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通過溶劑/去污劑處理對生物流體進行病毒滅活的方法

文檔序號:1176089閱讀:1159來源:國知局
專利名稱:通過溶劑/去污劑處理對生物流體進行病毒滅活的方法
通過溶劑/去污劑處理對生物流體進行病毒滅活的方法本發(fā)明涉及生物流體的病毒滅活,特別涉及血漿和血漿制品的病毒滅活。人和動物的血漿及血漿組分在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中起著重要作用。在處理出血期、血栓形 成期、纖維蛋白溶解、傳染期中它們主要用于輸血的目的,或用于預(yù)防或者在某些臨床情況 中的手術(shù)前用于對患者預(yù)處理。使用人或動物血漿或血漿組分的主要缺點是具有傳播血源性病毒的風(fēng)險,該血源 性病毒例如人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)以及西尼 羅河病毒,或可能出現(xiàn)的病毒如登革熱病毒、奇孔古尼亞病毒、嚴重急性呼吸綜合癥(SARS) 病毒以及禽流感病毒,這些病毒都是脂包膜病毒。病毒引起的風(fēng)險也存在于由重組哺乳動 物細胞系和轉(zhuǎn)基因動物得到的制品中。因此,已經(jīng)開發(fā)了用于對血漿和/或血漿組分和/或重組制品進行病毒滅活的不 同方法,例如用亞甲基藍處理,然后用可見光照射并進行溶劑/去污劑處理或單獨溶劑處 理。美國專利第4481189號和第4540573號描述了例如使用有機溶劑去污劑組合(S/D法) 或單獨使用溶劑以使血漿和血漿制品中含有的或加入其中的肝炎病毒或其它包膜病毒的 傳染性降低幾個數(shù)量級。在試劑濃度、溫度和接觸時間的合適條件下,溶劑/去污劑處理或單獨溶劑處理 有效地分解了具有與脂質(zhì)有關(guān)的包膜蛋白的病毒,同時忽略其對敏感性血漿蛋白質(zhì)的分子 構(gòu)象和生物活性的影響。目前,溶劑/去污劑(S/D)法是市場上包括輸血用血漿的許多血漿和生物技術(shù) (源自哺乳動物細胞或哺乳動物的重組或轉(zhuǎn)基因制品)制品的主要病毒滅活處理方法。該 方法通常用相對于蛋白質(zhì)溶液體積的0. 3%體積比至體積比的有機溶劑三(正丁基) 磷酸酯(TnBP)和通常為吐溫80、Triton X-100、吐溫20或脫氧膽酸鈉中的一種或幾種去污 劑孵育蛋白質(zhì)溶液1至6小時。在含有大量供體的大池(pool) (100升至5000升或更大) 中處理血漿或血漿制品,需要大的并且昂貴的制藥生產(chǎn)設(shè)備。該處理保持了范圍廣泛的凝血因子和其它不穩(wěn)定血漿蛋白的功能活性,該不穩(wěn) 定的血漿蛋白具有對病原性脂包膜的血源性病毒優(yōu)異的殺病毒效果記錄。(Burnouf and Radosevich, Blood Rev 2000,14:94-110)。在SD處理后,還要將用于輸血的大池SD (LP/SD)血漿進行疏水作用層析以便去除 SD試劑。然而,這種疏水作用層析步驟涉及昂貴的層析材料,消耗相對大量的緩沖液,并且 因為設(shè)備是要重復(fù)使用的,需要在每批實驗結(jié)束后對設(shè)備進行清洗和消毒,因此使除去SD 相當昂貴并耗時。此外,由于設(shè)備的重復(fù)使用,存在被傾向粘附于設(shè)備表面的病毒和朊病毒 逐批污染的風(fēng)險。此外,歷經(jīng)如在Horowitz B. et al.,Blood 1992 ;79 :826_31 所描述的用相 對于生物流體重量的1 %體積比的TnBP和相對于生物流體重量的1 %重量比的Triton X-100 (聚氧乙烯(9-10)對叔辛基苯酚;分子式t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)x,χ = 9-10)孵育,油 萃取,離心并進行疏水作用層析的用于輸血的大池SD(LP/SD)血漿具有諸如α 2-抗纖溶酶 (α 2-ΑΡ或SERPINF2)的特定絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)或諸如S蛋白的抗凝劑的低功能活性。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點,需要一種使用SD處理的病毒滅活方法,該方法不需要 疏水作用層析就可滿意地除去SD化學(xué)品,并具有α 2-ΑΡ和/或S蛋白的高功能活性。在長期并深入的研究后,現(xiàn)在本發(fā)明人驚奇并意外地發(fā)現(xiàn)這一目的可以通過將生 物流體病毒滅活的方法達到,該方法包括(a)用三(正丁基)磷酸酯(TnBP)和聚氧乙烯(4_5)對叔辛基苯酚 (t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)xOH, χ 5 ;Triton X-45)的混合物處理生物流體的步驟;(b)油萃取步驟,其中用基于大豆油體積的5%至15%,優(yōu)選8%至12%,甚至 更優(yōu)選約10%的大豆油處理包含三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯酚 (t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)χ0Η,χ 5)的生物流體從而將三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4_5) 對叔辛基苯酚(t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)xOH, χ ^ 5)轉(zhuǎn)移到大豆油中去;(c)依靠重力使在步驟(b)后回收的生物流體通過活性炭過濾器;(d)依靠重力使在步驟(C)后回收的生物流體通過細菌過濾器;假設(shè)大豆油萃取步驟是該方法中唯一的油萃取步驟。三(正丁基)磷酸酯(TnBP)的有益用量為相對于生物流體體積的0. 體積比至 2 %體積比,優(yōu)選為0. 3 %體積比至1. 5 %體積比,甚至更優(yōu)選為0. 5 %體積比至1 %體積比, 例如為體積比。聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯酚(t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)xOH,χ = 5) (Triton X-45) 的有益用量為相對于生物流體體積的0. 體積比至2%體積比,優(yōu)選為0. 3%體積比至 1.5%體積比,甚至更優(yōu)選為0. 5%體積比至1 %體積比,例如為1 %體積比。