孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒，該法結(jié)合了間接酶免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，在不需要另外制備酶標(biāo)單克隆抗體的情況下，將傳統(tǒng)兩步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法簡化為一步，并利用15～35%乙腈對高濃度無色孔雀石綠溶解力有限的特性，將其作為樣品溶解液。該法應(yīng)用在動物源性食品中孔雀石綠殘留檢測，具有快速、簡便、特異、靈敏、準(zhǔn)確、檢測范圍寬等特點，更加符合快速檢測的要求，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明試劑盒的IC50為0.45μg/L，回收率為86.37～116.84%，與標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的吻合率為100%，適合用于孔雀石綠的痕量分析與批量檢測。
【專利說明】孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及孔雀石綠殘留檢測分析領(lǐng)域，尤其涉及一種孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]孔雀石綠(Malachite Green，MG)分子式為C23H25N2Cl,屬于三苯甲烷類染料，曾因其在預(yù)防和治療水霉病、鰓霉病、小瓜蟲病、魚卵霉菌等方面的顯著功效，而廣泛應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠特別是其代謝產(chǎn)物在水生動物體內(nèi)具有明顯的蓄積殘留現(xiàn)象，且因為MG具有使動物肝細胞空泡化、影響動物的生長和繁殖能力、致癌性等危害，已嚴重威脅到水生動物和人類健康，所以美國、加拿大、歐盟等許多國家都禁止在水產(chǎn)品中使用孔雀石綠；歐盟、澳大利亞和新西蘭確定孔雀石綠和無色孔雀石綠的最低執(zhí)法限量為2μ g/kg ;我國也在2002年將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農(nóng)業(yè)部公告193號)，并在《2000年度中國出口動物源性食品有毒有害物質(zhì)殘留監(jiān)控計劃》中首次將鰻魚中MG項目的監(jiān)控列入年度計劃，并延續(xù)至今。然而，由于目前尚無孔雀石綠的較好替代品，因此一些不法商販仍在非法使用，導(dǎo)致孔雀石綠殘留超標(biāo)事件時有發(fā)生。
[0003]鑒于孔雀石綠的危害，世界各國相繼立法禁止其在食品動物中使用，并建立了許多殘留檢測方法，用于檢測孔雀石綠的殘留量。常用的有理化方法(如高效液相色譜法、氣相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、薄層層析)以及免疫學(xué)方法(如放射免疫法、熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)分析法、化學(xué)發(fā)光分析法等)。其中理化方法具有精密度與準(zhǔn)確度高的優(yōu)點，往往被用作最終確證的檢測方法，而免疫學(xué)方法因其簡便、快速、廉價、高靈敏性、高通量等特點，較好地彌補了理化方法的不足，近年來越來越多地被應(yīng)用于藥物殘留的檢測。
[0004]試驗證實,孔雀石綠進入動物體內(nèi)會快速轉(zhuǎn)化為無色孔雀石綠(LeucomalachiteGreen, LMG), 24h內(nèi)轉(zhuǎn)化率達80%，而且LMG不溶于水，難于排出體外，消除速度慢，殘留時間達100天以上，殘留毒性比MG更高，在很多國家被視為殘留標(biāo)示物，因此以LMG為檢測對象更能說明MG在動物體內(nèi)殘留的情況。
[0005]中國專利申請“一種孔雀石綠的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法及試劑盒”(申請?zhí)?01210106196.3
【公開日】2013年9月12日)采用兩步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測體系和檢測方法對待測樣品中孔雀石綠殘留進行檢測，操作步驟多、分析時間長、檢測范圍窄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、簡便、特異、靈敏、準(zhǔn)確、檢測范圍寬的孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。
[0007]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題提供一種特異性高、親和力強的無色孔雀石綠單克隆抗體。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法，包括以下步驟:[0010]〈1>處理待測樣品；
[0011]<2>將半抗原無色孔雀石綠與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物(LMG-OVA)作為抗原包被于發(fā)光固相載體，封閉后，依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)樣品或經(jīng)前處理的待測樣品、酶標(biāo)二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和無色孔雀石綠單克隆抗體進行反應(yīng)，然后再加入化學(xué)發(fā)光液，測定系列標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的發(fā)光值；
[0012]<3>以步驟〈2>測得的發(fā)光值計算抑制率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中孔雀石綠的含量。
[0013]步驟〈1>按以下操作進行:取5g組織樣品加入IOmL乙腈超聲波震蕩15min,4000r/min離心IOmin,取上清液加入20g中性氧化招，震蕩混勻5min,4000r/min離心5min，取上清液于氮氣吹干，加入15~35%乙腈溶液溶解，用于檢測；
[0014]步驟〈2>按以下操作進行:用包被液將抗原稀釋成5 μ g/mL,每孔加入100 μ L,4°C孵育10~16h后，傾去包被液，用洗板機洗滌化學(xué)發(fā)光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封閉液，37°C孵育I~2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37°C烘干后，用錫箔紙真空密封，4°C保存；將化學(xué)發(fā)光板從4°C中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50 μ L將系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測樣品加入化學(xué)發(fā)光板，各設(shè)3孔重復(fù)，然后依次按照每孔50 μ L加入酶標(biāo)二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、無色孔雀石綠單克隆抗體，混勻，37°C孵育60min ;傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入ΙΟΟμ L化學(xué)發(fā)光液，混勻，盡快測定各孔發(fā)光值。
