專利名稱：Nogo受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)。更為具體的是，本發(fā)明涉及具有免疫原性的Nogo受體-1多肽，Nogo受體-1抗體及其抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體及其融合蛋白以及編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及組合物，其中包含這些Nogo受體抗體或其抗原結(jié)合片段、具有免疫原性的Nogo受體-1多肽、可溶性Nogo受體或其融合蛋白或編碼上述多肽/蛋白質(zhì)的核酸，以及制備和使用上述多肽/蛋白質(zhì)和核酸的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元的軸突和樹突是自神經(jīng)元發(fā)出的長的細(xì)胞延伸。延伸的軸突或者神經(jīng)突末端包含特化的區(qū)域，稱為生長錐。生長錐感受局部環(huán)境并且指導(dǎo)軸突向神經(jīng)元的目標(biāo)細(xì)胞生長。生長錐對許多環(huán)境信號產(chǎn)生應(yīng)答，例如表面粘連性、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和電場。在生長錐處對生長的指導(dǎo)涉及多種不同類型的粘連分子、細(xì)胞間信號以及剌激和抑制生長錐的因子。正在生長的神經(jīng)突其生長錐以不同的速率生長，但通常是每天一到兩mm。生長錐為手形，具有寬而扁平的突出(微刺突或者絲狀偽足)，以不同方式粘附到胚胎的表面，絲狀偽足一直是有活性的，有一些絲狀偽足縮回到生長錐內(nèi)，而其它絲狀偽足繼續(xù)伸長通過基質(zhì)。不同絲狀偽足之間的延伸形成片層足。生長錐用其片層足和絲狀偽足探查其前方及兩側(cè)的區(qū)域。當(dāng)伸長接觸到一個不適于生長的表面時，就會縮回。當(dāng)伸長接觸到一個適于生長的表面時，它就會繼續(xù)延伸并且指引生長錐朝這個方向生長。生長錐可以被基質(zhì)表面特性的微小變化所指引。當(dāng)生長錐到達(dá)一個適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)細(xì)胞時就會產(chǎn)生一個突觸連接。神經(jīng)細(xì)胞的功能受到其臨近環(huán)境中神經(jīng)元和其它細(xì)胞之間接觸的巨大影響(U.Rutishauser，T.M.Jessell，Physiol.Rev.1988，68，p.819)。這些細(xì)胞包括特化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的施旺細(xì)胞，該細(xì)胞用髓鞘(一種多層膜組成的絕緣結(jié)構(gòu))將神經(jīng)元的軸突包住(G.Lemke，in An Introduction to MolecularNeurobiology，Z.Hall，Ed.[Sinauer，Sunderland，Mass.，1992]，p.281)。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元具有損傷之后再生的能力，但是由于在髓鞘中存在抑制蛋白并且很可能由于這些細(xì)胞所處的局部環(huán)境中通常具有其它類型的分子，神經(jīng)元的再生受到抑制(Brittis and Flanagan，Neuron 2001，30，pp.11-14；Jones et al.，J.Neurosci.2002，22，pp.2792-2803；Grimpe etal.，J.Neurosci.2002，22，pp.3144-3160)。在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中已經(jīng)鑒別出了許多髓鞘質(zhì)抑制蛋白，例如NogoA(Chen et al.，Nature，2000，403，434-439；Grandpre et al.，Nature 2000，403，439-444)，髓鞘質(zhì)相關(guān)糖蛋白(MAG，McKerracher et al，Neuron 1994，13，805-811；Mukhopadhyay et al，Neuron 1994，13，757-767)以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OM-gp，Mikoi and Stefansson，J.Cel l.Biol.1988，106，1273-1279)。在分別的研究中，發(fā)現(xiàn)這些蛋白中每一種都是神經(jīng)元Nogo受體-1的配體(Wang etal.，Nature 2002，417，941-944；Liu etal.，Science，2002，297，1190-93；Grandpre etal.，Nature 2000，403，439-444；Chen etal.，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi et al.，Neuron，2002，35，283-90)。Nogo受體-1是一種GPI-錨定的膜蛋白，它含有8個富含亮氨酸的重復(fù)單元(Fournier et al.，Nature 2001，409，341-346)。在與抑制蛋白(例如NogoA，MAG和OM-gp)發(fā)生相互作用時，Nogo受體-1復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，導(dǎo)致生長錐萎陷且神經(jīng)突向外生長受到抑制。現(xiàn)在迫切需要具有這樣的分子，它們能夠抑制Nogo受體-1與其配體間的結(jié)合，并且能減弱髓鞘質(zhì)介導(dǎo)的生長錐萎陷和對神經(jīng)突向外生長的抑制。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可溶性Nogo受體-1多肽和含有這些多肽的融合蛋白，以及針對Nogo受體-1特異性免疫原性區(qū)域的抗體及其抗原性片段。本發(fā)明還涉及結(jié)合本發(fā)明抗體的免疫原性Nogo受體-1多肽。本發(fā)明還涉及可與能結(jié)合Nogo受體-1的單克隆抗體結(jié)合的Nogo受體-1多肽。該多肽尤其可用作免疫原，或者用于篩選抗體鑒定其是否具有與本發(fā)明所述抗體類似特異性。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及編碼本發(fā)明所述多肽的核酸、載體和包含這些核酸的宿主細(xì)胞，以及制備這些多肽的方法。本發(fā)明所述抗體、可溶性受體和受體融合蛋白能拮抗或者阻斷Nogo受體-1，可用于抑制Nogo受體-1與其配體的結(jié)合、抑制神經(jīng)元中生長錐萎陷以及降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長或者出芽的抑制。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種多肽，該多肽選自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO26)；LDLSDNAQLR(SEQ IDNO27)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO30)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO31)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO32)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO33)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO34)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO35)；DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO36)；DNAQLR(SEQ ID NO37)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO41)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO42)；LDLSDNAALRWDPTT(SEQ IDNO43)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO44)；和LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO45)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種編碼所述免疫原性多肽的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸可操作地連接于一表達(dá)調(diào)控序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述核酸或載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明所述多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)含本發(fā)明所述核酸或載體的宿主細(xì)胞，以及從宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收所述多肽。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備抗體的方法，該方法包括下述步驟用選本發(fā)明所述多肽或者用含本發(fā)明所述核酸或含本發(fā)明所述載體的宿主細(xì)胞免疫宿主；以及回收該抗體。本發(fā)明還提供了用該方法制備的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了能特異性結(jié)合本發(fā)明所述多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段。其中所述抗體不是雜交瘤細(xì)胞系HB 7E11(ATCC保藏號為PTA-4587)制備的單克隆抗體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段(a)能抑制神經(jīng)元內(nèi)生長錐萎陷；(b)能降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長和出芽的抑制；以及(c)能抑制Nogo受體-1與配體間的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述的神經(jīng)突向外生長和出芽是軸突生長。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體是單克隆的。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體是一種鼠的抗體。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體選自人源化抗體、嵌合抗體和單鏈抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，該方法包括下述步驟讓Nogo受體-1與本發(fā)明所述抗體或其抗原-結(jié)合片段接觸。一些實(shí)施方案中，所述配體選自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種抑制神經(jīng)元內(nèi)生長錐萎陷的方法，該方法包括下述步驟讓所述神經(jīng)元與本發(fā)明所述抗體或其抗原-結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長或出芽抑制的方法，該方法包含下面的步驟讓神經(jīng)元與本發(fā)明所述抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，所述的神經(jīng)突生長或者出芽是軸突生長。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其中包括藥物學(xué)可接受的載體和本發(fā)明所述抗體或其抗原-結(jié)合片段。一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步還含有一種或多種其它治療劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包含下述步驟讓神經(jīng)元與有效量的本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元處于體外。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元位于哺乳動物體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動物表現(xiàn)出多發(fā)性硬化、ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化癥)、亨丁頓氏癥(Huntington’s disease)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏癥(parkinson’s disease)、糖尿病性神經(jīng)病、中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷等疾病的體征或者癥狀。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供促進(jìn)哺乳動物中的瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的方法，該方法包括(a)提供表達(dá)本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1的抗體或其抗原結(jié)合片段的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；以及(b)將所述宿主細(xì)胞導(dǎo)入該哺乳動物至所述神經(jīng)元所在位置或其附近。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了促進(jìn)哺乳動物的瀕臨死亡的神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包括在神經(jīng)元或其附近位置施用病毒載體，該載體包含編碼本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段由該核苷酸序列在哺乳動物中表達(dá)而成，其表達(dá)量足以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。
附圖簡述

圖1是Nogo受體-1結(jié)構(gòu)的示意圖，人的sNogoR310包含第26-310位殘基，sNogoR344包含第26-344位殘基。大鼠的sNogoR310包含第27-310位殘基，sNogoR344包含第27-344位殘基。圖2是利用Vector NtiTM軟件繪制的Nogo受體-1蛋白的抗原性曲線，大鼠P-617是SEQ ID NO10，大鼠P-618是SEQ ID NO11。圖3A圖示的是抗-Nogo受體-1抗體7E11的結(jié)合活性。該圖顯示了7E11濃度對Nogo66與Nogo受體-1結(jié)合的影響。圖3B圖示的是抗-Nogo受體-1抗體1H2的結(jié)合活性。該圖給出了1H2的濃度對Nogo66與sNogoR344-Fc(在本申請和美國專利申請60/402,866中又稱Fc-sNogoR344或者Ig-sNogoR344)的結(jié)合的影響。Fc-MAG不與Nogo66競爭結(jié)合sNogoR344-Fc。圖4圖示的是抗-Nogo受體-1抗體1H2、3G5和2F7的ELISA結(jié)果。實(shí)驗(yàn)測定了在固定化抗原的存在下抗體對OD450的影響。所述固定化抗原是sNogoR310-Fc(在本申請和美國專利申請60/402,866中又稱Fc-sNogoR310或Ig-sNogoR310)、sNogoR344-Fc、p-617、p-618、p4、p-5以及卵清蛋白和BSA。圖5圖示的是在不同含量的髓鞘質(zhì)存在的條件下，單克隆抗體7E11對大鼠DRG神經(jīng)突向外生長的影響。圖6A圖示了在下列競爭劑存在的條件下sNogoR310與125I-Nogo66和125I-Nogo40結(jié)合的結(jié)果Nogo66、Nogo40和抗-Nogo受體-1單克隆抗體上清。圖6B圖示了125I-Nogo66與sNogoR310的結(jié)合活性。圖7圖示的是sNogoR310-Fc對125I-Nogo40與sNogoR310間結(jié)合的影響。圖8圖示的是sNogoR310-Fc與125I-Nogo40的結(jié)合活性。圖9A給出了在髓鞘質(zhì)存在或者不存在的情況下，sNogoR310對每個細(xì)胞神經(jīng)突向外生長/細(xì)胞的影響，圖9B給出了在髓鞘質(zhì)存在或者不存在的情況下，sNogoR310對神經(jīng)突向外生長的影響。圖10A圖示了存在或者不存在髓鞘質(zhì)含量增加的情況下，sNogoR310-Fc對P4大鼠DRG(背根神經(jīng)節(jié))神經(jīng)突向外生長的影響。因10B圖示的是在使用PBS、PBS+sNogoR310-Fc、20ng髓鞘質(zhì)以及髓鞘質(zhì)+sNogoR310-Fc處理之后每個細(xì)胞中神經(jīng)突的數(shù)目。圖11圖示了在髓鞘質(zhì)含量增加的情況下單克隆抗體5B10對DRG神經(jīng)突向外生長/細(xì)胞的影響。圖12圖示了在大鼠脊髓橫切模型中誘導(dǎo)損傷之后直至30天時sNogoR310-Fc對于BBB得分的影響。圖13A和13B給出的是，在野生型或者08或01品系轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行背部半切斷之后，作為時間函數(shù)的運(yùn)動功能BBB得分(locomotorBBB score)。圖13C圖示的是在野生型或者轉(zhuǎn)基因小鼠損傷之后，作為時間函數(shù)的最大承受傾斜角度(maximal tolerated inclined plane angle)。圖13D顯示了在傾斜格柵爬行試驗(yàn)(inclined grid climbing)中，作為時間函數(shù)的后肢錯誤。在所有這些圖中，給出的數(shù)據(jù)都是每組7-9只小鼠的平均值±s.e.m.。轉(zhuǎn)基因組的數(shù)值與野生型小鼠的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)差異。(兩個星號，P＜0.01；Student’s t-檢驗(yàn))。圖14A顯示的是在對經(jīng)載體或sNogoR310-Fc處理后的動物進(jìn)行背部半切斷后，作為時間函數(shù)的運(yùn)動功能BBB得分，圖14B顯示的是損傷之后格柵行走(grid walking)中，作為時間函數(shù)的后肢錯誤。圖14C顯示的是腳印分析，結(jié)果表明與未受損傷或受損傷但給予了sNogoR310-Fc的大鼠相比，對照小鼠表現(xiàn)出步長變小，步寬增大。在所有這些圖中，給出的數(shù)據(jù)都是每組7-9只小鼠的平均值±s.e.m.。轉(zhuǎn)基因組的數(shù)值與野生型小鼠的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)差異(圖14A-B)。對照數(shù)值與沒有脊髓損傷或者脊髓損傷但給予sNogoR310-Fc小鼠的數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)差異(圖14C)。(星號，p＜0.05；兩個星號，P＜0.01；Student’s t-檢驗(yàn))。