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中,三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯 酚(t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)xOH, χ ^ 5)各自用量均為相對于生物流體體積的體積比。本發(fā)明的生物流體包括哺乳動物的血液、血漿、血清、血漿組分、源自血液組分 的沉淀物和源自血液分級分離的上清液、貧血小板血漿、富血小板血漿、無冷凝蛋白血漿 (cryo-poor plasma)(冷上清)、重組和轉(zhuǎn)基因的制品。優(yōu)選的生物流體為包括回收血漿 (源自全血的血漿)和單采血漿的血漿,無冷凝蛋白血漿,諸如用于純化凝血酶原復(fù)合物的 組分、因子IX、因子VII、C蛋白、S蛋白、抗凝血酶、α2-ΑΡ、α 1-抗胰蛋白酶(α 1-ΑΤ)、纖 溶酶原激活物抑制劑-1 (PAI-I)、Cl-抑制劑的血漿組分,諸如聚乙二醇、辛酸或硫酸銨沉 淀組分的源自血漿的沉淀物,以及它們相應(yīng)的上清液,或者源自血漿分級分離的任何其它 沉淀物或上清液,上清液Ι+Π+ΙΙΙ,沉淀物Ι+ΙΙ+ΠΙ,上清液Π+ΙΙΙ,沉淀物ΙΙ+ΠΙ,上清 液1+111,上清液IV,沉淀物V或沉淀物II??梢詮幕厥昭獫{(源自全血的血漿)以及從單 采血漿中得到血漿組分、沉淀物和上清液。特別優(yōu)選的生物流體是單采血漿,回收血漿,源自單采血漿的冷沉淀物,來自回收 血漿的冷沉淀物和無冷凝蛋白血漿(單采的和回收的)。在步驟(a)的SD處理后,用大豆油萃取一次的操作使TnBP的含量降低至小于初 始TnBP含量(IOOOOppm)的10%,即降低至小于約lOOOppm,優(yōu)選降低至小于初始TnBP含 量(IOOOOppm)的5%,即降低至小于約500ppm,并且步驟(b)使Triton X-45含量降低至 小于初始Triton X-45含量(IOOOOppm)的30%,即降低至小于3000ppm,優(yōu)選降低至小于 初始Triton X-45含量(IOOOOppm)的25%,即降低至小于2500ppm。
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此外,令人非常意外和驚奇的是,在根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的病毒滅活的生物流 體中,二(2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(DEHP)的含量明顯低于其在起始生物流體中的含 量。起始生物流體中的DEHP產(chǎn)生于含在通常用于生物流體(例如血漿,無冷凝蛋白血漿或 者冷沉淀物)的儲存袋的材料中的DEHP的擴散。用于諸如血液和血液組分的生物流體的 儲存和收集袋通常由PVC(聚氯乙烯)制成。DEHP是不與PVC聚合物化學(xué)結(jié)合的增塑劑,并 且當PVC醫(yī)療器具接觸到流體時可以浙濾。由于擔(dān)心在諸如新生兒、兒童、孕婦或肝功能損 傷的患者的特殊患者群體中可能的毒性,需要生物流體特別是用于輸血的生物流體具有可 能最低的DEHP含量。令人意外和驚奇的是,發(fā)現(xiàn)油萃取和過濾均使DEHP含量降低至低于 起始血漿中DEHP含量并且小于在其它群體的用于輸血的血漿和血小板濃縮物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 的 DEHP 含量的水平(例如參見 Inoue, K. etal, Clin. Chem. Acta 2005 ;358 (1-2) 159-66 ; Cole RS et al. Vox Sang 1981 ;40 (5) 317-22 ;Loff S et al. , J. Pediatr. Surg. 2000 ; 35(12) 1775-81 ;Buchta C. et al. , Transfusion 2005 ;45 (5) :798_802)。最重要的是需要大豆油萃取以得到透明/不渾濁的生物流體溶液,該溶液能夠被 過濾而不需要進一步的附加方法(例如離心),因此有可能進行直接有效過濾。令人非常驚 奇和意外的是,當該方法包括僅一次單獨的大豆油萃取步驟時才能得到透明/不渾濁的溶 液。多于一次的大豆油萃取或用諸如蓖麻油的其它油的萃取總是產(chǎn)生渾濁溶液,該渾濁溶 液不能依靠重力通過活性炭過濾器而被過濾。因此,在優(yōu)選的實施方案中,大豆油萃取之后的過濾步驟特別是通過活性炭過濾 器的過濾可通過重力進行。炭過濾步驟(c)使TnBP的含量進一步降低至小于IOppm或無法檢測到的水平,使 Triton X-45的含量降低至小于50ppm,或甚至小于lOppm,除去在油萃取過程中由于混合 仍然可存在于生物流體溶液中的油滴,并通過除去細胞碎片、顯微聚集物、殘留的脂質(zhì)使生 物流體溶液進一步澄清,由此提高了隨后的細菌過濾器的能力并且使其更容易能夠通過采 用過濾器的過濾和/或納米過濾進行病毒/朊病毒除去步驟(例如去除非包膜病毒),所述 過濾器為諸如Cuno Zeta Plus VR過濾器的吸附過濾器,或孔徑為15nm-75nm的過濾器,或 者與諸如Pall DV過濾器、Millipore Viresolve或Asahi Planova系列過濾器的相當?shù)?過濾器ο用于過濾生物流體小池即小于約500ml的合適的活性炭過濾器的實例包括但不 限于由Pall公司商業(yè)化的Pall Supracap 60系列過濾器膠囊,例如AKS6、AKS7、AKS4和 AKSl ;由 Cuno Inc.商業(yè)化的 Cuno Zeta Plus ZetaCarbon 系列,例如 BIOCAP 30-R32SP、 BIOCAP 30-R33SP、BIOCAP 30-R34SP、BIOCAP 30-R35SP,以及新引進的 BIOCAP 25-R32SP、 BIOCAP 30-R33SP、BIOCAP 30-R34SP 和 BIOCAP 35-R25SP。在本發(fā)明有益的實施方案中,細菌過濾器包含大小為約0. 2 μ m的孔。當使用在其 諸如0.65μπι至0.2μπι的孔隙率中具有梯度的細菌過濾器時,相對于細菌過濾步驟(d)的 能力得到最好結(jié)果。這樣漸變的孔隙率確保了在越來越多小孔隙率的纖維上的材料的逐級 過濾。用于生物流體的小池即小于1. 5L過濾的合適的細菌過濾器的實例為由Pall公司商 業(yè)化的 Capsule Mini Kleenpak EKV (型號 KM5EKVP2S)。在優(yōu)選的實施方案中,通過重力進行步驟(d)中的細菌過濾。如果在處理過程中發(fā)生了偶然的細菌污染,則由于細菌過濾確保了生物流體溶液的細菌安全性。