[0015]封閉液是5%的脫脂奶粉；無色孔雀石綠單克隆抗體稀釋為1.15 μ g/mL ;系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度為 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ；包被液是pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
[0016]孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒，包括包被有包被抗原(LMG-OVA)的化學(xué)發(fā)光板、無色孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、無色孔雀石綠單克隆抗體工作液、濃縮洗滌液、HRP-山羊抗小鼠IgG (酶標(biāo)二抗)工作液、化學(xué)發(fā)光液；包被抗原為無色孔雀石綠與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物；無色孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液為7個濃度梯度，分別是 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;濃縮洗滌液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐溫-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化學(xué)發(fā)光液來自超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒P0018--BeyOECL Plus。
[0017]上述試劑盒在動物源性食品中孔雀石綠殘留檢測中的應(yīng)用。
[0018]無色孔雀石綠單克隆抗體，按以下操作制備:以半抗原無色孔雀石綠與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(LMG-BSA)作為免疫原，免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，按照常規(guī)方法進行細胞融合和陽性株的篩選，對篩選出的陽性細胞株連續(xù)克隆3次，經(jīng)過鑒定、凍存和建株后，進行腹水的制備，然后通過純化腹水，獲得能特異性識別無色孔雀石綠的單克隆抗體。
[0019]上述的無色孔雀石綠單克隆抗體，按以下操作制備:
[0020]〈1>動物免疫
[0021]將健康的6周齡雌性BALB/c小鼠通過基礎(chǔ)免疫和5次加強免疫后，對效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫；
[0022]<2>細胞融合和克隆篩選
[0023]沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，利用細胞融合技術(shù)將小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞進行融合，融合后的細胞懸液加至已事先鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞；
[0024]待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準(zhǔn)確吸取ΙΟΟμ L上清，加至已包被抗原(LMG-OVA)的酶標(biāo)板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100%時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力；
[0025]<3>細胞凍存與復(fù)蘇
[0026]用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中
培養(yǎng)；
[0027]〈4>腹水的制備與純化
[0028]采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，即得無色孔雀石綠單克隆抗體。
[0029]本發(fā)明首次探討了檢測無色孔雀石綠殘留的一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫機理，發(fā)明人結(jié)合了間接酶免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，在不需要另外制備酶標(biāo)單克隆抗體的情況下，將傳統(tǒng)兩步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法簡化為一步，并利用15?35%乙腈對高濃度無色孔雀石綠溶解力有限的特性，將其作為樣品溶解液，成功建立了一步式孔雀石綠化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。本發(fā)明“一步法”的線性檢測范圍(0.001?100 μ g/L)比“兩步法”和ELISA寬，最低檢測限(0.0016 μ g/L)降低了 10?100倍，更加符合痕量分析和批量檢測；另外，本發(fā)明配制的15?35%乙腈對高濃度孔雀石綠溶解力有限，當(dāng)待測樣品中孔雀石綠含量超過本發(fā)明的最高檢測限100 μ g/L時，會出現(xiàn)肉眼可見的渾濁，因此，當(dāng)檢測孔雀石綠嚴重超標(biāo)的樣品時(含量超過上述兩種方法檢測范圍而低于ΙΟΟμ g/L)，無需對樣品進一步稀釋并重復(fù)檢測；而當(dāng)孔雀石綠殘留量超過最高檢測限時，則利用15?35%乙腈溶解樣品直觀地提示需對樣品進一步稀釋，然后再進行檢測。通過以上改進，本法簡化了操作步驟，減少了工作量，降低了試驗誤差，縮短了檢測時間，節(jié)省了檢測成本，具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確等特點，更加符合快速檢測的要求，具有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明試劑盒的IC5tl為
