一種癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及癲癇病灶靶向的納米給藥系統(tǒng)，具體涉及一種基于色氨酸衍生物(tryptophan derivate,TD)修飾的載拉莫三嗪聚合物膠束及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明使用可定位至癲癇灶的靶向頭基色氨酸的衍生物修飾普朗尼克聚合物膠束，包載小分子疏水性抗癲癇藥物拉莫三嗪，制備可靶向至癲癇灶的納米膠束給藥系統(tǒng)。所制備的靶向膠束給藥系統(tǒng)能有效提高疏水性藥物的入腦能力，通過(guò)無(wú)創(chuàng)性的靜脈給藥后顯著提高藥物在腦部的積累量和入腦效率。本發(fā)明的給藥系統(tǒng)，可明顯提高藥物進(jìn)入腦內(nèi)癲癇病灶的能力，適用于促進(jìn)其他疏水性抗癲癇藥物在癲癇病灶內(nèi)的蓄積，有助提高抗癲癇藥物對(duì)難治性癲癇的療效。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種癲癇病灶靶向的納米給藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種基于色氨酸衍生物(tryptophan derivate, TD)修飾的載拉莫三嘆聚合物膠束及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了癲癇是一組以腦神經(jīng)元異常放電引起的反復(fù)癇性發(fā)作為特征的慢性腦疾病，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中患病率僅次于腦卒中的第二常見(jiàn)病。據(jù)報(bào)道，我國(guó)現(xiàn)有癲癇患者約900萬(wàn)，每年新增病例45萬(wàn)，其中25%?30%的患者經(jīng)過(guò)多種現(xiàn)有的抗癲癇藥物(AEDs)正規(guī)治療仍不能有效控制發(fā)作，是臨床上的治療難點(diǎn)，也是引起殘疾和死亡的重要原因。目前臨床上治療難治性癲癇主要依靠多種作用機(jī)制不同的AEDs聯(lián)用或著手術(shù)切除致癇病灶，但前者效果有限而后者只能適用特定患者而且副作用較大，因此兩者的應(yīng)用均受明顯限制。近年來(lái)大量研究顯示，癲癇病灶局部血腦屏障(BBB)以P-糖蛋白(P-gp)為主的多種藥物外栗蛋白的過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致癲癇耐藥的重要機(jī)制，后者可以將多種作用機(jī)制不同的AED栗出病灶局部進(jìn)而影響藥物療效。因此，如何在有效繞開(kāi)或特異性抑制局部外栗蛋白的活性以增加局部腦組織內(nèi)藥物濃度的同時(shí)，不破壞血腦屏障(BBB)正常的生理防護(hù)功能，從而達(dá)到提高AED的療效而不增加其副作用的目的，是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的當(dāng)前臨床工作亟需解決的一項(xiàng)重要課題，也是目前癲癇研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。
[0003]近年來(lái)隨著納米技術(shù)的廣泛應(yīng)用，也為難治性癲癇的治療提供了一條新的可能途徑。在既往的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)納米材料包載一些神經(jīng)治療藥物后可以有效提高藥物的入腦能力而不破壞正常的BBB屏障功能。以生物可降解的聚合物材料作為傳遞和輸送治療藥物進(jìn)入腦組織的載體顯示出其靶向和控釋的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等疾病中已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。研究顯示大多數(shù)納米?？邕^(guò)BBB的主要機(jī)制有:納米載藥系統(tǒng)普遍具有的長(zhǎng)循環(huán)特性可使得其可以有更多的機(jī)會(huì)吸附于血管內(nèi)壁上，在局部產(chǎn)生跨屏障的濃度梯度，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散入腦；表面修飾特異性配體的納米粒可以通過(guò)受體介導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)或靜電吸附介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)而入腦；此外，某些納米材料(如普朗尼克類(lèi)材料)不僅可以作為載體遞送藥物，而且本身即可抑制BBB上的P-gp等蛋白的外栗活性，從而減少藥物入腦的阻力而增加局部腦組織內(nèi)藥物的濃度。