使用溶瘤腺病毒的腦癌治療的制作方法
【專利說明】使用溶瘤腺病毒的腦癌治療
[0001 ]本申請要求于2013年6月18日提交的美國臨時申請序列號61/836,230的優(yōu)先權(quán)權(quán) 益，其全部內(nèi)容在此通過引用并入。
[0002] 發(fā)明背景 A.發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性地涉及醫(yī)藥和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及使用溶瘤腺病毒 來在患者中治療膠質(zhì)瘤的組合物和方法。
[0004] B.相關(guān)技術(shù)說明
[0005] 癌癥的發(fā)生被理解為是通過遺傳改變的積累所發(fā)生的復(fù)雜、多步驟生物學(xué)進(jìn)程的 結(jié)果。這些改變中的很多（如果不是全部)都涉及特定的細(xì)胞生長控制基因。這些基因通常 分為兩類:原癌基因（proto-oncogene)和腫瘤抑制基因。這兩類基因的突變通常都對含有 改變之遺傳物質(zhì)的細(xì)胞賦予了生長優(yōu)勢。
[0006] 與原癌基因相反，腫瘤抑制基因的功能是對抗細(xì)胞增殖。當(dāng)通過如點突變或缺失 使腫瘤抑制基因失活時，細(xì)胞中控制生長的調(diào)控機制被打亂。已經(jīng)將成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤 抑制劑基因的功能突變和/或喪失與腫瘤形成相關(guān)聯(lián)。在一些情況下，腦瘤是從中樞神經(jīng)系 統(tǒng)(central nervous system，CNS)外部的原發(fā)性腫瘤向腦部的轉(zhuǎn)移瘤。由轉(zhuǎn)移瘤衍生的腦 瘤通常比腦部的原發(fā)性腦瘤更常見。轉(zhuǎn)移至腦的最常見原發(fā)性腫瘤是肺瘤、乳腺瘤、黑素瘤 和腎瘤。這些腦轉(zhuǎn)移瘤通常發(fā)生在多個部位，但也可能發(fā)生孤立性轉(zhuǎn)移瘤。
[0007] 由于常規(guī)治療通常失敗并且具有毒性，因此基因治療是用于腦瘤(包括膠質(zhì)瘤在 內(nèi)）的有前景的治療。另外，對導(dǎo)致惡性腫瘤之遺傳異常的鑒定提供了關(guān)鍵性的分子遺傳信 息從而有助于設(shè)計基因治療。腫瘤進(jìn)展中顯示的遺傳異常包括腫瘤抑制基因失活以及多種 生長因子和致癌基因（oncogene)過表達(dá)。腫瘤治療可通過提供編碼治療性多肽的多核苷酸 或者提供靶向腫瘤之突變及由此導(dǎo)致的異常生理狀況的其他治療劑來實現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞與正 常細(xì)胞的區(qū)別之處正是這些突變和異常生理狀況。腫瘤選擇性病毒將會是用于基因治療的 有前景的工具。已將病毒如何復(fù)制的知識的最新進(jìn)展應(yīng)用于設(shè)計腫瘤選擇性溶瘤病毒。在 膠質(zhì)瘤中，已表明有三類病毒可用于動物模型:可選擇性地在ras途徑激活的腫瘤中進(jìn)行復(fù) 制的呼腸孤病毒(Coffey等，1998);經(jīng)遺傳改變的單純皰疹病毒(Martuza等，1991 ;Mineta 等，1995;Andreanski等，1997)，其包括可通過正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的差別表達(dá)激活 的那些(Chase等，1998);以及不能表達(dá)ElB55kDa蛋白并用于治療p53-突變腫瘤的突變腺病 毒（13丨8〇11〇;1^等，1996;!16丨86等，1997;?代5^38等，1998;1(;[1'11等，1998)?？偠灾@些報道 確認(rèn)了溶瘤病毒作為抗癌劑的相關(guān)性。在全部三種系統(tǒng)中，目標(biāo)均是病毒的瘤內(nèi)擴散和選 擇性地殺滅癌細(xì)胞的能力。在關(guān)鍵點處靶向細(xì)胞途徑的經(jīng)遺傳修飾腺病毒在膠質(zhì)瘤中同時 具有強力和選擇性的抗癌作用。