0.45 μ g/L,回收率為86.37?116.84%，與標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的吻合率為100%，適合用于孔雀石綠的痕量分析與批量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為實施例2孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031]圖中:X軸為孔雀石綠梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對數(shù)值；Y軸為各濃度孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品的發(fā)光值除以“O ”濃度孔發(fā)光值(RLU/RUU90。
【具體實施方式】
[0032]實施例1無色孔雀石綠單克隆抗體的制備
[0033]1.1動物免疫
[0034]以半抗原無色孔雀石綠與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(LMG-BSA)作為免疫原，對健康的6周齡雌性BALB/c小鼠進行基礎(chǔ)免疫和5次加強免疫后，測定血清效價和IC5tl，選取效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫；
[0035]1.2細胞融合和克隆篩選
[0036]沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，利用細胞融合技術(shù)將小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞進行融合，融合后的細胞懸液加至已事先鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞；
[0037]待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準(zhǔn)確吸取100 μ L上清，加至已包被抗原LMG-OVA的酶標(biāo)板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100%時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力；1.3細胞凍存與復(fù)蘇
[0038]用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中
培養(yǎng)；
[0039]1.4腹水的制備與純化
[0040]采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，證實獲得的無色孔雀石綠單克隆抗體IHlO達到電泳純。
1.5單克隆抗體的鑒定
[0041]1.5.1雜交瘤細胞培 養(yǎng)上清及純化后抗體效價的測定
[0042]采用間接ELISA方法，測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中LMG-McAb的效價為1:640，親和層析純化后的腹水效價達到1:5X105。
[0043]1.5.2親和力的測定
[0044]通過非競爭ELISA，分別以O(shè)D45tl值為縱坐標(biāo)，以LMG-McAb的濃度為橫坐標(biāo)，繪制親和曲線，以公式I計算不同抗原包被濃度下的親和常數(shù)，取平均值得出無色孔雀石綠單克隆抗體的親和常數(shù)(Ka)為6.2XlOVmolο

η-l
[0045]Ka=-(公式 I)

2(n[Ab']-[Ah]t)
[0046]1.5.3亞類的鑒定
[0047]采用美國Southern Biotech公司的免疫球蛋白亞類檢測試劑盒測定無色孔雀石綠單克隆抗體IHlO為IgG1亞類，K輕鏈。
[0048]實施例2孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法的建立
[0049]2.1相關(guān)試劑的配制
[0050]碳酸鹽緩沖液(pH9.6，即包被液):準(zhǔn)確稱取Na2CO3L 59g、NaHC032.93g，超純水溶解后，調(diào)節(jié)pH至9.6，定容至1000mL。
[0051]洗滌液(ρΗ7.4):準(zhǔn)確稱取 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12Η202.90g、KC10.20g，超純水溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入吐溫-200.50mL，定容至1000mL。
[0052]磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4):準(zhǔn)確稱取 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g，超純水溶解后，調(diào)節(jié) pH 至 7.4，定容至 IOOOmL0
[0053]封閉液:準(zhǔn)確稱取脫脂奶粉1.0g，加入20mL磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻至完全溶解。
[0054]BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，P0018，IOOmL):購自碧云天生物技術(shù)研究所。
[0055]2.2抗原、抗體稀釋倍數(shù)的確定
[0056]采用方陣滴定確定抗原、抗體稀釋倍數(shù):將LMG-OVA (10mg/mL)按照1:2000、1:4000、1:6000 和 1:8000 稀釋后包被化學(xué)發(fā)光板，并以 1:1000、1:2000、1:3000 和 1:4000稀釋無色孔雀石綠單克隆抗體(4.6mg/mL)，進行反應(yīng)，選擇反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線IC5tl (50%抑制率時藥物的濃度，即反應(yīng)的靈敏度)最小的條件作為最佳抗原包被條件。由表1結(jié)果確定包被抗原和單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)分別為1:2000、1:4000，即5μ g/mL、1.15 μ g/mL。
[0057]表1抗原、抗體稀釋倍數(shù)的確定
【權(quán)利要求】
1.一種孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于包括以下步驟: <1>處理待測樣品； 〈2>將半抗原無色孔雀石綠與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物作為抗原包被于發(fā)光固相載體，封閉后，依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)樣品或經(jīng)前處理的待測樣品、酶標(biāo)二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和無色孔雀石綠單克隆抗體進行反應(yīng)，然后再加入化學(xué)發(fā)光液，測定系列標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的發(fā)光值； <3>以步驟〈2>測得的發(fā)光值計算抑制率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中孔雀石綠的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于: 步驟〈1>按以下操作進行:取5g組織樣品加入IOmL乙腈超聲波震蕩15min,4000r/min離心IOmin,取上清液加入20g中性氧化招,震蕩混勻5min, 4000r/min離心5min,取上清液于氮氣吹干，加入15~35%乙腈溶液溶解，用于檢測； 步驟〈2>按以下操作進行:用包被液將抗原稀釋成5 μ g/mL，每孔加入100μ L，4°C孵育10~16h后，傾去包被液，用洗板機洗滌化學(xué)發(fā)光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封閉液，37°C孵育I~2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37°C烘干后，用錫箔紙真空密封，4°C保存；將化學(xué) 發(fā)光板從4°C中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50 μ L將系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測樣品加入化學(xué)發(fā)光板，各設(shè)3孔重復(fù)，然后依次按照每孔50 μ L加入酶標(biāo)二抗、無色孔雀石綠單克隆抗體，混勻，37°C孵育60min ;傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入IOOyL化學(xué)發(fā)光液，混勻，盡快測定各孔發(fā)光值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于:所述封閉液是5%的脫脂奶粉；所述無色孔雀石綠單克隆抗體的稀釋為1.15 μ g/mL ;所述系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的濃度為 O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、l μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述包被液是pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
4.一種孔雀石綠殘留一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒，其特征在于包括包被有包被抗原的化學(xué)發(fā)光板、無色孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、無色孔雀石綠單克隆抗體工作液、濃縮洗滌液、HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化學(xué)發(fā)光液；所述包被抗原為無色孔雀石綠與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物；所述無色孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液為7個濃度梯度，分別是 O μ g/L,0.001 μ g/L,0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述濃縮洗滌液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐溫-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化學(xué)發(fā)光液來自超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒P0018--BeyOECL Plus。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒應(yīng)用于動物源性食品中孔雀石綠殘留的檢測。
6.一種無色孔雀石綠單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備:以半抗原無色孔雀石綠與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原，免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，按照常規(guī)方法進行細胞融合和陽性株的篩選，對篩選出的陽性細胞株連續(xù)克隆3次，經(jīng)過鑒定、凍存和建株后，進行腹水的制備，然后通過純化腹水，獲得能特異性識別無色孔雀石綠的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無色孔雀石綠單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備: 〈1>動物免疫將健康的6周齡雌性BALB/c小鼠通過基礎(chǔ)免疫和5次加強免疫后，對效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫； <2>細胞融合和克隆篩選 沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，利用細胞融合技術(shù)將小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞進行融合，融合后的細胞懸液加至已事先鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞； 待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準(zhǔn)確吸取100 μ L上清，加至已包被抗原的酶標(biāo)板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100%時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力； <3>細胞凍存與復(fù)蘇 用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37 V水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中培養(yǎng); <4>腹水的制備與純化 采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，即得無色孔雀石.綠單克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/577GK103472228SQ201310408148
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】吳健敏, 馬玲, 張啟模, 陳鳳蓮, 覃紹敏, 白安斌, 韋建興, 林俊, 劉金鳳, 黃紅梅, 關(guān)忠誼 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所