顯微確定測(cè)定形狀。
[0102] -電荷:通過確定電泳信號(hào)（ζ電位，表面電荷）在Zetasizer(Malvern Instruments GmbH)上測(cè)量溶解于去離子水中的不同的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)。
[0103] -內(nèi)毒素：根據(jù)D . E . Gui If oyle , et al Evaluation of a chromogeni C procedure for use with the Limulus lysate assay of bacterial endotoxins drug products. J Parenter Sci Technol, 1985,39(6):郵.233-6 通過整試劑顯色法化 AL chromo邑enic assay)測(cè)量?jī)?nèi)毒素。
[0104] -溶血作用：紅細(xì)胞的血紅蛋白濃度的測(cè)量，所述紅細(xì)胞與顆粒在生理緩沖液中解 育化。在紅細(xì)胞膜損壞的情況下，上清液中的可測(cè)量的血紅蛋白濃度增加。
[0105] -凝集:紅細(xì)胞的吸收的測(cè)量，所述紅細(xì)胞與聚合物在生理緩沖液中解育。具有細(xì) 胞聚集的樣本與不凝集的均勻分布的細(xì)胞相比顯示出更低的吸收。
[0106] 在圖4中示出結(jié)果。A:尺寸，B:電荷，C:內(nèi)毒素負(fù)荷。動(dòng)態(tài)光散射用于尺寸測(cè)量，所 述動(dòng)態(tài)光散射借助ζ電位確定電荷。D:此外示出：DY635-PLGA-NP在血液中不具有賴氨酸特 性并且其不引起紅細(xì)胞的凝集。Ε和F:在電子顯微照片(SEM)中示出：顆粒是圓形或球形的， 其是未加載的并且沒有祀向作用化)和加載的并且具有祀向作用(F)。
[0107] 實(shí)例4:通過RNAi和體外吸收引起藥物相關(guān)效應(yīng)（"概念驗(yàn)證"）
[010引實(shí)施圖6A:胎pa 1-6細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下（37°C，5%C02，DMEM4.5g/l葡萄糖， 10%加熱滅活的胎牛血清，1 %盤尼西林/鏈霉素)在6孔板中培養(yǎng)（100.000細(xì)胞/9.6cm2)。 在24小時(shí)之后，不同濃度的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)添加到孔中并且解育不同的時(shí)間段(濃度 和解育時(shí)間在圖5A中可見），所述納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)如實(shí)例7B中那樣制備。在解育時(shí)間之 后，細(xì)胞用漢克平衡鹽溶液化BSS)洗涂并且用混有1%β-疏基乙醇的化T緩沖液（Qiagen GmbH)裂解。mRNA從裂解液分離并且在RT-qPCR中分析。緊接著，值W次黃嚷嶺-鳥嚷嶺-憐酸 核糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平歸一化并且HMGCR表達(dá)水平(HMGCR:3-^基-3-甲基戊二酷-輔酶A-還 原酶輔酶或HMG-CoA)與未轉(zhuǎn)染的化pa 1-6細(xì)胞相比較。
