使用環(huán)保洗滌劑的病毒滅活方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年11月15日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/905,075,以及2014年 2月7日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/937，284的優(yōu)先權，其內容在此整體引入作為參考。
技術領域
[0003] 本發(fā)明提供使用洗滌劑的病毒滅活方法。
【背景技術】
[0004] 出于各種目的，藥物活性物質的生物技術生產需要輔助物質。洗滌劑用于合成階 段結束時，來裂解生產細胞、釋放合成產品進行純化，并提供抗病毒或細菌污染的保護作 用。所需的產品純化后，生長介質和用于產品純化的緩沖液會被滅活，并排至廢水。按照環(huán) 境風險評價(ERA)針對洗滌劑作出的評估，這種排放可能造成環(huán)境問題。
[0005]當前在藥物活性物質的生物技術生產中用于滅活病毒的方案常依賴于使用 Triton X-lOCLTriton X-100的降解產品是辛基酸(octlyphenol)，一種證明有雌激素作用 的生態(tài)毒素(ecotoxin)。對辛基酸排放規(guī)定的限值是0.01~0. lppb。這樣，在生物技術工藝 中使用Triton-X可能需要使用復雜和昂貴的手段，以從廢物流中除去辛基酚。在生物制劑 的生產中需要使用環(huán)境相容的洗滌劑。
[0006] 本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，通過引用將其全文并入。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明提供在治療性多肽的制備工藝中滅活產品原料流(feedstream)中病毒的 方法，該方法包括用洗滌劑處理原料流的步驟，其中所述洗滌劑是與環(huán)境相容的。該方法保 持了治療性多肽的產品質量;例如，與使用Triton X-100的方法或無洗滌劑的方法相比較 而言。
[0008] 在一些實施方案中，治療性多肽的產品質量導致產品變體(variant)的改變不超 過產品原料流中總多肽的5%。在一些實施方案中，產品變體的增加不超過產品原料流中總 多肽的5%。在一些實施方案中，產品變體是尺寸變體、電荷變體、氧化變體、脫酰胺變體、糖 化變體或具有改變的聚糖分布(glycan profiles)的變體。在一些實施方案中，產品變體是 酸性和/或堿性產品變體。在本發(fā)明的一些實施方案中，洗滌劑處理原料流不造成多肽的片 斷化增加超過約5%。在一些實施方案中，洗滌劑處理原料流不造成原料流中聚集體的增加 超過約5%。在其它實施方案中，洗滌劑處理原料流不導致制備工藝中多肽的產量降低超過 約5%〇
[0009] 本發(fā)明提供在治療性多肽的制備工藝中滅活產品原料流中病毒的方法，該方法包 括用洗滌劑處理原料流的步驟，其中將環(huán)境相容的洗滌劑加入原料流至最終濃度約〇. 01 % 至約10%。在一些實施方案中，洗滌劑加入原料流至最終濃度約0.3%至約1 %。在一些實施 方案中，原料流經(jīng)洗滌劑處理至少約1分鐘到至少約48小時。在其它實施方案中，原料流經(jīng) 洗滌劑處理至少約15分鐘到至少約3小時。在其它實施方案中，原料流經(jīng)洗滌劑處理至少約 1小時。在本發(fā)明的一些實施方案中，原料流在約4°C到約30°C接受洗滌劑處理。在其它實施 方案中，原料流在約15 °C到約20 °C接受洗滌劑處理。
[0010] 在本發(fā)明的一些實施方案中，洗滌劑是非離子洗滌劑或兩性離子洗滌劑。在一些 實施方案中，洗滌劑具有約12至約15的親水親油平衡值(HLB)。
[0011] 在本發(fā)明的一些實施方案中，洗滌劑不包含或形成辛基酚。在一些實施方案中，洗 滌劑不包含或形成過氧化物。
[0012] 在本發(fā)明的一些實施方案中，包含洗滌劑的原料流是低濁度的。在一些實施方案 中，向原料流添加洗滌劑不增加原料流的濁度。
[0013] 在本發(fā)明的一些實施方案中，丟棄時，由洗滌劑使用導致的受納水體中洗滌劑的 預測環(huán)境濃度(PEC)在該洗滌劑的預測無效應濃度(PNEC)以下。在其它實施方案中，PECK PNEC 低。
[0014] 在本發(fā)明的一些實施方案中，環(huán)境相容的洗滌劑包括烷基葡糖苷。在其它實施方 案中，烷基葡糖苷是癸基葡糖苷。在其它實施方案中，環(huán)境相容的洗滌劑是醇乙氧基化物。 在其它實施方案中，環(huán)境相容的洗滌劑是烷基聚乙二醇醚。在一些實施方案中，環(huán)境相容的 洗滌劑具有CAS登記號CAS 9005-64-5，CAS 9005-65-6，CAS 126-43-8,68515-73-1，CAS 58846-77-8,CAS 59122-55-3,CAS 110615-47-9,CAS 29836-26-8,CAS 64366-70-7,CAS 68937-66-6,CAS 69227-22-1,CAS 25322-68-3,CAS 27252-75-1,CAS 4292-10-8,CAS 132778-08-6，CAS 110615-47-9，CAS 68515-73-1或CAS 68439-46-3。
[0015] 在一些實施方案中，洗滌劑包含一種或多種表面活性劑。在其它實施方案，洗滌劑 包含一種或多種表面活性劑、防腐劑和螯合劑。
[0016] 在某些方面，本發(fā)明提供了在治療性多肽的制備工藝中滅活產品原料流中病毒的 方法，該方法包括用環(huán)境相容的洗滌劑處理原料流的步驟，其中原料流包含收獲的細胞培 養(yǎng)物流體。在一些實施方案中，洗滌劑加入到收獲的細胞培養(yǎng)物流體。在其它實施方案中， 原料流包含捕獲池或回收的產品池。在其它實施方案中，捕獲池或回收的產品池是親和色 譜池。在又其它實施方案中，捕獲池或回收的產品池是蛋白A池、蛋白G池或蛋白L池。在其它 實施方案中，捕獲池或回收的產品池是混合模式色譜池。在其它實施方案中，捕獲池是 CaptoAdhere 池。