發(fā)明詳述定義及一般技術(shù)除另有定義外，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。如有沖突，以本申請的定義為準(zhǔn)。而且，除非上下文有特別說明，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語也包括單數(shù)。本申請中的所有出版物、專利和參考文獻(xiàn)在此全文引入作為參考，用于所有目的。盡管在實(shí)施或者驗(yàn)證本發(fā)明時可以使用與本申請所述類似或等同的材料和方法，但是下文仍然描述了適宜的方法和材料。材料、方法和實(shí)例僅僅是范例性的，其目的并非限制。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將會在詳述和權(quán)利要求中顯現(xiàn)出來。在本說明書和權(quán)利要求中，″包含″一詞其含義應(yīng)該被理解為包括特定的一個個體或一組個體，同時也不把任一其它個體或任一組其它個體排除在外。本申請中提供以下的術(shù)語和定義，以便更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。本申請所使用的″抗體″是指完整的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明所述的抗體可以是任一同種型或者任一類(例如M，D，G，E和A)或者是任一亞類(例如G1-4，A1-2)，并且可以具有κ或λ輕鏈。本申請所使用的″Fc″是指通過木瓜蛋白酶降解得到的抗體重鏈恒定區(qū)的那一部分。本申請所使用的，″NogoR融合蛋白″是指包含與異源多肽融合的可溶性Nogo受體-1基元的蛋白質(zhì)。本申請所使用的，″人源化抗體″是指抗體中至少一部分的非人序列被人的序列所代替。如何制備人源化抗體的例子可以在美國專利6,054,297，5,886,152和5,877,293中找到。本申請所使用的″嵌合抗體″的含義是抗體中含有第一抗體的一個或多個區(qū)域以及至少一種其它抗體的一個或多個區(qū)域，所述的第一抗體和其它抗體可以來源于相同或者不同的物種。本申請和美國專利申請60/402,866中使用的″Nogo受體”，“NogoR”“NogoR-1，”“NgR，”和“NgR-1”都是指Nogo受體-1。
Nogo受體-1多肽一方面本發(fā)明涉及具有免疫原性的Nogo受體-1多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述免疫原性的多肽基本上由選自下列的氨基酸序列組成LDLSDNAQLRWDPTT(大鼠)(SEQ ID NO1)；LDLSDNAQLRSVDPAT(人)(SEQ ID NO2)；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO3)；AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ ID NO4)；和CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO5)。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可與能結(jié)合Nogo受體-1的單克隆抗體結(jié)合的Nogo受體-1多肽。一些實(shí)施方案中，所述多肽可被單克隆抗體7E11識別。一些實(shí)施方案中，所述多肽選自LDLSDNAQLR(SEQ ID NO28)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO30)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO31)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO32)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO33)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO34)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO35)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO36)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO37)；DNAQLR(SEQ ID NO38)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO42)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO43)；LDLSDNAALRWDPTT(SEQ IDNO44)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO45)；或LDLSDNAQLAWDPTT(SEQID NO46)。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼SEQ ID NO1-5、26-27、29-37和41-45所示多肽的核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述核酸分子與表達(dá)調(diào)控序列(例如pCDNA(I))相連。本發(fā)明還涉及載體，其中含有編碼本發(fā)明所述免疫原性多肽的核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述載體是克隆載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述載體含有至少一種選擇性標(biāo)記。本友明還涉及宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞包含上述核酸或載體。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明所述免疫原性多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是酵母。
抗體本發(fā)明還涉及與本發(fā)明所述Nogo受體-1多肽特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或者抗原結(jié)合片段可與一種多肽結(jié)合，該多肽基本上由選自SEQ ID NO1-5、26-27、29-37和41-45的氨基酸序列組成。本發(fā)明所述抗體或者抗原結(jié)合片段可以在體內(nèi)或者體外制備，以下討論所述抗體或其抗原結(jié)合片段的制備。本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段能抑制Nogo受體-1與配體(例如NogoA，NogoB，NogoC，MAG，OM-gp)的結(jié)合并降低髓鞘介導(dǎo)的對神經(jīng)突向外生長和出芽(特別是軸突生長)的抑制，且能減弱髓鞘介導(dǎo)的生長錐萎陷。在一些實(shí)施方案中，抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠的。在一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1來自大鼠。在另一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1是人的。在一些實(shí)施方案中抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段是重組的、工程化的、人源化的和/或嵌合的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體選自單克隆抗體7E11(ATCC保藏號PTA4587)；單克隆抗體1H2(ATCC保藏號PTA-4584)；單克隆抗體2F7(ATCC保藏號PTA-4585)；單克隆抗體3G5(ATCC保藏號PTA-4586)；以及單克隆抗體5B10(ATCC保藏號PTA-4588)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是多克隆抗體46。有代表性的抗原結(jié)合片段是Fab、Fab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v、Fd、dAb以及含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體和含有至少部分免疫球蛋白的多肽，這部分免疫球蛋白足以賦予該多肽特異性的抗原-結(jié)合能力(例如免疫粘附素)。在本申請中，F(xiàn)d是指由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段；Fv是指由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段。dAb是指是由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的片段(Ward et al.，Nature 341544-546，1989)。本申請中使用的單鏈抗體(scFv)是指這樣一種抗體，其中所述的VL區(qū)和VH區(qū)通過一合成接頭配對形成一種單價分子，該合成接頭使得VH區(qū)和VL區(qū)成為了一個蛋白單鏈(Bird et al.，Science 242423-426，1988和Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883，1988)。本申請中使用的雙抗體是指雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于多肽單鏈上，但是由于所使用接頭的太短，而不能使所述同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)配對，這樣就迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對從而生成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，例如，Holliger，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993，and Poljak，R.J.，et al.，Structure 21121-1123，1994)。本申請中使用的可特異性結(jié)合目的抗原的免疫粘附素是指其中共價或非共價地引入了一個或多個CDR的分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述Nogo受體-1抗體的亞單位多肽，其中所述的亞單位多肽選自(a)重鏈或其可變區(qū)；和(b)輕鏈或其可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸編碼本發(fā)明所述Nogo受體-1抗體亞單位多肽的重鏈或其可變區(qū)，或者輕鏈或其可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述Nogo受體-1抗體的高變區(qū)(CDR)或編碼CDR的核酸。
免疫本發(fā)明所述的抗體可以通過免疫接種合適的宿主(例如脊椎動物，包括人、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬、爬行動物、魚、兩棲動物以及禽類、爬行動物和魚的卵中)制得。所述抗體可以是多克隆或者單克隆的。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明所述具有免疫原性的Nogo受體-1多肽免疫宿主。在另一些實(shí)施方案中，使用與完好或者破裂細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合的Nogo受體-1免疫宿主，通過與本發(fā)明所述Nogo受體-1多肽的結(jié)合來鑒定出本發(fā)明所述抗體。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體-1抗原與佐劑一起施用以刺激免疫應(yīng)答。通常除了抗原之外還需要施用佐劑以激發(fā)對于抗原的免疫應(yīng)答，這些佐劑通常是不溶的或者是不能降解的物質(zhì)，會引發(fā)非特異性的炎癥，吸引單核巨噬細(xì)胞到達(dá)免疫接種位置。佐劑的實(shí)例包括，但不限于，弗氏佐劑，RIBI(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)或其片段。抗體制備方法的綜述，參見例如，Harlow and Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual，Yelton，D.E.et al.(1981)；Ann.Rev.ofBiochem.，50，pp.657-80.，and Ausubel et al.(1989)；Current Protocols inMolecular Biology(New YorkJohn Wiley&Sons)。與本發(fā)明所述免疫原性Nogo受體-1多肽的免疫反應(yīng)性的測定，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的許多方法，包括例如，免疫印跡檢測和ELISA。
抗體及生產(chǎn)抗體的細(xì)胞系的制備本發(fā)明的單克隆抗體可以通過如Harlow和Lane(1988)，(同上)中描述的常規(guī)方法制備。簡而言之，在合適時機(jī)殺死動物，用本領(lǐng)域熟知的幾種技術(shù)中的一種使淋巴結(jié)和/或脾臟B細(xì)胞無限增殖化，這些方法包括，但不限于，轉(zhuǎn)化例如使用EBV或者與無限增殖化的細(xì)胞系例如骨髓瘤細(xì)胞融合。之后將細(xì)胞分為單個的克隆，檢測每一個克隆的上清是否產(chǎn)生了特異性針對本發(fā)明所述免疫原性Nogo受體-1多肽的抗體。篩選、克隆及擴(kuò)增雜交瘤的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。類似的，測定免疫球蛋白核苷酸和氨基酸序列的方法也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。其它制備本發(fā)明所述抗體的適宜方法包括在體外讓淋巴細(xì)胞與Nogo受體-1接觸或者與本發(fā)明所述免疫原性多肽接觸。另一種方法是在噬菌體或者類似載體中篩選抗體文庫，參見Huse et al.，Science，246，pp.1275-81(1989)。本發(fā)明使用的抗體可以是經(jīng)過修飾的或者是沒有經(jīng)修飾的?？梢詫⒖乖?本申請是指Nogo受體-1或者本發(fā)明所述免疫原性多肽)和抗體與可以提供可檢測信號的物質(zhì)進(jìn)行共價或者非共價連接而對抗原和抗體進(jìn)行標(biāo)記，本領(lǐng)域內(nèi)已有多種不同的標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)，可以在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)踐中使用。適宜的標(biāo)記物包括，但不限于，放射性核苷酸、酶、底物、輔酶、抑制劑、熒光試劑、化學(xué)發(fā)光試劑、磁性粒子等等。教導(dǎo)如何使用這些標(biāo)記物的專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，還可以制備重組免疫球蛋白(參見美國專利4,816,567)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述抗體有多種結(jié)合特異性，例如雙功能抗體，它可以使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道的眾多技術(shù)來制備，包括制備雜交瘤、二硫鍵交換、化學(xué)交聯(lián)、在兩個單克隆抗體之間添加多肽連接物、向某一個細(xì)胞系中引入二套免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，等等，更詳細(xì)的討論參見下文)。本發(fā)明所述的抗體還可以是人單克隆抗體，例如那些由無限增殖的人細(xì)胞系產(chǎn)生的、由SCID-hu小鼠或者其它能夠產(chǎn)生″人″抗體的非人動物產(chǎn)生。
噬菌體展示文庫可以通過篩選重組聯(lián)合抗體文庫，篩選出本發(fā)明所述的抗Nogo受體-1抗體。用于與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽結(jié)合的范例性的聯(lián)合文庫，例如，使用VL和VHcDNA制備的scFv噬菌體展示文庫，該cDNA由源自經(jīng)本發(fā)明所述Nogo受體-1多肽免疫后動物的mRNA制得。制備和篩選這種文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。有商品化的材料和方法可用于制備噬菌體展示文庫(例如the Pahrmacia recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；the Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，目錄號240612；and others from MorphoSys)。還有其它可以用于制備和篩選抗體展示文庫的方法和試劑(參見例如Ladner et al.U.S.Pat.No.5,223,409；Kang etal.PCT公開文本W(wǎng)O 92/18619；Dower et al.PCT公開文本W(wǎng)O 91/17271；Winter et al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/20791；Markland et al.PCT公開文本W(wǎng)O92/15679；Breitling et al.PCT公開文本W(wǎng)O 93/01288；McCafferty et al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/01047；Garrard et al.PCT公開文本W(wǎng)O 92/09690；Fuchs etal.(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse et al.(1989)Science 2461275-1281；McCaffertyetal.，Nature(1990)348552-554；Griffiths et al.(1993)EMBO J.12725-734；Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226889-896；Clackson et al.(1991)Nature352624-628；Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893576-3580；Garrad et al.(1991)Bio/Technology 91373-1377；Hoogenboom et al.(1991)Nucl.Acids Res.194133-4137；and Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.887978-7982)。從重組免疫球蛋白展示文庫中篩選和分離出本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體之后，可以從展示的噬菌體中(例如從噬菌體基因組中)回收編碼所選抗體的核酸，并通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)將其亞克隆入其它表達(dá)載體中。如果需要的話，還可以進(jìn)一步對核酸進(jìn)行處理，以制備本發(fā)明所述的其它抗體形式，如下所述。為了表達(dá)通過篩選聯(lián)合文庫分離出的抗體，將編碼該抗體重鏈和輕鏈或者輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA克隆入重組表達(dá)載體，并將該載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞，如上所述。