而且,避免了在處理過程中所使用的諸如TnBP、Trit0n X_45或大豆油的各 種化學(xué)品的滅菌,節(jié)省了時間和成本,并且使該方法可以應(yīng)用于不容易得到滅菌設(shè)備的環(huán) 境中。在生物流體是血漿,冷沉淀物或無冷凝蛋白血漿的情況下,細菌過濾進一步確保 除去在血液/血漿采集(例如由于對捐獻者的手臂不適當?shù)那鍧?時引入的并且沒有被 SD處理破壞掉的任何血源性細菌。此外,針對血源性寄生物(例如引起巴貝斯蟲病的巴貝 斯原蟲;引起瘧疾的瘧原蟲;引起利什曼病的利什曼原蟲;引起美洲錐蟲病的美洲錐蟲), 特別是如果使用非常新鮮和未冷凍的血漿作為起始材料并且這些寄生物意外地沒有被SD 處理破壞掉時,細菌過濾提高了血漿/冷沉淀物/無冷凝蛋白血漿溶液安全性的范圍。在 0. 2μπι的薄膜上的細菌過濾也使血液細胞碎片除去,由此降低了由殘留的淋巴細胞和細胞 團塊引起的免疫性輸血反應(yīng)的風(fēng)險。此外,根據(jù)本發(fā)明人的了解,這是第一次能夠?qū)⒂裳簷C構(gòu)制備的輸血用血漿或 諸如冷沉淀物或無冷凝蛋白血漿的其它血漿組分通過0. 2 μ m過濾器進行過濾。通過孔徑 為約0. 2 μ m過濾器的過濾有利于產(chǎn)生除沒有細菌和寄生物之外,也沒有任何血細胞(白細 胞、血小板、紅細胞)和細胞碎片的產(chǎn)物。血細胞和細胞碎片的完全除去也能夠提高輸血用 血漿或諸如冷沉淀物或無冷凝蛋白血漿的其它血漿組分的安全性,除去或減少了與病原體 相關(guān)的白細胞,例如巨細胞病毒、埃-巴二氏病毒或朊病毒。與本發(fā)明相比,常規(guī)的單供體 血漿是無菌操作的并包含顯著水平的血細胞;去白細胞的單供體血漿包含低水平的白細胞 但是仍然可以包含血小板;諸如單供體亞甲基藍血漿或補骨脂素血漿的病毒滅活血漿單位 分別通過亞甲基藍過濾器或補骨脂素吸收過濾器,但仍然包含血細胞或血細胞碎片。另外,根據(jù)本發(fā)明得到的血漿和無冷凝蛋白血漿減少了脂質(zhì)的含量,這可以降低 患TRALI (與輸血有關(guān)的急性肺損傷)的風(fēng)險。最后,根據(jù)本發(fā)明得到的血漿和冷沉淀物顯示了對FVIII和可凝固纖維蛋白原含 量的良好保持,而用亞甲基藍、補骨脂素和核黃素處理的血漿,F(xiàn)VIII和可凝固纖維蛋白原 含量會損失20%至30%??傊?,本發(fā)明的方法使血漿、無冷凝蛋白血漿和冷沉淀物的制劑(a)病毒滅活, (b)具有對FVIII和可凝固纖維蛋白原的良好保持,(c)基本上沒有脂質(zhì),(d)基本上沒有 血細胞和細胞碎片,以及(e)與起始血漿、無冷凝蛋白血漿或冷沉淀物相比,具有較低的二 (2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯(DEHP)含量。在有益的實施方案中,本發(fā)明的方法在步驟(C)之前包括將在步驟(b)后回收的 生物流體依靠重力通過輸血過濾器的步驟。該附加的過濾步驟沒有影響生物流體的濁度, 而是除去了在大豆油萃取后可能存在于生物流體中的可見凝塊,因此作為安全措施。優(yōu)選 地,通過重力進行該過濾步驟。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于諸如血漿和血漿制品的SD處理的生物流體的大池的工 業(yè)處理以及所謂的小型池(minipool) (MD-SD)的處理。在國際專利申請WO 2006/082115 中描述了應(yīng)用于諸如血漿和血漿制品(MP/SD)的生物流體小型池的溶劑/去污劑方法,其 中將少量的血漿在封閉的袋系統(tǒng)中處理,該專利申請通過引用在此并入本文。關(guān)于袋內(nèi)病毒滅活系統(tǒng),本發(fā)明的方法特別受到關(guān)注,這是由于過濾能夠依靠重 力發(fā)生,而不需要諸如蠕動泵的專用設(shè)備,因此使其使用起來方便又經(jīng)濟。一次性過濾器的使用使該方法與袋內(nèi)系統(tǒng)特別匹配,這是由于袋和過濾器的整個系統(tǒng)可以在使用后簡單地 丟棄。

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一實施方案,用于血漿(或無冷凝蛋白血漿)小型池的SD處 理的袋內(nèi)系統(tǒng)的示意圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的一實施方案,用于冷沉淀物小型池的SD處理的袋內(nèi)系統(tǒng)的示 意圖。圖3A是在S/D-F處理(溶劑/去污劑處理后用大豆油萃取和過濾)之前與之后 的血漿和冷沉淀物小型池的在非還原條件下的電泳圖案照片。圖3B是在S/D-F處理(溶劑/去污劑處理后用大豆油萃取和過濾)之前與之后 的血漿和冷沉淀物小型池的在還原條件下的電泳圖案照片。圖4示出根據(jù)實施例20,單采血漿和回收血漿在S/D處理后、油萃取后以及過濾后 的TnBP的平均含量。圖5示出根據(jù)實施例20,單采血漿和回收血漿在S/D處理后、油萃取后以及過濾后 的Triton X-45的平均含量。圖6示出根據(jù)實施例20,在處理單采血漿或回收血漿的各個步驟中DEHP測定的結(jié)^ ο圖7示出在本發(fā)明的S/D-F處理之前與之后冷沉淀物小型池的VWF多聚體譜圖。圖1示出的袋內(nèi)系統(tǒng)(1)表示一種特殊構(gòu)造的系統(tǒng),該系統(tǒng)適用于處理本發(fā)明方 法的血漿(或無冷凝蛋白血漿)小型池。該系統(tǒng)包含第一病毒滅活袋(2)、第二病毒滅活袋
(3)、漏斗形袋(4)、回收袋(5)、輸血過濾器(6)、活性炭過濾器(7)、細菌過濾器(8)和兩個 用于回收病毒滅活并純化的血漿或無冷凝蛋白血漿的收集袋(9)。在選擇的實施方案中,該 系統(tǒng)不包含輸血過濾器(6)。袋內(nèi)系統(tǒng)還可以在細菌過濾器和收集袋(9)之間包含另外的 收集袋以用來將病毒滅活并純化的血漿在分配進收集袋(9)之前收集起來。在有益的實施方案中,病毒滅活袋是橢圓形或圓形的以方便組分的混合并避免死 點的存在,死點為血漿材料與S/D試劑接觸不到的地方。通過在血液和血制品輸血領(lǐng)域中所使用的技術(shù)連接的狀態(tài)將病毒滅活袋(2,3)、 漏斗形袋(4)、回收袋(5)、過濾器(6、7、8)和用于回收病毒滅活并純化的血漿或無冷凝蛋 白血漿的收集袋(9)直線互相連接。將待處理的血漿或無冷凝蛋白血漿從一個或多個血漿收集袋或儲存袋(10)中直 接轉(zhuǎn)移至第一病毒滅活袋(2)的第一入口(11)。然后例如用注射器通過第二入口(12)向 第一袋(2)中加入處理化學(xué)品(triton X-45和TnBP)。注射器可以直接或通過管子連接到 第二入口上。在第一病毒滅活袋(2)中進行第一次孵育后,通過第一袋(2)的出口(13)和第二 袋(3)的入口(14)將包含處理化學(xué)品的血漿或無冷凝蛋白血漿轉(zhuǎn)移至第二病毒滅活袋(3) 中用于進一步的孵育。在第二孵育步驟結(jié)束后,通過第二袋(3)的出口(15)和漏斗形袋⑷的第一入口 (16)將包含處理化學(xué)品的血漿或無冷凝蛋白血漿從第二病毒滅活袋(3)轉(zhuǎn)移至漏斗形袋