然而，由于納米給藥系統(tǒng)所提高的藥物入腦量仍然有限，而且較難解決腦內(nèi)藥物在整個(gè)腦組織內(nèi)無(wú)選擇性分布的難題，目前針對(duì)克服BBB的腦革巴向納米粒大多還處在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，而以生物反應(yīng)調(diào)節(jié)納米材料為載體遞送AEDs的納米給藥系統(tǒng)還尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]色氨酸是人體內(nèi)的一種必須氨基酸，可通過(guò)大分子中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入腦內(nèi)而轉(zhuǎn)化為神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺。在癲癇局灶由于異常的犬尿氨酸代謝途徑，大量色氨酸進(jìn)入癲癇灶內(nèi)代謝為喹啉酸及犬尿氨酸，導(dǎo)致局部腦組織對(duì)色氨酸的攝取明顯增高。近年來(lái)多項(xiàng)研究應(yīng)用正電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(Epilepsia 2011, 52 (9): 1692-1698 ；Neurology2013,81(7):674-680)和核磁共振掃描(Epilepsia 2008,49 (8): 1419-1430)均發(fā)現(xiàn)以色氨酸衍生物(tryptophan derivate, TD)作為配體所制備的對(duì)比劑能夠有效聚集于癲癇病灶，從而實(shí)現(xiàn)癲癇病灶定位。但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)以該衍生物作為靶向頭基構(gòu)建載抗癲癇藥物的納米給藥系統(tǒng)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前臨床現(xiàn)有的AEDs均不能有效進(jìn)入難治性癲癇病灶局部等的缺陷，提供一種針對(duì)病灶局部的納米膠束給藥系統(tǒng)，具體涉及一種氨基酸衍生物(色氨酸衍生物)修飾的具有生物活性調(diào)節(jié)能力的納米靶向給藥體系，尤其涉及一種新的癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)。
[0006]本發(fā)明利用兩親性的普朗尼克聚合物材料的生物活性調(diào)節(jié)能力，特別是其所具有的調(diào)節(jié)以P-gp為代表的多種多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體外栗活性的能力，以極具臨床應(yīng)用價(jià)值的色氨酸衍生物(TD)作為靶向頭基，修飾高分子的普朗尼克聚合物載藥膠束，增加納米給藥系統(tǒng)透過(guò)血腦屏障的能力，特別是提高抗癲癇藥物在癲癇病灶內(nèi)的蓄積量，實(shí)現(xiàn)AEDs的病灶靶向給藥。
[0007]具體而言，本發(fā)明的癲癇靶向載拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)，其特征在于，采用色氨酸衍生物作為靶向頭基，用具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)能力的兩親性嵌段共聚物普朗尼克P123作為基礎(chǔ)載體材料，以帶有色氨酸衍生物基團(tuán)的聚合物膠束F127作為組分，兩者在去離子水或HBS溶液或PBS溶液(pH = 7.4)中自組裝成約20nm的穩(wěn)定的核-殼結(jié)構(gòu)，將疏水性模型藥物拉莫三嗪(LTG)包載進(jìn)入形成的膠束內(nèi)核中，制成本發(fā)明的癲癇靶向載LTG聚合物膠束給藥系統(tǒng)。
[0008]所述的色氨酸衍生物修飾的癲癇靶向聚合物給藥系統(tǒng)由基礎(chǔ)載體嵌段共聚物P123和色氨酸衍生物修飾的嵌段共聚物F127自動(dòng)聚合形成，優(yōu)選地，作為基礎(chǔ)載體的Pluronic P123和作為組分的色氨酸衍生物修飾的F127嵌段共聚物的重量比為7?8:3。
[0009]本發(fā)明中，所述的普朗尼克類(lèi)材料及其帶有色氨酸衍生物功能基團(tuán)的聚合物衍生物選自聚氧乙烯20-聚氧丙烯69-聚氧乙烯20 (分子量5750，普朗尼克P123系列，簡(jiǎn)稱(chēng)P123)、聚氧乙烯100-聚氧丙烯65-聚氧乙烯100 (分子量12600，普朗尼克F127系列，簡(jiǎn)稱(chēng)F127)和色氨酸衍生物功能化的F127(簡(jiǎn)稱(chēng)TD-F127)。
