專利名稱:一種在有機(jī)介質(zhì)體系中化學(xué)酶法制備內(nèi)嗎啡肽-1的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工酶催化技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種在有機(jī)介質(zhì)體系中化學(xué)酶法制備 內(nèi)嗎啡肽的生產(chǎn)方法。
內(nèi)嗎啡肽(Endomorphin)是一種具有鎮(zhèn)痛作用的四肽，有內(nèi)嗎啡 肽-1 (Endomorphin-I，EM-I，Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和內(nèi)嗎啡肽 _2 (Endomorphin-2, EM-2， Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)兩種，由美國都藍(lán)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)家Zadina (Nature，1997，386， 499-502)于1997年在牛腦中發(fā)現(xiàn)，它存在于動(dòng)物和人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，被認(rèn)為是μ型阿 片受體(μ-opiate receptor,MOR)的高親和性、高選擇性的內(nèi)源性配基。其最顯著的生理 功能是對于痛覺的調(diào)控，此外還能調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌激素的產(chǎn)生和釋放。內(nèi)嗎啡肽 不具有其他嗎啡類物質(zhì)的各種副作用(Psychopharmacology(Berlin)，2000，151,299-305 ； Am. J. Respir. Crit. CareMed, 2000，162，994-999)，如物理依賴性、耐藥性、呼吸抑制、胃腸 道不適等。因其高效、低毒、構(gòu)象相對簡單，為阿片領(lǐng)域的研究及新型高效的鎮(zhèn)痛藥的開發(fā) 提供了更加便捷的模式，隨著研究的深入，內(nèi)嗎啡肽及其類似物的商業(yè)及臨床應(yīng)用將成為 必然。因此，如何簡單、高效、大規(guī)模的獲得內(nèi)嗎啡肽用于研究和生產(chǎn)十分重要。
內(nèi)嗎啡肽的氨基酸組成及其結(jié)構(gòu)如下式所示背景技術(shù)：
EM-I .Tyr-Pro-Trp-Phe-NE
EM-2 .Tyr-Pro-Phe-Phe-NE[0006] 現(xiàn)階段內(nèi)嗎啡肽的合成主要為化學(xué)法(Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters, 2000, 10,2755-2758 ；Bioorganic & Medicinal Chemistry,2005, 13,6713-6717 ；Bioorganic & Medicinal Chemistry,2007,15,1694-1702 ；Chemistry &Biodiversity，2007，4，458-467)，但是化學(xué)法合成肽類物質(zhì)步驟繁瑣，易消旋。目前，只 有一篇酶法合成內(nèi)嗎啡肽的報(bào)道2008年，何平等人(Chinese Journal ofBiochemistry & Molecular Biology, 2008, 24,426-431)采用酶法合成了內(nèi)嗎啡肽_1，其以乙腈作為有 機(jī)介質(zhì)，在微水有機(jī)溶劑體系中以Boc-Trp和Phe-NH2為底物，用海藻酸鈉-殼聚糖固定 化木瓜蛋白酶(IPSAC)催化合成Trp-Phe-NH2,產(chǎn)率為27.8%。在同樣的反應(yīng)體系中以 Boc-Tyr-Pro-OMe和Trp-Phe-NH2為底物，用海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶(IPSAC) 催化合成 Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2,產(chǎn)率為 35. 2%。[0007]上述酶法合成內(nèi)嗎啡肽-1的體系中，海藻酸鈉-殼聚糖固定化木瓜蛋白酶較昂 貴，且普通蛋白酶在有機(jī)相體系中的活性及穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致產(chǎn)率較低。而且乙腈作為有機(jī) 相反應(yīng)體系，具有較大的毒性。來源于天然耐有機(jī)溶劑微生物的耐有機(jī)溶劑蛋白酶，能穩(wěn)定 存在于有機(jī)溶劑中，可在有機(jī)溶劑中高效的催化肽的脫水縮合反應(yīng)。本發(fā)明采用了自行篩 選到的耐有機(jī)溶劑蛋白酶粗酶液，有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)，相對于商品酶成本低，催化合成內(nèi)嗎 啡肽-1的產(chǎn)率達(dá)90%左右；另外，在耐有機(jī)溶劑蛋白酶催化合成內(nèi)嗎啡肽-1的反應(yīng)中，采 用了水-二甲基亞砜(DMSO)單相體系、水-乙酸乙酯雙相體系，在兩種體系中都實(shí)現(xiàn)了底 物與產(chǎn)物的反應(yīng)分離耦合，大大提高了產(chǎn)率，簡化了產(chǎn)物的分離純化。經(jīng)過發(fā)明者的銳意 研究，發(fā)現(xiàn)了一種采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶在有機(jī)介質(zhì)中高產(chǎn)、簡便、綠色的催化內(nèi)嗎啡肽-1 合成的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種有機(jī)介質(zhì)體系中化學(xué)酶法制備內(nèi)嗎啡肽的工藝，本工 藝分別在水-有機(jī)溶劑單相體系和水-有機(jī)溶劑雙相體系中采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶催化合 成二肽和四肽，并實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)分離耦合，大大提高產(chǎn)率，便于產(chǎn)物分離。該生產(chǎn)工藝的主要 步驟及反應(yīng)式如下
