn)品的的質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種分級酶解法制備含寡糖海藻有機肥的方法。通過多種酶分級酶解，使各類酶發(fā)揮協(xié)同作用，提高活性物質(zhì)褐藻寡糖的含量，增強肥效。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種分級酶解法制備含寡糖海藻有機肥的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、制備產(chǎn)品A：將新鮮的海洋藻類植物洗凈、除雜，浸泡12-48h后，磨漿，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在110-150℃滅菌15-30min，冷卻至20-35℃得到產(chǎn)品A，備用；

并制備酶溶液：將蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別活化后接種到同一個種子發(fā)酵罐混合富集培養(yǎng)，接種量均為10％-20％，溫度為30℃-38℃，培養(yǎng)10h-24h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到纖維素分解酶溶液甲；將嗜糖芽孢桿菌活化后轉(zhuǎn)入種子發(fā)酵罐富集培養(yǎng)，接種量為10％-20％，，溫度為30℃-38℃，培養(yǎng)10h-24h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到褐藻酸降解酶溶液乙；

所述的接種量是指種子液占發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比；

2)、制備產(chǎn)品B：按酶溶液甲和產(chǎn)品A的重量比為1∶3-10，將酶溶液甲加入到產(chǎn)品A中，控制溫度為30-40℃，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)反應的pH值為5-8，反應時間為2-10h，得到產(chǎn)品B；

3)、制備產(chǎn)品C：按酶溶液乙和產(chǎn)品B的重量比為1∶3-10，將酶溶液乙加入到產(chǎn)品B中，控制溫度為30-40℃，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)反應的pH值為5-8，反應時間為2-10h，得到產(chǎn)品C；

4)、制備產(chǎn)品D：將發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)品C溫度冷卻至0℃～5℃，保存2～7天，然后將溫度恢復至25℃～35℃，得到產(chǎn)品D；

5)、制備海藻有機肥：向產(chǎn)品D中加入硝酸鉀10-15重量份、磷酸二氫鉀5-15重量份、尿素10-15份，攪拌使溶解均勻得到100重量份的海藻有機肥。

所述的海洋藻類植物為銅藻、海帶、褐藻、鼠尾藻和馬尾藻中的一種或者任意比例的兩種以上。

所述混合富集培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基配方為：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸鈉1.2g，磷酸二氫鉀0.04g，碳酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，調(diào)節(jié)pH6.8-7.0。

嗜糖芽孢桿菌活化與擴培的培養(yǎng)基配方為：紅薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化錳0.02g，磷酸二氫鉀0.02g，氯化鐵0.005g，硫酸鎂0.2g，硫酸鈣0.1g，新鮮海水1000mL，調(diào)節(jié)pH7.2-7.5。

所述的步驟2)至步驟3)中的酸堿調(diào)節(jié)劑為檸檬酸，草酸，醋酸，氨水，碳酸鈉，醋酸鈉中的一種或幾種。

所述海藻有機肥料的寡糖含量在20g/L以上，褐藻酸含量在20g/L以上，pH值為7.0-8.5，N、P、K含量比例為1-2∶1∶0.8-1.5。

所述嗜糖芽孢桿菌是嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3，其保藏號為CGMCC No12155。

本發(fā)明的有益效果：

1、所用的酶為微生物自身代謝產(chǎn)生，環(huán)保無殘留。

2、酶的專一性決定了其目標產(chǎn)物明確，而高效性大大縮短了反應時間，提高了反應效率。

3、解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的纖維素分解酶能夠降解藻類細胞壁，加快有效物質(zhì)的外流；嗜糖芽孢桿菌產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶能夠?qū)⒑衷逅峤到鉃樾」烟潜恢参镂绽?。兩種酶協(xié)同作用大大提高了褐藻酸的提取率和轉(zhuǎn)化率，提高了褐藻寡糖的含量。

4、采用本發(fā)明制備的有機肥，寡糖含量高，肥效顯著，可明顯提高作物產(chǎn)量和抵抗力。

5、根據(jù)酶的作用不同，最適反應條件存在差別，本發(fā)明采用分級酶解工藝，將酶作用發(fā)揮到最大化，保證了最好的效果。

6、整個工藝流程經(jīng)過微生物和酶的雙重作用，使得最終產(chǎn)品重金屬含量明顯降低。

附圖說明

圖1是顯微觀察YIC～Alg3菌株的革蘭氏染色及聚集成團現(xiàn)象圖。

圖2是基于16SrDNA序列構(gòu)建的YIC～Alg3菌株系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。

