r>[0154] WMCF-7細(xì)胞系作為研究乳腺癌細(xì)胞系的模型體系。在康寧（Corning)24孔板中， 每孔使用ImL DMEM培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清FBS和1 %青鏈霉素)培養(yǎng)2 X IO5個(gè)細(xì)胞，將24孔 板在37°C、5 % C〇2條件的解箱中預(yù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。
[01巧]第一種實(shí)驗(yàn)條件：向Corning 24孔板中每孔加入10化不同濃度FITC-E5多膚或 FITC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束(實(shí)施例5，6，8的樣品）的PBS溶液，使FITC-E5多膚的最終濃度為1 咖、5咖和10咖，陽(yáng)G-陽(yáng)膠束的濃度為10-40咖，空白對(duì)照組只加入10化PBS溶液，將24孔細(xì) 胞培養(yǎng)板在解箱中解育化。
[0156] 第二種實(shí)驗(yàn)條件：向Corning 24孔板中加入10化FITC-E5多膚或FITC-ES-WG-W 納米膠束(實(shí)施例8的樣品）的PBS溶液，使FITC-E5多膚的最終濃度為扣M，PEG-ro的濃度為 20咖，空白對(duì)照只加入10化PBS溶液，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板在解箱中解育0-化。
[0157] 在上述兩種情況下，利用流式細(xì)胞儀（F CM，AUunc嚴(yán)acoustic focusing cytometer，Applied Biosystems ,Life Technologies ,CarIsbad，CA)，設(shè)置發(fā)身才波長(zhǎng) 488nm，檢測(cè)波長(zhǎng)535nm(l通道）。將陰性對(duì)照組細(xì)胞樣品放置于儀器樣品架并開(kāi)始檢測(cè)，根 據(jù)細(xì)胞大小，在前向角信號(hào)(FSC)，側(cè)向角信號(hào)(SSC)的散點(diǎn)圖中設(shè)口，并在記錄檢測(cè)結(jié)果前 設(shè)置闊值，使得巧光強(qiáng)度的數(shù)量統(tǒng)計(jì)峰圖中，口中的細(xì)胞巧光強(qiáng)度高于闊值巧光強(qiáng)度W上 的數(shù)量低于1%，設(shè)置完成后，計(jì)數(shù)10,000個(gè)細(xì)胞。在上述口設(shè)置W及計(jì)數(shù)條件下，依次檢測(cè) 空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品，記錄相應(yīng)的檢測(cè)值，即高于闊值巧光強(qiáng)度的數(shù)量百分比。
[015引在第一種情況下，如圖4a所示，在相同的解育時(shí)間下（2h)，單獨(dú)的FITC-E5多膚與 MCF-7細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率（即陽(yáng)性細(xì)胞所占％)隨著FITC-E5多膚的濃度增加而增加。 FITC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束與MCF-7細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率（即陽(yáng)性細(xì)胞所占％)也是隨著 FITC-E5多膚的濃度增加而增加。但在相同的FITC-E5多膚濃度和IOiiM)和相同解 育時(shí)間（2h)條件下，門TC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束（實(shí)施例5，6，8的樣品）與MCF-7細(xì)胞CXCR4受 體的結(jié)合率要明顯高于單獨(dú)的FITC-E5多膚與MCF-7細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率。
[0159] 在第二種情況下，如圖4b所示，F(xiàn)ITC-E5多膚（5咖)和陽(yáng)G-陽(yáng)膠束（20咖)的濃度，改 變解育時(shí)間（〇-5h)，當(dāng)解育時(shí)間大于或等于化時(shí)，F(xiàn)ITC-E5-PEG-ro納米膠束(實(shí)施例8的樣 品）與MCF-7細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率要明顯高于單獨(dú)的FITC-E5多膚與MCF-7細(xì)胞CXCR4受 體的結(jié)合率。W上兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得益于PEG-PE能夠顯著增加 FITC-E5多膚在PBS溶液中的 溶解性，促進(jìn)了 FITC-E5多膚與CXCR4受體的結(jié)合作用。
[0160] 實(shí)驗(yàn)例3 FITC-E5多膚或FITC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束與H邱G2細(xì)胞CXCR4受體親和力 的檢測(cè)。
[0161] W化pG2細(xì)胞系作為研究肝癌細(xì)胞系的模型體系。在Corning 24孔板中，每孔使用 ImL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清FBS和I %青鏈霉素）培養(yǎng)2 X IO5個(gè)細(xì)胞，將24孔板在37 °C、5 % C〇2條件的解箱中預(yù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。
[0162] 第一種實(shí)驗(yàn)條件：向Corning 24孔板中每孔加入10化不同濃度FITC-E5多膚或 FITC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束(實(shí)施例5、6、8的樣品）的PBS溶液，使FITC-E5多膚的最終濃度為1 咖、5咖和1 OiiM，陽(yáng)G-陽(yáng)膠束的濃度均為10-40測(cè)，空白對(duì)照組只加入10化PBS溶液，將24孔 細(xì)胞培養(yǎng)板在解箱中解育化。
