一種母乳中拉莫三嗪的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種母乳中拉莫三嗪的檢測方法，包括以下步驟：(1)供試品制備：取供試母乳，加入5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；(2)檢測：取步驟(1)的供試品用高效液相色譜進(jìn)行檢測，檢測條件為：固定相：C18色譜柱；流動相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為45:55，所述無機(jī)鹽溶液的pH為4.5；檢測波長：265nm。本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確檢測母乳中拉莫三嗪，并且檢測方法快速簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于臨床檢測母乳中拉莫三嗪的濃度，為服用拉莫三嗪的哺乳期婦女喂母乳提供指導(dǎo)。
【專利說明】
-種母乳中拉莫H瞎的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物藥物分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種母乳中拉莫=嗦的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 拉莫立嗦（lamotrigine，LTG,商品名：利必通）是苯=嗦類新一代廣譜抗癒痛藥 物，拉莫S嗦化學(xué)名稱為3, 5-二氨基-6- (2, 3-二氯苯基）-as- S叮嗦，分子式為
[0003] 由于大量臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)該藥物沒有明顯的胎兒致崎副作用，也不會影響女性 的生殖和月經(jīng)，還同時是一種情感穩(wěn)定劑，因此，該藥物成了全世界妊娠期女性的推薦抗癒 痛藥物。然而，因哺乳期婦女服用拉莫=嗦W后，母乳中是否含有拉莫=嗦W及含有的拉莫 =嗦濃度均不清楚，導(dǎo)致很多服用拉莫=嗦的癒痛女性不敢給孩子喂母乳，最后只能直接 選擇奶粉喂養(yǎng)，增加了癒痛患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，最重要的是奶粉不含母乳所含的所有免 疫成分，而且奶粉喂養(yǎng)也不能替代母乳喂養(yǎng)在培養(yǎng)親子感情方面的重要作用。因此，有效檢 測母乳中的拉莫=嗦具有重要意義。
[0004] 目前尚沒有關(guān)于檢測母乳中拉莫=嗦方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決前述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種母乳中拉莫S嗦的檢測方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種母乳中拉莫=嗦的檢測方法，它是采用高效液相色譜法進(jìn)行 檢測，包括W下步驟：（1)供試品制備：取供試母乳，加入5倍體積的乙酸乙醋混勻，離屯、， 取乙酸乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；（2)檢測：取步驟（1)的供試品用高效液相色譜 進(jìn)行檢測，檢測條件為：固定相：C18色譜柱；流動相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為 45:55,所述無機(jī)鹽溶液的抑為4. 5 ;檢測波長：265皿。
[0007] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述檢測方法是定量檢測方法，步驟如下：a、供試品制備：取供試 母乳，加入5倍體積的乙酸乙醋混勻，離屯、，取乙酸乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為供試品；b、標(biāo)準(zhǔn) 品制備：取空白母乳，加入1/9倍體積的拉莫=嗦標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻得標(biāo)樣母乳，再加入標(biāo) 樣母乳5倍體積的乙酸乙醋，混勻，離屯、，取乙酸乙醋層，吹干，復(fù)溶，作為標(biāo)準(zhǔn)品；C、檢測： 取步驟a的供試品和步驟b的標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜進(jìn)行檢測，檢測條件為：固定相：C18 色譜柱；流動相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為45:55,所述無機(jī)鹽溶液的抑為4. 5 ; 檢測波長：265nm ;d、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試母乳中拉莫S嗦的含量。
[000引母乳：是產(chǎn)后女性乳房產(chǎn)生的用作哺育嬰兒的汁液。
[0009] 空白母乳：是指來自于未服用拉莫S嗦婦女的母乳。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1)、步驟a或步驟b中，離屯、的轉(zhuǎn)速是4000;r/min，離屯、 的時間為lOmin。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1)、步驟a或步驟b中，吹干是在50°C條件下用氮?dú)獯?干。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（1)、步驟a或步驟b中，復(fù)溶是采用步驟（2)中的流動相 復(fù)溶。