類別轉(zhuǎn)換本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體可以是任一同種型。通過類別轉(zhuǎn)換可以得到任何所需要的抗體同種型。就類別轉(zhuǎn)換而言，使用本領(lǐng)域熟知的方法分離出編碼VL或者VH的核酸，其中不合任一CL和CH的編碼序列，然后將編碼VL或者VH的核酸與編碼來自所需類別免疫球蛋白分子的CL或者CH的核苷酸序列可操作地連接在一起?？梢酝ㄟ^使用包含CL或CH鏈的載體或者核酸來實(shí)現(xiàn)這種連接，如上所述。例如，可以通過類別轉(zhuǎn)換將最初為IgM的本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體變?yōu)镮gG抗體。另外，還可以利用類別轉(zhuǎn)換將一個IgG亞類變?yōu)榱硪粋€IgG亞類，如從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2。
突變的抗體在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體或抗原結(jié)合片段可以在重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，以改變抗體的結(jié)合特性。例如，可以在一個或多個CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行突變，以升高或者降低抗體對Nogo受體-1的Kd值，升高或降低Koff值，或者改變抗體的結(jié)合特異性。定點(diǎn)誘變技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。參見例如Sambrook et al.和Aumbel et al.，同上。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體可變區(qū)中這樣的氨基酸殘基突變，已知這樣的殘基與種系相比已經(jīng)發(fā)生了改變。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體可變區(qū)中的一個或多個氨基酸殘基突變，已知該殘基與種系相比已經(jīng)發(fā)生了改變。在另一個實(shí)施方案中，在一個或多個框架區(qū)域內(nèi)使編碼抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)的核酸發(fā)生突變?？梢栽诳蚣軈^(qū)或恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行突變以提高半衰期。在框架區(qū)或者恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變還可以改變抗體的免疫原性，為抗體共價或者非共價結(jié)合另一個分子提供一個位點(diǎn)，或者改變補(bǔ)體結(jié)合等特性?？梢栽趩我煌蛔兛贵w的每個框架區(qū)、恒定區(qū)及可變區(qū)中都進(jìn)行突變。也可以僅在單一突變抗體的框架區(qū)、恒定結(jié)構(gòu)域和可變區(qū)其中之一進(jìn)行突變。
融合抗體和免疫粘附素在另一個實(shí)施方案中，可以制備融合抗體或者免疫粘附素，其中包含與另一多肽相連的本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體的全部或者一部分。在一些實(shí)施方案中，只有抗-Nogo受體-1抗體的可變區(qū)與多肽相連。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體的VH結(jié)構(gòu)域與第一多肽相連，而該抗體的VL結(jié)構(gòu)域與第二多肽相連，所述第二多肽與第一多肽通過可使VH和VL結(jié)構(gòu)域相互作用形成抗體結(jié)合位點(diǎn)的方式連接在一起。在其它實(shí)施方案中，VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域被一個接頭隔開，該接頭可使VH和VL結(jié)構(gòu)域相互作用(參見下文的單鏈抗體部分)。然后將該VH-接頭-VL抗體與目標(biāo)多肽相連。融合抗體用于指導(dǎo)多肽進(jìn)入表達(dá)Nogo受體-1配體的細(xì)胞或者組織中。目標(biāo)多肽可以是治療劑，例如毒素，或者是診斷劑，例如易于顯色的酶，如辣根過氧化物酶。此外，融合抗體還可以利用兩條(或者多條)單鏈抗體相互連接而制得，如果需要在單個多肽鏈上創(chuàng)建二價或者多價抗體，或者制備雙特異性抗體，可以使用該方法。
單鏈抗體本發(fā)明包括與本發(fā)明的免疫原性Nogo受體-1多肽結(jié)合的單鏈抗體(scFv)。為了制備scFv，將編碼VH-和VL-的DNA與編碼柔性接頭例如氨基酸序列(Gly4-Ser)3的DNA可操作地連接在一起，從而可將VH和VL序列表達(dá)為一種連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其中所述的VL和VH區(qū)由一個柔性接頭連接在一起(參見例如Bird et al.(1988)Science 242423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCafferty et al.，Nature(1990)348552-554)。所述單鏈抗體可以是單價的，如果僅僅使用一個VH和一個VL；所述單鏈抗體可以是二價的，如果使用兩個VH和兩個VL；所述單鏈抗體可以是多價的，如果使用二個以上VH和VL。
嵌合抗體本發(fā)明還包括雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其中的一種特異性是針對本發(fā)明所述免疫原性Nogo受體-1多肽。在一個實(shí)施方案中，可以制備一種嵌合抗體，該抗體通過一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明所述Nogo受體-1多肽特異性地結(jié)合，而通過第二個結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二個分子結(jié)合。嵌合抗體可以通過重組分子生物學(xué)技術(shù)制備，也可以物理地偶聯(lián)在一起。此外，可以制備一種含一個以上VH和VL的單鏈抗體，該抗體能特異性地結(jié)合本發(fā)明所述多肽及另一分子，該分子與減弱髓鞘介導(dǎo)生長錐萎陷以及降低對神經(jīng)突向外生長和出芽的抑制有關(guān)。這種雙特異性抗體可以使用眾所周知的技術(shù)來制備，例如Fanger et al.Immunol Methods 472-81(1994)and Wrightand Harris，supra.and in connection with(iii)see e.g.，Traunecker et al.Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明所述抗體的一個或多個可變區(qū)制備嵌合抗體。在另一個實(shí)施方案中，使用所述抗體的一個或多個CDR區(qū)制備嵌合抗體。
衍生的及標(biāo)記的抗體可以對本發(fā)明所述抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)行衍生化，或者將其與另一分子(例如另一多肽或蛋白質(zhì))連接。通常，抗體及抗原結(jié)合片段的衍生化要保證其與本發(fā)明所述多肽間的結(jié)合不受衍生化或者標(biāo)記的不利影響。例如，可以將本發(fā)明所述抗體或抗體部分功能性連接(例如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價偶聯(lián)或者其它方法)于一個或多個其它分子個體，例如另一抗體(如雙特異性抗體或雙抗體)、檢測試劑、細(xì)胞毒性試劑、藥物和/或能介導(dǎo)抗體或抗原結(jié)合片段與另一分子結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽(例如鏈霉親和素核心區(qū)或多聚組氨酸標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方案中，通過交聯(lián)兩種或者多種抗體(屬于同一型或不同型，例如，制備雙特異性抗體時)得到衍生化抗體，適宜的交聯(lián)接頭包括那些異雙功能試劑，即帶有被適當(dāng)?shù)膯柛粑锔糸_的兩種不同反應(yīng)基團(tuán)的物質(zhì)(例如鄰-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或者同雙功能試劑(例如二琥珀酰亞胺基辛二酯)。這種接頭可以從Pierce Chemical Company，Rockford，Ill獲得。在一些實(shí)施方案中，所述衍生化的抗體是標(biāo)記后的抗體。例如，用于對本發(fā)明所述抗體或抗體部分衍生化的檢測試劑是熒光化合物，包括熒光素，異硫氰酸熒光素，羅達(dá)明，5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯，藻紅素，鑭系磷光物等。也可以用可檢測的酶標(biāo)記抗體，例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。在使用可檢測酶標(biāo)記的實(shí)施方案中，通過加入其它試劑檢測抗體，酶利用這些試劑產(chǎn)生可檢測的反應(yīng)產(chǎn)物，例如對于辣根過氧化物酶而言，使用過氧化氫和二氨基聯(lián)苯，還可以使用生物素標(biāo)記抗體，通過間接測量親和素和鏈霉親和素的結(jié)合來檢測。還可以使用被第二報告分子(例如亮氨酸拉鏈對序列、二抗的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)識別的、事先確定的多肽表位來標(biāo)記抗體。還可以使用放射性標(biāo)記氨基酸標(biāo)記抗-Nogo受體-1抗體或者其抗原片段。放射性標(biāo)記可以用于診斷或者治療的目的。放射性標(biāo)記的抗-Nogo受體-1抗體可以在診斷中使用，例如用于測定受試者的Nogo受體-1水平。而且，放射性標(biāo)記的抗-Nogo受體-1抗體還可以用于治療，用于治療脊髓損傷。多肽的標(biāo)記物的實(shí)例包括，但不限于，下列放射性同位素或放射性核苷酸-3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I?？?Nogo受體-1抗體或者其抗原片段還可以通過化學(xué)基因，例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或者糖基被衍生化。這些基因?qū)τ谠鰪?qiáng)抗體的生物學(xué)性質(zhì)是有用的，例如增加血清的半衰期或者增加對組織的結(jié)合。
抗-Nogo受體-1抗體的特性抗-Nogo受體-1抗體的類和亞類可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來確定抗-Nogo受體-1抗體的類別和亞類。通常，可以使用對于某個特定抗體類和亞類特異的抗體來確定某個抗體的類和亞類。這類抗體是商品化的。可以使用ELISA、蛋白質(zhì)印跡以及其它的技術(shù)來確定類和亞類?；蛘呖梢詼y定抗體重鏈和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的部分或者全部的序列，將它們的氨基酸序列與多種不同類和亞類的免疫球蛋白的已知氨基酸序列進(jìn)行比較，來確定抗體的類和亞類。
抗-Nogo受體-1抗體與Nogo受體-1的結(jié)合親和力本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體與本發(fā)明的Nogo受體-1多肽的結(jié)合親和力與解離速率可以使用本領(lǐng)域已知的方法來測定。例如可以通過競爭ELISA、RIA、BIAcore或者KinExA技術(shù)來測量結(jié)合親和力，也可以用BIAcore或者KinExA技術(shù)測量解離速率。通過表面胞質(zhì)共振，使用例如BIAcore來測量結(jié)合親和力和解離速率。經(jīng)測定，7E11和1H2的Kd分別為1×10-7和2×10-8M。
通過抗-Nogo受體-1抗體抑制Nogo受體-1的活性在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體或者其抗原結(jié)合片段可抑制Nogo受體-1與配體間的結(jié)合?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法例如ELISL、RIA或者功能性拮抗作用來測量這種抑制的IC50。在一些實(shí)施方案中，所述IC50為0.1-500nM，在一些實(shí)施方案中，所述IC50為10-400nM。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體或者其部分的IC50為60-400nM。在結(jié)合試驗(yàn)中，測定的7E11和1H2的IC50分別為400nM和60nM。參見下文表3?？傊?，在本發(fā)明的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能找到很多方法來改變本發(fā)明抗體的生物學(xué)特性，這些方法包括提高或者降低給定抗體分子的穩(wěn)定性或半衰期、免疫原性、毒性、親和力或產(chǎn)量的方法，或者以任何其它方式改變抗體使其更加適合于特定用途。下文對含本發(fā)明所述抗體的組合物以及本發(fā)明所述抗體的用途進(jìn)行描述可溶性Nogo受體-1多肽蛋白質(zhì)全長的Nogo受體-1由信號序列、N-末端區(qū)域(NT)、8個富含亮氨酸的重復(fù)單元(LRR)、LRRCT區(qū)(位于所述8個富含亮氨酸重復(fù)單元C末端的富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域)、C-末端區(qū)(CT)和GPI錨定物組成(參見圖1)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案提供了可溶性的Nogo受體-1多肽。本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽包含NT結(jié)構(gòu)域、8個LRR和一個LRRCT結(jié)構(gòu)域，但是沒有信號序列和功能性的GPI錨定物(即沒有GPI錨定物，或有一個但不能與細(xì)胞膜有效結(jié)合的GPI錨定物)。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體-1多肽包含異源的LRR。在一些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體-1多肽包含2，3，4，5，6，7或8個異源的LRR。異源LRR是指來自于除Nogo受體-1以外的另一蛋白的LRR。可以得到的獲取異源LRR的蛋白質(zhì)實(shí)例有toll-樣受體(TLR1.2)；T-細(xì)胞活化富含亮氨酸重復(fù)單元蛋白；deceorim；OM-gp；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白酸性不穩(wěn)定亞基slit和robo；以及toll-樣受體4。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了319個氨基酸長的可溶性Nogo受體-1多肽(可溶性Nogo受體-1344，sNogoR1-344，或sNogoR344)(SEQ ID NO6和8中的第26-344位殘基或者SEQ ID NO8的第27-344位殘基)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了285氨基酸長的可溶性Nogo受體-1多肽(可溶性Nogo受體-1310，sNogoR1-310，或sNogoR310)(SEQ IDNO7和9的第26-310位殘基或者SEQ ID NO9的第27-310位殘基)。見圖1。
表1.人和大鼠的Nogo受體-1多肽序列 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的可溶性Nogo受體1多肽抑制配體與Nogo受體-1的結(jié)合，充當(dāng)Nogo受體-1配體的拮抗劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽來降低對神經(jīng)元內(nèi)部神經(jīng)突向外生長和出芽(例如軸突生長)的抑制，抑制髓鞘介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)的生長錐萎陷。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。令人驚奇的是，sNogoR310和sNogoR344能夠阻斷NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp與Nogo受體-1間的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽是融合蛋白的組分，該融合蛋白還包括異源多肽。在一些實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域是重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述異源多肽是Fc片段。在一些實(shí)施中，所述Fc與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽的C末端連接。在一些實(shí)施方案中，Nogo受體-1融合蛋白是一種二聚休。