[0010]本發(fā)明中所選的Pluronic P123和F127原料均由德國(guó)BASF公司提供。
[0011 ] 本發(fā)明中，所述的載體材料選自普朗尼克P123和F127，其安全性和生物相容性均好，且兩者具有相近的疏水段以及較低的臨界膠束濃度，因此，其形成的聚合物混合膠束具有更好的增溶效果，可以明顯增加LTG的溶解度，并可在大量血液稀釋過(guò)程中保持良好的穩(wěn)定性。
[0012]本發(fā)明中，所述的Pluronic P123膠束具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)功能，能夠有效抑制抑制P-糖蛋白的活性，從而能夠增強(qiáng)其所包載的藥物穿透各種生理病理屏障(血腦屏障、腫瘤屏障)的能力。
[0013]本發(fā)明中，形成的聚合物膠束可將其包載的藥物通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)靶向途徑遞送到特定的組織，通過(guò)在聚合物膠束表明修飾具有靶向性的特定分子，比如氨基酸、肽類(lèi)、糖類(lèi)、激素類(lèi)、單抗、凝集素以及低分子量的化合物等，可明顯增加其在靶點(diǎn)位置的蓄積，所述聚合物膠束表面的聚氧乙烯分子(PEO)分子能夠延長(zhǎng)膠束在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高藥物靶向遞送的成功機(jī)率。
[0014]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物修飾的靶向聚合物膠束載體是由普朗尼克P123和色氨酸衍生物修飾的F127組成。
[0015]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物修飾所述的聚合物膠束F127作為疏水性藥物遞送載體的組分。
[0016]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物由L-色氨酸甲酯鹽酸鹽與芐氧羰基-丙氨酸經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合后脫去保護(hù)的氯甲酸芐酯基團(tuán)形成。
[0017]所述的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽與芐氧羰基-丙氨酸的分子摩爾比為1:1。
[0018]所述的L-色氨酸甲酯鹽酸鹽與芐氧羰基-β_丙氨酸在六氟磷酸苯并三唑-卜基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)和N，N-二異丙基乙胺(DIEA)的催化下發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)的中間產(chǎn)物采用核磁氫譜圖進(jìn)行表征(圖1-Β)。
[0019]上述反應(yīng)生成的產(chǎn)物在甲酸銨和鈀碳中脫去氯甲酸芐酯基團(tuán)即生成所需的靶向頭基色氨酸衍生物(tryptophan derivative, TD) ο
[0020]本發(fā)明中，所述的兩親性嵌段共聚物材料可選自普朗尼克類(lèi)材料、PEG化磷脂類(lèi)、PEG化殼聚糖類(lèi)、PEG化聚乳酸類(lèi)及PEG化聚氨基酸類(lèi)。
[0021]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物功能化的兩親性嵌段共聚物分別是所述嵌段共聚物材料的親水端如PEO分子或PEG分子的色氨酸衍生物功能化的產(chǎn)物。
[0022]本發(fā)明中，所述的疏水性藥物選自疏水性的抗感染藥物、抗腫瘤藥物或抗癲癇藥物；尤其是疏水性模型藥物L(fēng)TG。
[0023]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物修飾的F127聚合物膠束由色氨酸衍生物和羰基二咪唑活化的F127共價(jià)結(jié)合而成。
[0024]所述的Pluronic F127末端的輕基活化是將適量純化的Pluronic F127材料和適當(dāng)當(dāng)量的羰基二咪唑(CDI)在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下在無(wú)水乙腈中反應(yīng)生成的。
[0025]其中F127材料和⑶I的分子摩爾比為1:10。
[0026]所述的反應(yīng)體系在室溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用預(yù)冷的無(wú)水乙醚沉淀三次以除去未反應(yīng)的⑶I，收集沉淀，真空干燥即得末端活化的F127-⑶I粉末。
[0027]本發(fā)明中，所述的色氨酸衍生物修飾的F127聚合物載體材料的合成是由色氨酸衍生物與F127-⑶I在四氫呋喃中反應(yīng)生成。