[0008] 由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤中存在Pl6/Rb/E2F途徑的異常，因此已注意到對Rb途徑的靶向 與膠質(zhì)瘤治療的相關(guān)性(Fueyo等，1998a;Gomez_Manzano等，1998)。通過轉(zhuǎn)移pl6和Rb基因 替代喪失的腫瘤抑制活性來革E向該途徑已產(chǎn)生了細(xì)胞抑制效應(yīng)(Fueyo等，1998a; Gomez- Manzano等，1998)。由于外源野生型E2F-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且抑制體內(nèi)腫瘤生長，因此E2F-1 的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了強效的抗癌作用(Fueyo等，1998b)。然而，用現(xiàn)有的腺病毒構(gòu)建體治療人膠質(zhì) 瘤實際上并不能影響腫瘤的顯著部分，這主要是因為復(fù)制缺陷型腺病毒載體不能夠復(fù)制并 感染其它細(xì)胞，從而不能將外源核酸轉(zhuǎn)移至足夠數(shù)量的癌細(xì)胞(Puumalainen等，1998)。盡 管對pl6/Rb/E2F途徑的靶向產(chǎn)生了體內(nèi)抗癌作用，但是載體系統(tǒng)的這一缺陷限制了所述基 因的體內(nèi)治療效果。
[0009] 仍然需要用于癌癥(特別是腦瘤)的另外治療，其包括構(gòu)建能夠進(jìn)行細(xì)胞特異性復(fù) 制的另外的溶瘤病毒。另外的治療包括具有治療能力或者能夠被體內(nèi)追蹤的腺病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于在人患者中治療膠質(zhì)瘤的方法，其包括a)鑒定患有 膠質(zhì)瘤的患者;和b)使膠質(zhì)瘤與溶瘤腺病毒接觸，所述溶瘤腺病毒具有不能結(jié)合Rb的E1A多 肽并且包含在H1結(jié)構(gòu)域中插入有RGD氨基酸的纖維蛋白，其中治療引起以下中的一項或更 多項：i)腫瘤負(fù)荷降低大于25% ;ii)六個月的無進(jìn)展存活;和iii)腫瘤壞死，并且所述治療 不產(chǎn)生由所述溶瘤腺病毒引起的足以導(dǎo)致所述治療終止的不良事件。觀察到i)至iii)中的 2項或更多項，或者觀察到i)至iii)中的全部三項。所述對象還可表現(xiàn)出針對所述膠質(zhì)瘤的 自身免疫應(yīng)答。腫瘤響應(yīng)可包括如通過對比MRI所確定的更小的明確腫瘤邊界（defined tumor border)。
[0011] 所述溶瘤腺病毒可以是△ 24腺病毒。步驟a)可包括腫瘤成像，并且所述方法還可 包括在步驟a)之后且在步驟b)之前獲得所述腫瘤的活組織檢查。所述膠質(zhì)瘤可以是星形細(xì) 胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、間變性膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、腦脊膜瘤、松果體區(qū)腫瘤、脈絡(luò) 叢腫瘤、神經(jīng)上皮瘤、胚胎性腫瘤、外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤、腦神經(jīng)腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤、生 殖細(xì)胞瘤或鞍區(qū)腫瘤。所述膠質(zhì)瘤可以是復(fù)發(fā)性的，和/或一種或更多種首次膠質(zhì)瘤治療已 對所述膠質(zhì)瘤失效。
[0012] 所述膠質(zhì)瘤可以是可切除的或不可切除的?？稍谒鲋委熤笄谐z質(zhì)瘤?？捎?所述溶瘤腺病毒處理切除后的瘤床(tumor bed)?？赏ㄟ^將腺病毒顱內(nèi)遞送到患者中來使 膠質(zhì)瘤與腺病毒接觸。所述遞送可包括瘤內(nèi)注射，可包括多次注射，例如將切除后的導(dǎo)管植 入所述患者中并經(jīng)所述導(dǎo)管遞送所述溶瘤腺病毒?？赏ㄟ^用針在最短10分鐘的時間段內(nèi)緩 慢輸注來施用所述溶瘤腺病毒?？闪Ⅲw定向地將溶瘤腺病毒施用到所述患者膠質(zhì)瘤中的多 于一個部位。劑量可以是向患者施用約1〇 3至約1〇15病毒顆粒，約1〇5至約1〇12病毒顆粒，或者 向患者施用約1〇 7至約1〇1()病毒顆粒。所述治療可包括以1 X 1〇7、3 X 107、1 X 108、3 X 108、1 X 109、3 X 109、1 X 101Q和3 X 101Q病毒顆粒給藥，包括劑量遞增。
[0013] 所述方法還可包括向患者施用第二治療，其中所述第二治療是抗血管生成治療、 化學(xué)治療、免疫治療、外科手術(shù)、放射治療、免疫抑制劑或使用治療性多核苷酸的基因治療。 可在施用包含溶瘤腺病毒的組合物之前向患者施用第二治療，在施用包含溶瘤腺病毒的組 合物的同時向患者施用第二治療，或者在施用包含溶瘤腺病毒的組合物之后向患者施用第 二治療。所述化學(xué)治療可包括烷化劑、有絲分裂抑制劑、抗生素或抗代謝物。所述第二治療 可特別地包括放射治療和替莫唑胺。
[0014] 可基于Thl應(yīng)答的存在進(jìn)一步選擇對象。所述Thl應(yīng)答可以抗原特異性干擾素 -γ (IFN- γ )、IL_12和補體固定抗體(complement-fixing antibody)的增加為特征。
[0015] 在另一個實施方案中，提供了用于在人患者群體中治療膠質(zhì)瘤的方法，其包括a) 鑒定患有膠質(zhì)瘤的患者;和b)使膠質(zhì)瘤與溶瘤腺病毒接觸，所述溶瘤腺病毒具有不能結(jié)合 Rb的E1A多肽并且包含在H1結(jié)構(gòu)域中插入有R⑶氨基酸的纖維蛋白，其中所述群體的治療引 起以下中的一項或更多項：i)30%的所述患者具有臨床益處，其中臨床益處定義為完全響 應(yīng)者+部分響應(yīng)者加疾病穩(wěn)定；ii )25%的六個月無進(jìn)展存活;和iii)響應(yīng)者具有12個月的 中值存活，其中所述響應(yīng)者定義為完全響應(yīng)者+部分響應(yīng)者。
[0016] 所述溶瘤腺病毒可以是△ 24腺病毒。步驟a)可包括腫瘤成像，并且所述方法還可 包括在步驟a)之后且在步驟b)之前獲得所述腫瘤的活組織檢查。所述膠質(zhì)瘤可以是星形細(xì) 胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、間變性膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、腦脊膜瘤、松果體區(qū)腫瘤、脈絡(luò) 叢腫瘤、神經(jīng)上皮瘤、胚胎性腫瘤、外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤、腦神經(jīng)腫瘤、造血系統(tǒng)腫瘤、生 殖細(xì)胞瘤或鞍區(qū)腫瘤。所述膠質(zhì)瘤可以是復(fù)發(fā)性的，和/或者一種或更多種首次膠質(zhì)瘤治療 已對所述膠質(zhì)瘤失效。
[0017] 所述膠質(zhì)瘤可以是可切除的或不可切除的?？稍谒鲋委熤笄谐z質(zhì)瘤?？捎?所述溶瘤腺病毒處理切除后的瘤床?？赏ㄟ^將腺病毒顱內(nèi)遞送到患者中來使膠質(zhì)瘤與腺病 毒接觸。所述遞送可包括瘤內(nèi)注射，可包括多次注射，例如將切除后的導(dǎo)管植入所述患者中 并經(jīng)所述導(dǎo)管遞送所述溶瘤腺病毒?？赏ㄟ^用針在最短10分鐘的時間段內(nèi)緩慢輸注來施用 所述溶瘤腺病毒?？蓪⑷芰鱿俨《玖Ⅲw定向地施用到所述患者膠質(zhì)瘤中的多于一個部位。 劑量可以是向患者施用約1〇 3至約1〇15病毒顆粒、約1〇5至約1〇12病毒顆粒，或者向患者施用 約10 7至約101()病毒顆粒。