(4)中用于油萃取。例如用注射器(18)通過漏斗形袋⑷的第二入口(17)加入用于油萃取的大豆油。注射器(18)可以直接或通過管子連接到第二入口上。在油萃取步驟中,首先將包含處理化學(xué)品的血漿或無冷凝蛋白血漿和大豆油混合 均勻然后通過重力使其相分離。在通過重力進行的相分離結(jié)束之后,獲得下層的血漿或無冷凝蛋白血漿相以及上 層的大豆油相。然后通過漏斗形袋(4)的出口(19)和回收袋(5)的入口(20)將下層相轉(zhuǎn) 移到回收袋(5)中。然后將回收的血漿或無冷凝蛋白血漿依次通過輸血過濾器(6)(如果存在),活性 炭過濾器(7)和細菌過濾器(8)。在通過細菌過濾器(8)后,在收集袋(9)中回收病毒滅活 并純化的血漿或無冷凝蛋白血漿。圖2顯示的袋內(nèi)系統(tǒng)(Ia)表示一種特殊構(gòu)造的系統(tǒng),該系統(tǒng)適用于處理本發(fā)明方 法的冷沉淀物小型池。該系統(tǒng)與圖1系統(tǒng)的不同之處在于它還包含另外的收集袋以混合處 理過的冷沉淀物并在細菌過濾器(8)和收集袋(9)之間分配(21)前得到均相溶液。在選 擇的實施方案中,該系統(tǒng)不包含輸血過濾器(6)。當在圖2顯示的袋內(nèi)系統(tǒng)(Ia)中對冷沉淀物進行病毒滅活時,將30_50單位(約 IOml/單位)的冷沉淀物從其儲存袋中直接轉(zhuǎn)移至第一病毒滅活袋(2)的第一入口(11)。隨后的步驟基本上與用于血漿或無冷凝蛋白血漿的步驟相同。當所述的處理順序應(yīng)用于SD-處理的生物流體特別是血漿和諸如免疫球蛋白G的 分級血漿制品的大池的工業(yè)處理時,其可以提高產(chǎn)量并以不止一種方式簡化制備方法。首 先,用一次性炭過濾器來代替昂貴的疏水相互作用步驟(填充材料通常是C18或SDR-hyper D)以除去在工業(yè)規(guī)模上使用的SD試劑。這避免了對層析材料(可回收的)進行確認、清潔 和消毒的需要,并且降低/避免了緩沖液的消耗,使得處理更經(jīng)濟和快捷,還避免了對被趨 于粘附在層析設(shè)備表面的病毒和朊病毒逐批污染的擔(dān)憂。其次,Triton X-45的使用提供了更優(yōu)質(zhì)的具有α 2-ΑΡ、α 1_AT、S蛋白(PS)以及 其他蛋白酶抑制劑或抗凝血劑的優(yōu)良含量的血漿和其它蛋白酶抑制劑或抗凝劑,該Triton X-45對于在大豆油后得到潔凈的材料是必需的。本發(fā)明的另一個目的是病毒滅活的生物流體,該病毒滅活的生物流體選自血漿、 無冷凝蛋白血漿和冷沉淀物,其中該生物流體基本上不含脂質(zhì),不含血細胞和細胞碎片。生 物流體,即血漿和冷沉淀物,有利于FVIII和可凝固纖維蛋白原的良好保存。在生物流體中缺少脂質(zhì)、血細胞和細胞碎片能夠顯著降低免疫性輸血反應(yīng)的風(fēng) 險,該免疫性輸血反應(yīng)例如由殘留的脂質(zhì)或淋巴細胞或細胞團塊引起的TRALI (與輸血有 關(guān)的急性肺損傷)。其也能夠降低源自與血細胞或血細胞膜有關(guān)的病原體的風(fēng)險。為了更充分地說明本發(fā)明的實質(zhì)及其實現(xiàn)方式,提供了以下非限定的實施例。雖 然所有的實施例均涉及小型池并且在封閉的袋系統(tǒng)中進行,但應(yīng)該理解的是該方法可以很 容易被放大,特別是關(guān)于通過活性炭過濾器和細菌過濾器的過濾。合適的大型過濾器是可 商購的。除非另有說明,實施例中所有的百分數(shù)均為體積百分數(shù)。實施例1
用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號S7381,Sigma)萃取1次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血菜中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)的 50%/50% 的混合物以達到相對于 血漿重量的TnBP和Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton Χ_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈晃 動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。然后將袋懸掛以確保在 油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min。將透明的血漿相回收。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0·2μπι的細菌過濾器(Mini Kleenpak 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用1 % TnBP-I % Triton X_45和隨后用大豆油萃取1次的組合得到超過 350ml的透明血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾以除去SD試 劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。實施例2 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號85471,源自大豆,Sigma)萃取1次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血菜中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50%/50 % 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino
然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml的大豆油(型號85471,源自大豆,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸 浮液劇烈晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。然后將袋懸 掛以確保在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min。將透明的血漿相回收。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0·2μπι的細菌過濾器(Mini Kleenpak 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用1 % TnBP-I % Triton X_45和隨后用大豆油萃取1次的組合得到超過 350ml的透明血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾以除去SD試 劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。實施例3 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號 19-42500,Penta International Corporation)萃取 1 次的單采血菜按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血菜中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50 %/50% 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加 Λ 40ml WicS^ ( M^· 19-42500, Penta International Corporation,_ 國)。
漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈晃動至少lmin,之后將其放入震蕩培養(yǎng)箱中 以確保溫和攪拌至少15min。然后將袋懸掛以確保在油相(上層)和血漿相(下層)之間 傾析45min。將透明的血漿相回收。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0·2μπι的細菌過濾器(Mini Kleenpak 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用TnBP-I% Triton X_45與隨后用大豆油萃取1次的組合得到超過 350ml的透明血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾以除去SD試 劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。實施例4 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號S7381,Sigma)萃取2次的單采血漿
10
按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血菜中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)的 50%/50 % 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X-45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml的大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈 晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保 在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min。將血漿相回收并將油萃取步驟重復(fù)一次,產(chǎn)生約360ml的血漿(總計2次大豆油 萃取)將能夠通過輸液過濾器的非常渾濁的血漿相回收。只有約30ml能夠依靠重力通 過AKS6 Pall炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾,并且過濾器開始堵塞,過濾處理停止。結(jié)論使用TnBP-I % Triton X_45和隨后用大豆油萃取2次的組合產(chǎn)生非常 渾濁的血漿,該血漿不能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾。實施例5 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號S7381,Sigma)萃取3次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50 %/50% 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入
1140ml的大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈 晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保 在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min。將血漿相回收并將油萃取步驟重復(fù)兩次,產(chǎn)生約350ml血漿。將略微渾濁的血漿相回收。350ml血漿通過輸液過濾器。只有約80ml能夠依靠重 力通過AKS6 Pall炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾,并且過濾器開始堵塞,過濾 處理停止。結(jié)論使用TnBP-I % Triton X_45與隨后用大豆油萃取3次的組合產(chǎn)生略微 渾濁的血漿,該血漿不能依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾。實施例6 用1% TnBP-I % Triton X_45(X45,Triton (R) X-45, Sigma)處理并用大豆油(型 號S7381,Sigma)萃取1次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X_45(X45,Triton X_45,Sigma)的 50% /50%的混合物以達到 1% TnBP 和 1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml的大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈 晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保 在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min?;厥胀该鞯难獫{相。