[0028]所述的色氨酸衍生物與F127-⑶I的分子摩爾比為10:1。
[0029]本發(fā)明采用核磁共振氫譜(1HNMR)技術(shù)對(duì)制備過(guò)程的各種中間產(chǎn)物以及終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定(如圖3所示)，結(jié)果顯示，在7-8.5PPM處出現(xiàn)了三個(gè)未修飾F127上所沒(méi)有的特征性的吸收峰，為F127-CDI聚合物膠束表面CDI基團(tuán)的特征性吸收峰；當(dāng)換成色氨酸衍生物-F127，譜圖中CDI的特征吸收峰消失，出現(xiàn)了多個(gè)色氨酸衍生物所特有的吸收峰，表明色氨酸衍生物成功接上F127，驗(yàn)證色氨酸衍生物-F127靶向聚合物膠束合成成功。
[0030]本發(fā)明提供了載LTG靶向納米膠束的制備方法，其包括:采用薄膜水化法制備色氨酸衍生物修飾的PF/LTG載藥納米膠束:按優(yōu)選處方?jīng)龇Q(chēng)量普朗尼克P123及帶有色氨酸衍生物基團(tuán)功能化的F127衍生物置于圓底燒瓶中，加入乙腈使其溶解；將疏水性模型藥物溶解于甲醇中配置成3mg/ml的儲(chǔ)備液，吸取LTG儲(chǔ)備液加入普朗尼克類(lèi)材料的乙腈溶液中，兩溶液充分混合后在50°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成藥物-聚合物膠束薄膜，真空干燥過(guò)夜，加入處方量的PBS (pH = 7.4)，50°C水浴箱200rpm恒溫震蕩I小時(shí)使得溶液平衡。過(guò)0.22um有機(jī)濾膜即得癲癇灶靶向的納米給藥系統(tǒng)。
[0031]具體的，普朗尼克P123與色氨酸衍生物功能化的F127的重量比為7?8:3。
[0032]本發(fā)明采用粒徑儀和透射電鏡對(duì)癲癇靶向納米給藥系統(tǒng)進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖6所示，癲癇靶向納米遞藥系統(tǒng)為均一、球狀、粒徑介于20-30nm的粒子。
[0033]本發(fā)明所構(gòu)建的癲癇靶向載LTG聚合物膠束給藥系統(tǒng)通過(guò)匹魯卡品癲癇大鼠模型尾靜脈注射方式考察在體靶向效率，I小時(shí)后腦內(nèi)各區(qū)域分布結(jié)果顯示，載LTG靶向聚合物膠束(TD-PF/LTG)組在皮層、小腦、海馬內(nèi)的分布均高于游離LTG組，其中在癲癇病灶海馬內(nèi)的藥物濃度增加最明顯，為游離LTG的2.7倍，相比普通膠束(PF/LTG)組亦增加90%。
[0034]通過(guò)癲癇大鼠尾靜脈注射載羅丹明123(Rhol23)的靶向聚合物膠束給藥系統(tǒng)，腦組織冰凍切片后熒光顯微鏡定性觀察Rhol23腦內(nèi)分布的情況，初步探討本發(fā)明構(gòu)建的癲癇靶向聚合物膠束給藥系統(tǒng)的入腦機(jī)制。由于Rhol23是BBB上高表達(dá)的P-gp的經(jīng)典底物，因此游離的Rhol23較少透過(guò)BBB，特別是在Ρ-gp高表達(dá)的癲癇病灶區(qū)域；從定性結(jié)果可以看出，經(jīng)色氨酸衍生物修飾后的聚合物膠束可以明顯促進(jìn)Rhol23在腦內(nèi)的分布，與未修飾的聚合物膠束相比，可以明顯提高熒光探針在海馬病灶的聚集。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為靶向頭基色氨酸衍生物的合成路徑以及核磁氫譜圖(溶劑為DMS0-d6)。
[0036]圖2為色氨酸衍生物功能化的F127的合成路徑。
[0037]圖3核磁共振氫譜圖(1H-NMR)表征不同狀態(tài)的聚合物Pluronic F127，
其中A =Pluronic F127聚合物膠束，溶劑為CDCl3,
B:羰基二咪唑功能化的F127 (F127-⑶I)，溶劑為OTCl3,
C:色氨酸衍生物功能化得F127 (F127-TD)，溶劑為DMS0_d6。
[0038]圖4為BCECs在不同條件下攝取熒光探針Rho 123的定性和定量結(jié)果。
[0039]圖5為靶向載藥納米膠束制備示意圖。
[0040]圖6為載LTG靶向納米膠束的粒徑和形態(tài)表征。
[0041]圖7為激光共聚焦下觀察熒光探針Rho 123的靶向聚合物膠束在不同腦區(qū)內(nèi)的分布情況。
[0042]圖8為癲癇靶向載藥納米膠束體內(nèi)的組織分布情況，以藥物在腦內(nèi)各區(qū)域的含量比去同步的血藥濃度作為藥物入腦的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0043]實(shí)施例1