[0109] 實(shí)施圖6B:Hepa 1-6細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下在畑amber Slides(Nunc，The;rmo Scientific Gm地)上培養(yǎng)(5000細(xì)胞/1.5cm2)。在24小時(shí)之后，細(xì)胞混有100yg/mL(最終濃 度)DY-635改性的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)（制備如實(shí)例7B中描述）。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下與納米 結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)解育30分鐘后，細(xì)胞用皿SS洗涂并且用5%福爾馬林(pH 7)固定15分鐘。緊 接著，洗涂具有細(xì)胞的載玻片并且細(xì)胞核用DAPI染色。為了通過激光掃描顯微鏡來(lái)評(píng)估，細(xì) 胞用￥日(3*日5}1161(1(￥6(3*〇'1^日63，111(3.)濕潤(rùn)并且用蓋玻片密封。納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)通過 用DY-635改性在633nm處檢測(cè)到(激發(fā)），細(xì)胞核在460nm處可見(激發(fā)）。
[0110] 結(jié)果在圖5中示出。A:通過siRNA轉(zhuǎn)染到化pa 1-6細(xì)胞中，HMGCR基因表達(dá)能夠向下 調(diào)節(jié)至70%dHMGCR(3-^基-3-甲基戊二酷-輔酶A-還原酶輔酶或HMG-CoA)體現(xiàn)中央代謝的 共鍵酶-膽固醇生物合成。所述代謝基因的在該實(shí)驗(yàn)中示出的向下調(diào)節(jié)顯示出通過納米結(jié) 構(gòu)的載體系統(tǒng)進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明的有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)的效力。此外，提高的血漿膽固醇水平在 動(dòng)脈硬化的形成中具有核屯、意義。在此示出的利用本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)的治療方 法是對(duì)傳統(tǒng)的、用他汀類藥物治療的令人感興趣的替代，此外，運(yùn)是對(duì)于具有先天性高膽固 醇血水平的人(家族性高膽固醇血癥)在基因轉(zhuǎn)運(yùn)方向上的第一步。B:示出DY635-PLGA-NP 在30分鐘之內(nèi)由化pa 1-6細(xì)胞（鼠類肝細(xì)胞系）吸收。納米顆粒的運(yùn)種快速且密集的吸收迄 今在現(xiàn)有技術(shù)中未描述過。
[0111] 實(shí)例5:體內(nèi)祀向作用:器官特異性和分泌途徑的描述
[0112] 如在實(shí)例2(B)中那樣描述用于該實(shí)驗(yàn)的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)的制備。為了注入， 將冷凍干燥的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)借助軌道混合器(orbital mixer)和超聲波浴溶解于無(wú) 菌的5%葡萄糖溶液中（Glucosteril G5，Rresenius 沈&Co KGaG)。
[0113] 實(shí)施，（圖6A):小鼠或大鼠從靜脈插入導(dǎo)管(頸靜脈）。緊接著，肝臟非原位地在活 體顯微鏡上制備。緊接著，靜脈注射DY-635Q化mol/g體重化G))或攜帶有DY-635改性物的 納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)，（6.扣g/g KG)并且DY-635在63化m處的特有的巧光在肝臟中隨著時(shí) 間測(cè)量并且不同的興趣區(qū)（R0I .Regions of Interest)在拍攝的圖像中隨時(shí)間定量化。在 圖6中示出DY-635 (圖6B)或DY-635改性的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)（圖6C)的測(cè)量的有代表性的 圖像。DY-635或DY-635改性的納米結(jié)構(gòu)的載體系統(tǒng)通過DY-635在633nm處的巧光顯示。