[0017] 在本發(fā)明的一些實施方案中，環(huán)境相容的洗滌劑與消泡劑組合使用。在一些實施 方案中，消泡劑是西甲硅油（simethicone)。
[0018] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在治療性多肽的制備工藝中滅活產品原料流中 病毒的方法，該方法包括用環(huán)境相容的洗滌劑處理原料流的步驟，其中病毒是有包膜病毒。 在一些實施方案中，病毒是逆轉錄病毒、皰疹病毒、黃病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒、肝炎病 毒、正粘病毒、副粘病毒，彈狀病毒或披膜病毒。在一些實施方案中，原料流中洗滌劑的病毒 對數(shù)減少值(LRV)大于約一。在其它實施方案中，病毒LRV大于約四。在一些實施方案中，LRV 基于感染性測定法計算。在其它實施方案中，感染性測定法是噬斑測定法或TCID5()測定法。
[0019] 在本發(fā)明的一些實施方案中，方法還包括在加入洗滌劑后過濾原料流的步驟。在 一些實施方案中，加入洗滌劑后至少約15分鐘到至少約48小時過濾原料流。在其它實施方 案中，加入洗滌劑后至少約1小時到至少約3小時過濾原料流。在其它實施方案中，加入洗滌 劑后約1小時后過濾原料流。在一些實施方案中，過濾是超濾或深度過濾。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施方案中，加入洗滌劑后對原料流進行色譜處理。在一些實施 方案中，色譜是親和色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、或混合模式 色譜中的一種或多種。在一些實施方案中，親和色譜是蛋白A色譜、蛋白G色譜或蛋白L色譜。 在其它實施方案中，離子交換色譜為陰離子交換色譜或陽離子交換色譜。在其它實施方案 中，混合模式色譜是CaptoAdhere色譜。
[0021] 在某些方面，本發(fā)明提供了在治療性多肽的制備工藝中滅活產品原料流中病毒的 方法，該方法包括用環(huán)境相容的洗滌劑處理原料流的步驟，其中治療性多肽是抗體、免疫粘 附素、酶、生長因子、受體、激素、調控因子、細胞因子、Fc融合多肽、抗原或結合劑。在其它實 施方案中，抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、雙特異性抗體、或抗體片段。 在一些實施方案中，治療性多肽在哺乳動物細胞中生產。在一些實施方案中，哺乳動物細胞 系是中國倉鼠卵巢(CH0)細胞或幼倉鼠腎(BHK)細胞、鼠雜交瘤細胞、或鼠骨髓瘤細胞。
【附圖說明】
[0022]圖1示出使用不同的混合方法對無洗滌劑的MAblHCCF對照的洗滌劑混合濁度分 析;無混合(菱形），攪拌棒(正方形)和頂部攪拌器(overhead agitator)(三角形）。
[0023] 圖2示出了用1%聚山梨醇酯20(左上）、1%聚山梨醇酯20和0.3%TnBP(右上）、1% 聚山梨醇酯80 (左下）和1 %聚山梨醇酯80和0.3 % ΤηΒΡ(右下）處理的MAb 1HCCF的洗滌劑混 合池度分析。無混合（菱形），攪拌棒（正方形）和頂部攪拌器（三角形），重棒(heavy bar) (HCCF對照-無混合）。
[0024]圖3示出了用l%SafeCare(左上）、l%Ecosurf H19(右上）、0·1Μ辛酸（左下）和 1% 癸基聚葡糖苷(右下)處理的MAblHCCF的洗滌劑混合濁度分析。無混合(菱形），攪拌棒(正方 形)和頂部攪拌器(三角形），重棒(HCCF對照-無混合）。
[0025]圖4示出了在環(huán)境溫度下與洗滌劑過夜孵育并在MAbSelect Sure蛋白A上純化后 MAb3的肽圖。
[0026] 圖5示出了在40°C保持至多達59天的不同時間點上，10%Triton CG-110穩(wěn)定性樣 品的NMR譜。
[0027] 圖6示出了在40°C保持至多達59天的不同時間點上，10%Ecosurf EH-9原液穩(wěn)定 性樣品的NMR譜。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 本發(fā)明提供了在治療性多肽的制備工藝中使用環(huán)境相容的（環(huán)保)洗滌劑滅活產 品原料流中病毒的方法。使用環(huán)境相容的洗滌劑不對治療性多肽的產品質量產生不利影 響。例如，使用環(huán)境相容的洗滌劑不會導致產品變體的增加，例如但不限于，尺寸變體(包括 產品片段和聚集體）、電荷變體(包括酸性和堿性變體）、脫氨基變體和糖化變體。在一些方 面中，使用環(huán)境相容的洗滌劑不對工藝雜質(如CHOP、核酸、浸提的（leached)蛋白A、產品變 體、內毒素、病毒污染物、細胞培養(yǎng)基成分等)的清除產生不利影響。
[0030] I. 一般技術
