專利名稱：一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在載體上固定生物活性物質(zhì)的方法，特別是一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法。
載體表面生物活性物質(zhì)固定的常用方法有(1)吸附法物理吸附是一種較為簡單的固定化技術(shù)，生物活性物質(zhì)以靜電引力吸附在載體表面。物理吸附比較簡單，同其它化學方法相比，對生物活性的影響較小，但所固定的分子容易從載體表面脫落，壽命也較短。
(2)共價鍵合法通過共價鍵將生物活性物質(zhì)與載體表面上的基團鍵合而將它們固定在載體表面。表面上的共價鍵合較吸附困難，生物物質(zhì)的活性易受影響，在使用過程中易失去活性。在載體表面共價鍵合生物分子時，需考慮很多因素，操作步驟也較多，常包括載體基底表面的活化，生物分子的偶聯(lián)等。
(3)交聯(lián)法通過雙功能團試劑在生物活性物質(zhì)分子之間、分子與基底之間交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而使其固定于載體表面。這種方法的局限性是膜的形成條件不易確定，須仔細地控制pH、離子強度、溫度及反應(yīng)時間。交聯(lián)膜的厚度及雙功能團試劑的含量對傳感器的響應(yīng)具有重要的影響。
(4)包埋法應(yīng)用高分子聚合物包埋生物活性物質(zhì)的固定化技術(shù)已被廣泛使用，它可將生物分子通過高分子聚合物的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定在載體表面。該技術(shù)可采用溫和的實驗條件，大多數(shù)生物活性物質(zhì)可很容易摻入聚合物膜中，膜的孔徑和幾何形狀也可控制。但它也有一定的局限性，如必須控制很多實驗因素，聚合物形成過程中產(chǎn)生的自由基與聚合物的空間結(jié)構(gòu)會影響生物分子的活性等。
利用溶膠/凝膠多孔玻璃代替高分子聚合物膜進行生物分子如酶、蛋白質(zhì)、抗原抗體、DNA以及細胞甚至是生物組織等的固定是近年來發(fā)展起來的方法。溶膠/凝膠玻璃材料具有十分誘人的特性制備方法簡單，具有孔徑可調(diào)的多孔結(jié)構(gòu)，能在較低的溫度下包埋生物活性分子，從而保持生物分子的自身結(jié)構(gòu)、活性和功能，而且識別對象可通過凝膠玻璃的孔道與其接觸，產(chǎn)生識別信號。溶膠/凝膠本身也具有化學惰性、低溶脹性和良好的機械穩(wěn)定性。
溶膠/凝膠過程包括溶膠的形成(Sol)、溶膠凝膠化為濕凝膠(Gel)和濕凝膠的干燥和老化等幾個步驟(1)水解、縮合形成溶膠目前報道的方法大都采用低分子量的硅烷氧基化合物作為前驅(qū)體在強酸催化下和水反應(yīng)形成溶膠。由于硅氧烷和水不互溶，通常加入相應(yīng)的醇作為共溶劑。水解產(chǎn)物經(jīng)縮合后得到穩(wěn)定的溶膠。
(2)凝膠化水解產(chǎn)生的膠體粒子由于其表面負電荷間的排斥作用而穩(wěn)定存在。但隨著水解和聚合的進行，水被消耗，溶劑蒸發(fā)，膠粒濃度隨之增大，減弱了這種穩(wěn)定作用從而發(fā)生凝膠化。
(3)干燥和老化在凝膠化的最后階段，隨著水和溶劑的揮發(fā)，毛細管力使凝膠網(wǎng)絡(luò)聚集而發(fā)生收縮。此時往往會發(fā)生凝膠的干裂。有人建議在Sol-Gel過程中加入一些表面活性劑以防止這種現(xiàn)象的發(fā)生。
