7章， 第77-88頁(yè)中）。
[0046] 如本文所使用的，"肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子"是指內(nèi)源地存在于哺乳動(dòng)物，例如人 中的肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子、等位基因肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子的 功能保守衍生物、具有功能活性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子片段和肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子同源 物，諸如肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子。HB-EGF還涉及例如提供增強(qiáng)的活性、提高的穩(wěn)定 性、更高的產(chǎn)量或更好溶解度的HB-EGF的變體形式。用于本發(fā)明的方法的組合物可包含一 種HB-EGF活性或HB-EGF活性的混合物，例如包含多種不同的HB-EGF分子。通常地，如本文中 所使用，HB = -EGF的活性是指對(duì)同源受體的結(jié)合、受體的激活、作為受體結(jié)合和激活的結(jié)果 發(fā)生的生物活性等。
[0047] HB-EGF是皮膚傷口愈合所需的上皮形成中的主要生長(zhǎng)因子。HB-EGF對(duì)角質(zhì)形成細(xì) 胞和成纖維細(xì)胞的促有絲分裂和迀移作用促進(jìn)對(duì)于傷口愈合是必需的皮膚修復(fù)和血管生 成，并且是傷口液體的主要成分。針對(duì)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的HB-EGF細(xì)胞表面結(jié)合增強(qiáng) 增加皮膚傷口愈合的速度，減少人皮膚移植愈合時(shí)間的促細(xì)胞分裂原促進(jìn)能力，并促進(jìn)潰 瘍、燒傷和表皮裂開厚度傷口的快速愈合。
[0048]將HB-EGF合成為膜錨定促有絲分裂和趨化糖蛋白。HB-EGF是展示受高度調(diào)控的基 因表達(dá)的87個(gè)氨基酸的糖蛋白。胞外結(jié)構(gòu)域脫落導(dǎo)致兒童HB-EGF的可溶性成熟形式，其影 響用于平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的促有絲分裂因子和趨化因子。HB-EGF的跨膜形式是白喉 毒素的唯一受體并且在細(xì)胞的鄰分泌信號(hào)傳導(dǎo)中起作用。HB-EGF的兩種形式都參與正常的 生理過程和病理過程，包括腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移、器官增生和動(dòng)脈粥樣硬化疾病。為了本發(fā)明的 目的，通過使用蛋白的可溶性成熟形式。蛋白或試劑可以是基本上純的，例如不含其它蛋白 質(zhì)，不含細(xì)胞物質(zhì)等，通常具有至少約50%的純度，至少約75%的純度，至少約80 %的純度， 至少約90 %的純度，至少約95 %的純度，至少約99 %的純度。
[0049]在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用基本上純的人HB-EGF制劑?？梢砸约兊男问劫?gòu)買HB-EGF， 或其通過從人或其它動(dòng)物純化組分，或通過在宿主細(xì)胞(包括原核宿主細(xì)胞諸如釀酒酵母 或大腸桿菌，以及更優(yōu)選，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞諸如CHO細(xì)胞）中重組產(chǎn)生來(lái)產(chǎn)生。HB-EGF可以 是野生型人、哺乳動(dòng)物同源物，或是經(jīng)修飾的/突變的。具體地，可使用保留至少一部分全長(zhǎng) 組分的所需活性的組分的片段。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，HB-EGF是人HB-EGF，并且包含基因庫(kù)登錄號(hào)： 1^17032.161348175或基因庫(kù)登錄號(hào)：1^17033.161 34817或基因庫(kù)登錄號(hào)：1^17032.161 348175的氨基酸序列，特別地包括其中描述的蛋白質(zhì)的可溶性成熟一些。
