TGF-03TGF-M 或 TGF-βδ;胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-I 和 IGF-II);des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD-3，CD-4，CD-8和 CD-19;促紅細(xì)胞生成素;骨誘導(dǎo)因子;免疫毒素;骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP);干擾素如干擾素-α，-β，和-γ ;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF;白細(xì)胞介素（IL)，例如IL-1 至IL-10;超氧化物歧化酶;Τ細(xì)胞受體;表面膜蛋白；衰變加速因子;病毒抗原，如，AIDS包膜 的部分;轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體;地址素(addressing);調(diào)節(jié)蛋白；抗體;和任何上述所列多肽 的片段。
[0118]原料(feedstock)將含有至少一種蛋白，在一個(gè)實(shí)施方案中其是抗體?；镜?鏈 抗體單元是由兩條相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白（IgM抗體 由5個(gè)基本異四聚體單元與稱為J鏈的另外多肽組成，因此包含10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而分泌 型IgA抗體可聚合形成多價(jià)集合體，包括2-5個(gè)基本4鏈單元和J鏈）。在IgG的情況中，4鏈單 元通常是約150，000道爾頓。每個(gè)L鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接到Η鏈，而取決于Η鏈同種型， 兩個(gè)Η鏈通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接。每個(gè)Η和L鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè) Η鏈在Ν端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，對于α和γ鏈，隨后是三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH)，對于μ和ε同種 型，隨后是四個(gè)CH結(jié)構(gòu)域。每個(gè)L鏈在Ν端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，隨后在其另一端具有恒定結(jié) 構(gòu)域(CLhVL與VH對齊(aligned)，CL與重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)對齊。據(jù)信特定氨基酸 殘基形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。一個(gè)VH和一個(gè)VL配對在一起形成一個(gè)抗原結(jié) 合位點(diǎn)。對于不同類別抗體的結(jié)構(gòu)和特性，例如，見Basic and Clinical Immunology,第8 版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange, Norwalk ,CT, 1994,71 頁和第6章。
[0119] 來自任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈都可以基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列而分為兩種 明顯不同的類型(稱為κ和λ)之一。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白 可分為不同的類或同種型。有五類免疫球蛋白 ：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其分別具有命名為 α，δ，ε，γ和μ的重鏈。γ和α類可基于其CH序列和功能中相對小的差異進(jìn)一步分為亞類，例 如，人類表達(dá)下列亞類:IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl，和IgA2。
[0120] 抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，和一個(gè)殘 余的"Fc"片段（名稱反映其易于結(jié)晶的能力）Aab片段由一個(gè)完整的L鏈和Η鏈的可變區(qū)結(jié) 構(gòu)域(VH)和一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)組成。每個(gè)Fab片段就抗原結(jié)合而言是單價(jià) 的，即其具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體的胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)大的F(ab'）2片段，其大致 相當(dāng)于具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段，其仍能夠交聯(lián)抗原。Fab '片段 不同于Fab片段，差異在于其在CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端具有另外幾個(gè)殘基，包括來自抗體鉸鏈 區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab '-SH在本文中是如下Fab '的名稱，在該Fab'中恒定結(jié)構(gòu)域的 半胱氨酸殘基(一個(gè)或多個(gè))攜帶游離硫醇基。F(ab'）2抗體片段最初作為之間具有鉸鏈半 胱氨酸的Fab'片段對生成?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
[0121] Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩個(gè)Η鏈的羧基端部分。抗體的效應(yīng)子功能 由Fc區(qū)的序列確定，這區(qū)域也是某些類型的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)所識別的部分。