[0163] 第二種實(shí)驗(yàn)條件：向Corning 24孔板中加入10化FITC-E5多膚或FITC-ES-WG-W 納米膠束(實(shí)施例8的樣品）的PBS溶液，使FITC-E5多膚的最終濃度為扣M，PEG-ro的濃度為 20咖，空白對(duì)照只加入10化PBS溶液，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板在解箱中解育0-化。
[0164] 在上述兩種情況下，利用流式細(xì)胞儀記錄檢測(cè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品，記錄相 應(yīng)的檢測(cè)值，即高于闊值巧光強(qiáng)度的數(shù)量百分比。
[0165] 在第一種情況下，如圖5a所示，在相同的解育時(shí)間下（2h)，單獨(dú)的FITC-E5多膚與 HepG2細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率（即陽(yáng)性細(xì)胞所占％)隨著FITC-E5多膚的濃度增加而增加。 FITC-E5-陽(yáng)G-PE納米膠束（實(shí)施例5、6、8的樣品）與H邱G2細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率（即陽(yáng)性 細(xì)胞所占％)也是隨著FITC-E5多膚的濃度增加而增加。但在相同的FITC-E5多膚濃度（liiM、 SiiM和10山〇和相同解育時(shí)間（2h)條件下，門TC-E5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束與H邱G2細(xì)胞CXCR4受體 的結(jié)合率要明顯高于單獨(dú)的FITC-E5多膚與化pG2細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率。
[0166] 在第二種情況下，如圖加所示，固定FITC-E5多膚（5咖)和PEG-陽(yáng)膠束（20咖）的濃 度，改變解育時(shí)間（〇-5h)，當(dāng)解育時(shí)間大于或等于化時(shí)，門TC-E5-PEG-PE納米膠束(實(shí)施例8 的樣品）與化pG2細(xì)胞CXCR4受體的結(jié)合率要明顯高于單獨(dú)的FITC-E5多膚與HepG2細(xì)胞 CXCR4受體的結(jié)合率。W上兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得益于陽(yáng)G-陽(yáng)能夠顯著增加 FITC-E5多膚在PBS 溶液中的溶解性，促進(jìn)了 FITC-E5多膚與CXCR4受體的結(jié)合作用。
[0167] 實(shí)驗(yàn)例4 E5多膚和ES-PEG-TO納米膠束對(duì)CX化12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞遷移過(guò)程中相關(guān) 基因表達(dá)的抑制作用。
[0168] WMCF-7作為研究乳腺癌細(xì)胞系的模型體系，選取細(xì)胞遷移過(guò)程中的標(biāo)志性事件 (上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT)的代表性基因（N-巧粘蛋白：N-ca化erin，波形蛋白：Vimentin,基質(zhì)金 屬蛋白酶:MMP2和MMP9)作為研究對(duì)象。
[0169] 在直徑為60cm的Corning皿中，每皿使用2.5mL DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清FBS 和1%青鏈霉素)培養(yǎng)5X105個(gè)MCF-7細(xì)胞，將Corning皿置于37°C、5%C02條件的解箱中預(yù)培 養(yǎng)2地，使細(xì)胞貼壁。加入CX化12溶液誘導(dǎo)，使每孔的CX化12濃度為l(K)ng/mM同時(shí)向培養(yǎng)皿 中加入10化E5多膚的PBS溶液或E5-PEG-陽(yáng)納米膠束的PBS溶液(實(shí)施例3的樣品），其中E5 多膚的終濃度為化M，PEG-TO的終濃度為20測(cè)，空白對(duì)照只加入10化PBS溶液，將培養(yǎng)皿在 解箱中解育24h。
[0170] 從MCF-7細(xì)胞中提取RNA:細(xì)胞處理所需時(shí)間后，每皿加入1血化izol裂解細(xì)胞，靜 置5min;將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入EP管，加入1/5體積的氯仿，劇烈混勻，室溫放置10min;4°C條件 下Wl2000g的轉(zhuǎn)速離屯、15min，取上清水相轉(zhuǎn)入新的EP管；加入1/2體積的異丙醇，混勻，室 溫放置5-lOmin; 4°C條件下W 12000g的轉(zhuǎn)速離屯、Smin，棄上清，沉淀用75 %乙醇清洗;4°C條 件下W7500g的轉(zhuǎn)速離屯、5min，留沉淀;干燥RNA，倒置EP管5-lOmin，加入10-20化DEPC處理 過(guò)的無(wú)菌水溶解，核酸分析儀分析RNA的質(zhì)量和濃度。
[0171] 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA:將模板RNA巧Ong-化g)在冰上解凍；引物、IOX RT Mix、Super Pure dNTP、d地2〇在室溫解凍，解凍后迅速置于冰上，使用前將每種溶液滿旋振蕩混勻，簡(jiǎn) 短離屯、W收集殘留在管壁的液體;按照下表中的逆轉(zhuǎn)錄體系配制混合液(最后加模板RNA)， 徹底混勻，滿旋振蕩時(shí)間不超過(guò)5s，簡(jiǎn)短離屯、后置于冰上，37°C解育60min。
[0173] SYBR Green 1 嵌合巧光法Real Time PCR(RT-PCR):按照下表，先將"d地2O+SYBR mix+正反向引物"混合完畢，加入到各個(gè)小反應(yīng)管中（2化L體系），最后加 cDNA模板，上機(jī)檢 測(cè)，分析結(jié)果。