[0051] "功能保守變體"是其中給定的氨基酸殘基已被改變但不改變蛋白質(zhì)的總體構(gòu)象 和功能的蛋白質(zhì)，包括，但不限于，具有相似特性(諸如，例如，酸性、堿性、疏水性等)的氨基 酸對(duì)氨基酸的取代。具有相似性質(zhì)的氨基酸在本領(lǐng)域中是公知的。例如，精氨酸、組氨酸和 賴氨酸是親水堿性氨基酸并且是可互換的。類似地，異亮氨酸、疏水氨基酸可被亮氨酸、甲 硫氨酸或纈氨酸替換。除指定為保守的那些氨基酸外的氨基酸在蛋白質(zhì)或酶中可以不同， 以使得具有相似功能的任何兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的百分比蛋白質(zhì)或氨基酸序列相似性可變化， 并且可以是例如70%至99%，如根據(jù)比對(duì)方案，例如通過聚類方法測(cè)定的，其中相似性基于 MEGALIGN算法。"功能保守變體"還包括具有如通過20個(gè)BLAST或FASTA算法測(cè)定的至少60% 氨基酸同一性，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90 %，以及更優(yōu)選95%的 氨基酸同一性，并且具有與和其相比較的天然或親代蛋白質(zhì)或酶相同或大體上相似的性質(zhì) 或功能的多肽或酶。
[0052]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)HB-EGF可包括所提供的序列的變體、同源物和直向同源物。變 體可與天然序列大體上相似，即相異于至少一個(gè)氨基酸，以及可相異于至少兩個(gè)，但通常不 超過約10個(gè)氨基酸(相異的數(shù)目取決于天然序列的大?。?。序列變化可以是取代、插入或缺 失。系統(tǒng)地引入丙氨酸或其他殘基的掃描突變可用于確定被保持在變體序列中的關(guān)鍵氨基 酸?？捎糜谔峁┍景l(fā)明的變體序列的保守氨基酸取代通常包括以下組內(nèi)的取代：（甘氨酸、 丙氨酸）；（纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸）；（天冬氨酸、谷氨酸）；（天冬酰胺、谷氨酰胺）；（絲氨 酸、蘇氨酸）；（賴氨酸、精氨酸）；和(苯丙氨酸、酪氨酸）。
[0053]可以以本領(lǐng)域中已知的各種方式改變天然存在的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，以產(chǎn)生序 列的靶向變化，并從而提供本發(fā)明的變體序列。此類變體將通常是功能上保守的變體，其通 常在序列上與對(duì)應(yīng)的天然或親代蛋白質(zhì)相異，但仍然保留所需的生物活性和/或功能或顯 示增強(qiáng)的生物活性和/或功能。本領(lǐng)域中已知的各種方法可用于產(chǎn)生靶向變化，例如與隨機(jī) 和靶向突變組合的噬菌體展示、掃描突變的引入等，以及提供本發(fā)明的變體序列。包括的是 His或表位標(biāo)簽的添加（以幫助純化），如本文中所例舉的?？梢岳缤ㄟ^誘變、外顯子改組 等(如本領(lǐng)域中已知的），隨后通過篩選或選擇來(lái)進(jìn)一步修飾經(jīng)修飾以提供特定目標(biāo)特征的 酶，以最優(yōu)化或恢復(fù)酶的活性，例如恢復(fù)至野生型水平，從而提供本發(fā)明的其它變體序列。 [0054]術(shù)語(yǔ)"HB-EGF"還包括生物活性片段。目標(biāo)片段包括具有至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸， 更通常地至少約50個(gè)連續(xù)的氨基酸的片段，并且可包含100個(gè)或更多個(gè)氨基酸，達(dá)到完全蛋 白質(zhì)，并且可進(jìn)一步延伸以包含另外的序列。