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0·2μπι的細菌過濾器(Mini Kleenpak 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用TnBP-I% Triton X_45(使用另一品牌的Triton X-45)并隨后用 大豆油萃取1次的組合得到超過350ml的透明血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和 細菌過濾器過濾以除去SD試劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。實施例7 用2% TnBP處理并用大豆油(型號S7381,Sigma)萃取1、2或3次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。
將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 以達到2% TnBP的最終濃度。將血漿-TnBP混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然后將處理袋 在37°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。然后將血 漿-TnBP混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30min。然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP混合物中加入40ml的大豆油 (型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP/lOvol %油懸浮液劇烈晃動至少lmin,然后放入震蕩 培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保在油相(上層)和血漿相(下 層)之間傾析45min?;厥盏难獫{相是非常渾濁的,使其不能進行通過炭過濾器(AKS6 Pall炭過濾器; SUPRAcap 60 SC060XAK6)的過濾。將油萃取步驟重復(fù)兩次。在每種情況中,血漿均是非常渾濁的而不能進行上述過 濾步驟。結(jié)論使用2% TnBP與隨后用大豆油萃取1、2或3次的組合,在每種情況中 均產(chǎn)生非常渾濁的血漿,該血漿不能夠依靠重力通過AKS6Pall炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)并且甚至不能通過細菌過濾器被過濾。實施例8 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用蓖麻 油萃取1、2或3次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50%/50 % 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X-45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml 蓖麻(castor)(=蓖麻(ricinus))油(型號 83912,F(xiàn)luka)。將血菜-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少 15min。之后將袋懸掛以確保在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min?;厥盏难獫{相是渾濁的,使其不能進行通過炭過濾器(AKS6 Pall炭過濾器; SUPRAcap 60 SC060XAK6)的過濾。
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將油萃取步驟兩次重復(fù)。在每種情況下,血漿均是渾濁的而不能進行上述過濾步
馬聚ο結(jié)論使用TnBP-I% Triton X-45與隨后用蓖麻油萃取1、2或3次的組合產(chǎn) 生渾濁的血漿,該血漿不能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾。實施例9 M 1% TnBP-I % Triton X-100 處理并用大豆油(型號 S7381,Sigma)萃取 1、2 或 3次的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-100 (Merck,Darmstadt,德國)的 50% /50% 的混合物以達到 1% TnBP 和 1% Triton X-100的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X-100混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混 合。然后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理 30min。然后將血漿-TnBP-Triton X_100混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下 孵育 Ih 30min。然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_100混合物中加入 40ml大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-lOO/lOvol %油懸浮液劇烈晃 動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。然后將袋懸掛以確保在 油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min?;厥盏难獫{相是渾濁的,使其不能進行通過炭過濾器(AKS6 Pall炭過濾器; SUPRAcap 60 SC060XAK6)的過濾。將油萃取步驟兩次重復(fù)。在每種情況下,血漿均是渾濁的而不能進行上述的過濾步驟。結(jié)論使用TnBP-I% Triton X-100與隨后用大豆油萃取1、2或3次的組合, 產(chǎn)生渾濁的血漿,該血漿不能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾。實施例10 用TnBP-1% Tween 80處理并用大豆油(型號S7381,Sigma)萃取1、2或3次 的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是+/-400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和吐溫80,也稱作聚山梨醇酯80 (型號59924,F(xiàn)luka)的50% /50%的混合物以達到TnBP和1 %吐溫80的最終濃度。將血漿-TnBP-吐溫80混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然后 將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。然 后將血漿-TnBP-吐溫80混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30min。然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-吐溫80混合物中加入40ml大 豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-吐溫80/10vol %油懸浮液劇烈晃動至少lmin, 然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。然后將袋懸掛以確保在油相(上層) 和血漿相(下層)之間傾析45min?;厥盏难獫{相是渾濁的,使其不能進行通過炭過濾器(AKS6 Pall炭過濾器; SUPRAcap 60 SC060XAK6)的過濾。將油萃取步驟兩次重復(fù)。在每種情況下,血漿均是渾濁的而不能進行上述的過濾步驟。結(jié)論使用TnBP-I %吐溫80與隨后用大豆油萃取1、2或3次的組合,產(chǎn)生渾 濁的血漿,該血漿不能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾。實施例11 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號S7381,Sigma)萃取1次的回收血漿由全血制備2單位回收血漿,并將該回收血漿收集到CPD抗凝血劑/防腐劑(比 例14ml/100ml血液)中。在收集的4小時內(nèi)將血液以3600g離心12min。血漿在處理前 沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50%/50 % 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X-45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加入 40ml的大豆油(型號S7381,Sigma)。將血漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈 晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保 在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析45min。將透明的血漿相回收。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0·2μπι的細菌過濾器(Mini Kleenpak 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用TnBP-I% Triton X_45與隨后用大豆油萃取1次的組合得到超過 350ml的透明回收血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾以除去SD 試劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。
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實施例12 用1% TnBP-I % Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka,Sigma Aldrich)處理并用大豆 油(型號 19-42500, Penta International Corporation) WM 1 &的回收血I由全血制備2單位回收血漿,并將該回收血漿收集到CPD抗凝血劑/防腐劑(比 例14ml/100ml血液)中。在收集的4小時內(nèi)將血液以3600g離心12min。血漿在處理前 沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X-45 (型號 93419,F(xiàn)luka, Sigma Aldrich)的 50 %/50% 的混合物以達到 1 % TnBP和1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X-45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。 然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino然后將該混合物轉(zhuǎn)移到油萃取袋中。向血漿-TnBP-Triton X_45混合物中加 Λ 40ml WicS^ ( M^· 19-42500, Penta International Corporation,_ 國)。
漿-TnBP-Triton X-45/lOvol %油懸浮液劇烈晃動至少lmin,然后放入震蕩培養(yǎng)箱中以確 保溫和攪拌至少15min。之后將袋懸掛以確保在油相(上層)和血漿相(下層)之間傾析 45min。將透明的血漿相回收。超過370ml的血漿通過輸液過濾器,然后能夠依靠重力(不 用依靠泵提供的壓力)通過與購自Pall的0.2μπι的細菌過濾器(Mini KleenpakTM 20,型 號 KM5EKVP2S)串聯(lián)的 AKS6 Pall 炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論使用TnBP-I% Triton X_45與隨后用大豆油萃取1次的組合得到超過 350ml的透明血漿,該血漿能夠依靠重力通過炭過濾器和細菌過濾器被過濾以除去SD試 劑、油殘余物、血細胞碎片、細菌和寄生物。實施例13 用TnBP-I % Triton X_45(X45,Triton X_45,Sigma)處理并且不進行大豆 油萃取的單采血漿按照制造商的操作指南通過單采步驟采集2血漿單位,并用ACDA(比例 8ml/100ml血液)抗凝。