體系統(tǒng)的或根據(jù)本發(fā)明的藥 物組合物的應用，W用于主動地和選擇性地將納米結構的載體系統(tǒng)或藥物組合物轉運到祀 組織中，其中轉運通過至少一種作為祀單元的多次甲基染料引起。尤其優(yōu)選地，至少一種多 次甲基染料經(jīng)由至少一種組織特異性的轉運體引起將納米結構的載體系統(tǒng)或藥物組合物 吸收到祀組織的細胞中。尤其優(yōu)選地，納米結構的載體系統(tǒng)和/或其組成部分在祀組織中的 累積能夠借助至少一種多次甲基染料的巧光特性檢測。除了至少一種多次甲基染料之外， 至少一種聚合物、至少一種脂質和/或至少一種藥物有效成分能夠理解為納米結構的載體 系統(tǒng)(納米顆?；蛑|體)的組成部分。
[0075] 本發(fā)明的另一主題設及一種根據(jù)本發(fā)明的納米結構的載體系統(tǒng)的或根據(jù)本發(fā)明 的藥物組合物作為藥物的應用。
[0076] 本發(fā)明的另一主題設及一種根據(jù)本發(fā)明的納米結構的載體系統(tǒng)的或根據(jù)本發(fā)明 的藥物組合物的應用，W用于治療疾病和治療肝臟和/或腎臟、優(yōu)選為具有肝臟和/或腎臟 損害的傳染病、例如追疾和丙型肝炎，肝功能衰竭、例如藥物引起的肝功能衰竭和突發(fā)性肝 功能衰竭，肝硬化、例如酒精引起的肝硬化，肝臟的代謝疾病、例如肝豆狀核變性(Wilson's 疾病）和莫伊倫格瑞伊特(Meulengracht)疾病，肝臟的排泄功能障礙，肝腫瘤，原發(fā)性肝腫 瘤、例如肝細胞性肝癌，血管肉瘤和肝母細胞瘤，腎腫瘤，原發(fā)性腎腫瘤、例如透明細胞癌， 乳頭狀癌和嫌色細胞癌，腎炎，慢性和急性腎衰竭W及引起肝臟和/或腎臟的相繼損害的疾 病，例如敗血癥。
[OOW]根據(jù)本發(fā)明的納米結構的載體系統(tǒng)和祀單元、尤其多次甲基染料開辟了在分子中 診斷與治療相結合的獨特的可行性。因此，可W通過自由的祀結構的吸收來預測關于治療 的效力的預測，但也可W檢測和控制用結合到納米顆?；蛑|體上的相同的祀結構的治 療。由于在連接體區(qū)域中祀結構的高的靈活性，祀單元能夠化學地結合到極多樣的脂質和 聚合物上。此外，通過祀單元的化學結構，與生物學的祀單元(例如抗體或膚)相反，所述祀 單元是極穩(wěn)定的并且對于化學提純和分析是可供使用的。由此，在合成中的高的再現(xiàn)性和 可控性是可行的。通過祀單元作為組織特異性的轉運體的配體的特性，所述祀單元在在從 聚合物解析之后在體內(nèi)被剪切，由此避免細胞內(nèi)的累積和毒性。通過現(xiàn)在在多光譜光聲斷 層攝影術領域中的動態(tài)的用于成像的顯影可W直接證明祀單元。但是此外，用于計算機輔 助的倫琴射線斷層攝影術或磁共振體層攝影術的根據(jù)本發(fā)明的造影劑也能夠封入納米顆 粒或脂質體中，由此所述納米顆?；蛑|體同樣能夠被定位。
[0078]迄今，運類多樣的和細胞特異性的系統(tǒng)是獨特的，所述系統(tǒng)經(jīng)由在紅色至紅外線 區(qū)域中發(fā)巧光的染料作為祀單元將診斷和治療相結合，所述染料又通過其對于生物轉運體 的選擇性也極其有效地由肝臟和腎臟排出。
【附圖說明】
[0079]此外，根據(jù)附圖示例地闡述本發(fā)明：
[0080] 圖1示出根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的可能的變化和其對納米顆粒本身的物理化學性 質W及生物學結果的圖像的概況(表1)。
[0081] 圖2示意性示出根據(jù)本發(fā)明的聚合物的官能化。A:通過多次甲基染料DY635的抓C 偶聯(lián)到PLGA的簇酸末端基團上來將官能化的PLGA聚合物合成為DY635-P1GA-NP(或者也稱 作DY635-PLGA;運兩個術語在本發(fā)明中同義地使用）dB:用UV和IR檢測器的官能化的PLGA聚 合物的SEC洗脫曲線(SEC elugram)。此外，在實例1中詳細描述合成和官能化。
[0082] 圖3示出根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的結構和制備。各個的超聲波步驟通過灰色針(箭 頭)表征。此外，在實例2進行詳細的描述。A:納米顆粒的結構和其借助單面乳膠工藝的制 備。疏水聚合物W深灰色表示，疏水的有效成分W中度灰色表示，水中的表面活性劑 (Tensid)W淺灰色表示。B:納米顆粒的結構和其借助雙面乳膠工藝的制備。疏水聚合物W 深灰色表示，疏水的有效成分W白色表示。那么上部淺灰色的層再次是水與表面活性劑。C: 根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的可能的變化和其對納米顆粒本身的物理化學性質W及生物學結 果的圖像的概況(橫截面圖）（表1)。疏水聚合物或脂質W黑色表示，可能的藥物有效成分、 半乳糖、和DY635作為用于細胞特異性地吸收到肝細胞中的轉運體W灰色表示，其中僅根據(jù) 本發(fā)明的納米顆粒保留了細胞特異性。
