E5多膚的最終濃度為扣M，PEG-PE 的最終濃度為20咖，空白對照加入PBS溶液，AMD3100 (5咖)作為陽性對照組。下室(Corning 24孔板)加入800化含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)含有CX化12水溶液（lOOng/mL)誘導(dǎo)。培 養(yǎng)板在37°C、5 % C〇2條件的解箱中培養(yǎng)2地。取出轉(zhuǎn)移小皿，冰甲醇固定5min，驚干，用0.1 % 結(jié)晶紫溶液(純水配置)染色5min，再用PBS溶液洗兩次，之后，用棉棒將內(nèi)側(cè)的紫色結(jié)晶擦 去，各選擇5個(gè)無重疊區(qū)，用光學(xué)顯微鏡（X200)對小皿外側(cè)的結(jié)晶紫計(jì)數(shù)，進(jìn)而推算轉(zhuǎn)移細(xì) 胞的數(shù)目（第一種檢測方法）。染色拍照完成后用33%醋酸(0.1 mL/孔)脫色lOmin，將結(jié)晶紫 完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)(第二種檢測方法）。
[0184] 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)20咖的陽G-陽解育的MCF-7細(xì)胞與空白對照的遷移率相比沒有顯 著性差異。如圖8a、8b所示（圖中Control、AMD3100、E5、E5+PEG-PE分別是指PBS對照組、 CXCR4小分子括抗劑、E5多膚、E5-陽G-陽納米膠束），在加入了扣M AMD3100與細(xì)胞解育后， 通過計(jì)算下室中細(xì)胞數(shù)量得MCF-7細(xì)胞的遷移能力被降低了約50%;在加入了E5多膚或E5-陽G-陽納米膠束(實(shí)施例4的樣品，其中E5多膚濃度為扣M，PEG-陽膠束濃度為20咖)與細(xì)胞 解育后，通過計(jì)算下室中細(xì)胞數(shù)量得MCF-7細(xì)胞的遷移能力被依次降低了約75%或98%，即 E5-PEG-PE納米膠束(實(shí)施例4的樣品）可W更有效地抑制MCF-7細(xì)胞被趨化因子CX化12誘導(dǎo) 的遷移作用。
[01化]實(shí)驗(yàn)例7 E5多膚和ES-PEG-TO納米膠束對CX化12誘導(dǎo)化pG2細(xì)胞體外遷移的抑制 作用；
[0186]收獲對數(shù)生長期的化pG2細(xì)胞，用含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將30化L含 有IX IO6個(gè)細(xì)胞的懸液，W及E5多膚或ES-PEG-TO納米膠束的PBS溶液(實(shí)施例4的樣品）加 入transwel I小室（直徑為如m的PET微孔濾膜）的上室，使E5多膚的最終濃度為扣M，PEG-PE 的最終濃度為20咖，空白對照加入PBS溶液，AMD3100 (5咖)作為陽性對照組。下室(Corning 24孔板)加入800化含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)含有CX化12水溶液（lOOng/mL)誘導(dǎo)。培 養(yǎng)板在37°C、5 % C〇2條件的解箱中培養(yǎng)2地。取出轉(zhuǎn)移小皿，冰甲醇固定5min，驚干，用0.1 % 結(jié)晶紫溶液(純水配置)染色5min，再用PBS溶液洗兩次，之后，用棉棒將內(nèi)側(cè)的紫色結(jié)晶擦 去，各選擇5個(gè)無重疊區(qū)，用光學(xué)顯微鏡（X200)對小皿外側(cè)的結(jié)晶紫計(jì)數(shù)，進(jìn)而推算轉(zhuǎn)移細(xì) 胞的數(shù)目（第一種檢測方法）。染色拍照完成后用33%醋酸(0.1 mL/孔)脫色lOmin，將結(jié)晶紫 完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)(第二種檢測方法）。
[0187] 預(yù)實(shí)驗(yàn)中，加入了陽G-陽膠束的化pG2細(xì)胞與空白對照的遷移率相比沒有顯 著性差異。如圖9a、9b所示（圖中Control、AMD3100、E5、E5+PEG-PE分別是指PBS對照組、 CXCR4小分子括抗劑、E5多膚、E5-陽G-陽納米膠束），在加入了扣M AMD3100與細(xì)胞解育后， 通過計(jì)算下室中細(xì)胞數(shù)量得化pG2細(xì)胞的遷移能力被降低了約60%;在加入了 E5多膚或E5-陽G-陽納米膠束(實(shí)施例4的樣品，其中E5多膚濃度為扣M，PEG-陽膠束濃度為20咖)與細(xì)胞 解育后，通過計(jì)算下室中細(xì)胞數(shù)量得化pG2細(xì)胞的遷移能力被依次降低了約75%或95%，即 E5-PEG-PE納米膠束(實(shí)施例4的樣品）可W更有效地抑制化pG2細(xì)胞被趨化因子CX化12誘導(dǎo) 的遷移作用。