本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明所述多肽的核酸，所述多肽包括SEQID NO1-9、26-27、29-37和41-45中的任一多肽。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼的多肽選自SEQ ID NO6和8所示Nogo受體-1的第26-344位氨基酸殘基，或SEQ ID NO8所示Nogo受體-1的第27-344位氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼的多肽選自SEQ ID NO7和9所示Nogo受體-1的第26-310位殘基或SEQ ID NO9所示Nogo受體-1的第27-310位殘基。本申請所使用的“核酸”指的是基因組DNA、cDNA、mRNA和反義分子，以及以其它骨架為基礎(chǔ)的核酸或者包括了天然來源或者合成的其它堿基。在一些實(shí)施方案中，所述核酸還包含轉(zhuǎn)錄啟動子，以及任選的信號序列，它們都可操作地連接于編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明所述Nogo受體-1融合蛋白的核酸，包括含有選自下列的多肽的融合蛋白SEQ ID NO6和8所示Nogo受體-1的第26-344位氨基酸殘基，或SEQ ID NO:8所示Nogo受體-1的第27-344位氨基酸殘基；以及SEQ ID NO7和9所示Nogo受體-1的第26-310位殘基，或SEQ ID NO9所示Nogo受體-1的第27-310位殘基。在一些實(shí)施方案中，編碼Nogo受體-1融合蛋白的核酸還包含轉(zhuǎn)錄啟動子，以及任選的信號序列。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列還編碼免疫球蛋白恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白恒定區(qū)是重鏈恒定區(qū)，在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列還編碼與絞鏈區(qū)相連的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述核酸還編碼Fc。在一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1融合蛋白包含F(xiàn)c片段。本發(fā)明的編碼核酸還可以被進(jìn)一步修飾使其包含用于診斷和探測目的的可檢測標(biāo)記物。在本領(lǐng)域內(nèi)已知有多種這樣的標(biāo)記物，并且可以很容易地用于本申請描述的編碼分子。適宜的標(biāo)記物包括，但不限于，生物素、放射性標(biāo)記核苷酸等，一個本領(lǐng)域技術(shù)人員可以運(yùn)用本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的標(biāo)記物得到標(biāo)記的編碼核酸分子。
組合物在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，該組合物包含選自下列序列的多肽SEQ ID NO1-5、26-27、29-37和41-45。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，它們包含本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段，或者可溶性Nogo受體-1多肽或者融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以含有適宜的藥物學(xué)上可接受的載體，包括賦形劑和輔助物(auxiliaries)，它們的作用是促進(jìn)活性化合物被加工成為可以被作為藥物使用遞送到作用位點(diǎn)的制劑。適宜的腸胃外給藥制劑包括水溶形式活性化合物的水溶液，如可溶于水的鹽。此外，還可以施用活性化合物的懸液，如適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙?。適宜的親脂溶劑或賦形劑包括脂肪油，如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯。含水注射懸液可以含有增強(qiáng)懸液粘稠度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。任選地，所述懸液中還可以包含穩(wěn)定劑。還可以使用脂質(zhì)體包裹本發(fā)明所述分子用于向細(xì)胞內(nèi)的遞送。示例性的″藥物可接受載體″是指任一及全部的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑、以及生理學(xué)相容物、水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、右旋葡萄糖、甘油、乙醇等以及上述物質(zhì)的組合。在一些實(shí)施方案中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含藥物上可接受的物質(zhì)，例如潤濕劑或者少量的輔助物，例如潤濕劑、乳化劑，防腐劑或緩沖劑，這些物質(zhì)延長了保存期或者提高了本發(fā)明所述抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體或者融合蛋白的效力。本發(fā)明所述的組合物可以多種形式存在，包括例如液態(tài)、半固態(tài)以及固態(tài)劑型，例如液態(tài)溶液(如可注射和可灌注的溶液)、分散系或懸液。優(yōu)選的劑型取決于要采用的給藥方式和治療用途。在一些實(shí)施方案中，所述組合物的劑型是可注射和可灌輸溶液，與用其它抗體對人進(jìn)行被動免疫所用的組合物類似。所述組合物可以配制為溶液、微乳劑、分散系、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的規(guī)則結(jié)構(gòu)。將抗-Nogo受體-1抗體按照要求加入所需量的適當(dāng)溶劑(溶劑中含有以上列舉成分中的一種或組合)中，過濾除菌，制備成為滅菌的注射用溶液。通常，將活性化合物加入滅菌載體制備分散系，該載體中含有堿性的分散介質(zhì)，以及所需的上述其它成分)。就用于配制滅菌注射溶液用的滅菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，得到活性成分和其它成分的粉末，這些成分均來自事先過濾除菌的溶液?？梢酝ㄟ^下列方式保持溶液的合適流動性讓用包衣，例如卵磷脂；對于分散體而言，保持所需的粒徑；以及使用表面活性劑。通過在組合物中加入延緩吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠來延長注射組合物的吸收。在一些實(shí)施方案中，可以在配制活性化合物時加入能防止化合物迅速釋放的載體，例如控制釋放制劑，包括植入體、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸镉H和的多聚物，例如乙烯乙酸樹臘、聚酸肝、聚乙醇酸、膠原、聚正酯和聚乳酸。許多制備這種制劑的方法已獲專利保護(hù)并且通常已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。還可以在組合物中引入補(bǔ)充性的活性化合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段、或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白可以與一種或多種其它治療劑共同配制和/或共同給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以含有″治療有效量″或者″預(yù)防有效量″的本發(fā)明所述抗體、抗原結(jié)合片段、多肽或融合蛋白?！逯委熡行Я俊迨侵冈谒鑴┝亢蜁r間內(nèi)能有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期治療效果的量。Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段、或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白的治療有效量可根據(jù)個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重等因素而有所不同。治療有效量還指能確保所述抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽或者Nogo受體融合蛋白獲得的治療有益效果超過任何毒副作用的量?！孱A(yù)防有效量″是指在所需劑量和時間內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期預(yù)防效果的量，通常因?yàn)榻o對象使用預(yù)防劑量是在發(fā)病以前或者發(fā)病的早期，所以預(yù)防有效量要低于治療有效量。可以調(diào)整給藥劑量以提供最佳的預(yù)期反應(yīng)(例如治療或預(yù)防反應(yīng))。例如可以快速灌注，或者一定時間內(nèi)分劑量施用，或者可以治療情況的迫切程度按比例減少或增加劑量。將腸胃外組合物配制為劑量單位形式是非常有利的，使藥物的給服變得不費(fèi)力。本申請使用的劑量單位形式的均一性是指適于作為治療哺乳動物受試者單位劑量的物理學(xué)上的獨(dú)立單位，每個單位含有經(jīng)計算可產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量的活性化合物以及所需的藥物載體。本發(fā)明所述劑量單位形式的具體規(guī)格直接取決于(a)抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性受體-1多肽或Nogo受體融合蛋白的獨(dú)特性質(zhì)以及需要達(dá)到的特定的治療或預(yù)防效果，和(b)用于個體過敏反應(yīng)(sensitivity)治療時配合所述抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性受體1多肽或Nogo受體融合蛋白的固有限制。在一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.1-4mg/千克體重/天。在一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.2-4mg每千元體重/天，在一些實(shí)施方案中，所述Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量范圍是0.2mg每千元體重/天。
抗體、抗原、結(jié)合片段、可溶性抗體和融合蛋白的用途在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過向有需要的哺乳動物施用所述抗-Nogo受體-1抗體、該抗體的抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽或含所述多肽的融合蛋白，抑制Nogo受體-1活性的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，該方法包含下面的步驟讓Nogo受體-1與本發(fā)明所述抗體或抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，配體選自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元內(nèi)生長錐萎陷的方法，該方法包含下述步驟讓神經(jīng)元與本發(fā)明所述抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長或出芽抑制的方法，該方法包含下述步驟讓神經(jīng)元與本發(fā)明所述抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)突向外生長或出芽是軸突生長。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了促進(jìn)哺乳動物瀕臨死亡神經(jīng)元存活的方法，該方法包含下述步驟a)提供一種培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)(i)抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段，或(ii)可溶性Nogo受體-1多肽；以及(b)將宿主細(xì)胞引入哺乳動物神經(jīng)元所在的位置或者其附近。Almudena Ramon-Cueto，M Isabel Cordero，F(xiàn)ernando F Santos-Benito andJesus Avila(2000)Functional recovery of paralegic rats and motor axonregneration in their spinal cords by olfactory ensheathing cells.Neuron25，425-435。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了促進(jìn)哺乳動物瀕臨死亡神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包含下述步驟在神經(jīng)元所在的位置或者其附近施用病毒載體，該載體包含編碼(a)抗Nogo受體-1抗體或者其抗原結(jié)合片段；或(b)可溶性Nogo受體-1多肽的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片段或可溶性Nogo受體-1多肽由乳動物體內(nèi)的核苷酸序列表達(dá)，其表達(dá)量足以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。病毒載體和這些方案可使用方法的描述見，例如Noel et al.，Human Gene Therapy，13，1483-93(2002)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制Nogo受體-1與配體結(jié)合的方法，該方法包含下述步驟讓配體與本發(fā)明所述可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)Nogo受體-1配體活性的方法，該方法包含下述步驟讓Nogo受體-1配體與本發(fā)明所述可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制神經(jīng)元內(nèi)生長錐萎陷的方法，該方法包含下述步驟讓Nogo受體-1配體與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽或者Nogo受體-1融合蛋白接觸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長或出芽的抑制的方法，該方法包含下述步驟讓Nogo受體1配體與本發(fā)明的可溶性Nogo受體-1多肽或Nogo受體-1融合蛋白接觸。在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，所述配體選自NogoA，NogoB，NogoC，MAG和OM-gp。在一些實(shí)施方案中，所述的神經(jīng)突向外生長或出芽是軸突生長。在本申請描述的任一類型的抗體或者受體都可以用于治療。在一些實(shí)施方案中，所述抗-Nogo受體-1抗體是人抗體。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動物是人類患者。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段施用于表達(dá)Nogo受體-1的非人哺乳動物(例如靈長類，樹猴或恒河猴)，所述抗體與表達(dá)的Nogo受體-1發(fā)生交叉反應(yīng)，用于獸醫(yī)的目的或者作為人類疾病的動物模型。這種動物模型可用于評價本發(fā)明抗體的治療效果。在一些實(shí)施方案中，施用抗-Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白，用于治療脊髓損傷，促進(jìn)損傷部位的軸突生長。本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體-1多肽或融合蛋白可以單獨(dú)提供，或者聯(lián)合使用，或者與其它調(diào)節(jié)特定病理過程的藥劑相繼聯(lián)合使用。例如，在中風(fēng)之后可以同時給服抗炎藥，以阻止進(jìn)一步的神經(jīng)元損傷和對軸突再生的抑制。在本申請中，所述Nogo受體-1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體1和Nogo受體融合蛋白，與一種或多種其它治療劑聯(lián)合使用，二者可以同時、連續(xù)或者單獨(dú)施用。本發(fā)明所述的抗-Nogo受體-1抗體，抗原結(jié)合片段，可溶性Nogo受體-1多肽、Nogo受體-1融合蛋白可以通過腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔、透皮、吸入或者口腔含化等途徑給藥。例如可以通過微灌輸在損傷部位局部給藥。通常的給藥位置包括，但不限于，損傷導(dǎo)致的脊髓受損區(qū)域。給藥劑量取決于年齡、健康狀況、接受注射者的體重、同時進(jìn)行的治療的種類以及治療頻率(如果有的話)，預(yù)期效果的特性。本發(fā)明所述化合物可以體內(nèi)應(yīng)用，一般用于哺乳動物，例如人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠或者體外應(yīng)用。