1)采用混合酸酐法由 Boc-Tyr 和 Pro-OMe 合成二肽 Boc-Tyr-Pro-OMe ；
2) Boc-Tyr-Pro-OMe的甲醇溶液，加入適量lmol/L NaOH溶液反應(yīng)，之后用檸檬酸 調(diào)節(jié) PH 為 3，得到 Boc-Tyr-Pro-OH ；
3)耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2在50 % DMSO反應(yīng)體系中由Boc-Trp和Phe-NH2合成 二肽Boc-Trp-Phe-NH2,產(chǎn)物直接從反應(yīng)體系中析出，水洗，抽濾，真空干燥；
4)采用50 % (ν/ν)三氟乙酸去除Boc-Trp-Phe-NH2的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到 Trp-Phe-NH2 ；
5)耐有機(jī)溶劑蛋白酶ΡΤ121在水-有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系中催化Boc-Tyr-Pro-OH 和Trp-Phe-NH2反應(yīng)生成Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，產(chǎn)物被萃取到上相有機(jī)層，取上層，水 洗，旋蒸除去溶劑，真空干燥；
6)同樣采用50% (ν/ν)三氟乙酸去除Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的Boc保護(hù)基 團(tuán)，得到內(nèi)嗎啡肽-1 (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)。
Boc-Tyr+Pro-OMe-HCl chemicalmethod> Boc-Tyr-Pro-OMeBoc-Tyr+Pro-OMe — Boc-Tyr-Pro-OH
Boc-Trp+ Phe-NH2。二^。丄 Boc-Trp-Phe-NH2
Boc-Trp-Phe-NH2 — Trp-Phe-NH2
Boc-Tyr-Pro-OH +Trp-Phe-NH2 ^mati^method^ Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2
Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 — Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2
二肽Boc-Tyr-Pro-OMe由混合酸酐法合成，底物Boc-Tyr與Pro-OMe 'HCl摩爾比 約為1 1，_15°C反應(yīng)1.5小時(shí)，產(chǎn)物為黃色油狀物，產(chǎn)率95.6%。該黃色油狀物溶于甲 醇，加入IM NaOH溶液，室溫反應(yīng)10小時(shí)，用10% (w/v)檸檬酸調(diào)節(jié)pH到3，用乙酸乙酯萃取，旋蒸，得白色固體為Boc-Tyr-Pro-OH，產(chǎn)率87 %。
二肽 Boc-Trp-Phe-NH2 由來自于 Bacillus cereus WQ9-2 (CCTCCM2010010 ；申請 號=201010103804. 6)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2在50% DMSO反應(yīng)體系中合成，反應(yīng)條件 為100mM Boc-Trp和200mM Phe-NH2, 37 °C, 200rpm,反應(yīng)2 5個(gè)小時(shí)，產(chǎn)物直接從反應(yīng) 體系中析出，水洗除去有機(jī)溶劑DMSO及剩余底物，抽濾，真空干燥得較純產(chǎn)物，產(chǎn)率87% 95%。
四 月太 Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 由 來自于 Pseudomonas aeruginosa PT121 (CCTCCM208029 ；公開號=CN 101240254A)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121在水-乙酸乙 酯雙相反應(yīng)體系中合成，20mM Boc-Tyr-Pro-OH與60mM Trp-Phe-NH2溶于乙酸乙酯，三分之 一乙酸乙酯體積的PT121粗酶液加入反應(yīng)瓶，370C，250rpm,反應(yīng)8小時(shí)，產(chǎn)物被萃取到乙酸 乙酯層，取上相乙酸乙酯層，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、10% (w/v)檸檬酸溶液、水、飽和氯 化鈉溶液洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得淺黃色粉末狀物質(zhì)，產(chǎn)率85% 95%。