[0188] 其他實(shí)施例多膚納米膠束巧5-陽G-陽納米膠束或FITC-E5-PEG-陽納米膠束)與W 上實(shí)驗(yàn)例1-7記載的ES-PEG-TO納米膠束或FITC-E5-PEG-PE納米膠束的效果相當(dāng)。限于篇 幅，本文僅例舉部分最具說服力的試驗(yàn)例。
[0189] 實(shí)施例18 E5-PEG-陽納米膠束及FITC-E5-PEG-陽納米膠束的制備
[0190] 分別將E5多膚分子和FITC標(biāo)記的E5多膚分子用無菌超純水配制成Img/血溶液，將 陽G-陽分子用無菌超純水配制成lOmg/mL溶液，取一定量的PEG-PE(其聚乙二醇親水嵌段的 分子量為2000)水溶液分別加入E5多膚水溶液和FITC標(biāo)記的E5多膚水溶液中，使溶液中 陽G-陽分子與E5多膚或FITC-E5多膚分子的摩爾比為20:1~4:1，在溶液充分混勻后，加入 1/9溶液體積的10 X PBS溶液，37°C水浴解育60min，隨后室溫靜置12h，獲得E5-陽G-陽納米 膠束的1 XPBS溶液及FITC-E5-PEG-陽納米膠束的1 XPBS溶液。
[0191] 實(shí)施例19 E5-PEG-PE-DOX聯(lián)合載藥膠束的制備
[0192] 將藥物阿霉素(Dox)用無菌超純水配制成2mg/mL溶液。分別取上述實(shí)施例18制備 的ES-PEG-TO納米膠束，在室溫下加入一定量的藥物阿霉素(Dox)溶液，使得PEG-PE、E5和 Dox的摩爾比為20~100:0.1~100:0.1~100,60°(3水浴解育10111111，隨后室溫靜置2地，形成 聯(lián)合的載藥膠束化5-陽G-陽-Dox聯(lián)合載藥納米膠束或FITC-E5-陽G-PE-Dox聯(lián)合載藥納米 膠束），如圖16所示。
[0193] 下表列出幾種PEG-PE、E5和Dox的具體摩爾比：
[0194]
[0196] 對比例I PEG-PE-Dox納米膠束的制備
[0197] 將藥物阿霉素(Dox)用無菌超純水配制成2mg/mL溶液，將陽G-PE用無菌超純水配 制成lOmg/mL溶液，取一定量的PEG-陽水溶液加入到Dox水溶液中，在溶液充分混勻后，加入 1/9溶液體積的10 X PBS溶液，使之稀釋為陽G-陽-Dox納米膠束的1 X PBS溶液，使混合溶液 中PEG-PE分子與Dox分子的摩爾比范圍為20:0.1~8;解育：將所得混合溶液于40°C水浴解 育30min;靜置:室溫(25°C)靜置12小時(shí)，得到PEG-PE-Dox納米膠束溶液。
[0198] 對比例2 AMD3100-DOX的制備
[0199] 將AMD3100分子用無菌超純水配制成Img/mL溶液，將藥物阿霉素(Dox)用無菌超純 水配制成2mg/mL溶液，取一定量的AMD3100分子水溶液加入到Dox水溶液中，在溶液充分混 勻后，加入1/9溶液體積的10 X PBS溶液，使之稀釋為AMD3IOO-Dox的1 X PBS溶液，使混合溶 液中AMD3100分子與Dox分子的摩爾比為5:0.1~2;解育：將所得混合溶液于40°C水浴解育 SOmin;靜置:室溫(25°C)靜置12小時(shí)，得到AMD3100-DOX溶液。
[0200] 對比例3 E5-D0X的制備
[0201] 將E5多膚分子用無菌超純水配制成Img/mL溶液，將藥物阿霉素(Dox)用無菌超純 水配制成2mg/mL溶液，取一定量的E5多膚分子水溶液加入到Dox水溶液中，在溶液充分混勻 后，加入1/9溶液體積的10 X PBS溶液，使之稀釋為E5-D0X的1 X PBS溶液，使混合溶液中E5分 子與Dox分子的摩爾比為5:0.1~2;解育：將所得混合溶液于40°C水浴解育30min;靜置:室 溫(25°C)靜置12小時(shí)，得到E5-D0X溶液。
[0202] 實(shí)驗(yàn)例8 E5-PEG-PE-D0X聯(lián)合載藥膠束的表征