[0122] "Fv"是包含完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由緊密且非共價(jià) 結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的 折疊發(fā)出六個(gè)高變環(huán)(分別來自Η和L鏈的各3個(gè)環(huán)），其提供抗原結(jié)合的氨基酸殘基，并賦予 抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使是一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半一一僅包含抗原特異的三 個(gè)CDR)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管比完整結(jié)合位點(diǎn)的親和力低。
[0123] "單鏈Fv"也簡稱為"sFv"或"scFv"，是包含連接成一個(gè)多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu) 域的抗體片段。優(yōu)選，sFv多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使得sFv形成用于抗原 結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于sFv的綜述，參見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Antibody Engineering,2nd edition(C.Borrebaeck,ed.,0xford University Press，1995。
[0124] 術(shù)語"雙抗體"（diabody)是指通過構(gòu)建在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭（約5-10 個(gè)殘基）的sFv片段(見上一段)制備的小抗體片段，從而這導(dǎo)致V結(jié)構(gòu)域的鏈間而非鏈內(nèi)配 對，形成二價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性雙抗體是兩個(gè)"交叉" sFv片 段的異二聚體，其中兩個(gè)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙抗體更完整地描 述于，例如 EP404,097; W093/11161;和 Hoi linger 等，Proc. Natl .Acad. Sci. USA ,90 :6444-6448(1993)。
[0125] 非人(例如，嚙齒動(dòng)物)抗體的"人源化"形式是嵌合抗體，其包含來自非人抗體的 最小序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中受體的高變區(qū)殘基 被具有所需抗體特異性、親和性和能力的來自非人物種(供體抗體）的高變區(qū)殘基取代，所 述非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物。在一些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū) (FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中出 現(xiàn)的殘基。這些修飾是為了進(jìn)一步精化抗體的性能。一般，人源化抗體包含至少一個(gè)，通常 兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白 的，而全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列。人源化抗體任選還可以包含免疫球蛋 白恒定區(qū)（Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)，的至少一部分。對于更多詳情，參見Jones et al.，Nature 321:522_525(1986);Riechmann et al.，Nature 332:323-329(1988);和 Presta,Curr.Op. Struct.Biol.2:593-596(1992)〇
[0126] 用于生產(chǎn)多肽的方法
[0127] 細(xì)胞
[0128] 本文提供的方法和組合物可使用任何適于在本文所述培養(yǎng)基中生長和/或生產(chǎn)多 肽(例如，抗體)的細(xì)胞，包括動(dòng)物、酵母或昆蟲細(xì)胞。在一個(gè)方面，方法和組合物的細(xì)胞是適 于細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)多肽的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞類型。因此本文提供的方法(例如，滅活 細(xì)胞培養(yǎng)基中病毒的方法)和組合物可使用任何適宜的細(xì)胞類型，包括動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)方 面，方法和組合物使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞。方法和組合物也可以使用雜交瘤細(xì)胞。在一種變型 中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是非雜交瘤哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其已轉(zhuǎn)化了編碼所需多肽的外源分離核 酸，所述多肽為如抗體、抗體片段(包括配體結(jié)合片段)和嵌合抗體。在一個(gè)變型中，方法和 組合物使用選自以下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：人成視網(wǎng)膜細(xì)胞（PER. C6(CruCell，Leiden,The Netherlands));用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系（C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚腎系（293細(xì)胞或亞 克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293細(xì)胞，Graham et al.，J.Gen Virol. ,36:59(1977));幼倉鼠 腎細(xì)胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin, Proc .Natl · Acad .Sci. USA, 77 :4216( 1980));小鼠支持細(xì)胞（TM4, Mather, Biol. Reprod.