[0083] 圖4示出根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的選擇的表征的結果。箱線圖包括0.25至0.75分 位數(shù)。中位數(shù)被標繪為水平條，平均值被標繪為長方體。細線(whiskers)分別示出最大值或 最小值。A:PLGA納米顆粒的尺寸不區(qū)別于加載siRNA/PEI的化GA納米顆粒(大約180nm)。相 反，DY635-PLGA納米顆粒是顯著更大的（大約260nm)DB:PLGA納米顆粒的Z電位^-化tentia 1)是梢?guī)ж撔缘?。通過使用DY635-PLGA納米顆粒，電位波動到弱正性的Z電位(不 顯著）。通過用siRNA/PEI polyplexes(siRNA/PEI+PLGA納米顆粒)加載，Z電位顯著改變并 且強烈變?yōu)檎?+76mVKC:為了確定內(nèi)毒素量，研究濃度為25mg NP/ml的納米顆粒(NP)溶 液，如所述溶液也在體內(nèi)使用。內(nèi)毒素負荷在樣本間在0.4ng/ml和0.6ng/ml之間波動。然 而，值總是位于抑A的極限值(2.5ng/ml)之下。D:25mg/ml的NP溶液也用于溶血和凝聚化驗。 DY635-化GA納米顆粒用于所述化驗，如所述DY635-PLGA納米顆粒也在體內(nèi)環(huán)境中使用。在 圖3中對此進一步描述。
[0084] 圖5示出體外化pa 1 -6細胞中的RNAi的吸收動力和表征。A:圖表(熱點圖），所述圖 表描述時間依賴性和濃度相關的RNAi。在軸上，相對于siRNA濃度(ng/100.000細胞)繪制W 小時化)為單位的時間。HMGCR相對于未處理的對照組相的表達變化構成為W灰度刻度的方 式W百分比繪制(在圖像之上的刻度）。對于在熱點圖中的點，使用1、5、10、25、50、100、200 和400ng/100.000細胞的siRNA濃度并且在12、16、24、32、40或48小時之后進行研究。在每個 時間點生成Ξ次獨立的重復試驗。緊接著，將結果相對于未處理的化pa 1-6細胞的HMGCR基 因表達水平相對化并且借助HPRT基因表達歸一化。B:在0和30分鐘(min)之后將納米顆粒吸 收到化pa 1-6細胞中。DY635在切5通道中在LSM上顯示。在細胞的洗涂和固定之后對細胞核 進行DAPI染色。實例4對此進一步描述。
[0085] 圖6示出根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒在肝臟、腎臟、脾臟和屯、臟中的器官特異性和動力 學。A:DY635與DY635-化GA-NP的衰變動力學的對比。肝臟中3個R0I的平均值。誤差條示出 SEM。B+C:切5 (DY63 5)通道的圖像(B淺灰色到白色，C淺灰色）和DAP I (背景）通道在IVM上的 不同的時間點的疊加。D-G:在DY635-PLGA-NP注入之后10分鐘的扣m器官切片。DY635-PLGA-NP或DY635(切5通道，圖像中綠色)和細胞核(DAPI染色，圖像中紅色)在圖像上疊加。F，G:在 此，染色附加地用與相對比中視覺化的肝結構（圖像中藍色)疊加。圖5進一步地描述。
[0086] 圖7示出根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的分泌途徑。DY635-PLGA-NP的分泌途徑:A:對于 血漿收縮率的計算，在具有DY635-化GA納米顆粒的未處理的血漿中建立標準曲線。在膽汁 中應用具有DY635的標準系列W用于膽汁分泌。B:示出在膽汁中的DY635百分比"恢復" (Wiedergewinnung)。測量點基于A中的數(shù)據(jù)W計算的方式產(chǎn)生。曲線借助化iginPro 8.5， 如ickFit:具有偏差的指數(shù)衰減來近似。