血漿在處理前沒有除去白細胞。將血漿在干冰乙醇浴中冷凍并 在-30°C下的冷藏室中儲存最長3個月。將2捐獻血漿在35°C下的溫度可控的水浴中解凍lOmin,然后將其匯集到第一 SD 處理袋。血漿池的體積是400ml。向 400ml 血漿中小心加入 8ml 的 TnBP (Prolabo,VWR,F(xiàn)ontenay—sous—bois,法國) 和 Triton X_45(X45,Triton X-45,Sigma)的 50% /50% 的混合物以達到 1% TnBP 和 1% Triton X-45的最終濃度。將血漿-TnBP-Triton X_45混合物劇烈晃動5min以確保不同組分的良好混合。然 后將處理袋在31°C下的震蕩培養(yǎng)箱中孵育,之后在恒速溫和攪拌(150rpm)下處理30min。然后將血漿-TnBP-Triton X-45混合物轉(zhuǎn)移到第二 SD處理袋中并在相同條件下孵育Ih 30mino將非常渾濁的血漿相回收,該血漿相不能夠通過AKS6 Pall炭過濾器(SUPRAcap 60 SC060XAK6)被過濾。結(jié)論需要在TnBP-I % Triton X_45后采用大豆油的萃取以使血漿澄清并能 夠進行炭過濾。下文的表1顯示了與各自起始的(標記“起始”)血漿相比,五批次如實施例1所 述處理的(標記“最終”)血漿質(zhì)量的對比。結(jié)果顯示使用TnBP-I % Triton X-45隨 后大豆油萃取1次并通過在AKS6炭過濾器和細菌過濾器上進行過濾處理的方法沒有改變 血漿的蛋白質(zhì)品質(zhì),也沒有導(dǎo)致離子平衡的改變。在油萃取1次和炭過濾后的最終血漿中 TnBP和Triton X-45的含量降低至無法檢測的水平。
權(quán)利要求
將生物流體病毒滅活的方法,其包括(a)用三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4 5)對叔辛基苯酚(t Oct C6H4 (OCH2CH2)xOH,x≈5)的混合物處理所述生物流體的步驟;(b)油萃取步驟,其中用所述生物流體體積的5%體積比至15%體積比的大豆油處理包含所述三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4 5)對叔辛基苯酚(t Oct C6H4 (OCH2CH2)xOH,x≈5)的生物流體從而將三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4 5)對叔辛基苯酚(t Oct C6H4 (OCH2CH2)xOH,x≈5)從所述生物流體轉(zhuǎn)移到所述大豆油中去;(c)使在步驟(b)后回收的所述生物流體通過活性炭過濾器;以及(d)使在步驟(c)后回收的所述生物流體通過細菌過濾器;前提條件是所述大豆油萃取步驟是該方法中唯一的油萃取步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述三(正丁基)磷酸酯和所述聚氧乙烯(4-5)對 叔辛基苯酚(t-0ct-C6H4-(OCH2CH2)χ0Η,χ 5)的各自用量均為所述生物流體體積的體 積比。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述大豆油的用量為所述生物流體體積的5%體積 比至15%體積比,優(yōu)選為8%體積比至12%體積比,甚至更優(yōu)選為約10%體積比。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟(c)中的過濾是通過重力進行的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟(d)中的過濾是通過重力進行的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其在步驟(c)之前還包括將步驟(b)后回收的所述生物 流體通過的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中通過所述輸血過濾器的過濾是通過重力進行的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述方法是使用成套一次性袋進行的,所述成套一 次性袋包含在其中進行步驟(a)的溶劑/去污劑處理袋以及在其中進行步驟(b)的油萃取 袋,所述第二袋具有內(nèi)室,所述內(nèi)室具有與漏斗形袋的出口裝置相連的漏斗形的下部。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其中所述成套一次性袋還包含活性炭過濾器和細菌過濾
10.權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的方法在生物流體小型池的病毒滅活中的用途。
11.選自血漿、無冷凝蛋白血漿和冷沉淀物的病毒滅活的生物流體,其中所述生物流體 基本上不含脂質(zhì),也不含血細胞和細胞碎片。
全文摘要
病毒滅活生物流體的方法包括(a)用三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯酚(t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH,x=5)的混合物處理生物流體的步驟;(b)油萃取步驟,其中用生物流體體積的5%體積比至15%體積比的大豆油處理包含三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯酚(t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH,x=5)的生物流體從而將三(正丁基)磷酸酯和聚氧乙烯(4-5)對叔辛基苯酚(t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH,x=5)從生物流體轉(zhuǎn)移到大豆油中去;(c)使在步驟(b)后回收的生物流體通過活性炭過濾器;以及(d)使在步驟(c)后回收的生物流體通過細菌過濾器;假設(shè)大豆油萃取步驟是該方法中唯一的油萃取步驟。
文檔編號A61K35/14GK101977635SQ200980109803
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者哈迪阿方斯·古布蘭, 米爾亞納·拉多塞維奇, 蒂爾瑞·伯爾諾弗, 馬格迪·艾爾-埃吉貝 申請人:醫(yī)療器械研究基金會
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