[0044]將L-色氨酸甲酯鹽酸鹽與芐氧羰基-β-丙氨酸按摩爾比1:1溶于Ν，Ν_ 二甲基甲酰胺中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP，1.1eq)和N，N-二異丙基乙胺(DIEA，2eq)，室溫反應(yīng)至原料反應(yīng)完全后，倒入水中，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和NaCl洗兩次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干后柱層析制備得中間產(chǎn)物。將中間產(chǎn)物溶于甲醇中，加入甲酸銨(3eq)，鈀碳(10%，質(zhì)量比)，回流反應(yīng)2小時(shí)后，將鈀碳過(guò)濾掉后，有機(jī)相旋干后即得可作為靶向頭基的色氨酸衍生物，合成路徑如圖1-A所示；通過(guò)1H-NMR圖譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，其中化合物2的核磁譜圖結(jié)果如圖1-B所示:IH-NMR (300MHz, DMSO_d6) δ: 10.85 (1Η, s)，8.38-8.35 (1Η, d, J = 9Hz)，7.49-7.46 (1Η, d, J=9Ηζ)，7.35-7.29 (6Η, m)，7.21-7.17 (1Η, t, J = 6Ηζ)，7.13-7.13 (1Η, d)，7.08-7.03 (1Η, t，J = 9Ηζ)，6.99-6.95 (1Η, t, J = 6Ηζ)，4.99 (2Η, s)，4.52-4.45 (2Η, q, J = 7.8Ηζ,), 3.55 (3
H,s)，3.17-2.97 (4Η, m)，2.36-2.20 (2Η, m)。
[0045]實(shí)施例2
[0046]F127末端羥基的羰基二咪唑功能化:
將適量(12.6g，I mmol)丙酮純化的Pluronic F127材料溶解于15mL無(wú)水乙腈，另將
1.62g羰基二咪唑(CDI，1mmol)溶解于15mL無(wú)水乙腈，然后將⑶I的乙腈溶液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于2h內(nèi)緩慢滴加到上述溶液中。滴加完畢后，發(fā)應(yīng)體系繼續(xù)在室溫條件下反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用預(yù)冷的無(wú)水乙醚沉淀三次以除去未反應(yīng)的CDI，收集沉淀，真空干燥即得末端活化的F127-⑶I白色結(jié)晶粉末；通過(guò)1H-NMR圖譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。
[0047]實(shí)施例3
[0048]色氨酸衍生物修飾的功能化F127的合成:
將實(shí)施例1合成的終產(chǎn)物和實(shí)施例2合成的產(chǎn)物F127-CDI以摩爾比10:1溶于四氫呋喃中，回流5小時(shí)后，室溫反應(yīng)過(guò)夜，反應(yīng)完全后，將四氫呋喃旋干，加入乙醚攪拌析出固體，過(guò)濾得色氨酸衍生物功能化的F127 (F127-TD);通過(guò)1H-NMR圖譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證；合成路徑及核磁氫譜圖如圖所示。
[0049]實(shí)施例4
[0050]采用薄膜水化法制備載藥聚合物膠束固定稱(chēng)量180mg的Pluronic P123和90mg色氨酸衍生物修飾或不修飾的Pluronic F127置于燒杯中，加入乙腈5ml充分溶解，稱(chēng)取拉莫三嗪溶解于甲醇中制備成3mg/ml的儲(chǔ)備液，取5ml加入上述聚合物溶液中，兩溶液充分混合后在50°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成藥物-聚合物膠束薄膜，真空干燥過(guò)夜，加入處方量的PBS (pH = 7.4)，50°C水浴箱200rpm恒溫震蕩I小時(shí)使得溶液平衡。過(guò)0.22 μ m有機(jī)濾膜即得載拉莫三嗪的納米膠束給藥系統(tǒng)。
[0051]實(shí)施例5
[0052]采用Malvern nano-ZS電位/粒度分析儀測(cè)定修飾有色氨酸衍生物的納米膠束(TD-PF/LTG)的平均粒徑是28.69±0.29nm，結(jié)果如圖所示。
[0053]實(shí)施例6
[0054]取膠束溶液適量，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，室溫干燥0.5小時(shí)，置于透射電鏡下觀察納米膠束的外部形態(tài)，結(jié)果如圖所示。
[0055]實(shí)施例7