[0055] 不改變一級(jí)序列但提供本發(fā)明的其它變體蛋白質(zhì)的對(duì)蛋白質(zhì)的目標(biāo)修飾包括蛋 白質(zhì)的化學(xué)衍生，包括例如，醜化(例如月桂基、硬脂基、肉?適基、癸基等基團(tuán)）、PEG化、醋 化或酰胺化。此類修飾可用于例如通過將PEG側(cè)鏈或月桂基基團(tuán)附接于表面賴氨酸來(lái)增加 酶對(duì)蛋白水解的抗性。還包括的是糖基化修飾，例如在其合成和加工過程中或在進(jìn)一步加 工步驟中通過修飾蛋白質(zhì)的糖基化模式產(chǎn)生的那些糖基化修飾;例如通過使蛋白質(zhì)暴露于 實(shí)現(xiàn)糖基化的酶，諸如哺乳動(dòng)物糖基化或去糖基化酶。還包括的是具有磷酸化氨基酸殘基， 例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的序列。
[0056] 在本發(fā)明的實(shí)踐中也是有用的和由本發(fā)明提供的是已使用分子生物學(xué)技術(shù)和/或 化學(xué)修飾以提高它們對(duì)蛋白水解降解、氧化等的抗性，和最優(yōu)化溶解性或使它們更適合作 為治療劑的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)的主鏈可被環(huán)化以增強(qiáng)穩(wěn)定性（參見Friedler等（2000) J. Biol. Chem. 275: 23783-23789)。此類蛋白質(zhì)的類似物包括含有除天然存在的L-氨基酸外 的殘基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的那些蛋白質(zhì)。
[0057] HB-EGF模擬物。目標(biāo)HB-EGF試劑還包括模擬物，例如小分子、蛋白質(zhì)、適體等，其提 供HB-EGF的生物活性。此類活性包括HB-EGF對(duì)細(xì)胞表面上的EGF受體和硫酸乙酰肝素蛋白 聚糖的結(jié)合。
[0058]原HB-EGF被合成為I型單次跨膜前體蛋白，隨后其經(jīng)歷廣泛的蛋白酶解加工，稱為 胞外結(jié)構(gòu)域脫落（參見，例如，Yan等J Cell Biol.2002;158(2) :221-6;Asakura等Nat Med.2002;8(1):35-40;Izumi等Embo J·1998;17(24):7260-72;Nakagawa等J Biol Chem. 1996;271(48):30858-63)。這釋放了HB-EGF的可溶性成熟一些。主要負(fù)責(zé)原HB-EGF的 胞外結(jié)構(gòu)域脫落的金屬蛋白酶(包括ADAM 9、10、12、17)調(diào)節(jié)成熟HB-EGF的結(jié)合以及調(diào)節(jié) EGFR 的激活（參見 Cisse 等 J Biol Chem.2005;280(49):40624-31;Peschon 等 Science·1998;282(5392):1281-4;Sahin和Blobel FEBS Lett.2007;581(1):41-4;Sahin 等J Cell Biol .2004; 164(5): 769-79) JB-EGF隨后通過EGFR依賴性機(jī)制和不依賴于EGFR 的機(jī)制起作用。HB-EGF含有據(jù)認(rèn)為是EGF家族成員鍵合和激活EGFR所需的EGF樣結(jié)構(gòu)域 (Thompson等J Biol Chem.l994;269(4):2541-9)〇
[0059]取決于細(xì)胞環(huán)境，EGF家族成員可誘導(dǎo)鄰分泌、自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)， 因?yàn)榭赏ㄟ^金屬蛋白酶從膜切割它們，以形成成熟的可溶性生長(zhǎng)因子（Singh和Harris， Cell SignalJOOS5IT(IO): 1183-93)。存在 4 個(gè)鑒定的 EGFR家族成員（HERl、HER2、HER3 和 HER4)。它們是具有單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相關(guān)的酪氨酸激酶 (Plowman等Proc Natl Acad Sci U S A.1993;90(5):1746-50;Taylor等Semin Cell Dev Biol. 2014) AGF家族的成員具有不同的對(duì)EGFR家族的結(jié)合活性。