具體實施方式

結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

1)制備產(chǎn)品A：將新鮮的銅藻和海帶(質(zhì)量比為1∶1)洗凈、除雜，浸泡24h后，磨漿，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在115℃滅菌30min，冷卻至20℃得到產(chǎn)品A，備用。

2)制備酶溶液：將蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別活化后接種到同一個種子發(fā)酵罐混合富集培養(yǎng)，接種量均為10％，溫度為37℃，培養(yǎng)15h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到纖維素分解酶溶液甲；將嗜糖芽孢桿菌活化后轉(zhuǎn)入種子發(fā)酵罐富集培養(yǎng)，接種量為10％，，溫度為30℃，培養(yǎng)12h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到褐藻酸降解酶溶液乙。

所述的接種量是指種子液占發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比。

所述的混合富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：豆粕粉20g，蛋白胨15g，酵母膏6g，海藻酸鈉1.2g，磷酸二氫鉀0.04g，碳酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，甘露醇4.5g，水1000mL，調(diào)節(jié)pH6.8-7.0。

所述的嗜糖芽孢桿菌富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：紅薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化錳0.02g，磷酸二氫鉀0.02g，氯化鐵0.005g，硫酸鎂0.2g，硫酸鈣0.1g，新鮮海水1000mL，調(diào)節(jié)pH7.2-7.5。

3)制備產(chǎn)品B：按酶溶液甲和產(chǎn)品A的重量比為1∶7，將酶溶液甲加入到產(chǎn)品A中，控制溫度為35℃，用草酸和醋酸鈉調(diào)節(jié)反應的pH值為6.8，轉(zhuǎn)速為150r/min，反應時間為2h，得到產(chǎn)品B。

4)制備產(chǎn)品C：按酶溶液乙和產(chǎn)品B的重量比為1∶10，將酶溶液乙加入到產(chǎn)品B中，控制溫度為30℃，用草酸和醋酸鈉調(diào)節(jié)反應的pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為200r/min，反應時間為3h，得到產(chǎn)品C。

5)制備產(chǎn)品D：將發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)品C溫度冷卻至3℃，保存2天，然后將溫度恢復至25℃，得到產(chǎn)品D；

6)制備海藻有機肥料：向產(chǎn)品D中加入硝酸鉀10重量份、磷酸二氫鉀8重量份、尿素15份，攪拌使溶解均勻得到100重量份的海藻有機肥料。

實施例2

1)制備產(chǎn)品A：將新鮮的馬尾藻和鼠尾藻(質(zhì)量比為1∶1)洗凈、除雜，浸泡36h后，磨漿，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)，在121℃滅菌30min，冷卻至30℃得到產(chǎn)品A，備用。

2)制備酶溶液：將蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌分別活化后接種到同一個種子發(fā)酵罐混 合富集培養(yǎng)，接種量均為15％，溫度為37℃，培養(yǎng)18h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到纖維素分解酶溶液甲；將嗜糖芽孢桿菌活化后轉(zhuǎn)入種子發(fā)酵罐富集培養(yǎng)，接種量為15％，，溫度為35℃，培養(yǎng)14h，將發(fā)酵液離心后經(jīng)過膜過濾除去菌體得到褐藻酸降解酶溶液乙。

所述的接種量是指種子液占發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比。

所述的菌種富集培養(yǎng)基配方均同實施例1。

3)制備產(chǎn)品B：按酶溶液甲和產(chǎn)品A的重量比為1∶6，將酶溶液甲加入到產(chǎn)品A中，控制溫度為37℃，用醋酸和氨水調(diào)節(jié)反應的pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為200r/min，反應時間為3h，得到產(chǎn)品B。

4)制備產(chǎn)品C：按酶溶液乙和產(chǎn)品B的重量比為1∶6，將酶溶液乙加入到產(chǎn)品B中，控制溫度為35℃，用氨水和醋酸調(diào)節(jié)反應的pH值為7.2，轉(zhuǎn)速為220r/min，反應時間為4h，得到產(chǎn)品C。

5)制備產(chǎn)品D：將發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)品C溫度冷卻至3℃，保存3天，然后將溫度恢復至30℃，得到產(chǎn)品D；