[0056]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCECs)以0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心后重新懸浮于無(wú)血清DMEM中，在共聚焦皿中(35mmX20mm)調(diào)整細(xì)胞密度至2X 104，置于37°C、5% C02孵育箱里培養(yǎng)24小時(shí)后光鏡下觀察狀態(tài)，形態(tài)正常者分別加入含有50mM谷氨酸的PBS溶液或空白PBS溶液lml-1.5ml，上述相同條件孵育半小時(shí)后吸凈上清溶液，用空白DMEM洗滌I次后再加入DMEM孵育。再過(guò)24小時(shí)后加入羅丹明123(Rhol23)終濃度為 5uM(l.9ug/ml)的 Rhol23PBS 溶液或 0.05% PF/Rhol23 的 PBS 溶液，37°C 5% C02條件下培養(yǎng)30min，用預(yù)冷PBS洗滌3遍后，再加少許PBS (覆蓋皿底)，直接置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖顯示，納米膠束包載的聚合物Rhol23可以明顯提高Rhol23進(jìn)入BCECs的能力，且在谷氨酸刺激的BCECs上仍有類(lèi)似的效果。
[0057]實(shí)施例8
[0058]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BCECs以0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心后重新懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)胞密度至50X 104。取50X 14經(jīng)或不經(jīng)實(shí)施例7所示的谷氨酸刺激的BCECs重新懸浮于不含血清的無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)液中，加入Rho 123終濃度為5uM的Rho 123原藥或0.05% PF/Rhol23在37°C、5% CO2的孵育箱下孵育30min。將孵育后的細(xì)胞1500r/min離心5分鐘，并用冰冷PBS洗滌兩次后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，收集530nm處的Rhol23熒光，使用Cell Quest軟件進(jìn)行直方圖分析，分析時(shí)設(shè)門(mén)，以去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊對(duì)測(cè)定的干擾。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)Rhol23的平均熒光強(qiáng)度(meanfluorescence intensity, MFI)，MFI值越高攝取細(xì)胞攝取能力越強(qiáng)，P_gp外栗作用越弱，反之則相反，結(jié)果如圖所示，Pluronic P123/F127混合膠束能夠有效抑制生理或病理狀態(tài)下BCECs表明P-gp的功能，有效增加熒光探針Rhol23的穿透能力。
[0059]實(shí)施例9
[0060]為了初步探討構(gòu)建的腦靶向聚合物膠束的入腦按40mol %用薄膜水化法配置PF/Rho123ο 0.8mg Rhol23和 35mg PF(P123:F127w/w 2:1, 23mg P123, 12mg F127 或 F127-TD)溶于5ml甲醇中，避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)I小時(shí)形成薄膜，加入PBS pH 7.42ml 37°C恒溫震蕩I小時(shí)得溶液，0.22um濾過(guò)即可得0.4mg Rho 123/ml的PF/Rhol23普通聚合物膠束溶液及癲癇靶向TD-PF/Rhol23膠束溶液，按每只大鼠3.5mg Rho 123/Kg的量給予Rhol23以及膠束包載的Rho 123溶液，I小時(shí)后心臟灌流取全腦，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小時(shí)，4°C、15%的蔗糖溶液中脫水6小時(shí)，4°C、30%的蔗糖溶液中脫水24小時(shí)，包埋、冷凍后進(jìn)行冰凍切片，厚度為20 μ m，采用熒光試劑Hochest 33342 (I μ g/ml)進(jìn)行核染色，用Carl-Zeiss激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠大腦皮層、小腦、海馬的Rhol23焚光分布情況，如圖所不。
[0061]本發(fā)明中采用的Pluornic P123和F127膠束購(gòu)自BASF公司，羅丹明123 (Rhol23)購(gòu)自Sigma公司。
[0062]實(shí)施例10