溶膠/凝膠生物傳感器制備的常見方法是將生物活性物質(zhì)分散于溶膠后，滴涂或蘸涂到平面基體載體的表面，而后溶膠在載體表面在適當?shù)臏囟认履z凝化，從而使生物活性物質(zhì)固定在載體表面。由于硅溶膠需要在強酸催化的條件下制備，而酸度過高會使生物物質(zhì)的活性降低甚至失去其活性。在傳感器的制作過程中，滴涂在載體表面的硅溶膠在膠凝成膜時易發(fā)生開裂，使膜從載體表面脫落而不能有效地進行生物活性物質(zhì)的固定。為了防止膜的開裂和脫落，通常在水解縮合形成溶膠的過程中預先加入表面活性干燥控制劑以控制溶膠中水分揮發(fā)的速度，防止形成的凝膠膜開裂。但表面活性干燥控制劑都是有機化合物，會不同程度地影響生物活性物質(zhì)的活性，最終影響生物傳感器的性能。
2、技術(shù)方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法，是將鈦溶膠的膠凝化過程用于生物活性物質(zhì)在載體表面的包埋，構(gòu)造新型仿生催化界面(生物功能膜)和生物傳感器。具體步驟是(1)將生物活性物質(zhì)溶解于緩沖溶液中，所選擇的緩沖溶液的pH值因生物分子的種類而異，標準是使生物物質(zhì)的活性最大。
(2)在載體表面上滴涂一定濃度的上述混合溶液，并將其懸于鈦烷氧基化合物液面的上方，然后將此體系密閉。
(3)將以上密閉體系置于15-35℃的恒溫中，恒溫4-8小時。
(4)在密閉體系中，液面上的鈦烷氧基化合物蒸汽與載體表面上的溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠，膠凝化后將生物活性物質(zhì)包埋并固定于載體表面，在載體上獲得二氧化鈦凝膠膜并可制成生物傳感器。
本發(fā)明中，影響所獲得的生物功能膜和生物傳感器性能的主要因素有四個方面(1)緩沖溶液的pH值只有在一定的酸度下，生物物質(zhì)才具有最佳活性。如果緩沖溶液的酸度偏離這一數(shù)值，將生物分子溶解于其中就會傷害它的活性，從而影響生物功能膜和生物傳感器的性能。
(2)生物活性物質(zhì)的濃度載體表面溶膠膠凝化以后，包埋生物活性物質(zhì)的容量是有限的。如果濃度過高，就會有一部分生物物質(zhì)不能被凝膠膜包埋進去；生物物質(zhì)的濃度太低，膜的容量達不到飽和，最終影響生物功能膜及生物傳感器的性能。
(3)溫度當?shù)瓮坑猩镂镔|(zhì)溶液的載體懸于四異丙氧基鈦液面之上時，會有兩個過程同時發(fā)生，一是四異丙氧基鈦蒸汽在載體表面沉積，另一個是載體表面溶液中水分的揮發(fā)。如果溫度太高，四異丙氧基鈦的蒸汽壓太大，水解的速度太快，此時形成的就不是溶膠，而是二氧化鈦的顆粒沉淀；如果溫度太低，四異丙氧基鈦的蒸汽壓太小，水分揮發(fā)的速度就會比蒸汽沉積的速度快，載體表面以致沒有足夠的水與四異丙氧基鈦的蒸汽發(fā)生水解反應(yīng)來生成想要的溶膠。
(4)時間足夠的時間能使水解反應(yīng)充分，同時也能保證溶膠完全膠凝化。太短的時間會是反應(yīng)不充分，膠凝化不完全；太長的時間，在溶膠完全膠凝化以后就毫無意義了。
3、有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點是可控制鈦烷氧基化合物的水解速度，避免其與水直接混合而強烈水解產(chǎn)生沉淀，在溶膠制備的過程中不需加入酸和表面活性劑，能夠隨意控制酸度環(huán)境，便于最大限度地保持生物活性物質(zhì)的活性。而且，所制得的膜不開裂，不會從載體表面脫落，由于凝膠膜內(nèi)的多孔結(jié)構(gòu)和氫鍵的相互作用，使被包埋的生物活性物質(zhì)也不易泄漏。這種技術(shù)將溶膠的制備和成膜的過程合二為一，溶膠/膠凝成膜的同時將生物活性物質(zhì)包埋而被固定于載體表面。該方法不僅簡化了溶膠/膠凝成膜和生物傳感器的制備步驟，制得的生物傳感器也因二氧化鈦凝膠膜良好的生物兼容性、凝膠膜形成的溫和條件、生物活性物質(zhì)不易泄漏、其活性不會受到傷害、膜不易開裂等優(yōu)點而保持較高的活性、較長的壽命和好的穩(wěn)定性。