[0018] 所述方法還可包括向患者施用第二治療，其中所述第二治療是抗血管生成治療、 化學(xué)治療、免疫治療、外科手術(shù)、放射治療、免疫抑制劑或使用治療性多核苷酸的基因治療。 可在施用包含溶瘤腺病毒的組合物之前向患者施用第二治療，在施用包含溶瘤腺病毒的組 合物的同時向患者施用第二治療，或者在施用包含溶瘤腺病毒的組合物之后向患者施用第 二治療。所述化學(xué)治療可包括烷化劑、有絲分裂抑制劑、抗生素或抗代謝物。
[0019] 可基于Thl應(yīng)答的存在進(jìn)一步選擇對象。所述Thl應(yīng)答可以抗原特異性干擾素 -γ (IFN-γ )、IL-12和補體固定抗體的增加為特征。
[0020] 對于本文中所述的任何其它方法和組合物，可采用在本發(fā)明方法和/或組合物的 背景下所討論的實施方案。因此，涉及一種方法的實施方案也可應(yīng)用于本發(fā)明的其它方法。
[0021] 術(shù)語"約"指測定病毒、蛋白質(zhì)或其它量和測量值的不精確性，并且旨在包括由任 何具體測定、測量或量化誤差的至少一個標(biāo)準(zhǔn)差。
[0022] 本文說明書中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞可意指一個/種或超過一個/種。如本 文權(quán)利要求中所使用的，當(dāng)與詞語"包含/包括"聯(lián)合使用時，沒有數(shù)量詞修飾的名詞可意指 一個/種或超過一個/種。
[0023]本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢將由以下詳細(xì)描述而變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理 解，詳細(xì)描述和具體實施例盡管指示出本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案但是僅以舉例說明的方 式提供，因為根據(jù)該詳細(xì)說明，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾對本領(lǐng)域技術(shù) 人員而言將是顯而易見的。
[0024]附圖簡要說明
[0025] 以下附圖形成本說明書的一部分，并包括在本說明書中以進(jìn)一步證明本發(fā)明的某 些方面。通過參照這些附圖中的一個或更多個并結(jié)合本文所示的對具體實施方案的詳細(xì)描 述，將更好地理解本發(fā)明：
[0026] 圖1A至1D.軸向?qū)Ρ葓D像:在外科手術(shù)、放射治療、替莫唑胺和一個周期的達(dá)沙替 尼已失敗的第一次復(fù)發(fā)后，用DNX-2401治療對象。目前，在對DNX-2401治療完全響應(yīng)情況 下，治療后32個月無疾病的跡象(根據(jù)McDonald標(biāo)準(zhǔn)）。（圖1A)治療前，（圖1B)2個月，（圖1C) 8個月，（圖2D)23個月。箭頭:腫瘤。在圖1B中觀察到明顯進(jìn)展，其由炎癥而非腫瘤生長引起。 腫瘤繼續(xù)作出響應(yīng)(圖1C)，變得越來越小并且呈纖絲狀。在圖1D中觀察到不存在腫瘤。在腦 溝之下的小增強區(qū)為囊腫(箭頭）。
[0027]圖2.軸向?qū)Ρ葓D像:在之前的外科手術(shù)、放射治療、替莫唑胺和貝伐單抗已失敗的 第三次復(fù)發(fā)后用DNX-2401治療對象。在Δ-24-R⑶治療后2個月觀察到小葉外觀的腫瘤(左 圖），其繼續(xù)存在直至在6個月時顯示崩解（"肥皂泡"右圖）。在6個月時切除腫瘤并進(jìn)行分 析。獨立的病理學(xué)報道聲明，腫瘤大部分壞死，剩余部分被T細(xì)胞占優(yōu)勢的免疫細(xì)胞浸潤(左 偵U: 2個月；右側(cè):6個月）。