本發(fā)明的載體在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有編碼序列的重組DNA分子(rDNA)。本申請中，rDNA分子是指經(jīng)過分子操作的DNA分子。產(chǎn)生rDNA分子的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，例如參見Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning -A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press。在一些rDNA分子中，編碼DNA序列可操作地連接于表達(dá)調(diào)控序列和載體序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明多肽的核酸的載體，與本發(fā)明所述核酸可操作連接的載體和表達(dá)調(diào)控序列的選擇，直接取決于所需的功能特性(例如蛋白表達(dá)，以及待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞)，這是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。本發(fā)明所述載體至少可以指導(dǎo)復(fù)制或者向宿主染色體的插入，優(yōu)選能夠指導(dǎo)rDNA分子內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。用于調(diào)控可操作連接蛋白編碼序列表達(dá)的表達(dá)調(diào)控元件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括但不限于，誘導(dǎo)型啟動子、組成型啟動子、分泌信號和其它調(diào)控元件。優(yōu)選地，誘導(dǎo)型啟動子是很容易控制的，例如對宿主細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答。在一個實(shí)施方案中，含有編碼核酸分子的載體含有原核復(fù)制子，即一段DNA序列，它能夠指導(dǎo)自我復(fù)制并且維持重組DNA分子位于被該DNA分子轉(zhuǎn)化了的原核宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌宿主細(xì)胞)的染色體之外，這種復(fù)制子在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。此外，包含有原核復(fù)制子的載體還可以包含一種基因，該基因的表達(dá)使載體具有可檢測或可篩選的標(biāo)記，例如藥物抗性，通常的細(xì)菌藥物抗性基因是那些使載體具有氨芐青霉素或四環(huán)素抗性的基因，包含原核復(fù)制子的載體還可以包含能夠指導(dǎo)編碼基因序列在細(xì)菌宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)內(nèi)表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核或細(xì)菌噬菌體啟動子。啟動子是由DNA序列組成的表達(dá)調(diào)控元件，它可以與RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。與細(xì)菌宿主相容的啟動子序列通常由質(zhì)粒載體提供，該質(zhì)粒載體含有適宜的限制性位點(diǎn)，可以方便插入本發(fā)明所述DNA片段。這種載體質(zhì)粒的實(shí)例有pUC8，pUC9，pBR322和pBR329(Bio-RadLaboratories)，pPL和pKK223(Pharmacia)。任何適宜的原核宿主都可以用來表達(dá)編碼本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的重組DNA分子。另外還可以使用與真核細(xì)胞相容的表達(dá)載體，優(yōu)選那些與脊椎動物細(xì)胞相容的載體，用于形成含編碼序列的rDNA分子。真核細(xì)胞表達(dá)載體是本領(lǐng)域眾所周知的，可以從許多商業(yè)來源獲得。通常提供的這種載體含有適宜的限制性位點(diǎn)可以方便地插入目的DNA片段。這種載體的實(shí)例有pSVL and pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1，pML2d(InternationalBiotechnologies)，pTDTl(ATCC31255)以及其它真核表達(dá)載體。用于構(gòu)建本發(fā)明的rDNA分子的真核細(xì)胞表達(dá)載體還包括在真核細(xì)胞中有效的選擇標(biāo)記，優(yōu)選藥物抗性選擇標(biāo)記。優(yōu)選的藥物抗性標(biāo)記是其表達(dá)產(chǎn)生新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸基轉(zhuǎn)移酶(neo)基因，(Southern et al.，(1982)J.Mol.Anal.Genet.1，327一341)?；蛘哌x擇標(biāo)記物位于另外一個質(zhì)粒上，兩個載體通過共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，通過在針對所選標(biāo)記物的合適藥物中培養(yǎng)來篩選轉(zhuǎn)染子。為表達(dá)本發(fā)明所述的抗體或抗體部分，將編碼部分或者全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體中，從而使該基因可操作地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、EBV衍生的附加體等。將抗體基因連入載體內(nèi)，使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列行使它們預(yù)定的功能，調(diào)控抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列的選擇要與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入不同的載體中。在一些實(shí)施方案中，二者被插入同一表達(dá)載體中。使用常規(guī)方法(例如抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)的連接，或者沒有限制性位點(diǎn)時使用平端連接)將抗體基因插入到表達(dá)載體中。便利的載體應(yīng)編碼功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，通過基因工程引入適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，這樣可以很容易地插入和表達(dá)任一VH或VL序列，如前所述。在這種載體中，拼接通常發(fā)生在被插入的J區(qū)中的拼接供體位點(diǎn)和人C區(qū)之前的拼接受體位點(diǎn)之間，以及在人CH外顯子的拼接區(qū)域內(nèi)。聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼區(qū)下游的天然染色體位點(diǎn)。重組表達(dá)載體也可以編碼信號肽，信號肽有助于抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆入載體，使得信號肽與抗體鏈基因的氨基端以正確的閱讀框相連，信號肽可以是免疫球蛋白的信號肽或者異源信號馱(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。除了本發(fā)明所述免疫原性多肽、Nogo受體-1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶有控制這些蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)控序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)控序列的選擇，取決于多種因素如選擇的待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，預(yù)期的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等等。對于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選的調(diào)控序列包括指導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中高水平蛋白表達(dá)的病毒元件，例如衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列(LTR)的啟動子和/或增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)、猴病毒40(SV40)(例如SV40的啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒以及哺乳動物強(qiáng)啟動子，如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子。關(guān)于病毒調(diào)控元件的進(jìn)一步描述及其序列，參見Stinski的美國專利5,168,062，Bell等人的美國專利4,510,245和Schaffner等人的美國專利4,968,615。除了異源基因和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶其它序列，例如調(diào)控載體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因有助于選擇已經(jīng)帶有載體的宿主細(xì)胞(參見Axelet等人的美國專利例如4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，所述選擇性標(biāo)記基因通常能賦予已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞藥物抗性，例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞內(nèi)氨甲喋呤的篩選/擴(kuò)增)以及neo基因(用于G418篩選)。
重組制備本發(fā)明所述蛋白的宿主細(xì)胞和方法編碼本發(fā)明所述抗-Nogo受體-1抗體、免疫原性多肽、可溶性Nogo受體-1多肽、可溶性Nogo受體-1融合蛋白的核酸和包含這些核酸分子的載體可以用于轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以使用任何已知的向宿主細(xì)胞內(nèi)引入多核苷酸的方法。向哺乳動物細(xì)胞內(nèi)引入異源多核苷酸的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體包裹多核苷酸以及直接將DNA微注射入細(xì)胞核內(nèi)。此外，還可以通過病毒載體將核酸分子引入哺乳動物細(xì)胞。通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，用本發(fā)明的rDNA分子轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞宿主，這些方法通常取決于所使用的載體類型和宿主系統(tǒng)。對于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以使用電穿孔和鹽處理的方法(參見例如，Sambrook etal.，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press；Cohen et al.，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110-2114)。對于用含有rDNA的載體轉(zhuǎn)化脊椎動物細(xì)胞，可以使用電穿孔、陽離子脂質(zhì)或者鹽處理的方法(參見例如Graham et al.，(1973)Virology52，456-467；Wigler et al.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1373-1376)。可以通過眾所周知的技術(shù)，包括對選擇標(biāo)記物的篩選，鑒定出成功轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，即含有本發(fā)明所述rDNA分子的細(xì)胞。例如，可以對引入了本發(fā)明所述rDNA的細(xì)胞進(jìn)行克隆，得到單細(xì)胞集落。收獲這些集落，裂解并使用Southern，(1975)J.Mol.Biol.98，503-517描述的方法檢查它們的DNA中是否存在所述rDNA，或者用免疫學(xué)方法對該細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測?？勺鳛楸磉_(dá)宿主的哺乳動物細(xì)胞系在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括許多可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無限增殖細(xì)胞系。這些細(xì)胞系包括，特別是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，NSO，SP2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(例如Hep G2)，A549細(xì)胞和一系列其它細(xì)胞系。通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平來篩選特別優(yōu)選的細(xì)胞系。其它可以使用的細(xì)胞系有昆蟲細(xì)胞系，如Sf9細(xì)胞。當(dāng)將編碼本發(fā)明所述免疫原性多肽、Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體1融合蛋白的重組表達(dá)載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞時，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段足夠長的時間來制備這些物質(zhì)，該時間足以使所述抗體、多肽和融合蛋白能表達(dá)于所述宿主細(xì)胞，或者更優(yōu)選，本發(fā)明所述免疫原性多肽、Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白能被分泌到宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中?？梢允褂贸Ｒ?guī)的蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收本發(fā)明所述的免疫原性多肽、Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白。另外，可以使用一系列已知的技術(shù)提高本發(fā)明所述免疫原性多肽、Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和可溶性Nogo受體-1融合蛋白(或其的其它部分)在制備細(xì)胞系中的表達(dá)。例如谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(GS系統(tǒng))是在某些特定條件下提高表達(dá)的常用方法。GS系統(tǒng)在歐洲專利0216846，0256055，和0323997以及歐洲專利申請89303964.4中有完整或部分的討論。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了由核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼本發(fā)明所述Nogo受體-1抗體、抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和/或可溶性Nogo受體-1融合蛋白。宿主細(xì)胞可以是原核或者真核的。用于表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞沒有限制，只要該細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)方法、與表達(dá)載體的擴(kuò)增、與基因產(chǎn)物表達(dá)相兼容即可。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括，但不限于，酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動物細(xì)胞，例如來自小鼠、大鼠、猴或人的細(xì)胞系。有用的真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，該細(xì)胞系可以從ATCC獲得，編號為CCL61；NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞NIH-3T3，其ATCC編號為CRL1658；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)，以及真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系。
使用rDNA分子制備重組蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供了使用本申請描述的核酸分子，制備本發(fā)明所述的Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體-1多肽和/或可溶性Nogo受體-1融合蛋白的方法。通常，重組形式蛋白質(zhì)的制備通常包括以下的步驟首先，獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子。如果編碼序列中沒有內(nèi)含子，則該編碼序列可以直接用于任何宿主中的表達(dá)。任選地，將所述核酸分子與適宜的調(diào)控序列可操作性地連接，如上所述，生成含所述蛋白質(zhì)開放閱讀框的表達(dá)單元。使用該表達(dá)單元轉(zhuǎn)化合適的宿主，將轉(zhuǎn)化后的宿主在允許重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)。任選地，從培養(yǎng)基或者從細(xì)胞中分離重組蛋白；在可以允許一些雜質(zhì)存在條件下，可不必對該蛋白質(zhì)進(jìn)行回收和純化。上述每一步驟都可以通過多種方式完成。例如，所需的編碼序列可以從基因組片段中獲得，并且直接用于適當(dāng)?shù)乃蘖ⅰ＠眠m當(dāng)?shù)膹?fù)制子和調(diào)控序列，完成多種宿主中可操作的表達(dá)載體的構(gòu)建，如上所述。調(diào)控序列、表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型，上文已有詳細(xì)討論。如果原來沒有的話，可以在編碼序列的兩端添加適宜的限制性位點(diǎn)，從而得到一種可插入這些載體的可切割基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地對本領(lǐng)域已知的任一宿主/表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，與本發(fā)明所述核酸分子一起用于制備重組蛋白質(zhì)。為了更好的理解本發(fā)明，給出以下實(shí)施例。這些實(shí)施例的目的僅僅是舉例說明，而不應(yīng)該被理解為以任何方式對本發(fā)明的范圍的限制。
實(shí)施例1小鼠抗-Nogo受體-1單克隆抗體的制備使用以下的方法和步驟制備與本發(fā)明所述免疫原性Nogo受體-1多肽特異性結(jié)合的抗-Nogo受體-1抗體。
免疫使用兩種免疫方式1.使用含有Nogo受體-1(NogoR-1)的COS-7細(xì)胞或細(xì)胞膜作為免疫原將大鼠Nogo受體-1基因(GenBankTM登錄號AF462390)克隆入含CMV啟動子和藥物篩選用的遺傳霉素抗性基因的表達(dá)載體PEAG1256(Biogen)。使用Superfect(Qiagen)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞。使用遺傳霉素(GibcoTM，2mg/ml)篩選轉(zhuǎn)染子，克隆，然后通過FACS法驗(yàn)證Nogo受體-1蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)。按[Wang et al.，J.Neurochem.，751155-1161(2000)]描述的步驟制備COS-7細(xì)胞膜，兩次漂洗，以1mg/ml(蛋白濃度)濃度保存于10％甘油中，-70℃儲存。用含50μg大鼠Nogo受體-1-COS-7細(xì)胞膜或表面表達(dá)Nogo受體-1的COS-7全細(xì)胞和50μlRIBI MPL+TDM+CWS佐劑(SigmaChemicalCO.，St.Louis，MO)的乳劑，通過腹膜內(nèi)途徑免疫8周齡的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序?yàn)槊績芍芤淮?Lipman et al.，1992)。分別在第一次免疫前、第二次免疫后7天、第三次免疫后7天和第三次免疫后38天采集免疫小鼠的血清，使用以下描述的ELISA測量抗-Nogo受體-1抗體的滴度。