， 23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CV1ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1 587);人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞，ATCC CCL 2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34);buffalo大鼠 肝細(xì)胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺細(xì)胞（W138，ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51);TRI細(xì)胞（Mather et al.，Annals N. Y. Acad .Sci. ,383:44-68(1982) );MRC 5 細(xì)胞;FS4 細(xì)胞；和人肝細(xì)胞瘤系（Hep G2 細(xì)胞）。 在一個(gè)具體的變型中，方法和組合物使用CH0細(xì)胞。在一個(gè)具體的變型中，培養(yǎng)CH0細(xì)胞系， 和自CH0細(xì)胞系表達(dá)多肽(例如，抗體）。多肽(例如，抗體)可被分泌到本文公開的培養(yǎng)基，可 從該培養(yǎng)基中分離和/或純化多肽，或可通過裂解含有編碼多肽的分離核酸的細(xì)胞使多肽 釋放到本文公開的培養(yǎng)基中。
[0129] 適應(yīng)于在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成感興趣的多肽的適宜方法、載體和宿主 細(xì)胞在本領(lǐng)域中是已知的，描述在例如，Gething et al.，Nature，293 :620-625( 1981); Mantei et al.，Nature，281:40_46(1979);Levinson et al.;EP 117,060;和EP 117,058。 對于多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)，特別有用的質(zhì)粒是pRK5(EP公開號307,247)SpSVI6B (PCT公開號TO 91/08291，公布于1991年6月13日）。
[0130] 可以用表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在經(jīng)改良而適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化 子或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選Graham and van der Erb，Virology，52:456-457( 1978)的硫酸鈣沉淀法或Lipofectamine ·TM. (Gibco BRL)Method of Hawley-Nelson,Focus 15:73(1193)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般 方面是本領(lǐng)域中已知的，并且已經(jīng)例如由Axel描述在1983年8月16日授權(quán)的美國專利號4， 399,216中。用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種技術(shù)，見，例如，Keown et al.，Methods in Enzymology(1989)，Keown et al.，Methods in Enzymology，185:527_537(1990)，和 Mansour et al.，Nature,336:348-352(1988)。
[0131] 方法和組合物也包括使用在細(xì)胞培養(yǎng)中分泌單克隆抗體的雜交瘤。單克隆抗體可 以通過如下制備:從免疫的動(dòng)物回收免疫細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞或來自淋巴結(jié)組織的淋巴細(xì) 胞），以常規(guī)方式使細(xì)胞永生化(例如，通過與骨髓瘤細(xì)胞融合或通過Epstein-Barr(EB)病 毒轉(zhuǎn)化），和篩選表達(dá)所需抗體的克隆。雜交瘤技術(shù)由Kohler and Milstein, Eur.J.Immunol. ,6:511 (1976)最初描述，并且也描述在 Hammerling et al.，In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,pp.563-681(1981),1? 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)可以分泌高水平的抗許多特定抗原的單克隆抗體的雜交細(xì)胞系。
[0132] 多肽
[0133] 由本文詳述的組合物(例如，細(xì)胞)和方法生產(chǎn)的多肽以及在本文提供的組合物中 存在的多肽可以與宿主細(xì)胞同源，或者優(yōu)選地，可以是外源的，這意味著它們與使用的宿主 細(xì)胞異源，即是外來的，諸如由中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)的人蛋白質(zhì)，或由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn) 的酵母多肽。在一個(gè)變型中，多肽是由宿主細(xì)胞直接分泌到培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物多肽(如抗 體）。在另一變型中，多肽通過裂解包含編碼多肽的分離核酸的細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基中。
[0134] 在一個(gè)變型中，多肽的氨基酸序列的鏈長足以形成更高水平的三級和/或四級結(jié) 構(gòu)。在一個(gè)方面，多肽具有至少約5_20kD的分子量，或者至少約15-20kD，優(yōu)選至少約20kD的 分子量。
[0135] 可以根據(jù)本公開的內(nèi)容制備在宿主細(xì)胞中可表達(dá)的任何多肽，該多肽可以存在于 本文提供的組合物中。多肽可以由宿主細(xì)胞的內(nèi)源性基因表達(dá)，或者由通過基因工程導(dǎo)入 宿主細(xì)胞的基因表達(dá)。多肽可以是天然存在的多肽，或者備選地可以具有經(jīng)人工工程化或 選擇的序列。工程化的多肽可以從天然單獨(dú)存在的其它多肽片段組裝，或可包含一個(gè)或多 個(gè)非天然存在的片段。
[0136] 可能期望根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽常?？梢曰诟信d趣的生物或化學(xué)活性而選擇。 以上描述了本發(fā)明多肽的例子。
[0137] 例如，本發(fā)明可用于表達(dá)任何藥學(xué)或商業(yè)相關(guān)的酶、受體、抗體、激素、調(diào)控因子、 抗原、結(jié)合劑，等。