6)制備海藻有機肥料：向產(chǎn)品D中加入硝酸鉀12重量份、磷酸二氫鉀10重量份、尿素13份，攪拌使溶解均勻得到100重量份的海藻有機肥料。

對比例1

1)制備產(chǎn)品A：操作方法同實施例2。

2)只制備酶溶液甲：操作方法同實施例2。

3)制備產(chǎn)品B：按酶溶液甲和產(chǎn)品A的重量比為1∶6，將酶溶液甲加入到產(chǎn)品A中，控制溫度為37℃，用醋酸和氨水調(diào)節(jié)反應的pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為200r/min，反應時間為3h，得到產(chǎn)品B。

4)制備產(chǎn)品C：將發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)品B溫度冷卻至3℃，保存3天，然后將溫度恢復至30℃，得到產(chǎn)品C；

5)制備海藻有機肥料：向產(chǎn)品C中加入硝酸鉀12重量份、磷酸二氫鉀10重量份、尿素13份，攪拌使溶解均勻得到100重量份的海藻有機肥料。

對比例2

1)制備產(chǎn)品A：操作方法與實施例2相同。

2)制備酶溶液：操作方法與實施例2相同。

3)制備產(chǎn)品B：將酶溶液甲和酶溶液乙按照質(zhì)量比為1∶1混合后加入到產(chǎn)品A中，混合溶液的加入量為產(chǎn)品A質(zhì)量的20％，控制溫度為35℃，用醋酸和氨水調(diào)節(jié)反應的pH值為7.0，轉(zhuǎn)速為200r/min，反應時間為4h，得到產(chǎn)品B。

4)制備產(chǎn)品C：將發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)品B溫度冷卻至3℃，保存3天，然后將溫度恢復至30℃，得到產(chǎn)品C；

5)制備海藻有機肥料：向產(chǎn)品C中加入硝酸鉀12重量份、磷酸二氫鉀10重量份、尿素13份，攪拌使溶解均勻得到100重量份的海藻有機肥料。

產(chǎn)品指標檢測結(jié)果見表1。

表1：產(chǎn)品檢測結(jié)果

從表1可見，本發(fā)明生產(chǎn)的海藻有機肥，活性物質(zhì)的含量明顯高于市場同類產(chǎn)品，尤其是褐藻寡糖作為本發(fā)明產(chǎn)品的特有的功能性成分，優(yōu)勢極為明顯。經(jīng)過微生物和酶的雙重作用，重金屬含量明顯降低。

將本發(fā)明的實施例和對比例相關肥料施于西紅柿種植地塊，畝用量為40kg。種植期為1年，與施用市場購買的類似產(chǎn)品對比，肥效結(jié)果見表2。

表2：肥效對比結(jié)果

表2表明：在施肥量相當?shù)那闆r下，使用本發(fā)明的海藻有機肥產(chǎn)品，明顯提升作物品質(zhì)，大大降低了作用病蟲害，有效增強作物的抗性，能提高作用產(chǎn)量11-12％；

無論從產(chǎn)品質(zhì)量以及肥效表現(xiàn)上，本發(fā)明采用的復合分級發(fā)酵技術(shù)效果明顯好于單一酶解以及簡單的將多種酶混合酶解。

本發(fā)明所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的保藏號為CGMCC No.12155，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2016年03月02日，拉丁文分類命名：Bacillus halosaccharovorans。

所述嗜糖芽孢桿菌YIC～Alg3的生物特性如下：

褐藻酸碳源培養(yǎng)基：海藻酸鈉5g，硫酸銨5g，硫酸鎂1g，磷酸氫二鉀2g，硫酸亞鐵0.01g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH7.2～7.4。

YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生長48h后，菌落不規(guī)則，淡黃色，中間不透明，邊緣半透明，表面褶皺。顯微鏡觀察菌株為桿狀，在末端或近末端可產(chǎn)生芽孢，革蘭氏陽性，能運動，生長后期菌體易聚集成團(圖1)。生長溫度范圍20～45℃，PH范圍6～9，NaCl濃度范圍0～15％，菌株最適生長溫度37℃，最適生長pH 7.5。觸酶，氧化酶，VP試驗陽性，能夠利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纖維素。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。根據(jù)其生理生化特征，16SrDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹信息，將該菌株鑒定為嗜糖芽孢桿菌Bacillus halosaccharovorans。

注：+表示可以利用，～表示不能利用。