2.用特異性Nogo受體-1多肽作為免疫原使用Vector NtiTM軟件對大鼠Nogo受體-1基因序列進(jìn)行了抗原性分析(圖2)。使用常用的戊二醛法將在分析中鑒定出的抗原性多肽與鑰孔血蘭蛋白(KLH)偶聯(lián)，使用含50μgKLH偶聯(lián)多肽及50μl完全弗氏佐劑(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的乳劑通過腹腔內(nèi)途徑免疫8周齡的雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，免疫程序?yàn)槊績芍芤淮巍７謩e在第一次免疫前、第二次免疫后一周、第三次免疫后一周天采集免疫小鼠的血清，測量抗-Nogo受體-1抗體的滴度。第三次免疫以后加強(qiáng)免疫一次。這次加強(qiáng)免疫后三天，開始融合實(shí)驗(yàn)。
雜交瘤的制備和篩選采自經(jīng)Nogo受體-1抗原性多肽免疫后小鼠的血清用ELISA篩選，而采自經(jīng)表達(dá)Nogo受體-1的COS-7細(xì)胞免疫后小鼠的血清用流式細(xì)胞儀篩選。使用流式細(xì)胞儀鑒別出產(chǎn)生特異性結(jié)合Nogo受體-1-COS-7細(xì)胞的抗體的小鼠，宰殺。此前描述方法(Kennett et al.，1993.MonoclonalAntibodiesA New Dimension in Biological Analysis.Plenum Press，NewYork)，分離脾細(xì)胞并與FL653骨髓瘤(Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠骨髓瘤的APRT衍生物，維持液是含有10％胎牛血清、4500mg/升葡萄糖、4mML-谷氨酰胺和20mg/ml8-氮鳥嘌呤的DMEM)融合，將獲得的融合細(xì)胞接種在24孔或48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Glass Works，Corning，NY)中，培養(yǎng)基中添加腺嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(AAT)。通過ELISA或流式儀，篩選出可與Nogo受體-1-COS-7細(xì)胞或與Nogo受體-1抗原性多肽結(jié)合的AAT抗性培養(yǎng)物，如下描述。陽性孔中的細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)一步亞克隆。為了篩選與Nogo受體-1抗原性多肽結(jié)合的抗體，將用作免疫原的肽與BSA偶聯(lián)。向96孔MaxiSorpTM 細(xì)胞培養(yǎng)板(NuncTM)的每一孔中加入50μl含0.5mg偶聯(lián)多肽的0.1M碳酸氫鈉緩沖液，pH9.0。然后，將該平板在37℃孵育1小時或者4℃孵育16小時，用含0.1％BSA、0.1％卵清蛋白，0.1％blotto和0.001％疊氮化物的25mM HEPES，pH7.4封閉液封閉非特異性位點(diǎn)，加入雜交瘤上清，在25℃孵育1小時。使用PBS漂洗三次之后，在每一孔中加入50μl1∶10000稀釋后的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Inc.)，繼續(xù)孵育1小時。漂洗兩次后，使用TMB (Pierce)顯色，然后用2M硫酸中止顯色，使用分光光度計測量450nm處顏色濃度。使用以下方法篩選可與全長Nogo受體-1結(jié)合的抗體。根據(jù)銷售商提供的方法，使用0.1μM Cell TrackerTMGreen CMFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)標(biāo)記COS-7細(xì)胞。在用抗Nogo受體-1待測血清孵育之前，將Cell TrackerTM標(biāo)記的對照細(xì)胞與漂洗過的Nogo受體-1-COS-7細(xì)胞等體積混和。取50μl細(xì)胞混合物均勻分散至96孔V型底聚苯乙烯板(Costar3877，Corning，NY)的每一孔中，加入100μl的雜交瘤上清或?qū)φ沼每筃ogo受體-1抗體，在4℃孵育半小時后，漂洗細(xì)胞，加入溶于50μlPBS的R-藻紅蛋白偶聯(lián)的親和純F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG Fcγ特異性二抗(1∶200稀釋，Jackson ImmunoResearch Laboratory，West Grove，PA)。在孵育結(jié)束時，使用PBS漂洗細(xì)胞兩次，用含有1％胎牛血清的200μlPBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行FACS分析?；蛘?，將Nogo受體1-COS-7細(xì)胞與雜交瘤上清混和，然后使用R-藻紅蛋白偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗處理，之后直接進(jìn)行常規(guī)FACS分析。我們使用多種不同的免疫原制備了25種抗-Nogo受體-1抗體。我們使用對應(yīng)于大鼠Nogo受體-1第110-125位殘基的多肽序列作為免疫原，制備了兩種抗體，7E11和5B10。我們使用從經(jīng)全長大鼠Nogo受體-1轉(zhuǎn)染后COS7細(xì)胞制備的細(xì)胞膜作為免疫原，制備了3種抗體，1H2、3G5和2F7。我們使用sNogoR310-Fc作為免疫原，制備了13種抗體(1D9.3、1E4.7、1B4.3、2C4.3、1F10.3、2H1.4、1H3.3、1G4.1、1E4.1、2G7.1、2C4.1、2F11.1、和1H4.1)，使用與大鼠Nogo受體-1第423-434位殘基對應(yīng)的多肽序列作為免疫原，制備了7種抗體(2E8.1，2G11.2，和1B5.1)。
單克隆抗體7E11和5B10的序列分析我們使用QiagenRNeasymini試劑盒提取了總RNA，并且從分離的RNA得到cDNA。我們使用引物5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′(SEQ ID NO12)和5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′(SEQ ID NO25)，PCR擴(kuò)增出輕鏈的序列；我們使用引物5′-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3′(SEQ ID NO13)和5′-GGGGATATCCACCATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGA-3′(SEQ ID NO14)，PCR擴(kuò)增出重鏈的序列。這些引物包含下列簡并核苷酸S代表G或C；M代表A或C，R代表G或A；W代表A或T；K代表G或T；以及Y代表T或C。我們將PCR片段克隆入測序載體中，利用雙脫氧終止法，使用測序載體特異引物測定了CDR區(qū)的DNA序列。我們從理論上翻譯了該DNA序列，單克隆抗體7E11和5B10的重鏈及輕鏈CDR區(qū)的部分氨基酸序列顯示于表2。表2中，下劃線部分為來自單克隆抗體重鏈和輕鏈的三個CDR區(qū)。7E11和5B10的輕鏈間具有94％的氨基酸序列同一性，重鏈間具有91％的氨基酸序列同一性。單克隆抗體7E11、5B10和1H2是IgG1同種型，單克隆抗體3G5和2F7是IgG2a同種型。這5種單克隆抗體都具有κ同種型輕鏈。我還用這種方法對其它單克隆抗體進(jìn)行了分析。
表2單抗7E11和5B10的氨基酸序列
單克隆抗體7E11的表位圖譜Mab 7E11與大鼠及人的NgR1都能結(jié)合。為了測定對負(fù)責(zé)7E11結(jié)合的表位進(jìn)行檢測，我們制備了大鼠NgR1的片段及合成肽，測試了它們與7E11間的結(jié)合情況。將含全部8個LRR結(jié)構(gòu)域和N-及C-末端帽子(sNgR310)的重組大鼠NgR1片段，用酸或溴化氰(CNBr)處理，然后通過凝膠電泳分離出該片段。未經(jīng)處理的sNgR310遷移的表觀分子量為42kDa。酸處理sNgR310得到兩種主要切割產(chǎn)物，15kDa(aa 27-aa 122)和30kDa(aa 123-aa 310)。CNBr處理得到三種片段，33/35kDa雙帶(aa 27-aa 229)，可能是異源糖基化片段，10kDa產(chǎn)物(aa 241-aa 310)，以及11個氨基酸殘基的片段(aa230-aa 240)，這個片段沒有停留在凝膠上。用7E11對凝膠的western印跡進(jìn)行探測，結(jié)果顯示它可與完整大鼠NgR1(aa 27-aa 310)、15kDa的酸處理片段(aa 27-aa 122)以及35kDa的CNBr處理片段(aa 27-aa 229)結(jié)合。7E11不能結(jié)合30kD的酸處理片段(aa 123-aa 310)或10kDa CNBr處理片段(aa241-aa 310)。15kDa酸處理片段和35kDa CNBr處理片段都包含序列LDLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO1)，這一點(diǎn)與7E11結(jié)合NgR1上的單個表位相一致。通過測試sNgR310的胰蛋白酶消化產(chǎn)物肽，對7E11結(jié)合位點(diǎn)作了進(jìn)一步分析。HPLC分析顯示數(shù)個片段，這表明在NgR1序列中存在著數(shù)個胰蛋白酶-敏感的賴氨酸及精氨酸殘基。7E11只與一種胰蛋白酶消化產(chǎn)物肽結(jié)合，這為7E11結(jié)合NgR1上的單個表位提供了證據(jù)。隨后的質(zhì)譜分析(MS)和序列分析鑒定這種被結(jié)合的肽為AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO26)。對肽LDLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO1)進(jìn)行進(jìn)一步圖譜分析。該肽經(jīng)胰蛋白酶消化后，產(chǎn)生兩種主要片段LDLSDNAQLR(SEQ IDNO27)和VVDPTT(SEQ ID NO28)，然后對7E11與它們結(jié)合的能力進(jìn)行了測試。MS分析表明該抗體結(jié)合的肽為LDLSDNAQLR(SEQ ID NO27)，因此，這種肽含有7E11的結(jié)合表位。在這種肽級分內(nèi)，詳細(xì)的MS分析鑒定出幾種亂序的肽，它們也能與7E11結(jié)合，包括在Asn115和Gln117上脫氨基的肽，在112或113位上添加了丙氨酸的肽，或者在114位上添加了絲氨酸的肽(表3)。這些數(shù)據(jù)表明位于這種肽片段上的幾個殘基對于7E11結(jié)合不是關(guān)鍵性的。
表3.被7E11結(jié)合的肽變體 另外，還對肽LDLSDNAQLRVVDPTT進(jìn)行了內(nèi)切蛋白酶Asp-N消化，并測試了與7E11的結(jié)合情況。內(nèi)切蛋白酶Asp-N將這種肽切割為3種肽片段，L、DLS和DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO36)。這些產(chǎn)物中，7E11能與肽DNAQLRVVDPTT結(jié)合。綜合考慮，胰蛋白酶和Asp-N切割數(shù)據(jù)進(jìn)一步將7E11結(jié)合表位定位為它們之間共有序列上DNAQLR(SEQID NO37)。對來自不同物種的NgR1、NgR2和NgR3的氨基酸序列進(jìn)行分析，7E11結(jié)合大鼠及人的NgR1但不結(jié)合小鼠NgR1、人NgR2或小鼠NgR3的觀察結(jié)果，推測7E11結(jié)合表位中的關(guān)鍵殘基。序列對齊結(jié)果表明大鼠NgR1的第110-125位與人NgR1相應(yīng)序列完全相同，小鼠NgR1序列僅有第119位上的一個氨基酸不同(大鼠和人NgR1中為Arg119，小鼠NgR1中為His119；表4)。
表4.來自不同物種的NgR間的序列對齊 NgR1上的Arg119在7E11結(jié)合中發(fā)揮作用，因?yàn)樗芎芎玫亟Y(jié)合大鼠和人的NgR1但幾乎不與小鼠NgR1結(jié)合。類似地，由于7E11不能很好地結(jié)合NgR3，所以Ala116參與了該表位的構(gòu)成，這是因?yàn)樵贒NAQLR序列(SEQ ID NO38)內(nèi)，NgR3與NgR1之間的差別僅在于在相應(yīng)序列上為精氨酸。在DNAQLR序列內(nèi)，NgR2的6個殘基中的4個與大鼠NgR1相同。Ala116和Gln117被分別取代為精氨酸和組氨酸。該結(jié)果證實(shí)了Ala116是在7E11結(jié)合中發(fā)揮作用的重要氨基酸殘基，但是并不排除Gln117的參與。為了驗(yàn)證這些接觸位點(diǎn)，制備了幾種包含LDLSDNAQLR肽(SEQ ID NO27)內(nèi)點(diǎn)突變的肽，測試與7E11間的結(jié)合情況。將所述肽固定在MaxiSorpTM平板(NuncTM)上，加入系列稀釋后的7E11。得到的EC50值列于表5。7E11與變體Leu110Ala和Asp111Ala結(jié)合，這些變體具有與原始肽近似的EC50值。對Gln117Ala進(jìn)行測試時，EC50提高了30-倍，對Arg119His進(jìn)行測試時，EC50提高了25-倍。當(dāng)Arg119突變?yōu)楸彼釙r，觀察到EC50變化最為顯著。
表5.7E11可與具有不同EC50的肽變體結(jié)合 另外還在新近測定的晶體結(jié)構(gòu)中，對7E11結(jié)合表位的位置進(jìn)行了測定。正如所料，該結(jié)構(gòu)表明7E11表位暴露于分子表面。殘基Arg119、Gln117、Ala116和Asp114突出于該結(jié)構(gòu)之外，而Leu118和Asn115位于該結(jié)構(gòu)之內(nèi)。該表位落到該結(jié)構(gòu)凹表面內(nèi)的酸性區(qū)域的上部，堿性表面正對著其中的一個側(cè)面。
用單克隆抗-Nogo受體-1抗體抑制配體與可溶性Nogo受體-1間的結(jié)合對用上述方法制得的抗-Nogo受體-1單克隆抗體進(jìn)行測試，測定其是否能抑制配體與Nogo受體-1間的結(jié)合。按下述方法制備包含大鼠Nogo受體-1第26-344位氨基酸殘基和大鼠IgG1分子的鉸鏈區(qū)及Fc區(qū)的可溶性Nogo受體-1融合蛋白(sNogoR344-Fc)，取0.5μg固定于250μg偶聯(lián)了蛋白-A或wheatgermagglutinin的SPA微珠(Amersham Pharmacia Biotech)，25℃作用2小時。向每一加樣孔加入50μgl HEPES-緩沖的孵育介質(zhì)(10mM HEPES，pH 7.4，0.1％牛血清白蛋白，0.1％卵白蛋白，2mM MgCl2，2mM CaCl2和蛋白酶抑制劑)，其中含偶聯(lián)了Fc-sNogoR-1、抗-Nogo受體-1mAb及1μl125I-Nogo66的SPA微珠(Amersham，2000Ci/mmol，1nM)。16小時后，使用TopCount(Packard)一式四份測定放射性強(qiáng)度。從曲線擬合分析中計算出IC50值(圖3)(PRISM，GraphPad Software，NJ)。一些實(shí)施方案中，我們還使用AP-配體偶聯(lián)物(例如，AP-Nogo66)，通過監(jiān)測丙氨酸磷酸酶活性檢測結(jié)合情況。我們還對mAbs阻斷配體MAG-Fc及AP-OM-gp與Nogo-受體-1間結(jié)合的能力進(jìn)行了測試。單克隆抗體7E11、5B10、1H2、3G5和2F7都能抑制Nogo66、MAG和OM-gp與sNogoR344-Fc間的結(jié)合。Nogo66與7E11和1H2計算得的IC50值分別為400nM和60nM。用ELISA對mAb-介導(dǎo)抑制這三種配體與Nogo受體-1間結(jié)合情況進(jìn)行監(jiān)測，得到的數(shù)據(jù)概括于表6。
表6.能抑制Nogo66、MAG和OM-gp與Nogo受體-1間結(jié)合的單克隆抗體
顯示的取代百分比是在30nM抗體時的，用所述曲線擬合分析測定某些單克隆抗體的EC50?！?”表示無可檢測活性，“ND”表示未檢測。
實(shí)施例2Fab-噬菌體抗-Nogo受體-1抗體的制備與本發(fā)明所述免疫原性Nogo受體-1多肽特異性結(jié)合的抗-Nogo受體-1Fab-噬菌體抗體，也是通過如下篩選Fab-噬菌體文庫制備的。使用重組大鼠可溶性sNogoR310-Fc蛋白和表達(dá)大鼠Nogo受體-1的COS7細(xì)胞篩選MorphoSys Fab-噬菌體文庫HuCALGOLD，純化和鑒定出與Nogo受體-1特異性結(jié)合的Fab-噬菌體。14D5的重鏈衍生自VH2基因，其輕鏈衍生自VK1基因。這些Fab-噬菌體中的一個，14D5，其重鏈和輕鏈的CDR的氨基酸序列示于表7。
表7.14D5的CDR的氨基酸序列 14D5的單價和二價兩種形式都能與大鼠Nogo受體-1結(jié)合。此外，14D5還與小鼠和人的Nogo受體-1以及人的Nogo受體-2結(jié)合，但是不與小鼠的Nogo受體-3結(jié)合。
實(shí)施例3用抗-Nogo受體-1單克隆抗體免疫沉淀Nogo受體1。為了進(jìn)行免疫沉淀，在分別有30μl蛋白A或G和1-2μg抗體存在情況下，將100μl裂解的細(xì)胞或者50μl PiPLC處理的細(xì)胞分別與400或450μl的提取緩沖液[10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.5％Tween-20TM，0.2mMPMSF]或者RIPA緩沖液混合。將混合物置于振蕩器中，在4℃孵育16小時。輕輕離心樣品使偶聯(lián)蛋白A或G的微珠沉淀，洗滌微珠兩次，每次用1ml洗滌緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.1％Tween-20)。最后一次用10％體積的初始洗滌緩沖液洗滌。將微珠重懸于100μl含10％β-巰基乙醇的2x SDS上樣緩沖液。樣品在室溫下孵育，然后在4-20％Tris-甘氨酸凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。SDS-PAGE凝膠電泳的結(jié)果顯示，單克隆抗體3G5和2F7可以免疫沉淀Nogo受體-1。
實(shí)施例4
ELISA測定抗體特異性為了測定實(shí)施例1和2中制備的單克隆抗體和Fab-噬菌體抗體的特異性，我們使用了一組Nogo受體-1多肽進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。該組多肽由以下多肽組成sNogoR310-Fc(包含大鼠Nogo受體-1的26-310位氨基酸和大鼠Fc片段的融合蛋白)、sNogoR344-Fc(見上文)，多肽p-617(SBQ IDNO1)，多肽p-618(來自大鼠Nogo受體-1LRR7區(qū)的19個氨基酸的多肽；圖2；SEQ ID NO11)和多肽p-4及p-5(分別來自Nogo受體-1的LRR5和LRRCT區(qū)的多肽)。使用卵清蛋白和BSA作為對照。如圖4所示，單克隆抗體1H2、3G5和2F7都能與sNogoR344-Fc特異性結(jié)合。在類似的實(shí)驗(yàn)中，那些抗體還能與由大鼠Nogo受體-1(SEQ ID NO3)的310-344個氨基酸殘基組成的多肽特異性結(jié)合，單抗7E11和5B10與多肽p-617(SEQ ID NO1)特異性結(jié)合。sNogoR310-Fc免疫制備抗體中的10種抗體(1D9.3，1E4.7，1B4.3，2C4.3，1F10.3，2H1.4，1H3.3，1G4.1，1E4.1，和2G7.1)在結(jié)合方面可以互相替代，表明它們識別sNogoR310上的相似或重疊的抗原表位。另外三種sNogoR310-Fc免疫制得的抗體(2C4.1，2F 11.1，和1H4.1)識別位于26-310位氨基酸殘基上的不同表位。我們還使用Fab-噬菌體14D5進(jìn)行了ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。讓配體AP-Nogo66，AP-OM-gp和MAG-Fc與固定化的sNogoR344-Fc結(jié)合，1μM的14D5完全抑制了Nogo與MAG間的結(jié)合。完全抑制OM-gp與sNogoR344-Fc間的結(jié)合則需要10μM的14D5。