[0031] 本文描述或提及的技術和程序是本領域技術人員通常充分理解和按照常規(guī)方法 學常規(guī)使用的，例如，在如下文獻中描述的廣泛應用的方法:Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor，N·YCurrent Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc·):PCR 2:A Practical Approach(M·J·MacPherson，B·D·Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane ,eds.(1988)Antibodies ,A Laboratory Manual，and Animal Cell Culture(R. I.Freshney,ed.(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather and P.E.Roberts ,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture : Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newel1,eds.,1993-8) J.ff i1ey and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M.ffeir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and Μ.P.Calos ,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds., 1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(ffiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers ,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies: A Practical Approach (D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach (P.Shepherd and C.Dean,eds.,0xford University Press，2000);Using Antibodies : A Laboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(CoId Spring Harbor Laboratory Press , 1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J·D·Capra，eds·，Harwood Academic Publishers，1995);和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company，1993)〇
[0032] II.定義
[0033] 術語"洗滌劑"是指可包含長鏈脂肪族堿或酸的鹽、或親水性部分(例如糖）、并具 有親水和疏水特性的試劑。由于具有親水和疏水特性，洗滌劑可以發(fā)揮特定作用。如本文所 用，洗滌劑具有破壞病毒包膜和滅活病毒的能力。在一些實例中，洗滌劑可以是包含表面活 性劑和一種或多種其它試劑(如螯合劑和防腐劑)的組合物。
[0034] "表面活性劑"（surfactant或surface active agent)是一種化合物，典型地（但 不一定)是有機化合物，其包含疏水和親水基團，因此半溶于有機溶劑和水性溶劑。表面活 性劑可以是非離子、陽離子或陰離子的。
[0035]如本文所使用的，"環(huán)境相容的"物質是對環(huán)境引起極小有害影響的物質。例如，環(huán) 境相容的物質對動物和/或植物的生命基本上是無毒的。
[0036] "預測環(huán)境濃度"或"PEC"是物質在排放到環(huán)境受納水體中的廢物中的預測濃度。 例如，在治療性蛋白質的制備中用于病毒滅活的洗滌劑的預測環(huán)境濃度是排放到環(huán)境中的 廢物流中洗滌劑的濃度。
[0037] "預測無效應濃度"或"PNEC"是預測可安全排放到環(huán)境中而沒有有害影響的廢物 中物質的濃度;例如，對受納淡水和/或海水的生物群沒有有害影響。
[0038]術語"多肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸聚合物。該聚 合物可以是直鏈或支鏈，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可被非氨基酸中斷。該術語還包 括已經(jīng)被天然地或通過介入修飾的氨基酸聚合物;例如，二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙酰 化、磷酸化或任何其它操作或修飾，如與標記組分綴合。例如，含有一種或多種氨基酸類似 物(包括例如，非天然氨基酸等）的多肽、以及含有本領域已知的其它修飾的多肽也包括在 該定義內。如本文所用的術語"多肽"和"蛋白質"特別涵蓋抗體。
[0039] "分離的多肽"是指已經(jīng)從表達其的細胞或細胞培養(yǎng)物中回收的多肽。
[0040] 如本文所使用的術語"多肽電荷變體"是指已經(jīng)相對于其天然狀態(tài)被修飾的多肽， 所述修飾使得該多肽的電荷改變。在一些實例中，電荷變體比親本多肽具有更強酸性；即， 具有比親本多肽更低的pi。在其它實例中，電荷變體比親本多肽具有更強堿性；即，具有比 親本多肽更高的pi。這樣的修飾可以是工程化的或是天然過程的結果，如氧化、脫酰胺化、 賴氨酸殘基的C末端加工、N-末端焦谷氨酸形成、和糖化。在一些實例中，多肽電荷變體是糖 蛋白，其中結合至蛋白的聚糖被修飾，使得糖蛋白的電荷相比于親本糖蛋白發(fā)生改變，例 如，通過加入唾液酸或其衍生物。如本文中使用的"抗體電荷變體"是抗體或其片段，其中所 述抗體或其片段已經(jīng)相對于其天然狀態(tài)被修飾，使得抗體或其片段的電荷發(fā)生改變。
[0041 ]如本文中可互換使用的，"核酸"指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷 酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物、或可通過 DNA或RNA聚合酶、或通過合成反應摻入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核 苷酸，如甲基化的核苷酸和其類似物。如果存在的話，可以在聚合物組裝之前或之后進行核 苷酸結構的修飾。
