甲醇= 20:1的比例加入甲醇進(jìn)行混合。取約6ml的超純水放入一個(gè)小的玻璃瓶中，加熱至80°C左右，然后將混合好的溶液逐滴慢慢加入玻璃瓶中，邊攪拌邊加入，此過程持續(xù)約30分鐘，加完溶液之后，繼續(xù)攪拌30min，使甲醇和三氯甲烷完全蒸發(fā)掉。然后，停止加熱，室溫下冷卻，將其轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，在4°C和3000rpm條件下離心10分鐘，去掉底部沉淀，收集上清液，此過程重復(fù)三次。分別稱取熒光染料ICG 5mg和多肽R4F-AP 8mg，其中ICG用500μ1的ddH20進(jìn)行溶解，R4F-AP用2ml的ddH20溶解。然后把溶解好的ICG、R4F-AP和FAM溶液加入到上面溶液中，避光放置4°C冰箱中過夜。將此混合物在4°C、3000rpm條件下濃縮至約2ml時(shí)，加滿PBS再進(jìn)行濃縮3次，最后納米顆粒的體積約為3ml左右。在無菌操作臺(tái)上用無菌過濾器過濾，避光保存在4°C冰箱中。
[0060]磁性熒光納米顆粒的納米粒徑圖參見圖1。圖1(左)為磁性熒光納米顆粒的電鏡圖，顯示該材料為近球形且分散性較好。圖1 (右)為磁性熒光納米顆粒的水合粒徑圖，顯示為30nm左右。圖2為磁性熒光納米顆粒的近紅外和磁共振成像圖，表明該材料具備多模成像的特性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磁性熒光納米顆粒是一種單分散性、粒徑均一且具有多模成像特性的納米顆粒。
[0061 ] 實(shí)施例2
[0062]實(shí)施例1中制備得到的磁性熒光納米顆粒對(duì)成熟DC(mDC)的標(biāo)記能力見圖3。圖3顯示磁性焚光納米顆粒能對(duì)mDC進(jìn)行高效焚光標(biāo)記，且在50yg/mL時(shí)對(duì)mDC的形態(tài)沒有大的影響(20%以內(nèi))，而實(shí)驗(yàn)選擇的濃度為20yg/mL。圖4顯示了不同濃度的磁性熒光納米顆粒與mDC共孵育后的細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在50yg/mL的濃度范圍內(nèi)，磁性熒光納米顆粒對(duì)mDCs的生長(zhǎng)沒有顯著性影響。攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs具有熒光特性(圖5)，熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞個(gè)數(shù)的增加而升高。同時(shí)，普魯士藍(lán)染色證明，攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs胞內(nèi)含有大量的磁性氧化鐵物質(zhì)(圖6)。這些結(jié)果表面磁性熒光納米顆粒能賦予DC熒光和磁感應(yīng)特性。
[0063]實(shí)施例3
[0064]實(shí)施例1中制備得到的磁性熒光納米顆粒在有無磁場(chǎng)作用下促進(jìn)DCs迀移能力的比較參見圖7。該步驟如下:
[0065]1)消化DC2.4，接種細(xì)胞至六孔板中，每孔1X106個(gè)細(xì)胞，體積為2ml;2)在接種細(xì)胞的第二天加60μ1的FMP-AP至其中一個(gè)孔中，另一個(gè)加60μ1 PBS作為對(duì)照，孵育時(shí)間為6小時(shí)；3)收集DC2.4，計(jì)數(shù)之后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 106個(gè)/mL; 4)將1 X 106個(gè)上述細(xì)胞放入25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(體積為10ml),并在培養(yǎng)瓶的一側(cè)放置一塊磁鐵作用24小時(shí);5)用剪刀剪下培養(yǎng)瓶的兩側(cè)(培養(yǎng)基覆蓋的區(qū)域)，采用正置顯微鏡進(jìn)行成像。
[0066]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)瓶測(cè)試中，放置磁鐵24小時(shí)后迀移至磁鐵端的壁上的DC細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的9倍(圖7)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，采用磁力牽引能極大地增強(qiáng)DC的迀移能力。
[0067]實(shí)施例4
[0068]實(shí)施例1中制備得到的磁性熒光納米顆粒在有無磁場(chǎng)作用下的迀移至淋巴組織的效率比較。