[0176] N-ca化erin、Vimentin、MMP2和MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平與細(xì)胞的遷移能力緊密 相關(guān)，表達(dá)上調(diào)則表示細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，表達(dá)下調(diào)則表示細(xì)胞遷移能力減弱。預(yù)實(shí)驗(yàn)中， 經(jīng)20咖的陽(yáng)G-陽(yáng)膠束解育的MCF-7細(xì)胞與空白對(duì)照組對(duì)比，上述基因 mRNA相對(duì)表達(dá)水平?jīng)] 有顯著性差異。如圖6所示，相比于對(duì)照組細(xì)胞，單獨(dú)E5多膚的PBS溶液處理MCF-7細(xì)胞后，其 N-ca化erin、Vimentin和MMP2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平基本沒(méi)有變化，MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)水 平下調(diào)30%左右。E5-PEG-PE納米膠束的PBS溶液（實(shí)施例3的樣品）處理MCF-7細(xì)胞后，其 Vimentin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平基本沒(méi)有變化，N-ca化erin和匪P2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào) 20%左右，MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)70%左右。說(shuō)明E5多膚和E5-PEG-陽(yáng)納米膠束(實(shí) 施例3的樣品）均能在mRNA水平上抑制EMT相關(guān)基因的表達(dá)，但E5-PEG-PE納米膠束(實(shí)施例3 的樣品）的抑制作用要優(yōu)于E5多膚。
[0177] 實(shí)驗(yàn)例5 E5多膚和ES-PEG-TO納米膠束對(duì)CX化12誘導(dǎo)化pG2細(xì)胞遷移過(guò)程中相關(guān) 基因表達(dá)的抑制作用。
[0178] W化pG2細(xì)胞系作為研究肝癌細(xì)胞系的模型體系。在直徑為60cm的Corning皿中， 每皿使用2.5mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清FBS和1%青鏈霉素）培養(yǎng)5X IO5個(gè)HepG2細(xì) 胞，將Corning皿置于37°C、5 % C〇2條件的解箱中預(yù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。加入CX化12溶液 誘導(dǎo)，使每孔的CX化12濃度為IOOng/血;同時(shí)向培養(yǎng)皿中加入10化E5多膚的PBS溶液或E5-PEG-PE納米膠束的PBS溶液(實(shí)施例3的樣品），其中E5多膚的終濃度為化M，PEG-陽(yáng)的終濃度 為，空白對(duì)照只加入IOiiL PBS溶液，將培養(yǎng)皿在解箱中解育24h。
[0179] 按照實(shí)驗(yàn)例4中的實(shí)驗(yàn)步驟，從HepG2細(xì)胞中提取RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Greenl嵌合巧光法Real Time PCR(RT-PCR)檢測(cè)EMT過(guò)程中N-ca化erin、Vimentin、MMP2和 MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。
[0180] 預(yù)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)20礎(chǔ)的PEG-PE膠束解育的化pG2細(xì)胞與空白對(duì)照組對(duì)比，上述基因 mRNA相對(duì)表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。如圖7所示，相比于對(duì)照組細(xì)胞，單獨(dú)E5多膚的PBS溶液 處理HepG2細(xì)胞后，其N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)30-40 % dE5-陽(yáng)G-陽(yáng)納米膠束的PBS溶液(實(shí)施例3的樣品）處理化pG2細(xì)胞后，其Vimentin和N-ca化erin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)50%，MMP2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)80%左右，匪P9的 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)90 %左右。說(shuō)明E5多膚和E5-PEG-陽(yáng)納米膠束均能在mRNA水平上抑 制EMT相關(guān)基因的表達(dá)，但E5-PEG-陽(yáng)納米膠束(實(shí)施例3的樣品）的抑制作用要優(yōu)于E5多膚。
[0181] 實(shí)驗(yàn)例6 E5多膚和ES-PEG-TO納米膠束對(duì)CX化12誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞體外遷移的抑制 作用；
[0182] AMD3100是一種巧CR4趨化因子受體括抗劑，作用于巧CR4和巧化12調(diào)節(jié)的趨化性。
[0183] 收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將30化L含 有1 X IO6個(gè)細(xì)胞的懸液，W及E5多膚或E5-PEG-陽(yáng)納米膠束的PBS溶液(實(shí)施例4的樣品）加 入transwel 1小室（直徑為如m的PET微孔濾膜）的上室，使