[0138] 細(xì)胞生長和多肽的生產(chǎn)
[0139] 通常，可以在促進(jìn)細(xì)胞生長、維持和/或多肽生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)條件下，使細(xì)胞與 任何本文描述的細(xì)胞培養(yǎng)基組合(接觸）。生長細(xì)胞和生產(chǎn)多肽的方法使用培養(yǎng)容器(生物 反應(yīng)器）以容納細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)容器可以由適于培養(yǎng)細(xì)胞的任何材料制成，包括玻 璃、塑料或金屬。典型地，培養(yǎng)容器至少為1升，可為10、100、250、500、1000、2500、5000、 8000、10000升或以上。可以在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)的培養(yǎng)條件，包括但不限于pH和溫度。
[0140] 細(xì)胞培養(yǎng)一般在初始生長階段在利于細(xì)胞培養(yǎng)物存活、生長和活力(維護(hù)）的條件 下維持。精確的條件根據(jù)細(xì)胞類型、細(xì)胞的來源生物、以及所表達(dá)多肽的性質(zhì)和特性而有所 不同。
[0141] 在初始生長階段，細(xì)胞培養(yǎng)的溫度主要基于該細(xì)胞培養(yǎng)物維持活力的溫度范圍選 擇。例如，在初始生長階段，CH0細(xì)胞在37°C生長良好。在一般情況下，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 在約25 °C至42 °C的范圍內(nèi)生長良好。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在約35 °C至40 °C的范圍內(nèi)生長 良好。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠根據(jù)細(xì)胞的需要和生產(chǎn)要求，選擇生長細(xì)胞的合適溫度(一 個(gè)或多個(gè))。
[0142] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，初始生長階段的溫度保持在單--個(gè)恒定的溫度。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，初始生長階段的溫度保持在一個(gè)溫度范圍內(nèi)。例如，在初始生長階段， 溫度可以穩(wěn)定地增加或降低。可替代地，在初始生長階段，溫度可以在不同時(shí)間以不連續(xù)的 量增加或降低。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定是否應(yīng)該使用一個(gè)或多個(gè)溫度，以及是否應(yīng) 該穩(wěn)定地或以不連續(xù)的量調(diào)整溫度。
[0143] 細(xì)胞可以在初始生長階段生長更長或更短的時(shí)間。在一個(gè)變型中，細(xì)胞生長足以 達(dá)到如下活細(xì)胞密度的一段時(shí)間，所述活細(xì)胞密度為在允許細(xì)胞不受干擾地生長的情況下 細(xì)胞將最終達(dá)到的最大活細(xì)胞密度的給定百分比。例如，細(xì)胞可以生長足以達(dá)到如下所需 活細(xì)胞密度的一段時(shí)間，其中所需活細(xì)胞密度為最大活細(xì)胞密度的1，5，10，15，20，25，30， 35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或 99%。
[0144] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞被允許生長限定的時(shí)間。例如，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃 度、細(xì)胞生長的溫度、和細(xì)胞固有的生長速率，細(xì)胞可生長〇，1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11， 12,13,14,15,16,17,18,19,20天或更多天。在一些情況下，可以允許細(xì)胞生長一個(gè)月或更 長時(shí)間。
[0145] 在初始培養(yǎng)階段可以攪動(dòng)或振蕩細(xì)胞培養(yǎng)物以增加氧合和養(yǎng)分向細(xì)胞的擴(kuò)散。根 據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在初始生長階段控制或調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器的某些內(nèi) 部條件可能是有益的，包括但不限于PH、溫度、氧合等。例如，可以通過提供適當(dāng)量的酸或堿 來控制pH值，可以用本領(lǐng)域公知的吹掃裝置(sparging device)控制氧合。
[0146] 初始培養(yǎng)步驟是生長階段，其中可以改變分批細(xì)胞培養(yǎng)條件以增強(qiáng)重組細(xì)胞的生 長，以產(chǎn)生種子罐（seed train)。生長階段通常指的是指數(shù)生長期，其中細(xì)胞通?？焖俜?裂，例如，生長。在這個(gè)階段中，培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間，一般為1至4天，例如，1，2,3或4天，并且 在對于細(xì)胞生長最佳的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，針對特定 宿主細(xì)胞，確定宿主細(xì)胞的生長周期。