[0028] 圖3.冠狀對比圖像(右）：在A組實驗中，在之前的外科手術(shù)、放射治療和替莫唑胺 已失敗的第一次復(fù)發(fā)時用DNX-2401治療對象。左圖：DNX-2401治療后1個月；右圖：DNX-2401 治療后10個月。在10個月時腫瘤體積減小82 %。
[0029] 圖4.軸向?qū)Ρ葓D像(右）：在A組實驗中，在之前的外科手術(shù)、放射治療和替莫唑胺 已失敗的第一次復(fù)發(fā)時用DNX-2401治療對象。
[0030] 圖5.T2/FLAIR圖像:在A組實驗中，在之前的外科手術(shù)、放射治療和替莫唑胺已失 敗的第一次復(fù)發(fā)后用DNX-2401治療對象。圖像證明顯著的改善，其中FLAIR信號幾乎完全消 退。
[0031] 圖6.由1期B組患者切除的貫穿人腫瘤的切片。截止DNX-2401治療后2周，對Ad六鄰 體蛋白染色顯示出病毒擴散和抗膠質(zhì)瘤作用的明顯跡象。A，病毒引起的壞死;B，受感染的 腫瘤細(xì)胞;C，未受感染的腫瘤細(xì)胞。
[0032] 圖7.由1期B組患者切除的貫穿人腫瘤的切片。如所示針對T細(xì)胞的存在進(jìn)行染色。 觀察到主要是⑶8T細(xì)胞的浸潤。H&E，蘇木精/曙紅;CD3，正常存在于靜息和活性T淋巴細(xì)胞 中的T細(xì)胞特異性標(biāo)志物;CD4，輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞淋巴中表達(dá)的T細(xì)胞標(biāo)志物;CD8，通常 存在于細(xì)胞毒/抑制性T細(xì)胞亞群上的T細(xì)胞標(biāo)志物。
[0033]圖8.1期臨床試驗設(shè)計。
[0034]圖9.臨床劑量研究遞增計劃。
[0035] 圖10.響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實施方式】
[0036] 對常規(guī)治療有固有抗性的惡性腫瘤是重大的治療挑戰(zhàn)。此類惡性腫瘤包括但不限 于惡性膠質(zhì)瘤，其為最廣泛的原發(fā)性腦瘤，年發(fā)病率為每100，〇〇〇人6.4例(CBTRUS，2002至 2003年）。這些破壞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤是原發(fā)性腦瘤的最常見亞型并且是最致命的人類癌癥 之一。在最具攻擊性的癌癥中（其表現(xiàn)為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞(glioblastoma multiforme， GBM))，盡管進(jìn)行了最大的治療努力，患者的中值存活持續(xù)時間仍為9至12個月（Hess等， 1999)。原型（prototypic)疾病惡性膠質(zhì)瘤對現(xiàn)有的治療方案有固有抗性（Shapiro和 Shapiro, 1998)。實際上，在約1/3的GBM患者中，盡管采用放射治療和化學(xué)治療，腫瘤仍持續(xù) 生長。即使在積極(aggressive)治療(包括外科手術(shù)、放射和化學(xué)治療)的情況下，中值存活 仍不到1年（Schiffer，1998)。由于幾乎沒有好的治療選擇可供許多這樣的頑固性腫瘤使 用，因此對新型創(chuàng)新性治療方法的探索是必不可少的。
[0037] 改善治療的一種潛在方法基于以下觀點:可將天然存在的病毒改造成在腫瘤細(xì)胞 中產(chǎn)生溶瘤作用（Wildner，2001;Jacotat，1967;Kirn，2001; Geoerger等，2002 ; Yan 等， 2003;Vile等，2002;其分別通過引用并入本文）。在腺病毒的情況下，其腺病毒基因組中的 特定缺失可減弱其在正常靜止期細(xì)胞中復(fù)制的能力，同時其保留在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的 能力。Fueyo等（