二肽 Boc-Trp-Phe-NH2 及四肽 Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 中 Boc 保護(hù)基團(tuán)的去除 采用如下方法一定量的樣品溶于適量二氯甲烷，然后冰浴下加入等量的三氟乙酸，室溫反 應(yīng)6小時(shí)，加入V(二氯甲烷)V(甲醇)=2 1的混合溶劑，以帶走三氟乙酸，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)除去溶劑，加入無水乙醚產(chǎn)物析出。
本發(fā)明的有益效果如下
1.采用自行篩選到的耐有機(jī)溶劑蛋白酶進(jìn)行催化反應(yīng)，很好的解決了酶在有機(jī)溶 劑中易失活，穩(wěn)定性差的問題，大大提高了產(chǎn)率。采用粗酶液進(jìn)行催化合成，降低了反應(yīng)成 本。
2.在所選有機(jī)反應(yīng)體系中，產(chǎn)物直接從反應(yīng)體系中析出或被萃取到雙相反應(yīng)中的 有機(jī)層，很好的實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)底物與產(chǎn)物的分離，提高了收率，中間產(chǎn)物不必分離純化。
3.本發(fā)明研究試驗(yàn)出一種有效的采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶在有機(jī)介質(zhì)中催化內(nèi)嗎 啡肽-ι合成的途徑，產(chǎn)率高，純化簡單，成本低廉，為內(nèi)嗎啡肽的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供了可 靠的技術(shù)支持。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一
Boc-Tyr-Pro-OH 的化學(xué)合成
IOOmL反應(yīng)器加入二氯甲烷10mL，Boc-Tyr-OH 0. 625g，置于_15°C的冰鹽浴，加入 N-甲基嗎啡啉(NMM)O. 5mL，氯甲酸異丁酯 0. 3mL，靜置 5min，加入 L-Pro-OMe · HCl 0. 47g, TLC檢測至反應(yīng)完畢，減壓蒸干，加入適量乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相依次用飽和碳酸氫 鈉溶液、10%檸檬酸溶液、水、飽和氯化鈉溶液洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得淺黃色粘稠物 Boc-Tyr-Pro-OMe。
0. 7g (2. Ommo 1) Boc-Tyr-Pro-OMe 溶于適量甲醇加入 IOmllmol/L 的 NaOH 水溶 液，室溫反應(yīng)10-12h加入20ml飽和NH4Cl溶液，用10 % (w/v)檸檬酸調(diào)節(jié)pH為3，用乙 酸乙酯萃取，依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水MgSO4干燥減壓蒸干，得白色粉末狀物質(zhì) Boc-Tyr-Pro-OH。
實(shí)施例二[0034]Trp-Phe-NH2 的酶法合成
0. 6g(IOOmM)Boc-Trp,0. 73g(200mM)Phe-NH2 溶于 lOmLDMSO，緩慢加入 IOmL 耐有 機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2的粗酶液，搖勻，37°C恒溫，200rpm, 2h后產(chǎn)物析出，用水洗滌，離心，真 空干燥，得白色粉末狀物質(zhì)Boc-Trp-Phe-NH2。
0. 9g Boc-Trp-Phe-NH2溶于6ml 二氯甲烷，冰浴下緩慢滴加6ml三氟乙酸(TFA)， 27 28°C反應(yīng)6h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入7.5ml V (二氯甲烷)V (甲醇)=2 1的 混合溶劑，真空除去溶劑以帶走殘留三氟乙酸(TFA)，加入20ml無水乙醚靜置一段時(shí)間后 析出固體為Trp-Phe-NH2。
實(shí)施例三
Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 的酶法合成
0. 042g (20mM) Boc-Tyr-Pro-OH 和 0. 084g (60mM) Trp-Phe-NH2 溶于 6ml 水飽和乙酸 乙酯，加入3ml耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121的粗酶液，37°C，250rpm反應(yīng)8 10小時(shí)，取上層 乙酸乙酯，依次用飽和碳酸氫鈉溶液、10% (w/v)檸檬酸溶液、水、飽和氯化鈉溶液洗滌，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得淺黃色粉末，為B0c-Tyr-Pr0-Trp-Phe-NH2。
0. 14g(0. lmmol) Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 溶于 3ml 二氯甲烷，冰浴下緩慢滴加 3ml三氟乙酸0^幻，27 281反應(yīng)611，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，加入61111 V(二氯甲烷)V(甲 醇)=2 1的混合溶劑，真空除去溶劑以帶走殘留三氟乙酸(TFA)，加入20ml無水乙醚靜 置一段時(shí)間后析出固體為Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2。