實(shí)施例5神經(jīng)突向外生長實(shí)驗(yàn)為了檢測上面產(chǎn)生的單抗和Fab-噬菌體抗體在減輕CNS髓鞘對神經(jīng)元抑制方面的能力，用0.1mg/ml多聚-D-賴氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培養(yǎng)用載玻片(4孔)。將CNS髓鞘或PBS按每滴3μl滴樣。在髓鞘或PBS中加入熒光微球(Polysciences)，用于后面步驟中的液滴鑒定(Grandpreet al，Nature 4032000)。然后潤洗Lab-Tek載片，用10μg/ml的層粘連蛋白(GibcoTM)包被，用1mg/ml的1型膠原酶(Worthington)解離P3-4SPrague Dawley大鼠幼仔的背根神經(jīng)節(jié)(DRG′s)，用火-磨光的巴氏吸管吹打，為增加神經(jīng)元細(xì)胞預(yù)鋪板，最終以23000個細(xì)胞/孔的密度接種到事先包被好的Lab-Tek培養(yǎng)載片中。培養(yǎng)基是含有5％熱滅活供體馬血清、5％熱滅活胎牛血清和50ng/ml小鼠神經(jīng)生長因子的F12，在37℃和5％CO2條件下孵育6小時。鋪板后立即加入15μg/ml的單抗7E11。使用含20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定載玻片20分鐘，用經(jīng)1∶500稀釋后的抗β-III-微管蛋白抗體(CoVance TUJ1)染色。將二抗抗-小鼠Alexa Fluor594(Molecular Probes)作1∶300倍稀釋，然后用Gel/MountTM(BiemedaTM)覆蓋載玻片，使用OpenLabTM軟件獲得放大5倍的數(shù)碼圖像，并使用MetaMorph軟件對神經(jīng)突向外生長進(jìn)行定量分析。單抗7E11保護(hù)DRG神經(jīng)元免遭髓磷質(zhì)介導(dǎo)的對神經(jīng)突向外生長的抑制。用單抗1H2和3G5觀察到了類似的結(jié)果。在神經(jīng)突向外生長保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，將大鼠的P7DRG神經(jīng)元培養(yǎng)在CNS髓磷質(zhì)基質(zhì)上，二價的14D5也能有效促進(jìn)神經(jīng)突的生長。
實(shí)施例6在轉(zhuǎn)染了Nogo受體-1的細(xì)胞上用7E11進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析為了進(jìn)一步鑒定實(shí)施例1中描述制備的抗-Nogo受體-1單抗的結(jié)合特性，我們對其與固定的或者活的表達(dá)大鼠或人Nogo受體-1的COS-7細(xì)胞或293細(xì)胞間結(jié)合的結(jié)合情況進(jìn)行了對比。
固定了的細(xì)胞將經(jīng)過和未經(jīng)過Nogo受體-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于8孔Lab-Tek培養(yǎng)載玻片上，用4％多聚甲醛固定15分鐘，用含有10％正常山羊血清和0.1％Triton X-100的PBS封閉1小時。在封閉液中加入15μg/ml和1.5μg/ml的單抗7E11室溫孵育2小時；用封閉液1∶300稀釋Alexa-偶聯(lián)的抗小鼠二抗(Molecular Probes)，孵育1小時。在二抗中加入5μg/ml的DAPI，以標(biāo)記所有的細(xì)胞核。
活的細(xì)胞將經(jīng)過和未經(jīng)過Nogo受體-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于8孔的Lab-Tek培養(yǎng)載玻片，用FACS緩沖液(含有4％供體馬血清)4℃封閉30分鐘，用含15μg/ml和1.5μg/ml 7E11的FACS緩沖液，4℃孵育1小時，潤洗后，用二抗抗-小鼠-Alexa(用FACS緩沖液1∶300稀釋后的)，4℃孵育30分鐘。免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)證明了所有的單抗都與表達(dá)大鼠Nogo受體-1的細(xì)胞結(jié)合。單抗7E11，2G7.1和2C4.1與表達(dá)人Nogo受體-1的固定細(xì)胞和活細(xì)胞都能結(jié)合。
實(shí)施例7脊髓挫傷小鼠模型為了檢測實(shí)施例1中制備的抗-Nogo受體-1單抗對神經(jīng)元的體內(nèi)作用，我們使用一個脊髓挫傷小鼠模型。用止痛劑和抗生素藥劑預(yù)防性地處理雌性小鼠(18-22克體重)。麻醉小鼠，將其置于立體定位儀中，在立體顯微鏡下固定脊柱。使用重物-下落打擊法(M.Li et al.，F(xiàn)unctional role and therapeutic implications ofneuronal caspase-1and-3in a mouse model of traumatic spinal cord injury.Neuroscience Vol.99，pp.333-342，2000)的改良方法致脊髓損傷。簡而言之，實(shí)施T9和T10椎板切除術(shù)，用一對小鼠橫夾固定脊柱，從兩旁支撐T9和T10的橫切作用。將直徑為1.4mm、重量為2克的不銹鋼沖擊棒至于硬脊膜上方2.5厘米處，且向下落在脊髓的T10節(jié)段上。在手術(shù)中將小鼠至于37℃保溫的毯子上，且術(shù)后每只小鼠均皮下注射1ml熱的滅菌鹽水以防止脫水，每天一次人工將膀胱內(nèi)的尿液擠出，直至對膀胱的反射控制恢復(fù)。所有動物術(shù)后每8-12小時麻醉止痛一次，術(shù)后每天接受兩次抗生素治療連續(xù)7天。在研究過程中動物可以自由攝食和飲水。通過髓鞘內(nèi)注射將抗-Nogo受體-1抗體遞送至損傷部位，連續(xù)28天，見下面描述的大鼠脊髓橫切模型。
實(shí)施例8可溶性Nogo受體-1融合蛋白的特性為了研究可溶性Nogo受體-1多肽(sNogoR-1)和融合蛋白(Fc-sNogoR-1)的特性，我們進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)。將3μg的可溶性Nogo受體(sNogoR310-Fc和sNogoR344-Fc)固定在250μg的WGA-SPA微珠上，加入0.5μL的放射性配體(終濃度為0.5nM)，終體積為100μl結(jié)合緩沖液(20mM HEPES，pH 7.4，2mM Ca，2mM Mg，0.1％BSA，0.1％卵清蛋白和蛋白酶抑制劑)。配體包括10μM Nogo66，10μM125I-Nogo40(NogoA的1-40位氨基酸)，對每一配體組用10μl抗Nogo受體-1抗體的上清。Nogo40上的三個酪氨酸分別作碘標(biāo)記，分別命名為Nogo40-A、-B和-C。三份平行樣的平均值用標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)合放射性百分比表示(圖6、7和8)。誤差柱表示的是平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。在數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化時，將沒有抑制劑時的結(jié)合放射性作為100％，而將在10μM Nogo40存在時的最低結(jié)合放射性作為0％。
實(shí)施例9對配體與可溶性Nogo受體-1融合蛋白間結(jié)合的抑制使用與實(shí)施例8中的結(jié)合實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測實(shí)施例1中制備的兩種單抗抑制125I-Nogo66與sNogoR344-Fc間結(jié)合的能力。單抗2F7和3G5抑制了125I-Nogo66與sNogoR344-Fc之間的結(jié)合。
實(shí)施例10神經(jīng)突向外生長實(shí)驗(yàn)用0.1mg/ml的多聚-D-賴氨酸(Sigma)包被Lab-Tek培養(yǎng)載玻片(4孔)，將CNS髓鞘或其與sNogoR310混合物、與sNogoR310-Fc融合蛋白混合物、與單抗5B10混合物或與對照PBS混合物，按每滴3μl分別點(diǎn)樣于載玻片上，在髓鞘或PBS中加入熒光微球(Polysciences)，用于后面步驟中的液滴鑒定(Grandpre et al，Nature 403，2000)。然后潤洗Lab-Tek載片，用10μg/ml的層粘連蛋白(GibcoTM)包被。用1mg/ml的1型膠原酶(Worthington)解離P3-4SPrague Dawley大鼠幼仔的背根神經(jīng)節(jié)(DRG′s)，用火-磨光的巴氏吸管吹打，為增加神經(jīng)元細(xì)胞預(yù)鋪板，最終以23000個細(xì)胞/孔的密度接種到事先包被好的Lab-Tek培養(yǎng)載片中。培養(yǎng)基是含有5％熱滅活供體馬血清、5％熱滅活胎牛血清和50ng/ml小鼠神經(jīng)生長因子的F12，在37℃和5％CO2條件下孵育6小時。使用含20％蔗糖的4％多聚甲醛溶液固定載玻片20分鐘，用經(jīng)1∶500稀釋后的抗β-III-微管蛋白抗體(CoVance TUJ1)染色。將二抗抗-小鼠Alexa Fluor594(Molecular Probes)作1∶300倍稀釋，然后用Gel/MountTM(BiemedaTM)覆蓋載玻片，使用OpenLabTM軟件獲得放大5倍的數(shù)碼圖像，并使用MetaMorph軟件對神經(jīng)突向外生長進(jìn)行定量分析。sNogoR310，sNogoR310-Fc和單抗5B10都能保護(hù)DRG神經(jīng)元免遭髓鞘質(zhì)介導(dǎo)的對神經(jīng)突向外生長的抑制(圖9-11)。在一個類似的使用雞神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)sNogo310有保護(hù)效果。另外我們還通過在有或無層粘連蛋白存在情況下的細(xì)胞生長試驗(yàn)，對可溶性Nogo受體的神經(jīng)元保護(hù)作用進(jìn)行了測試。在沒有層粘連蛋白的培養(yǎng)基中神經(jīng)元細(xì)胞生長得很不好，模擬了神經(jīng)元的應(yīng)激生長條件(stresscondition)。從出生后6-7天的大鼠幼仔(P6-7)中分離出背根神經(jīng)節(jié)，解離為單個細(xì)胞，平鋪到預(yù)先用多聚-D-賴氨酸包被過的96孔培養(yǎng)板，如上所述。向一些孔中加入2μg/ml的層粘連蛋白孵育2-3小時，沖洗后鋪入細(xì)胞。孵育18-20小時后，培養(yǎng)板用4％的多聚甲醛固定，用經(jīng)1∶500稀釋過的兔抗β-III-微管蛋白抗體(Covance)和經(jīng)1∶100稀釋過的抗-Huc/D(MolecularProbes)染色，加入1∶200稀釋的熒光二抗(Molecular Probes)。使用ArrayscanII(Cellomics)獲得放大5倍的數(shù)碼圖像，通過使用神經(jīng)突向外生長應(yīng)用，將神經(jīng)突向外生長定量為平均神經(jīng)突向外生長/神經(jīng)元/孔。對從每一條件下3個孔得到的9張5倍圖像進(jìn)行了分析。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用了PC12細(xì)胞(NeuroscreenTM)的亞克隆(cellomics)。所述NeuroscreenTM細(xì)胞用200ng/ml的神經(jīng)生長因子預(yù)分化7天，脫壁并重新接種到事先用多聚-D-賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中。向一些孔中加入5μg/ml的層粘連蛋白孵育2-3小時，沖洗后鋪入細(xì)胞。孵育2天后，培養(yǎng)板用4％的多聚甲醛固定，用經(jīng)1∶500稀釋過的兔抗β-III-微管蛋白抗體(Covance)和Hoechst(細(xì)胞核染色)染色。使用ArrayscanII對神經(jīng)突向外生長進(jìn)行定量，如在DRG細(xì)胞中一樣。在進(jìn)行細(xì)胞鋪板時，將sNogoR344-Fc或大鼠IgG以溶液形式添加至P6-7DRG神經(jīng)元和分化后的NeuroscreenTM細(xì)胞。當(dāng)P6DRG神經(jīng)元培養(yǎng)于無層粘連蛋白條件下時，觀察到1μM和10μM的sNogoR344-Fc具有神經(jīng)元保護(hù)作用。神經(jīng)突向外生長的定量實(shí)驗(yàn)顯示，隨著sNogoR344-Fc的加入，神經(jīng)突向外生長呈現(xiàn)出劑量依賴性增長。向生長在層粘連蛋白基質(zhì)中的DRG神經(jīng)元中加入相同濃度的sNogoR344-Fc，不產(chǎn)生任何異常結(jié)果，這表明sNogoR344-Fc只是在受應(yīng)激的細(xì)胞中才有活性。對于NeuroscreenTM細(xì)胞，沒有層粘連蛋白時，相同濃度的sNogoR344-Fc也具有神經(jīng)元保護(hù)作用。
實(shí)施例11Fc-sNogoR-1融合蛋白的制備和純化將編碼大鼠Nogo受體-1的1-310位氨基酸的cDNA構(gòu)建體與位于哺乳動物表達(dá)載體中的大鼠IgG1Fc融合，用電穿孔將該載體轉(zhuǎn)入中國倉鼠卵巢(CHO)(DG44)細(xì)胞。該細(xì)胞在含有10％透析過的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素及抗霉菌劑的α-MEM培養(yǎng)基中維持。轉(zhuǎn)染后兩天，收獲條件培養(yǎng)基，在還原條件下用蛋白印跡分析。使用多克隆兔抗-Nogo受體-1抗體檢測到一個約60KD的蛋白條帶。使用偶聯(lián)有R-PE的山羊抗大鼠IgG抗體對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和分選。在第二次分選后，將細(xì)胞平板到96孔培養(yǎng)板中，平板密度為每孔一個細(xì)胞。使用夾心ELISA檢測和比較每一個孔中分泌出的可溶性Nogo受體-1蛋白水平，用山羊抗大鼠IgG Fcκ特異性抗體包被ELISA平板。加入條件培養(yǎng)基。用偶聯(lián)有HRP的驢抗大鼠IgG Fab、Fc-特異性抗體對結(jié)合后的可溶性Nogo受體-1蛋白進(jìn)行檢測?？寺?C12具有最高的分泌水平。4C12在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中的CHO-M7培養(yǎng)基中擴(kuò)增和生長。37℃時的分泌水平約為10mg/L。大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)sNogoR310-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞。從10L的生物反應(yīng)器獲得1.7L濃縮的條件培養(yǎng)基。加入1/10體積的pH8.9的1.0MTris-HCl調(diào)高pH值。加入固態(tài)氯化鈉和甘氨酸至濃度分別為3.0M和1.5M。準(zhǔn)備60mL蛋白A-SepharoseTM層析柱，用10mM Tris-HCl，3M NaCl，1.5M甘氨酸，pH8.9平衡。將上述濃縮條件培養(yǎng)基上柱，使用蠕動泵控制上樣速度為1.5ml/分鐘。用300ml 10mM Tris-HCl，3M氯化鈉，1.5M甘氨酸，pH8.9洗滌柱體，然后再用120ml 5mM Tris-HCl，3M NaCl pH8.9洗柱。用25mM磷酸鈉、100mM NaCl，pH2.8溶液洗脫蛋白。在每支裝有1.0ml 1.0M HEPES，pH8.5的試管中收集10ml洗脫級分?；旌偷鞍踪|(zhì)洗脫級分，每次用2L 5mM磷酸鈉，300mM NaCl，pH7.4透析，共三次。
實(shí)施例12脊髓橫切實(shí)驗(yàn)為了檢測其促進(jìn)體內(nèi)功能性恢復(fù)的能力，使用大鼠脊髓橫切實(shí)驗(yàn)檢測了sNogoR-1融合蛋白。用當(dāng)日新鮮配制的待測溶液(sNogoR310-Fc溶于PBS)充滿Alzet滲透壓泵。裝載濃度計算為5和50μM，在移植入動物之前，泵在37℃提前運(yùn)轉(zhuǎn)40小時以上。雌性Long Evans大鼠在術(shù)前給服止痛藥和鎮(zhèn)靜劑，并使用異氟烷(以3％混入氧氣中)麻醉。將大鼠置于立體定向架中，暴露運(yùn)動皮質(zhì)，用于向脊髓兩側(cè)灌輸示蹤物BDA(分子量為10,000)。然后對大鼠實(shí)施T5-T6段脊髓背部半切斷，然后植入髓鞘內(nèi)導(dǎo)管和泵系統(tǒng)，用于遞送待測化合物(每組11只大鼠)。讓大鼠恢復(fù)和存活至術(shù)后第28天。記錄使用BBB系統(tǒng)的行為得分，直至誘導(dǎo)損傷后的28天，即本研究中的存活期結(jié)束之前。灌注和固定之后，取出脊髓，冷凍保存，切片，染色，進(jìn)行軸突計數(shù)。對小鼠和大鼠在損傷后進(jìn)行BBB(Basso-Beattie-Bresnaharl)(Basso et al.，1996，Neurotrauma 13，343-359)運(yùn)動評分、斜板試驗(yàn)和傾斜格柵行走試驗(yàn)(Li and Strittmatter，2003，J Neurosci.2003，23，4219-27)。對于斜板試驗(yàn)(inclined plane test)，我們測量了小鼠停留5秒鐘不滑下時，50厘米×60厘米板能夠傾斜的最大角度，對于傾斜格柵行走試驗(yàn)(inclined grid walking)，訓(xùn)練小鼠爬上傾斜45度的線格柵(wire grid)(35厘米長，2.54平方厘米的方格)。每次從下到上爬行的過程中計數(shù)后爪落在柵格板以下的次數(shù)。使用BBB運(yùn)動功能評分(BBB locomotor scale)、格柵行走和腳印分析對大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。對于格柵行走，訓(xùn)練大鼠爬上線格柵(70厘米長，2.54平方厘米的方格)，計數(shù)后爪落在柵格板以下的次數(shù)。對于腳印分析，用墨水記錄大鼠在連續(xù)運(yùn)動經(jīng)過90厘米長的跑道時后爪的行走模式，計算每側(cè)的步幅長度和步幅寬度(Metz et al.，2000，Brain Res.，883，165-177)。所有這些行為學(xué)測驗(yàn)至少由兩個人來完成。在手術(shù)、行為學(xué)測驗(yàn)和組織分析的全過程中，研究者不知道迷你泵中的化合物是什么。sNogoR310-Fc促進(jìn)了功能的恢復(fù)(圖12)。
實(shí)施例13大鼠脊髓挫傷實(shí)驗(yàn)用大鼠脊髓挫傷實(shí)驗(yàn)檢測可溶性Nogo受體-1多肽和融合蛋白對體內(nèi)神經(jīng)元的作用。使用止痛劑和抗生素預(yù)防性處理頭有大囊的Long Evans雌性大鼠(體重170-190g)。手術(shù)前10分鐘，通過腹腔注射咪達(dá)唑侖2.5mg/公斤體重使動物鎮(zhèn)靜，然后用異氟烷(以2-3％混于氧氣中)使動物麻醉。然后將大鼠的毛刮掉，用乙醇和聚維酮碘擦拭，在眼部施用眼潤滑劑。接下來沿著中線切開，暴露T7到T12段椎骨。在T91/2和T10段脊椎處進(jìn)行背部椎板切除術(shù)，暴露脊髓。將大鼠安放在沖擊器上。首先將T7和T8節(jié)段夾住，然后將T11和T12節(jié)段固定在沖擊器尾側(cè)的夾子上。在大鼠的胸部下方放一塊柔軟的材料。將沖擊棒設(shè)置在0的位置，將電地線夾連在傷口邊緣，然后將沖擊棒抬高到25mm，調(diào)節(jié)其位置至它恰巧正好在暴露的脊髓之上。然后釋放沖擊棒擊中脊髓，之后立即抬起沖擊棒。然后將大鼠從沖擊器上放下，在傷口處抹上Gelfoam?？p合傷口之上的肌肉，切口通過手術(shù)膠帶封合。將動物置于一個溫箱內(nèi)直至它們從麻醉中蘇醒。需要為大鼠提供抗生素、止痛劑和鹽水。此后每天早晚擠壓膀脫，直至功能恢復(fù)。如上所述，通過髓鞘內(nèi)向上述的大鼠脊髓橫切模型施用可溶性受體-1融合蛋白(例如sNogoR310-Fc)。術(shù)后一天進(jìn)行BBB評分，之后每周一次，直至4到6周。