[0069]l)C57BL/6小鼠的預(yù)處理:
[0070]取5只C57BL/6小鼠，分為兩組，其中實(shí)驗(yàn)組3只，對(duì)照組2只。在實(shí)驗(yàn)組小鼠右側(cè)足墊處分別注射25μ1 (lng/yL)TNF-a進(jìn)行預(yù)刺激;在對(duì)照組的小鼠左側(cè)和右側(cè)足墊各注射25μ1的(lng/yL) TNF-a進(jìn)行預(yù)刺激。
[0071 ] 2)EGFP小鼠來源的BMDC的提取:
[0072]提取EGFP小鼠來源的BMDC，培養(yǎng)至第六天的時(shí)候，加入含有l(wèi)yg/mL的LPS新鮮培養(yǎng)基10ml培養(yǎng)24小時(shí)，使其變?yōu)槌墒霥C。然后，收集細(xì)胞，經(jīng)兩遍清洗后，從新懸浮細(xì)胞至dish中，體積為5ml。在每個(gè)dish中加入ΙΟΟμΙ的FMP-AP共孵育6小時(shí)。
[0073]3)將DC由小鼠足墊處注射:
[0074]6小時(shí)后，收集DC，用無菌PBS洗兩遍，計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度至2.4X107cell/mL。用異氟烷吸入麻醉劑使小鼠處于麻醉狀態(tài)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組小鼠的右側(cè)足注射體積50μ1的DC( 1.2 X106個(gè))。在對(duì)照組的2只小鼠的右側(cè)足墊注射50μ1的DC(1.2X 106個(gè))，并在其左側(cè)足墊注射50μ1 PBS，最后分別在實(shí)驗(yàn)組小鼠的右側(cè)大腿處套上一個(gè)磁鐵，放置24小時(shí)。對(duì)照組不做處理。
[0075]4)采用近紅外整體成像和MRI成像對(duì)腿彎淋巴結(jié)進(jìn)行活體成像。
[0076]結(jié)果顯示，含有磁性熒光納米顆粒的mDCs經(jīng)足墊注射，在經(jīng)過磁場(chǎng)作用后，在腿彎淋巴結(jié)顯示出較強(qiáng)的熒光信號(hào)和磁共振信號(hào)(圖8)。通過熒光強(qiáng)度計(jì)算表明，在磁場(chǎng)作用下mDCs的迀移效率是未加磁場(chǎng)作用的16倍(圖9)。在此實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步使用EGFP-mDCs代替沒有熒光的mDCs，磁力牽引后將腿彎淋巴組織進(jìn)行分離，繼而進(jìn)行活體顯微成像，結(jié)果顯示，磁力牽引組具有較強(qiáng)的EGFP熒光信號(hào)，表明該組織中具有大量的EGFP-mDCs存在，該結(jié)果與圖8的活體成像結(jié)果基本一致(圖10)。
[0077]實(shí)施例5
[0078]實(shí)施例1中制備得到的磁性熒光納米顆粒在研究比較了mDC攝取單獨(dú)抗原多肽gplOO和裝載gplOO磁性焚光納米顆粒運(yùn)載(FMP-gplOO)后的抗原提呈能力，主要是通過比較兩者激活抗原特異性CD8+T細(xì)胞的能力。該實(shí)驗(yàn)主要從gplOO多肽免疫的小鼠腹股溝淋巴結(jié)和脾臟中分離獲取CD8+T細(xì)胞。如圖11所示，T細(xì)胞的增值隨著CD8+T/DC比例的增加而增加，并且FMP-gpl00-DC較gpl00-DC具有明顯增強(qiáng)的促T細(xì)胞增值能力。
[0079]實(shí)施例6
[0080]比較研究了在有無磁場(chǎng)作用下，攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs的抗癌能力。具體方法如下
[0081 ] 1)待DC成熟之后，收集mDC，并再用PBS洗兩遍。計(jì)數(shù)之后，按照每個(gè)dish中加入5ml培養(yǎng)基、3 X106個(gè)DC進(jìn)行培養(yǎng)。然后在其中的三個(gè)dish中加入ΙΟΟμΙ PBS作為空白對(duì)照組進(jìn)行孵育，其余的dish分別加入ΙΟΟμΙ的FMP-AP(鐵的濃度為780yg/mL)與DC共孵育6小時(shí)。最后用PBS調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.4X107個(gè)/mL。
[0082]2)從小鼠足墊處注射體積為50μ1，細(xì)胞數(shù)量為1.2 X 106個(gè)DC:其中5只小鼠注射PBS對(duì)照的DC，另外10只小鼠均注射孵育過FMP-AP的DC，且在其中5只鼠的大腿處放置一磁鐵作用24小時(shí)，接著取下磁鐵。
[0083]3)—個(gè)星期后，再以相同的方式免疫小鼠一次。