[0203] E5多膚分子水溶液的濃度為25咖，PEG-TO膠束水溶液的濃度為500咖，Dox水溶液 的濃度為1化M，使得PEG-陽、E5多膚和Dox的摩爾比為20 :1:0.4(實(shí)施例19中的19-E1的樣 品），45°C水浴解育30min，隨后室溫靜置化，形成聯(lián)合的載藥膠束化5-PEG-PE-Dox納米膠 束）。將E5-PEG-陽-Dox納米膠束的PBS溶液搖勻后，取10化樣品滴在經(jīng)輝光放電處理后表面 活化的鍛碳膜銅網(wǎng)上，靜置5min，濾紙吸干溶液，取化L 2%醋酸雙氧軸染色60s，濾紙吸干 染色液，用透射電子顯微鏡（transmission electron mic;roscopy，TEM，HT7700,日立公司） 觀察樣品形貌特征。透射電鏡反映了樣品的形貌和粒徑大小，如圖IOa所示，PEG-PE空膠束 在PBS溶液中是W球形結(jié)構(gòu)存在，粒徑分布較均一；如圖IOb所示，在E5-PEG-PE-DOX納米膠 束的PBS溶液中，當(dāng)PEG-陽膠束載入E5多膚和Dox分子后，E5-PEG-PE-DOX納米膠束仍保持球 形結(jié)構(gòu)，粒徑大小無明顯變化。
[0204] E5多膚分子水溶液的濃度為25iiM，PEG-ro膠束水溶液的濃度為IOOiiM, Dox水溶液 的濃度為扣M，使得陽G-陽、E5多膚和Dox的摩爾比為20:5:1(實(shí)施例19中的19-A3的樣品）， 55°C水浴解育20min，隨后室溫靜置8h，形成聯(lián)合的載藥膠束巧5-PEG-PE-Dox納米膠束）。將 E5-PEG-PE-Dox納米膠束的PBS溶液搖勻后取lmL置于lcmXlcm塑料樣品池內(nèi)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)光 散射(DLSJetasizer化no ZS，Malve;rn，英國）測試。動(dòng)態(tài)光散射反映了溶液中分子的粒徑 變化，預(yù)實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)，PEG-PE空膠束在PBS溶液中的粒徑為10~30nm;E5多膚在PBS溶液 中是不溶的，有肉眼可見的白色片狀物出現(xiàn)，其粒徑均在300皿W上;E5-PEG-陽納米膠束在 PBS溶液中得到了很好的分散，其粒徑為10~30皿。如圖11所示，E5-陽G-陽-Dox納米膠束的 PBS溶液中的粒徑也分布在10~30皿之間，與陽G-陽空膠束和E5-PEG-陽納米膠束在粒徑分 布上基本相同，說明E5多膚分子、Dox和陽G-陽分子發(fā)生了物理結(jié)合，PEG-陽能夠同時(shí)包載 E5多膚分子和Dox分子。
[0205] 實(shí)驗(yàn)例9游離藥物、單一膠束和聯(lián)合膠束對MCF-7腫瘤細(xì)胞的生長抑制情況
[0206] 將MCF-7細(xì)胞Wo. 25 %膜蛋白酶消化，每孔5 X IO3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)24h;然后棄去培養(yǎng)液，加入一定濃度的阿霉素溶液(Dox)、PEG-PE-Dox (對比例1的樣品）、AMDS 1 OO-Dox(對比例2的樣品）、E5-DOX(對比例3的樣品）和E5-PEG-PE-Dox溶液(實(shí)施例19的樣品，如圖其中PEG-PE、E5和Dox摩爾比），不同藥物組合溶液預(yù)先在55 °(3水浴解育20min，隨后室溫靜置化，繼續(xù)解育48h，加入Cel ITiter %及AQueous One Solution Reagent(Promega公司，20化/孔），在37°C，5%C02的環(huán)境下解育2小時(shí)；讀取 490nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。固定AMD310(K5山〇、E5多膚巧iiM)和陽G-陽膠束（2化 M)的濃度，改變Dox的濃度(0~化M)，如圖1站所示，聯(lián)合載藥膠束E5-PEG-陽-Dox(實(shí)施例19 的樣品）顯著優(yōu)于其它組。如圖12b所示，固定Dox和E5的濃度，MCF-7細(xì)胞的生長抑制率隨著 PEG-PE膠束的濃度增加而增加。如圖12c所示，固定Dox和PEG-PE膠束的濃度，MCF-7細(xì)胞的 生長抑制率隨著E5多膚的濃度增加而增加，在15iiM濃度下達(dá)到最大值。
[0207] 如圖12a所示，實(shí)施例19的樣品分別為19A1-A5;
[0208] 如圖12b所示，實(shí)施例19的樣品分別為19B1-B7;
[0209] 如圖12c所示，實(shí)施例19的樣品分別為19C1-C7。
[0210] 實(shí)驗(yàn)例10游離藥物、單一膠束和聯(lián)合膠束對化pG2腫瘤細(xì)胞的生長抑制情況
[0211] 將化pG2細(xì)胞Wo. 25 %膜蛋白酶消化，每孔5 X IO3細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，37°C， 5%C02條件下培養(yǎng)24h;然后棄去培養(yǎng)液，加