[0147] 在生長階段中，分批向培養(yǎng)容器中提供基礎(chǔ)培養(yǎng)基和細(xì)胞。在一個(gè)方面，培養(yǎng)基包 含少于約5%，或少于1%或少于0.1%的血清及其它動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)。然而，如果需要，可 以使用血清和動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)。在一個(gè)具體的變型中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基在HTST處理以滅活病 毒的期間具有約PH5.0至約pH6.9的pH。在一個(gè)方面，在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段之前，在 HTST處理以滅活病毒的期間，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH降低至約pH 5.0至約pH 6.9之間。在進(jìn)一 步的方面中，然后調(diào)整培養(yǎng)基的pH值至約pH 6.9至約pH 7.2用于細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階 段。在進(jìn)一步的方面，在HTST處理后，培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至約pH 6.9至約pH 7.2用于細(xì)胞培 養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段。在另一個(gè)特定的變型中，在HTST處理以滅活病毒的期間，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包 含限制總量到小于約10mM的磷酸和鈣。在一個(gè)方面，在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段前、在HTST 處理以滅活病毒期間，培養(yǎng)基中磷酸和鈣的總量限制到小于約10mM。在進(jìn)一步的方面，然后 在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)期間，將培養(yǎng)基中磷酸和鈣的總量升高到足以生產(chǎn)多肽的水平。在 另一個(gè)變型中，在HTST處理以滅活病毒期間，基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有約pH5.0至約pH6.9之間的pH， 磷酸和鈣的總量小于約10mM。在一個(gè)方面中，在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)階段前、在HTST處理以 滅活病毒期間，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH降低至約pH 5.0至約pH 6.9之間，且包含總量小于約10mM 的磷酸和鈣。在進(jìn)一步的方面中，在細(xì)胞培養(yǎng)的多肽生產(chǎn)期間，培養(yǎng)基中的pH然后調(diào)整至約 pH 6.9至約pH 7.2,培養(yǎng)基中磷酸和鈣的總量提高到足以用于生產(chǎn)多肽的水平。在任何方 面，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是化學(xué)確定的培養(yǎng)基。在任何方面，基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以是化學(xué)不確定的培 養(yǎng)基?？梢允褂靡槐痘騼杀队跉W洲專利EP307，247或美國專利6，180，401所詳述范圍的氨基 酸，維生素，微量元素和其它培養(yǎng)基組分，這些文件在此通過整體引用作為參考。
[0148] 可替代地，可商購的培養(yǎng)基諸如Ham's FlO(Sigma)，最小必需培養(yǎng)基(Minimal Essential Medium([MEM]，Sigma))，RPMI_1640(Sigma)，和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng) 基（[DMEM]，Sigma)適用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，并且可以補(bǔ)充如本文詳述的化學(xué)確定的培養(yǎng)基組 分(例如，通過使用提供的試劑盒）。此外，可以使用以下文獻(xiàn)描述的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì) 胞的培養(yǎng)基：Ham and Wallace，Meth.Enz.，58:44( 1979), Barnes and Sato, △仙1.81〇。1^111.，102:255(1980)，美國專利號4,767,704;4,657,866 ;4,927,762;或4,560， 655;W090/03430;WO 87/00195;美國專利號Re.30，985;或美國專利號5，122,469，所有這些 文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用全部并入本文，其中每一個(gè)培養(yǎng)基都可以補(bǔ)充如本文詳述的化學(xué) 確定的培養(yǎng)基組分(例如，通過使用提供的試劑盒）。
[0149] 本文所提供的任何培養(yǎng)基，也可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(如胰島 素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、或表皮生長因子），離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸鹽），緩沖液(諸如HEPES)，核 苷(如腺苷和胸苷），微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的最終濃度存在的無機(jī)化合物）， 微量金屬(如鐵和銅），和葡萄糖或等效能量來源。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它必需補(bǔ) 充劑也可以以適當(dāng)濃度包括在內(nèi)。
[0150] 在其生長的特定點(diǎn)，細(xì)胞可形成接種物以在生產(chǎn)階段在培養(yǎng)開始時(shí)接種培養(yǎng)基。 可替代地，生產(chǎn)階段可以是生長階段的連續(xù)。細(xì)胞生長階段之后通常跟隨多肽生產(chǎn)階段。
[0151] 在多肽生產(chǎn)階段中，細(xì)胞培養(yǎng)可維持在第二組培養(yǎng)條件下（相對于生長階段而 言），以有利于細(xì)胞培養(yǎng)物的存活和活力以及適于所需多肽的表達(dá)。例如，在隨后的生產(chǎn)階 段，CH0細(xì)胞在25°C至35°C的范圍內(nèi)很好地表達(dá)重組多肽和蛋白質(zhì)?？梢允褂枚鄠€(gè)不連續(xù)的 溫度迀移，以增加細(xì)胞密度或活力或提高重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語"多 肽生產(chǎn)階段"或"蛋白表達(dá)階段"可以指細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)生物藥品（例如，多肽）的細(xì)胞培養(yǎng) 階段。
[0152] 可以在隨后的生產(chǎn)階段維持細(xì)胞直到達(dá)到所需的細(xì)胞密度或生產(chǎn)滴度。在一個(gè)實(shí) 施方案中，在隨后的生產(chǎn)階段維持細(xì)胞直到重組多肽的滴度達(dá)到最大值。在其