權(quán)利要求
一種在有機(jī)介質(zhì)體系中化學(xué)酶法制備內(nèi)嗎啡肽 1的生產(chǎn)方法，其特征為由以下步驟構(gòu)成1)采用混合酸酐法由Boc Tyr和Pro OMe合成二肽Boc Tyr Pro OMe；2)Boc Tyr Pro OMe的甲醇溶液，加入適量1mol/L NaOH溶液反應(yīng)，之后用檸檬酸調(diào)節(jié)pH為3，得到Boc Tyr Pro OH；3)耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9 2在50％DMSO反應(yīng)體系中由Boc Trp和Phe NH2合成二肽Boc Trp Phe NH2，產(chǎn)物直接從反應(yīng)體系中析出，水洗，抽濾，真空干燥；4)采用50％(v/v)三氟乙酸去除Boc Trp Phe NH2的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到Trp Phe NH2；5)耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121在水 有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系中催化Boc Tyr Pro OH和Trp Phe NH2反應(yīng)生成Boc Tyr Pro Trp Phe NH2，產(chǎn)物被萃取到上相有機(jī)層，取上層，水洗，旋蒸除去溶劑，真空干燥；6)同樣采用50％(v/v)三氟乙酸去除Boc Tyr Pro Trp Phe NH2的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到內(nèi)嗎啡肽 1(Tyr Pro Trp Phe NH2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述合成內(nèi)嗎啡肽-1的生產(chǎn)方法，其特征在于=B0c-Trp-Phe-NH2 合成中采用的耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2來自于Bacillus cereusffQ9-2 (CCTCCM2010010 ；申 請?zhí)?201010103804. 6)，其中的親水有機(jī)溶劑為二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、乙 腈、異丙醇、丙三醇、乙二醇、1，2-丙二醇、1，4_ 丁二醇中的一種或它們的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述合成內(nèi)嗎啡肽-1的生產(chǎn)方法，其特征在于 Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2合成中采用的耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121來自于Pseudomonas aeruginosa PT121 (CCTCCM208029 ；公開號CN 101240254A)，其中的疏水性有機(jī)溶劑為乙 酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、異丁醇、異戊醇、氯仿、二氯甲烷等中的一種或它們的混合物。
專利摘要
本發(fā)明屬于生物化工酶催化技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種在有機(jī)介質(zhì)體系中化學(xué)酶法制備內(nèi)嗎啡肽-1的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶WQ9-2在50％DMSO反應(yīng)體系中由Boc-Trp和Phe-NH2合成二肽Boc-Trp-Phe-NH2，產(chǎn)物析出，然后酸解除去Boc保護(hù)基團(tuán)生成Trp-Phe-NH2；采用耐有機(jī)溶劑蛋白酶PT121在水-有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系中催化Boc-Tyr-Pro-OH和Trp-Phe-NH2反應(yīng)生成Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，產(chǎn)物被萃取到上相有機(jī)層，取有機(jī)層水洗，除去溶劑得Boc-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2，然后酸解生成內(nèi)嗎啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)。本發(fā)明采用粗酶液高效催化，產(chǎn)率高，相對商品酶成本低。反應(yīng)過程中采用的有機(jī)溶劑體系實(shí)現(xiàn)了底物與產(chǎn)物的反應(yīng)分離耦合，大大提高了收率，簡化了產(chǎn)物的分離純化步驟。
文檔編號C12P21/02GKCN101928741SQ201010235086
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月23日
發(fā)明者何冰芳, 吳斌, 孫洪林, 柏中中, 歐陽平凱, 許家興 申請人:南京工業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan