專利名稱：一種β-環(huán)糊精配基瓊脂糖氫鍵吸附純化縮宮素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化學合成多肽藥物一縮宮素的氫鍵吸附色譜分離純化方法，具體的是采用表面鍵合了 β-環(huán)糊精配基的瓊脂糖凝膠介質，利用氫鍵吸附色譜原理分離純化化學合成縮宮素。
背景技術：
自然界存在著數(shù)量龐大、種類繁多的生物活性肽，涉及各種毒素、激素、抗菌肽、信息素、細胞因子等，在各種生命活動中起著重要的調節(jié)作用，廣泛參與分子識別、信號轉導、 酶活調節(jié)、免疫調節(jié)、細胞分化及個體發(fā)育調控等過程。自從上世紀初多肽人工合成技術發(fā)明以來，已經(jīng)有幾十種人工合成多肽藥物上市，并被廣大患者采用。隨著近年來頻頻爆發(fā)食品、藥品安全問題，以及人們對藥品質量和使用安全性意識的提高，多肽藥物生產(chǎn)的純度標準與質量控制又重新受到各有關方面的重視?？s宮素(oxytocin，0T)于1895年被發(fā)現(xiàn)，結構如圖1所示，是具有一個二硫鍵的九肽酰胺，又名催產(chǎn)素，是一種哺乳動物激素，主要由下丘腦視上核和室旁核的神經(jīng)分泌大細胞系統(tǒng)分泌產(chǎn)生，從垂體后葉釋放入血液，沿血液循環(huán)到達遠端的器官發(fā)揮作用，在臨床上被廣泛用于引產(chǎn)、催產(chǎn)及預防因分娩后子宮乏力引起的大出血，是目前美國FDA唯一認可用于臨床引產(chǎn)的藥物。其分子量1007. 2Da，分子式C43H66N12O12S2,等電點7. 7，易溶于水， 溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品穩(wěn)定，PH3. 8 4. 4的酸性溶液中較穩(wěn)定，堿性溶液中不穩(wěn)定。早年藥用縮宮素的生產(chǎn)采用從動物垂體后葉組織中提取的方式，存在病毒滅活、除過敏原、除熱原等安全性問題，且提取物中存在難分離結構近似物，即后葉加壓素。我國自1969年第一次合成縮宮素以來，國內30余家縮宮素制劑生產(chǎn)廠家均采用九肽酰胺經(jīng)鈉-液氨法消除、縮合的辦法合成縮宮素，最終產(chǎn)品的純化過程較復雜，產(chǎn)品純度低、收率低，這也是導致臨床出現(xiàn)部分不良反應的因素之一?；瘜W合成縮宮素粗品中的主要雜質，是一些與目標多肽結構類似的雜肽，例如氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構體、部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽，以及氧化不徹底產(chǎn)生的還原態(tài)開環(huán)肽等。人工合成多肽藥物的傳統(tǒng)純化方法是多步反相色譜純化，反相色譜法是目前分辨率最高的多肽純化方法，可以精確分辨一個氨基酸殘基的差異，因此除了作為純化方法外， 還經(jīng)常被用作最終的純度驗證步驟。盡管已有商品化的制備級反相色譜柱，但將反相色譜技術應用于多肽藥物的規(guī)?；a(chǎn)還有不足第一，反相高效液相色譜的樣品載量較低，尤其是對雜質較多的粗品，過量粗制樣品會造成色譜柱的不可逆塌陷；第二，介質品種有限， 不易放大；第三，介質的重復使用次數(shù)有限，對樣品的預處理要求較高；第四，常規(guī)硅膠基質鍵合烷基配基，這樣的色譜分離介質，用作臨床用藥的生產(chǎn)，其生物相容性與生物安全性沒有葡聚糖、瓊脂糖類的介質高。瓊脂糖凝膠介質是天然多糖類色譜介質，發(fā)明于20世紀60年代，具有理想介質的許多特性高孔度(90-96% )，即使在高濃度下也能保持高的孔度；具有連接纖維的開放的結構；高的連通性有效保證了分子內物質傳遞；大比表面積提供了很高的吸附能力；易制備成不同瓊脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領域的需求；在氫氧化鈉中穩(wěn)定可滿足苛刻的在位清洗步驟；低的非特異性吸附使應用面較廣；具有彈性及非脆性(較易實現(xiàn)色譜柱的再裝填)，又可通過適度的交聯(lián)步驟使介質具有剛性(有較高的耐壓性能)；表面具有大量親水羥基，可被不同功能配基取代而應用于多種吸附色譜技術。β -環(huán)糊精是一種具有桶狀結構的多糖分子，結構如圖2所示，內部具有疏水空腔，外表面具有豐富的親水羥基和醚鍵，能夠提供氫鍵形成位點，主要作為藥物載體，與藥物分子形成包合物，目的是增加藥物分子的親水性，改善藥物分子在循環(huán)系統(tǒng)中的溶解度與釋放速率。β-環(huán)糊精分子本身還具有一定的手性選擇性。氫鍵吸附色譜是利用色譜介質與目標分子之間形成氫鍵作用的強弱實現(xiàn)分離的一類新型色譜分離方法，利用不帶有任何配基的高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠本身作為氫鍵吸附色譜介質，分離純化中藥多酚類化合物或多肽的機理及應用研究已有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于采用自制的可規(guī)模放大的以β -環(huán)糊精為配基的瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質，分離純化化學合成縮宮素粗品，簡化純化工藝，提高目標物選擇性、產(chǎn)品回收率、產(chǎn)品純度和生物安全性，提高樣品載量和介質重復利用度。本方法適用于液相合成或固相合成的化學合成縮宮素粗品。本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種以交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質、以β-環(huán)糊精為配基的氫鍵吸附色譜介質的合成方法，包括如下步驟1)12%濃度、30 μ m平均粒徑的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠微球1升，用水洗后轉入反應瓶或反應器；2)加入 100-200ml 水，加 5_15g 硫酸鈉，攪拌 2_3h ；3)加入 100-200ml 水和 50_60ml 的 20-50 % 的氫氧化鈉，60rpm 攪拌；4)加入30_60ml環(huán)氧化試劑，包括環(huán)氧氯丙烷和1，4_ 丁二醇-二縮水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 攪拌，反應 6_8h ；5)用鹽酸調 pH 4-6;6)加入20-50mg β -環(huán)糊精，20-50 %的氫氧化鈉，20-30 °C，60rpm攪拌，反應 12-20h ；7)用鹽酸調pH 4-6，水洗10個柱床體積；8)保存于20%乙醇中備用。本發(fā)明提供一種β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化化學合成縮宮素的方法，具體步驟如下1)流動相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動相為20-30%乙腈，配制好的流動相用0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置0. 5_lh備用；2)化學合成縮宮素粗品溶解于初始流動相，配制成10 50mg/mL溶液，超聲助溶 1 5min, 0. 45 μ m濾膜過濾；3) β-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質裝柱，用初始流動相平衡2個柱床體積后進樣，樣品體積為柱床體積的5 50% ；
4)洗脫方式初始流動相等度洗脫2個柱床體積后，純水等度洗脫2個柱床體積，然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為5 10個柱床體積，線性流速20 100cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測，計算縮宮素純度和收率。本發(fā)明提供了一種使用自制β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化化學合成縮宮素的方法，是對現(xiàn)有多肽分離純化方法的有益補充，與傳統(tǒng)多步反相色譜技術相比的優(yōu)勢在于一步分離可獲得較高純度的多肽，回收率高；介質對粗品耐受強， 樣品載量高，介質可重復利用數(shù)十次，易于規(guī)模放大；介質的生物相容性與生物安全性高。


圖1縮宮素分子結構圖2β_環(huán)糊精分子結構圖3實施例1中采用β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化液相合成縮宮素粗品色譜4實施例2中采用β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化固相合成縮宮素粗品色譜圖
具體實施例方式實施例1、β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化液相合成縮宮素粗品(初始純度約17%)1)流動相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動相為30%乙腈，配制好的流動相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣20min，室溫靜置0. 5h備用；2)化學合成縮宮素粗品溶解于初始流動相，配制成50mg/mL溶液，超聲助溶5min， 0. 45 μ m濾膜過濾；3) β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質裝柱，柱床直徑10mm，柱床高度 30cm，用初始流動相平衡2個柱床體積后進樣，樣品體積為柱床體積的10% ；4)洗脫方式初始流動相等度洗脫2個柱床體積后，純水等度洗脫2個柱床體積， 然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為10個柱床體積，線性流速40cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測；7)純化后，縮宮素純度由17%提高至96%，回收率78%。
實施例2、β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化固相合成縮宮素粗品(初始純度約58%)3)流動相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動相為20%乙腈，配制好的流動相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣20min，室溫靜置0. 5h備用；4)化學合成縮宮素粗品溶解于初始流動相，配制成50mg/mL溶液，超聲助溶3min， 0. 45 μ m濾膜過濾；幻β-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質裝柱，柱床直徑16mm，柱床高度 30cm，用初始流動相平衡2個柱床體積后進樣，樣品體積為柱床體積的20% ；4)洗脫方式初始流動相等度洗脫2個柱床體積后，純水等度洗脫2個柱床體積， 然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為10個柱床體積，線性流速30cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測；7)純化后，縮宮素純度由58%提高至98%，回收率85%。
權利要求
1.一種采用以β-環(huán)糊精為配基的瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質分離純化化學合成縮宮素的方法。分離純化方法具體如下1)流動相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動相為20-30%乙腈，配制好的流動相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置0. 5_lh備用；2)化學合成縮宮素粗品溶解于初始流動相，配制成10 50mg/mL溶液，超聲助溶1 5min, 0. 45 μ m濾膜過濾；3)β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質裝柱，用初始流動相平衡2個柱床體積后進樣，樣品體積為柱床體積的5 50% ；4)洗脫方式初始流動相等度洗脫2個柱床體積后，純水等度洗脫2個柱床體積，然后采用0 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為5 10個柱床體積，線性流速20 IOOcm/ h；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解配制成 0. 2mg/mL溶液，進行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0. 三氟乙酸)為梯度起點，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測，計算縮宮素純度和收率。
2.權利要求1中瓊脂糖凝膠介質偶聯(lián)β-環(huán)糊精配基的步驟包括1)12%濃度、30μ m平均粒徑的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠微球1升，用水洗后轉入反應瓶或反應器；2)加入100-200ml水，加5_15g硫酸鈉，攪拌2- ；3)加入100-200ml水和50_60ml的20-50%的氫氧化鈉，60rpm攪拌；4)加入30-60ml環(huán)氧化試劑，包括環(huán)氧氯丙烷和1，4-丁二醇-二縮水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 攪拌，反應 6_8h ；5)用鹽酸調pH4-6 ；6)加入20-50mgβ-環(huán)糊精，20-50%的氫氧化鈉，20-30°C，60rpm攪拌，反應12_20h ；7)用鹽酸調pH4-6，水洗10個柱床體積；8)保存于20%乙醇中備用。
3.權利要求1中要求的應用對象，化學合成縮宮素，包括液相合成與固相合成的縮宮素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用氫鍵吸附色譜分離純化化學合成縮宮素的方法。此方法采用表面鍵合了β-環(huán)糊精配基的高濃度、高交聯(lián)度的瓊脂糖凝膠介質，根據(jù)氫鍵吸附原理，從化學合成(包括液相合成和固相合成)的縮宮素粗品中，分離純化縮宮素，用于縮宮素原料藥的生產(chǎn)，具有選擇性高、樣品載量高、介質重復利用度高等優(yōu)點，克服傳統(tǒng)反相色譜法的介質重復利用度低、樣品載量低的缺點。
文檔編號C07K1/34GK102250218SQ20111017751
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權日2011年6月28日
發(fā)明者俞保彬, 周天瓊, 周正兵, 谷海濤, 顧銘, 高留根 申請人:中國科學院過程工程研究所, 杭州華津藥業(yè)股份有限公司