[001引進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟似或步驟C中，所述C18色譜柱的規(guī)格為 ISOmmX4. 6mm，填料粒徑為 5 y m。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（2)或步驟C中，所述流動相中，無機(jī)鹽溶液是濃度為 0. 05mol/L的憐酸二氨鐘溶液。 陽015] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（2)或步驟C中，流動相的流速1. 0血/min。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟（2)或步驟C中，檢測的柱溫為37°C。
[0017] 高效液相色譜是檢測領(lǐng)域常用的檢測方法，但是由于母乳本身的成分復(fù)雜，干擾 雜質(zhì)多，會干擾拉莫=嗦的測定，而且拉莫=嗦在母乳中的代謝產(chǎn)物也會干擾拉莫=嗦的 測定，另外，由于母乳中拉莫=嗦的濃度低，不易富集，檢測難度大。比如，
【申請人】在前期實(shí) 驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用紫外分光光度計在190-900nm對拉莫S嗦進(jìn)行紫外掃描，顯示其最大吸收波 長為207. 94nm，然而，在該波長下檢測，卻存在很多干擾峰，無法準(zhǔn)確檢測。
[0018] 本發(fā)明通過特定的前處理方法與特定高效液相色譜檢測條件的結(jié)合，達(dá)到了準(zhǔn)確 檢測母乳中拉莫=嗦的目的，并且，本發(fā)明方法快速簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好， 可用于臨床檢測母乳中拉莫=嗦的濃度，為服用拉莫=嗦的哺乳期婦女喂母乳提供指導(dǎo)。
[0019] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0020] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0021] 圖1為按本發(fā)明實(shí)施例1方法對空白母乳進(jìn)行檢測所得的高效液相色譜圖。
[0022] 圖2為按本發(fā)明實(shí)施例1方法對加入了拉莫=嗦標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)樣母乳進(jìn)行檢測所得 的高效液相色譜圖，LTG為拉莫S嗦。
[0023] 圖3為按本發(fā)明實(shí)施例1方法對加供試母乳進(jìn)行檢測所得的高效液相色譜圖，LTG 為拉莫=嗦。
[0024] 圖4為按本發(fā)明試驗(yàn)例2方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[00巧]圖5為按本發(fā)明試驗(yàn)例6抗干擾實(shí)驗(yàn)所得的高效液相色譜，圖中1為拉莫=嗦的 峰、2為氯霉素的峰、3為丙戊酸鋼的峰。
【具體實(shí)施方式】
[00%] 本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。 具體如下：實(shí)驗(yàn)材料：拉莫二嗦標(biāo)準(zhǔn)品100775-200401，中國藥品生物制品檢定所；甲醇：分 析純（20120921)，成都市科龍化工試劑廠；憐酸二氨鐘：分析純（20091010)，成都市科龍化 工試劑廠；乙酸乙醋：分析純（20120414)，成都市科龍化工試劑廠。主要實(shí)驗(yàn)儀器：高效液 相色譜儀：LC-20AB，日本島津公司；紫外掃描儀：UV-VIS282PC，化ico儀器有限公司。供試 母乳來自服用了拉莫=嗦婦女的母乳。
[0027] 實(shí)施例1本發(fā)明定量檢測方法 陽02引 （1)供試品的制備：取供試母乳200化，置于1.5血離屯、管中，加入1血乙酸乙 醋，旋滿混合20s，4000r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1. 5血離屯、管中，在50°C 水浴下用氮?dú)獯蹈?，加?00 y L流動相（流動相為甲醇-憐酸二氨鐘化05mol/l，pH4. 5) (45:55)，）后旋滿混合20s，作為供試品。
[0029] 似標(biāo)準(zhǔn)品的制備：取空白母乳180化，置于1. 5血離屯、管中分別加入濃度為5， 10,20,50,100和150 y g/mL拉莫=嗦標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 y以旋滿混合20s，使拉莫=嗦濃度分 別為0. 5, 1，2, 5, 10, 15 y g/mL，作為標(biāo)樣母乳。向該標(biāo)樣母乳中加入1血乙酸乙醋，旋滿混 合20s，4000r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1. 5血離屯、管中，在50°C水浴下用氮 氣吹干，加入100 y L流動相后旋滿混合20s，作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0030] 做分別取供試品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為20化，色譜條件如下：色譜柱為 Diamonsil C18 巧 ym 150mmX4.6mm)，流動相為甲醇-憐酸二氨鐘化 05mol/L，pH4.5) (45:55)，等度洗脫；柱溫為37°C ;流速為1. OmL/min ;檢測波長為265nm。
[0031] (4)制作拉莫=嗦濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試母乳中拉莫 =嗦的含量。
[0032] 實(shí)施例2本發(fā)明定性檢測方法 陽03引 （1)供試品的制備：取供試母乳200化，置于1. 5血離屯、管中，加入1血乙酸乙 醋，旋滿混合20s，4000;r/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層于1. 5血離屯、管中，在50°C 水浴下用氮?dú)獯蹈?，加?00 y L流動相（流動相為甲醇-憐酸二氨鐘化05mol/l，pH4. 5) (45:55))后旋滿混合20s，作為供試品。
[0034] (2)取供試品進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為20 iiL色譜條件如下：色譜柱為Diamonsil C18巧yml50mmX4.6mm)，流動相為甲醇-憐酸二氨鐘a).05mol/^，pH4.5)(45:55)，等度 洗脫；柱溫為37°C ;流速為1. O血/min ;檢測波長為265皿。
[0035] 為進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的有益效果，本發(fā)明提供W下試驗(yàn)例。
[0036] 試驗(yàn)例1系統(tǒng)適用性和專屬性實(shí)驗(yàn)
[0037] 取空白母乳、加入了拉莫S嗦（濃度為10 y g/mL)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)樣母乳和供試母乳 按實(shí)施例1中的方法測定，所得色譜圖分別如圖1、圖2及圖3所示?？蒞看出，拉莫=嗦的 出峰時間為5. lOmin，附近沒有雜質(zhì)峰的干擾，證明本發(fā)明的方法分離度好，無內(nèi)源性雜質(zhì) 干擾，且出峰時間短，檢測效率高。 陽03引試驗(yàn)例2靈敏度和準(zhǔn)確度檢測
[0039] 對實(shí)施例1標(biāo)樣母乳的高效液相色譜測定結(jié)果如表1所示，W濃度Y對樣品峰 面積X線性回歸，得拉莫S嗦的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = (2. 7090496 °°5)X-9. 9377136 °°2巧= 0.9999, n = 3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖4所示。證明按照本發(fā)明的方法，母乳中拉莫S嗦檢出限 可達(dá)0. 50 y g/mU靈敏度高，且在0. 50~15. OO y g/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度 好。
[0040] 表 1 [0041 ]
[0042] 試驗(yàn)例3精密度實(shí)驗(yàn)
[0043] 按照實(shí)施例1中步驟似的方法制備拉莫S嗦濃度分別為0. 5、5、15 y g/血的標(biāo) 樣母乳各5份，分別作為低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳。按照實(shí)施例1中的方法，在同一天 內(nèi)和同一周內(nèi)分別對上述5份低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳進(jìn)行測定并計算其日內(nèi)精密 度值和日間精密度值。上述低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳日內(nèi)RSD (n = 5)分別為5. 03%、 4. 80 %、4.47% ;日間RSD (n = 5)分別為7. 78 %、9. 84%、4. 90%，說明本發(fā)明的方法精密 度好。
[0044] 試驗(yàn)例4回收率實(shí)驗(yàn) W45] 按照實(shí)施例1中步驟似的方法制備拉莫S嗦濃度分別為0. 5、5、15 y g/mL的標(biāo) 樣母乳各5份，分別作為低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳。按照實(shí)施例1中的方法，測定濃度 與實(shí)際配置濃度之比計算回收率。上述低、中、高=種濃度的標(biāo)樣母乳平均回收率分別為 85. 20 %、105. 08 %、98. 72 %，其 RSD (n = 5)分別為 7. ：34 %、6. 65 %、5. 52 %，平均回收率均 大于85%，說明本發(fā)明的方法準(zhǔn)確度好。
[0046] 試驗(yàn)例5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0047] 按照實(shí)施例1中步驟似的方法制備拉莫S嗦濃度分別為0. 5、5、15 y g/mL的標(biāo) 樣母乳各5份，分別作為低、中、高立種濃度的標(biāo)樣母乳。置于4°C冰箱中保存10天后，按照 實(shí)施例1中的方法測定拉莫=嗦的濃度并計算RSD值，室溫放置化、地和-20°C凍存1周、 2周后分別進(jìn)行測定，其低、中、高=濃度的平均回收率分別為93. 5%，102. 2%，100. 4%， RSD(n = 5)分別為3. 47%，5. 77%，4. 42%，未見拉莫=嗦降解，說明本發(fā)明的方法穩(wěn)定性 好。
[0048] 試驗(yàn)例6抗干擾性實(shí)驗(yàn)
[0049] 拉莫=嗦臨床常與抗癒痛藥物左乙拉西坦、丙戊酸鋼、奧卡西平聯(lián)合使用，因此 有必要進(jìn)行拉莫S嗦的抗干擾性實(shí)驗(yàn)。取空白母乳120 y L，置于1. 5mL離屯、管中，加入濃 度均為IOOy g/mL的左乙拉西坦、丙戊酸鋼、奧卡西平和拉莫=嗦標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 ^以旋 滿混合20s，使左乙拉西坦、丙戊酸鋼、奧卡西平和拉莫=嗦的濃度均為10 y g/mU作為標(biāo) 樣母乳。向上述標(biāo)樣母乳中加入40 Ji g/mL氯霉素20 Ji L及乙酸乙醋1血，旋滿混合20s， 400化/min離屯、lOmin，吸取上層乙酸乙醋層850 Ji L于1. 5血離屯、管中，在50°C水浴下用氮 氣吹干，加入100 y L流動相后旋滿混合20s，按照實(shí)施例1中步驟（3)的方法測定，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果如圖5所示?？蒞看出，左乙拉西坦和奧卡西平無吸收，丙戊酸鋼保留時間為10. 14min 與拉莫=嗦分離良好；此時拉莫=嗦峰面積為396817,計算濃度為10. 65 y g/mU相對誤差 6. 50%。W上說明本發(fā)明方法在臨床上的抗干擾性強(qiáng)。
[0050] 綜上所述，本發(fā)明檢測方法快速簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，精密度好，準(zhǔn)確性高， 穩(wěn)定性好，抗干擾性強(qiáng)，適用于臨床應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1. 一種母乳中拉莫三嗪的檢測方法，其特征在于：它是采用高效液相色譜法進(jìn)行檢 測，包括以下步驟： (1) 供試品制備：取供試母乳，加入5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹 干，復(fù)溶，作為供試品； (2) 檢測：取步驟（1)的供試品用高效液相色譜進(jìn)行檢測，檢測條件為：固定相：C18色 譜柱；流動相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為45:55,所述無機(jī)鹽溶液的pH為4. 5 ;檢 測波長：265nm〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測方法是定量檢測方法，步驟如 下： a、 供試品制備：取供試母乳，加入5倍體積的乙酸乙酯混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹 干，復(fù)溶，作為供試品； b、 標(biāo)準(zhǔn)品制備：取空白母乳，加入1/9倍體積的拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻得標(biāo)樣母 乳，再加入標(biāo)樣母乳5倍體積的乙酸乙酯，混勻，離心，取乙酸乙酯層，吹干，復(fù)溶，作為標(biāo)準(zhǔn) 品； c、 檢測：取步驟a的供試品和步驟b的標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜進(jìn)行檢測，檢測條件為： 固定相：C18色譜柱；流動相：甲醇-無機(jī)鹽溶液，二者的體積比為45:55,所述無機(jī)鹽溶液 的pH為4. 5 ;檢測波長：265nm ; d、 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試母乳中拉莫三嗪的含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，離心的 轉(zhuǎn)速是4000r/min，離心的時間為lOmin。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，吹干是 在50°C條件下用氮?dú)獯蹈伞?. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（1)、步驟a或步驟b中，復(fù)溶是采用步驟 (2)中的流動相復(fù)溶。6. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，所述C18色譜柱的規(guī)格 為150mmX4. 6mm，填料粒徑為5 μ m〇7. 根據(jù)1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，所述流動相中，無機(jī)鹽 溶液是濃度為〇. 〇5mol/L的磷酸二氫鉀溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，流動相的流速 1. OmL/min〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)或步驟c中，檢測的柱溫為 37。。。
【文檔編號】G01N30/02GK105987962SQ201510059160
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月4日
【發(fā)明人】陳蕾, 周東, 謝貞建
【申請人】四川大學(xué)華西醫(yī)院