[0042] "分離的核酸"是指且包括脫離其通常環(huán)境或從其通常環(huán)境分離的、非天然存在 的、重組的或天然存在的序列。
[0043] "純化的"多肽是指純度已經(jīng)被增加的多肽，這使得與其在天然環(huán)境中和/或在實 驗室條件下最初產生和/或合成和/或擴增時的存在形式相比，其以更純的形式存在。純度 是一個相對術語，并不一定意味著絕對純度。
[0044] "產品原料流"，或可選地，"原料流"，是供給用于工藝純化方法的物質或溶液，其 含有感興趣的治療性多肽并且其也可以含有各種雜質。非限制性實例可以包括，例如，收獲 的細胞培養(yǎng)物流體(HCCF)、或在一個或多個純化工藝步驟后包含感興趣治療性多肽的收集 池。
[0045] 術語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋例如單一單克隆抗體(包括激動劑，拮抗劑和 中和抗體）、具有多表位特異性的抗體組合物、多克隆抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如， 雙特異性抗體）、免疫粘附素、和抗體片段，只要其展現(xiàn)出所需的生物學或免疫學活性即可。 術語"免疫球蛋白"（Ig)與抗體在本文中可互換使用。
[0046] "抗體片段"包含全長抗體的部分，通常是其抗原結合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的實 例包括Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab'）2，和Fv片段;單鏈抗體分子;雙抗體(diabody);線性抗體;和由抗 體片段形成的多特異性抗體。
[0047]如本文使用的術語"單克隆抗體"指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即，構 成群的各個抗體之間除了可能少量存在的可能天然突變外是相同的。單克隆抗體具有高度 特異性，針對單一抗原位點。此外，與多克隆抗體制劑(其包含針對不同決定簇(表位）的不 同抗體)不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗 體是有利的，因為其可以不被其它抗體污染而合成。修飾語"單克隆"不應被解釋為需要通 過任何特定的方法生產抗體。例如，在本發(fā)明中有用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler et al.，Nature，256:495( 1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可以使用重組DNA方法在細 菌、真核動物或植物細胞中制備(參見，例如，美國專利號4，816，567)。"單克隆抗體"例如， 也可以使用在 Clackson et al.，Nature, 352:624-628(1991)和 Marks et al·， J.Mol.Biol. ,222:581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。
[0048]本文中單克隆抗體包括："嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物 種或屬于特定抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與來自另一 物種或屬于另一抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源；以及此類抗體的片段（只 要其展現(xiàn)出所需的生物學活性）（參見美國專利號4,816,567;和Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci .USA,81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括"靈長化" 抗體(primatized antibody)，其包含來自非人靈長動物(例如，舊世界猴、猿等）的可變結 構域抗原結合序列和人恒定區(qū)序列。
[0049] "人源化"抗體是非人(例如，嚙齒類動物)抗體的形式，其是嵌合抗體，包含來自非 人抗體的最少序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中受體的高 變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)的具有所需的抗體特異性、親和性和能力的高變區(qū)殘 基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。在一些情況下，人免疫球蛋白的 構架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基取代。此外，人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗 體中出現(xiàn)的殘基。這些修飾是為了進一步精化抗體的性能。一般，人源化抗體包含至少一 個，通常兩個可變結構域，的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(huán)對應于非人免疫 球蛋白的那些序列，而全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列。人源化抗體任選地還 可以包含免疫球蛋