肝結(jié) 構(gòu)通過NADH/NAD化在450nm處的自發(fā)巧光顯示。為了顯示器官特異性，雄性小鼠經(jīng)由中屯、靜 脈導(dǎo)管被注射每g體重6.扣g DY-635改性的載體系統(tǒng)。在注射后10分鐘，動(dòng)物被無(wú)痛安樂死 并且取出器官并且冷凍制備W用于組織學(xué)后處理。緊接著，在冷凍切片機(jī)上制作器官的扣m 厚的切片并且所述切片用DAPI復(fù)染色。緊接著，全部器官在關(guān)于DAPI染色的細(xì)胞核（在 430nm處)和關(guān)于納米顆粒(在633nm處)相同的設(shè)置下研究。
[0114] 結(jié)果在圖6中示出。C:納米顆粒DY635-PLGA-NP已經(jīng)在1分鐘之后被吸收到肝細(xì)胞 中（圓石類信號(hào)富集區(qū)域，cobblestone-type si即al-rich areas)，在1分鐘和10分鐘之后 成像（lmin，10min)。在大約50分鐘（50min)之后，幾乎全部染料DY635從肝臟排出。DY635示 出類似的結(jié)果。B:整體上示出與在先前用純的染料DY635的研究中類似的結(jié)果。A:示出肝臟 中DY635的衰變率。肝臟中與DY635和DY635-PLGA-NP變化的DY635強(qiáng)度的衰變率示出：染料 DY635也仍細(xì)胞內(nèi)地結(jié)合到聚合物化GA上并且在PLGA水解之后才釋放和排出。D-G:示出器 官特異性，所述器官特異性借助不同的器官切片檢查。在注入DY635-化GA-NP(綠色）之后， 在肝臟(D)中能夠確認(rèn)強(qiáng)的積累。相反，在脾臟化）中、在屯、臟(F)中和在腎臟(G)中罕有納米 顆?？梢?脾臟、屯、臟)甚至沒有(腎臟)納米顆?？梢姟?br>[0115] 實(shí)例6:納米顆粒DY635-PLGA的分泌途徑
[0116] 根據(jù)運(yùn)些實(shí)驗(yàn)研究血漿收縮率和DY635-化GA-納米顆?；蚨啻渭谆玖螪Y635的 膽汁分泌。為此，給雄性大鼠（品種:Rcc化n:WIST)配器(在頸靜脈、頸動(dòng)脈、膽總管中的導(dǎo) 管）。緊接著，待試驗(yàn)的物質(zhì)經(jīng)由靜脈導(dǎo)管注入。緊接著，W短的時(shí)間間隔從動(dòng)脈導(dǎo)管取出血 液，并且從膽總管中的導(dǎo)管取出膽汁。隨后將血液進(jìn)一步處理為血漿。緊接著，燃料DY635的 量通過巧光分析法基于校準(zhǔn)曲線測(cè)量。在4分鐘之后能夠發(fā)現(xiàn)DY635-PLGA-NP在動(dòng)脈血中最 大并且在DY635-PLGA-NP注入之后直至20分鐘、即在15分鐘(min)之內(nèi)，DY635-PLGA-NP幾乎 全部吸收到器官中。存在輕度的延遲，因?yàn)槿缫呀?jīng)描述的那樣DY635必須首先從納米顆粒釋 中放出來(lái)，然后DY635分泌到膽汁中（圖6，繪圖A)。在膽汁中DY635的(計(jì)算的)95%的恢復(fù)度 同樣示出DY635-PLGA-NP對(duì)于肝細(xì)胞的高的特異性(圖6，繪圖B)。
[0117] 實(shí)例7:藥物有效成分封入納米顆粒中
[0118] 在聚合物或脂質(zhì)與祀單元官能化之后(實(shí)例1)，通過單面乳劑(A)和雙面乳劑(B) 制備納米顆粒。
[0119] (A)由單面乳劑構(gòu)成的納米顆粒
[0120] 如果封入親水性物質(zhì)，那么使用單面乳膠工藝。在此，有效成分通過疏水性相互作 用封入疏水性聚合物核中。在此，有效成分與聚合物溶解于適合的有機(jī)溶劑中。如果有機(jī)溶 劑相對(duì)于聚合物和有效成分是中性的，那么有機(jī)溶劑是適合的，即所述有機(jī)溶劑不化學(xué)變 化并且不影響聚合物和有效成分的穩(wěn)定性。當(dāng)前使用醋酸乙醋?；旌衔镉糜H水性溶劑包覆 層。為了穩(wěn)定納米顆粒和提高產(chǎn)率，如在雙面乳劑納米顆粒的情況下能夠向親水性溶劑滲 入表面活化劑(參見雙面乳劑納米顆粒）。兩個(gè)相通過高能超聲混合，所述高能超聲與垂直 地浸入樣本中的電極同軸地放射出。由此產(chǎn)生納米顆粒。