與EGF不同，HB-EGF結(jié)合 HERl和HER4,對(duì)于β動(dòng)物纖維素和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2亦如此。參見Higashiyama等 Science·1991;251(4996):936-9;Chang等Nature·1997;387(6632):509-12;Carraway等 Nature · 1997; 387(6632): 512-6; Shing等Science · 1993; 259(5101): 1604-7C3HB-EGF還減少 上皮標(biāo)志物諸如角蛋白1、5、10和14,然而增加細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性基因諸如SNA1、ZEB1、C0X_2和 MMPl(參見Stoll等J Invest Dermatol.2012;132(9):2148-57)〇
[0060] HB-EGF或提供HB-EGF活性的試劑的"有效量"或"治療有效量〃是當(dāng)在一段時(shí)間中 施用時(shí)增強(qiáng)慢性TM穿孔的愈合的那個(gè)劑量。
[0061 ] 制劑，即液體滴劑、持續(xù)釋放凝膠等可以以至少約lng/ml、至少約10ng/ml、至少約 100ng/ml、至少約 lμg/ml、至少約 10μg/ml、至少約 100μg/ml、至少約 200μg/ml、至少約 500μ g/ml、至少約750μg/ml、至少約lmg/ml、至少約5mg/ml、至少約10mg/ml、至少約50mg/ml、至 少約100mg/ml和達(dá)到約10mg/ml、高達(dá)約25mg/ml、高達(dá)約50mg/ml、高達(dá)約100mg/ml、高達(dá)約 500mg/ml的濃度包含HB-EGF或等同活性的提供HB-EGF活性的試劑?？梢砸员扔糜谥貜?fù)施用 的制劑尚的初始濃度提供用于持續(xù)釋放的制劑。
[0062] 制劑的體積通常為提供與鼓膜的有用接觸所需的體積，例如高達(dá)約5μ1、高達(dá)約10 μL、高達(dá)約25μ1、高達(dá)約35μ1、高達(dá)約50μ1、高達(dá)約75μ1、高達(dá)約100μΙ、高達(dá)約250μ1、高達(dá)約 375μ1、高達(dá)約500μ1。或者，可提供其中劑量為1滴、2滴、3滴的點(diǎn)滴器，其中，如在本領(lǐng)域中 是已知的，一滴為約50μ 1。體積。
[0063] 治療有效量在受試者中提供臨床上顯著的反應(yīng)，即，例如，促進(jìn)鼓膜穿孔愈合?；?者，治療有效量足以在宿主中促進(jìn)臨床上顯著的傷口愈合狀況。
[0064] 持續(xù)或處長(zhǎng)釋放制劑或裝置可被設(shè)計(jì)來(lái)具有適合用于起始劑量和所需局部濃度 的用于藥物釋放的tl/2，即一半活性試劑釋放的時(shí)間長(zhǎng)度，例如約24小時(shí)、約48小時(shí)、約3 天、約4天、約5天、約1周、約10天、約2周、約3周等的11/2。
[0065] 可以以適合用于有效劑量的維持的間隔，例如約每3小時(shí)、約每4小時(shí)、約每6小時(shí)、 約每12小時(shí)、約每18小時(shí)、約每24小時(shí)、約每48小時(shí)等，施用除持續(xù)或處長(zhǎng)釋放外的制劑，例 如液體滴耳劑等。
[0066]或者，HB-EGF或提供HB-EGF活性的試劑的有效量是導(dǎo)致相對(duì)于試劑不存在的情況 下的愈合更快的穿孔或傷口的愈合的量。有效量還可意指足以使HB-EGF的局部和/或全身 性水平升高例如約10%，優(yōu)選地約50%，更優(yōu)選地約100%的在施用活性劑或藥物之前發(fā)現(xiàn) 的水平的量或劑量。
[0067]根據(jù)個(gè)體的需要，用于與HB-EGF接觸的時(shí)間段可長(zhǎng)達(dá)1天、長(zhǎng)達(dá)2天、長(zhǎng)達(dá)3天、長(zhǎng)達(dá)