四、最佳實施方式實施例1選擇直徑4mm的盤狀平面玻碳電極作載體材料，生物活性物質(zhì)以辣根過氧化酶(HRP)為例作包埋固定的對象(1)先將電極表面用金相砂紙打磨，然后分別用1.0、0.3、0.05μm的γ-氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著用二次水沖洗干凈，電極表面依次用1∶1硝酸、丙酮、二次水超聲清洗，得到新鮮干凈的電極表面，于室溫干燥。
(2)將5毫克HRP溶解在1毫升0.02M pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，取10微升HRP溶液，滴涂在經(jīng)(1)步驟處理的電極表面，然后將此電極懸于四異丙氧基鈦液面的上方，將體系密閉后于25℃的恒溫箱中，恒溫6小時。
(3)在密閉體系中，四異丙氧基鈦蒸汽與電極表面的酶溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠。溶膠在膠凝成膜的過程中將HRP包埋凝膠膜內(nèi)，從而被固定在電極表面，制成HRP生物功能膜和H2O2生物傳感器。
實施例2以生物活性物質(zhì)葡萄糖氧化酶(GOx)作包埋固定的對象(1)將電極表面用實施例1中第一步驟處理。
(2)將2毫克GOx溶解在1毫升0.02M pH7.3的磷酸鹽緩沖溶液中，取10微升GOx溶液滴涂在經(jīng)(1)步驟處理的電極表面，然后將此電極表面懸于四甲氧基鈦液面的上方，將體系密閉后于20℃的水浴中恒溫5小時。
(3)同樣，電極表面的酶溶液與四甲氧基鈦蒸汽接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠。溶膠在膠凝成膜的過程中將GOx包埋凝膠膜內(nèi)，從而被固定在電極表面，制成GOx生物功能膜和葡萄糖生物傳感器。
權(quán)利要求
1.一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法，其特征在于該制備步驟是(1)將生物活性物質(zhì)溶解于緩沖溶液中；(2)在載體的表面滴涂上述混合溶液，并使之懸于鈦烷氧基化合物液面的上方，然后將此體系密閉；(3)將以上密閉體系置于15-35℃的恒溫中，恒溫4-8小時；(4)在密閉體系中，液面上的鈦烷氧基化合物蒸汽與載體表面上的溶液接觸，發(fā)生緩慢的水解反應(yīng)生成二氧化鈦溶膠，膠凝化后將生物活性物質(zhì)包埋并固定于載體表面，在載體上獲得二氧化鈦凝膠膜并可制成生物傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法，其特征在于所述的鈦烷氧基化合物是四異丙氧基鈦或四甲氧基鈦。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備二氧化鈦凝膠膜的氣相沉積方法,其制備步驟是:將生物活性物質(zhì)溶解于緩沖溶液中;在載體表面上滴涂上述溶液,并將其懸于鈦烷氧基化合物液面的上方,將此體系置于15～35℃的恒溫中密閉4～8小時;鈦烷氧基化合物蒸汽與載體表面上的溶液接觸,生成二氧化鈦溶液,膠凝后將生物活性物質(zhì)包埋并固定于載體表面,在載體上獲得二氧化鈦凝膠膜并可制成生物傳感器。本發(fā)明優(yōu)點是可控制鈦烷氧基化合物的水解速度,避免其與水直接混合而強烈水解產(chǎn)生沉淀;在溶膠制備的過程中不需加入酸和表面活性劑,能夠隨意控制酸度環(huán)境,便于最大限度地保持生物活性物質(zhì)的活性。而且,所制得的膜不開裂,不會從載體表面脫落。
文檔編號C04B35/624GK1381609SQ01138059
公開日2002年11月27日 申請日期2001年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月30日
發(fā)明者鞠熀先, 喻玖宏 申請人:南京大學