[0121] (B)雙面乳劑納米顆粒
[0122] 為了制備，疏水性聚合物W高濃度溶解于適合的溶劑中。如果有機(jī)溶劑相對(duì)于聚 合物和有效成分是中性的，那么有機(jī)溶劑是適合的，即所述有機(jī)溶劑不化學(xué)變化并且不影 響聚合物和有效成分的穩(wěn)定性。當(dāng)前使用醋酸乙醋。聚合物的濃度與聚合物的尺寸、親水 性、溶解度和穩(wěn)定性相關(guān)。在此，適合的濃度為2mg/mL和50mg/mL之間。有效成分W適合的濃 度溶解于超純水中。適合的有效成分濃度與有效成分的化學(xué)特性和納米顆粒的容量相關(guān)。 緊接著，溶解于有機(jī)溶劑中的殼聚合物用含水溶液中溶解的有效成分包覆層。聚合物和有 機(jī)溶劑在此必須至少10倍過量地存在于樣本中。通過高能超聲與垂直地浸入樣本中的電極 同軸地射入，朝外產(chǎn)生疏水的顆粒。由此，由于與納米顆粒的內(nèi)部的親水性基團(tuán)的相互作用 將有效成分封入親水的核中。在第二步驟中，適合的表面活化劑W適合的濃度溶解于超純 水中。當(dāng)所述表面活化劑能足W制造納米顆粒時(shí)，表面活化劑的濃度是合適的。濃度與環(huán)境 條件相關(guān)并且必須W實(shí)驗(yàn)的方式確定。所述濃度通常為0.01%和5%之間(w/v)。然后，如此 多的表面活化劑被添加到樣本中，使得聚合物的濃度僅為初始量的至少1/10。又形成兩個(gè) 相，所述相通過高頻超聲混合，所述高頻超聲與垂直地浸入樣本中的電極同軸地放射出來(lái)。 通過滲入表面活性的物質(zhì)(表面活化劑），例如表面活性劑(Tenside)，當(dāng)前為聚乙締醇，確 保水溶性的納米級(jí)顆粒的形成。
[0123] 為了說(shuō)明描述如下配藥，在所述配藥中將與聚乙締亞胺(PEI)絡(luò)合的親水性小干 擾RNA(siRNA)封入在PLGA納米顆粒中。PLGA事先用DY-635改性，使得每第200個(gè)鏈攜帶一個(gè) 染料分子：
[0124] (1)2.4化陽(yáng)1(1111旨/1111)與化1311?酷（化旨/41)混合并且用45.641超純水混合。所 述混合物W下稱作P〇lyplexe(陽(yáng)離子多聚物），因?yàn)殛庪x子的siRNA與陽(yáng)離子的PEI相互反 應(yīng)并且PEI將siRNA結(jié)合并且穩(wěn)定在孔眼緊密的網(wǎng)絡(luò)中。
[012引 （2)325mgDY-635-共輛的PLGA溶解于總共12.35ml的醋酸乙醋中。
[0126] (3)來(lái)自（2)的90μ1聚合物溶液與來(lái)自（1)的50μ1陽(yáng)離子多聚物用高頻超聲混合 (如上描述地射入）。
[0127 ] (4) ImL含0.3wt % PVA的超純水中被添加到混合物中并且用超聲射入。
[0128] (5)提純并且冷凍干燥產(chǎn)生的納米顆粒。
[0129] 提純(對(duì)于(A)和(B))
[0130] W該方式制備的納米顆粒具有如下直徑，所述直徑與脈管的形狀和材料、超聲強(qiáng) 度W及材料濃度相關(guān)并且具有120nm至220nm的尺寸。在無(wú)菌條件下，在制備納米顆粒之后， 除去溶劑。為了除去過量的表面活性劑，通過離屯、、降低殘余物和在無(wú)菌的超純水中重懸納 米顆粒來(lái)多次(至少兩次)清洗納米顆粒。最后凍干納米顆粒并且確定其質(zhì)量。
[0131] 實(shí)例8:藥物有效成分封入脂質(zhì)體中
[0132] 在聚合物或脂質(zhì)與祀單元官能化之后(實(shí)例1)，如下制備脂質(zhì)體：
[0133] 1.制備50mM脂質(zhì)溶液，所述脂質(zhì)溶液例如由1: 1D0PC:DSPC(1,2-二油酷-SN