[0084]4)接種E.G7-0VA腫瘤細(xì)胞:在小鼠第二次免疫的一個(gè)星期后，在免疫過的一側(cè)接近腿彎淋巴結(jié)處皮下接種數(shù)量為5X106、體積為ΙΟΟμΙ的E.G-7-0VA腫瘤細(xì)胞。
[0085]5)腫瘤體積的測(cè)量:待腫瘤體積長(zhǎng)到肉眼可見的時(shí)候開始測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬、高。然后每隔一天測(cè)量一次，測(cè)量周期為2周，2周后處死小鼠。腫瘤體積按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算:體積=長(zhǎng)X寬2/2。
[0086]如圖12所示，空載DC的腫瘤體積隨著天數(shù)的增加而逐漸增大，F(xiàn)MP-gpl00-DC免疫的小鼠的腫瘤體積一直保持在較低的狀態(tài)，說明了負(fù)載0VA多肽的DC能在體激活機(jī)體的免疫響應(yīng)。值得注意的是，磁場(chǎng)作用能顯著增強(qiáng)FMP-gpl00-DC的抗癌功效，并且有2只小鼠(每組共5只小鼠)在第14天時(shí)腫瘤已完全消失，從而首次在活體上證實(shí)了通過磁力作用可以增強(qiáng)DC的腫瘤預(yù)防功效。
[0087]實(shí)施例7
[0088]實(shí)施例1中的抗原肽序列不只局限于KVPRNQDWL，其它抗原多肽也適用于該體系，比如KTWGQYWQV、SII NFEKL和I SQAVHAAHAE I NEAGR。該促進(jìn)樹突細(xì)胞攝取抗原肽的多肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所述。
[0089]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，其特征在于，所述方法由成熟樹突細(xì)胞攜帶磁性熒光納米顆粒在外加磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-磁性氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機(jī)結(jié)合形成。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的磷脂為DMPC和MHPC。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的近紅外探針為ICG分子。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽是由α螺旋多肽、連接序列和抗原肽以共價(jià)鍵的形式串連而成。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述連接序列的氨基酸序列為GSG，所述抗原肽的氨基酸序列為KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、SIINFEKL或ISQAVHAAHAEINEAGR。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外加磁場(chǎng)為磁鐵產(chǎn)生或者恒定外加磁場(chǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)樹突細(xì)胞遷移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，由成熟樹突細(xì)胞(mDCs)攜帶磁性熒光納米顆粒在外加磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)。所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-磁性氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機(jī)結(jié)合形成。本發(fā)明能有效提高DC活體遷移至淋巴組織的效率，促進(jìn)DC攝取抗原肽后的腫瘤防治功效，以及可以進(jìn)行活體多模式成像檢測(cè)。
【IPC分類】A61K38/10, A61K49/18, A61K47/48, A61P35/00, A61K49/00, A61K38/08, A61K41/00, A61K39/00
【公開號(hào)】CN105477630
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510788151
【發(fā)明人】張智紅, 金紅林, 張宇, 戴艷鋒
【申請(qǐng)人】華中科技大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月17日