[0087] 圖8示出根據(jù)本發(fā)明的祀單元、更確切地說為多次甲基染料。圖8示出肝細胞祀單 元的一般結構和具有連接體至聚合物或脂質的說明的腎實質細胞-祀單元的一般結構W及 運樣肝細胞-祀單元和實質細胞-祀單元的實例(表2)。祀單元具有對于細胞類型(肝細胞或 腎實質細胞）的選擇性并且當所述祀單元與納米顆?；蛑|體通過化學鍵結合時，所述祀 單元將細胞選擇性能夠轉移到納米顆?；蛑|體。祀單元的選擇性在此通過與內(nèi)流轉運體 的相互作用產(chǎn)生，所述內(nèi)流轉運體由祀細胞表達。此外，祀單元具有在紅色至紅外線區(qū)域中 的巧光特性。運種巧光特性也能夠轉移到納米結構的載體系統(tǒng)上，更準確地轉移到納米顆 粒或脂質體上，由此在血液中和在組織中不僅能夠證實染料的積累，而且（當與納米顆?；?脂質體結合時)證實納米顆粒和/或脂質體的積累。
[0088] 圖9示出根據(jù)本發(fā)明的納米結構的載體系統(tǒng)在藥物有效成分的轉運中的效力。A: 在兩次注入朝向HMGCR轉運siRNA的納米結構的載體系統(tǒng)之后的或在控制物質的兩次注入 之后的血漿膽固醇水平。該圖示出中位條形圖，誤差條描述標準偏差的平均誤差，條中的數(shù) 字描述每組中的動物數(shù)量，顯著性通過雙尾U檢驗確定，**顯著水平為0.01。
[0089] 圖9A:該結果示出：通過描述的方案可行的是:血漿膽固醇濃度顯著降低。在此，器 官特異性的納米結構的載體系統(tǒng)示出最強效力。從圖9B顯而易見的是:通過器官特異性的 納米結構的載體系統(tǒng)在肝細胞中實現(xiàn)器官特異性和強的效果。反之，非特異性的納米結構 的載體系統(tǒng)不顯示HMGCR的特異性的和較弱的向下調節(jié)。
[0090] 圖10示出根據(jù)本發(fā)明的多次甲基染料作為祀單元、DY-635與人類肝細胞的底外側 的轉運體的根據(jù)本發(fā)明的相互作用。A、B示出平均值的條形圖，誤差條描述標準偏差的平均 誤差，全部實驗進行6次。顯著性通過雙側U檢驗確定，**顯著水平為0.01，*顯著水平為 0.01。
[0091 ]下面結合實例闡述本發(fā)明，但不限制于此。
【具體實施方式】
[0092]
[0093] ????:官能化聚合物的合成
[0094] 合成的納米顆?；谑杷酆衔?，聚乳酸-徑基乙酸共聚物(PLGA)，所述疏水聚合 物是生物相容的并且可生物分解的。運種聚合物由于其活性的簇酸基團Γ酸終止"）能夠通 過偶聯(lián)劑如抓C(l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺)共價地結合到胺官能化的染料 上。在此使用多次甲基染料DY-635(見圖2)。在此，每第100個聚合物鏈被官能化。緊接著，聚 合物借助透析從游離的染料DY-635分離并且借助沉降作用提純。在此，表征通過分子排阻 色譜法（SEC)進行，其中UV/Vis檢測器和RI(折射率，refractive index)檢測器相互組合。 圖2中示出合成的圖形視圖和SEC洗脫曲線。
[009引實例2:納米顆粒的制備
[0096]在聚合物的官能化(實例1)之后，借助單面乳劑(A)和雙面乳劑(B)制備納米顆粒。 在此使用高頻超聲，所述高頻超聲借助表面活性物質(表面活性劑，表面活化劑）、在此聚乙 締醇(PVA)有助于納米級顆粒的形成。疏水聚合物為此溶解于醋酸乙醋中（25mg/ml)，醋酸 乙醋是與可水不混合的溶劑。〇.3%PVA(聚乙締醇)在超純水中用作表面活化劑(表面活性 劑），其中總聚合物濃度為2.5mg/ml。將醋酸乙醋中的聚合物懸浮液添加至具有表面活化劑 的水并且通過超聲形成納米顆粒(A)。如果封入親水物質，那么親水物質首先溶解于水，添 加到醋酸乙醋中的聚合物并且超聲處理。緊接著，對此添加具有表面活化劑的水并且再次 通過超聲形成納米顆粒。在圖3中示出乳膠工藝的結果。
[0097]緊接著，如此制備的、具有大約200nm直徑的納米顆粒在空氣流下攬拌，直至整個 有機溶劑(醋酸乙醋)蒸發(fā)進而顆粒在水中是穩(wěn)定的。為了移除過量的表面活性劑，納米顆 ?；旧嫌贸兯赐恐辽賰纱?。運能夠通過滿旋和在超聲波浴中解育來支持。最后凍干 顆粒并且確定其質量。
[009引圖3:納米顆粒的表征
[0099] 由DY-635-共輛的化GA(DY635-PLGA-NP)構成的納米顆粒W恒定參數(shù)制備和再生 產(chǎn)。為此所使用的化驗如下實施：
[0100] -尺寸：通過動態(tài)光散射（例如ZetasizeHMalvern Instruments GmbH))或通過電 子顯微照片測量溶解于去離子水中的不同的納米結構的載體系統(tǒng)的尺寸。
[0101] -形狀:通過電子