[0063]按實(shí)施例4的方法制備PF/LTG普通聚合物膠束溶液和TD-PF/LTG癲癇病灶靶向聚合物膠束溶液，SD大鼠(正常大鼠或癲癇持續(xù)狀態(tài)后48小時(shí)大鼠)分別尾靜脈注射1mgLTG/kg的普通LTG溶液，載LTG普通聚合物膠束以及癲癇靶向聚合物膠束溶液，用HPLC法測(cè)定I小時(shí)時(shí)LTG在腦內(nèi)額葉皮層、小腦以及海馬內(nèi)的含量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)，其特征在于，采用色氨酸衍生物作為靶向頭基，用兩親性嵌段共聚物普朗尼克P123作為基礎(chǔ)載體材料，以帶有色氨酸衍生物基團(tuán)的聚合物膠束F127作為組分，兩者在去離子水或HBS溶液或PBS溶液中自組裝成穩(wěn)定的核-殼結(jié)構(gòu)，將疏水性模型藥物拉莫三嗪包載進(jìn)入形成的膠束內(nèi)核中，制成癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)。2.按權(quán)利要求1所述的癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的色氨酸衍生物修飾所述的聚合物膠束作為疏水性藥物傳遞載體。3.按權(quán)利要求1所述的癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的聚合物膠束由色氨酸衍生物修飾的Pluoronic F127聚合物膠束和兩親性嵌段共聚物Pluronic P123組成，其中色氨酸衍生物修飾的F127和未修飾靶向頭基的P123嵌段共聚物的質(zhì)量比為1:2。4.按權(quán)利要求3所述的癲癇灶靶向的拉莫三嗪聚合物膠束給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的兩親性嵌段共聚物選自普朗尼克類(lèi)及其帶有羰基二咪唑功能化基團(tuán)的衍生物、PEG化磷脂類(lèi)、PEG化聚乳酸類(lèi)或PEG化殼聚糖類(lèi)。5.按權(quán)利要求1所述的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的普朗尼克類(lèi)及其帶有羰基二咪唑功能化基團(tuán)的衍生物選自聚氧乙烯2(](PE02。)-聚氧丙烯69(PPO69)-聚氧乙烯μ(ΡΕ02。)和聚氧乙烯100_聚氧丙烯65_聚氧乙烯■的三嵌段共聚物。6.按權(quán)利要求1所述的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的色氨酸衍生物由L-色氨酸甲酯鹽酸鹽與芐氧羰基-β -丙氨酸經(jīng)共價(jià)結(jié)合后脫去保護(hù)基團(tuán)而成，兩者的分子摩爾比為1:1。7.按權(quán)利要求1或2所述的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的色氨酸衍生物修飾的F127聚合物膠束由色氨酸衍生物與羰基二咪唑(⑶I)功能化的F127嵌段共聚物以分子摩爾比約10:1的比例在四氫呋喃中反應(yīng)而成。8.按權(quán)利要求7所述的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的CDI功能化的F127聚合物膠束中，由兩親性嵌段共聚物F127膠束的親水嵌段聚氧乙烯分子的末端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)轸驶瞥伤龅聂驶溥蚬δ芑膬捎H性嵌段共聚物。9.按權(quán)利要求1所述的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的疏水性藥物還選自疏水性的抗腫瘤藥物或抗感染藥物。10.權(quán)利要求1的靶向載拉莫三嗪聚合物給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括步驟，稱(chēng)取處方量的兩親性嵌段共聚物Ρ123及色氨酸衍生物功能化的嵌段共聚物F127置于圓底燒瓶中，加入甲醇使其溶解，稱(chēng)取疏水性藥物溶于甲醇中制成一定濃度的儲(chǔ)備液，吸取處方量的藥物甲醇儲(chǔ)備液加入圓底燒瓶，混合均勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻的藥物-聚合物薄膜，真空干燥過(guò)夜，加入磷酸緩沖鹽(PBS，pH = 7.4)，50°C振蕩床振蕩I小時(shí)使溶液平衡，濾膜過(guò)濾法去除未包封的藥物，制得色氨酸衍生物修飾的癲癇灶靶向的聚合物膠束給藥系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK105982879SQ201510055541
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月3日
【發(fā)明人】吳洵昳, 劉建盛, 徐嵐, 李佳佳, 洪震
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院