實(shí)施例14sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)我們制備了表達(dá)可溶性Nogo受體-1蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，以檢測可溶性Nogo受體-1蛋白在體內(nèi)表達(dá)時的作用。我們將小鼠的sNogoR310cDNA(對應(yīng)于Nogo受體-1的1-310位氨基酸；SBQ ID NO28)克隆入C-3123載體的NotI位點(diǎn)。在該載體中，sNogoR310的表達(dá)是在神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(gfap)基因的調(diào)控序列的控制下的，這樣可以產(chǎn)生高水平表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物可以從損傷部位的活性星形膠質(zhì)細(xì)胞中分泌出來。接下來我們將得到的載體依次用AatII和SfiI消化，分離出位于3.4kb片段上的gfap∷sNOPE310構(gòu)建體。我們將該片段微注射入胚胎中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。我們通過PCR證實(shí)了轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合并且鑒定出了5個新建品系(founder line)。我們將表達(dá)水平最高的兩個雜合雄性新建品系與雌性C57BL/6J小鼠交配。我們使用抗Nogo受體-1的抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，證實(shí)在雜合的轉(zhuǎn)基因小鼠中，GFAP陽性的細(xì)胞表達(dá)和分泌了sNogoR310。我們將皮質(zhì)和脊髓在含有蛋白酶抑制劑(Rode)的Tris鹽緩沖鹽溶液中勻漿，將勻漿產(chǎn)物在4℃40,000rpm條件下離心20分鐘。取上清用4％多聚甲醛處理20分鐘以提高抗體的特異性，并在免疫印跡之前進(jìn)行透析，我們通過在RIPA緩沖液(含1％TritonX-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS的PBS)中用超聲波處理勻漿微粒級分，將得到的勻漿產(chǎn)物離心，同上處理此上清(去污劑-可溶性微粒級分)。我們使用1∶2000稀釋的Nogo受體-1的兔抗血清，通過免疫印跡分析了20微克的大腦或脊髓蛋白質(zhì)。在與AP偶聯(lián)的抗兔IgG和NBT/BCIP AP底物孵育之后，我們觀察到了免疫反應(yīng)性。我們檢測到，在兩個轉(zhuǎn)基因品系Tg08和Tg01的皮質(zhì)和脊髓的不含去污劑的可溶性提取物中有分泌型37kD sNogoR310，但是在同窩野生型(WT)小鼠中不存在大小為37KD或81KD的任何可溶性Nogo受體-1蛋白(若有也很少)。對微粒級分的檢查證明了在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中都存在相當(dāng)水平的內(nèi)源Nogo受體-1。
實(shí)施例15損傷之后在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)sNogoR310通過背部過半切斷損傷，檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷對sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)的影響。我們通過如實(shí)施例14中描述的方法將雜合雄性與C57/BL6雌性交配，獲得sNogoR310轉(zhuǎn)基因動物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談游铩Ｎ覀兩疃嚷樽沓赡甏菩噪s合轉(zhuǎn)基因或同窩野生型小鼠(10-16周齡)，實(shí)施完全椎板暴露手術(shù)，將背部脊髓T6和T7段完全暴露。我們對T6段脊髓實(shí)施背部過半切斷，使用30號針和顯微手術(shù)剪將背部和背外側(cè)皮質(zhì)脊髓束(CTS)完全分開。我們用做了記號的針多次穿過脊髓的背段，以確認(rèn)損傷的深度為1.0mm。我們縫合椎板暴露手術(shù)上方的肌肉層，使用手術(shù)膠帶將背部皮膚封合。為了跟蹤皮質(zhì)脊髓束，我們在脊髓損傷后14天在大腦皮質(zhì)上方的右側(cè)向顱骨內(nèi)鉆了一個骨窗.我們在皮質(zhì)表面以下0.7mm深的四個位置注射示蹤物BDA(分子量10000，濃度為10％溶于PBS)(MolecularProbes，Eugene，OR)。損傷后四周，小鼠心臟灌注PBS，然后用4％多聚甲醛固定。用于sNogoR310表達(dá)實(shí)驗(yàn)的小鼠不注射任何示蹤物。用于蛋白印跡分析的小鼠，損傷之后14天，不進(jìn)行灌注，收集在T3和L3段之間的脊髓。用于Nogo受體-1免疫組織化學(xué)染色的小鼠在半切后10天用4％多聚甲醛灌注，取出受損的脊髓進(jìn)行切片。使用固定于立體定位裝置(David Kopf，Tujunga，CA)中的11號解剖刀的刀刃對轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠實(shí)施皮質(zhì)針刺損傷，以檢查sNogoR310在受損腦部中的表達(dá)。在前囪后0.5mm、距離中線側(cè)1.5mm處作一個4mm長的副矢狀切割，切割為3.5mm深。損傷10天以后，我們在轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓可溶性提取物中檢測到sNogoR310表達(dá)的提高，但是在野生型小鼠中沒有檢測到。這與損傷后在損傷部位周國GFAP的水平升高是一致的。為了證明這不是由于NogoA補(bǔ)償性上調(diào)造成的，我們檢測了NogoA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在野生型或轉(zhuǎn)基因小鼠中完整未損的或者受損的皮質(zhì)和脊髓中表達(dá)是類似的。我們使用Nogo受體-1抗體和GAFP抗體，通過對受損的腦和含有受損區(qū)域的脊髓進(jìn)行免疫染色，檢查了在受損CNS中sNogoR310的細(xì)胞表達(dá)。有反應(yīng)活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有形態(tài)學(xué)差異，但是在gfap∷sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外間隙中，Nogo受體-1的染色強(qiáng)度明顯高于野生型小鼠，這表明在轉(zhuǎn)基因小鼠的損傷部位周圍，sNogoR310的表達(dá)升高。Nogo受體-1蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP僅在轉(zhuǎn)基因小鼠中共定位。在轉(zhuǎn)基因樣本中，存在明顯增強(qiáng)的非細(xì)胞染色擴(kuò)散，這與細(xì)胞外間隙中的sNogo310R是一致的。在野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠中都檢測到了神經(jīng)元細(xì)胞體的Nogo受體-1染色。
實(shí)施例16分泌的sNogoR310誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中CSF出芽我們對轉(zhuǎn)基因小鼠中損傷部位周圍的sNogoR310表達(dá)升高是否能引發(fā)受損軸突再生進(jìn)行了測試。我們Li and Strittmatter，2003，J.Neurosci.，23，4219-27一文中描述的方法，通過在右側(cè)運(yùn)動皮質(zhì)中注射順向(anterograde)示蹤物生物素葡聚糖胺(BDA)對下行皮質(zhì)脊髓束(CSF)的完整性進(jìn)行了檢驗(yàn)。在同窩野生型小鼠中，突出的背部皮質(zhì)脊髓束緊緊綁縛于損傷部位的頭向(rostral)，在同側(cè)只能看到少數(shù)背外側(cè)CST纖維。少量的BDA標(biāo)記的短側(cè)芽伸向灰質(zhì)，特別是在腹側(cè)脊髓中，但是出芽主要局限于與示蹤物注射對側(cè)的脊髓中。但是在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的背部半切斷位置頭向的切片中顯示了明顯不同的BDA標(biāo)記分布。在所有的轉(zhuǎn)基因小鼠品系Tg08或Tg01中，突出的背部皮質(zhì)脊髓束以外都觀察到了高密度的BDA標(biāo)記的CST纖維。異位纖維遍布灰質(zhì)區(qū)域，而一些纖維到達(dá)了外側(cè)和背外側(cè)的白質(zhì)中。在脊髓的對側(cè)(示蹤物注射點(diǎn)的同側(cè))可見許多纖維(每個橫切中4-12個芽)。側(cè)芽的微量光密度測量表明在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中出芽密度大約增加了10倍。與同窩野生型小鼠不同，對sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠距離損傷處1到4mm的副矢狀面縱切切片進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，dCST纖維向腹側(cè)灰質(zhì)區(qū)域伸出大量分支芽。通常，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，在損傷位置的頭向出芽的形式和程度與全身使用Nogo受體-1拮抗肽NEP1-40治療的小鼠中觀察到的類似(Li和Strutmatter，2003)。這些結(jié)果表明分泌的sNogoR310能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中CST出芽。
實(shí)施例17在sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠中，CST軸突再生越過損傷部位進(jìn)入遠(yuǎn)端脊髓我們從轉(zhuǎn)基因小鼠中分離出從損傷部位起頭向4mm和尾向4mm的脊髓(總共8mm長)，將其包埋于戊二醛聚合的白蛋白基質(zhì)中，在振動切片機(jī)上作副矢狀(30μm厚)切割。我們收集從損傷部位起頭向5-7mm和尾向5-7mm的脊髓橫切(50μm)。對于大鼠中的sNogoR310-Fc注射實(shí)驗(yàn)，從損傷部位起頭向10mm且尾向10mm延伸的脊髓，在振動切片機(jī)上作副矢狀切割(50μm厚)，收集從損傷部位起頭向11-16mm且尾向11-16mm脊髓的橫切。將切片與親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物共同溫育，使用鎳增強(qiáng)的二氨基聯(lián)苯胺HPR反應(yīng)(Grandpre，2002，Nature，417，547-551)來顯現(xiàn)BDA示蹤物。我們使用了間接免疫熒光技術(shù)，對一些切片進(jìn)行了5-羥色胺組織化學(xué)(抗-5-HT抗體)處理。為了觀察受損的區(qū)域，我們用針對GFAP的抗體(Sigma，St.Louis，MO)對一些切片進(jìn)行了雙染色。我們對切片進(jìn)行了封固、脫水，并用封固介質(zhì)覆蓋切片。在顯微鏡描圖器中描繪的跨越損傷部位的連續(xù)副矢狀切片顯示損傷部位周圍幾個mm處的再生CST纖維呈全面分布。野生型小鼠的切片顯示沒有從受損部位處伸出的CST纖維。sNogo310轉(zhuǎn)基因小鼠的類似切片顯示有大量CST纖維跨越橫切區(qū)域，以高度分支方式伸向遠(yuǎn)端的灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域。在半切部位頭向的近鄰區(qū)域，起源于突出的dCST的、高密度的BDA標(biāo)記的CST出芽伸入受損區(qū)域，但是大多數(shù)CST出芽不能穿越疤痕形成和組織空洞大量存在的橫切區(qū)域。小量但是非常顯著的一部分再生軸突，通過腹側(cè)和腹外側(cè)灰質(zhì)和白質(zhì)的殘余組織橋，繞過受損部位。此外，少量CST纖維自身通過受損的背側(cè)和背外側(cè)脊髓跨過橫切區(qū)域，進(jìn)入遠(yuǎn)端區(qū)域。在損傷的附近，再生纖維的行進(jìn)路線通常是曲折的，與頭向CST中正常平直的纖維明顯不同。在遠(yuǎn)端脊髓的灰質(zhì)區(qū)域中經(jīng)常見到的是平行纖維和樹枝狀纖維。重建表明在所有轉(zhuǎn)基因小鼠中，從損傷部位起尾向1-4mm的任何水平，5-15個BDA-標(biāo)記的再生纖維沿著頭-尾向軸向行進(jìn)。所有轉(zhuǎn)基因小鼠中，從背部半切斷部位起尾向的5-7mm的橫切切片中，在灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)域都可以觀察到BDA標(biāo)記的CST軸突。轉(zhuǎn)基因小鼠的纖維計數(shù)提示，在矢狀切片中的近端水平上有大致相近數(shù)目的BDA標(biāo)記的CST纖維。除了CST纖維以外，其它下行傳導(dǎo)束，例如縫核脊髓纖維(raphespinal fiber)，也在小鼠的運(yùn)動功能中起作用。在這種小鼠背部過半切斷模型中，橫切損傷了大部分5-羥色胺能纖維，使腹角中的這些纖維的密度降低了大約80％。對尾向脊髓腹角中5-羥色胺能纖維的分析表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中這些纖維的數(shù)目比野生型小鼠中的多，顯示sNogoR310在轉(zhuǎn)基因小鼠中的生長促進(jìn)作用并不只限于一條軸突下行路徑。
實(shí)施例18轉(zhuǎn)基因表達(dá)sNogoR310促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)CST軸突示蹤和5-羥色胺能纖維分析表明在轉(zhuǎn)基因小鼠中，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的sNogoR310刺激脊髓中受損的下行軸突廣泛的解剖學(xué)再生。我們進(jìn)行了幾項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例12所示，以確定這些再生的纖維是否有益于功能恢復(fù)。BBB實(shí)驗(yàn)給出的結(jié)果，野生型小鼠在4周的存活期內(nèi)部分地恢復(fù)了運(yùn)動功能。在損傷后4周時，大多數(shù)野生型小鼠的功能恢復(fù)到了這樣一個水平持續(xù)負(fù)重的跖肌步行，但是它們僅僅表現(xiàn)出偶爾到經(jīng)常的前后肢協(xié)調(diào)，在剛剛接觸測試表面時出現(xiàn)優(yōu)勢爪位置的旋轉(zhuǎn)。與此相反，在7-28天的觀察期內(nèi)，sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的兩個品系Tg08和Tg01的BBB得分顯著高于對照組(圖13A和13B)。損傷后28天，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，而且優(yōu)勢爪位置與身體平行，我們又進(jìn)行了另外兩項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)。首先我們測量了小鼠能夠在5秒鐘之內(nèi)不滑下的最大平板傾斜角度。在背部半切斷損傷之前，轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠都能夠在平板傾角為55度時保持它們的姿勢。在損傷后7-28天內(nèi)，對于所有的小鼠，可以經(jīng)受的傾角都有所縮小，但是轉(zhuǎn)基因小鼠的可經(jīng)受的傾角明顯大于對照組小鼠(圖13C)，在另一個行為實(shí)驗(yàn)中，小鼠攀爬與垂直方向至45度角的格柵，并計數(shù)爬行途中后肢落在格柵的平面以下的次數(shù)(Metz et al.，2000)。在損傷之前的訓(xùn)練中，所有的小鼠都沒有在該實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)這樣的錯誤。在損傷后2-6周期間，野生型小鼠出現(xiàn)大量的腳印錯誤，且只有極微小的改善。與此相反，在本申請中，sNogoR310轉(zhuǎn)基因小鼠在爬格柵實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出進(jìn)行性改善，主要的改善出現(xiàn)在損傷后1-3周之間(圖13D)。因此，從星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌sNogoR310的轉(zhuǎn)基因小鼠在胸髓(thoracic spinal)半切斷之后表現(xiàn)出CST再生，縫核脊髓(raphespinal)出芽和運(yùn)動功能的增強(qiáng)。
實(shí)施例19髓鞘內(nèi)施用sNogoR310-Fc蛋白誘導(dǎo)CST出芽作為第二個檢測可溶性Nogo受體1在脊髓外傷之后有促生長益處的實(shí)驗(yàn)，我們髓鞘內(nèi)施用純化的蛋白。我們將大鼠Nogo受體-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(27-310)與大鼠IgG1Fc結(jié)構(gòu)域相融合，以提高穩(wěn)定性，有助于純化。我們從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中純化蛋白。正如此前進(jìn)行的小鼠sNogoR310-Myc His試驗(yàn)(Fournier etal.，2002，J Neurosci.，22，8876-8883；Liu et al.，2002，Science，297，1190-1193)那樣，這種蛋白能阻斷Nogo-66、MAG和髓鞘在體外的作用。我們通過滲透壓迷你泵，將sNogoR310-Fc蛋白髓鞘內(nèi)施用至受到中胸背部半切斷損傷的小鼠。在損傷后4周的存活期內(nèi)，每只大鼠局部注射1.2mg sNogoR310-Fc蛋白。在接受載體處理(1.2mg大鼠IgG)的大鼠中，半切斷位置頭向的切片顯示在損傷部位上方有緊緊綁縛的突出背部CST和極少的異位BDA標(biāo)記的CST纖維。接受sNogoR310-Fc蛋白的損傷大鼠，其損傷位置頭向的切片顯示了完全不同的標(biāo)記分布模式，從橫切和副矢狀切片中可以觀察到大量從BDA標(biāo)記的CST上發(fā)出的異位纖維。有些情況下，突出越過了臨近中線的dCST區(qū)域，到達(dá)脊髓的周圍，與背外側(cè)的CST混和在一起。出芽的軸突在灰質(zhì)中的擴(kuò)展比在白質(zhì)中的擴(kuò)展程度要大。測量顯示，在經(jīng)sNogoR310-Fc處理過的大鼠中，與dCST鄰近的異位出芽纖維(在橫切中≥100μm；在矢狀切面中≥200μm)增加得更多。
實(shí)施例20在sNogoR310-Fc治療的大鼠中，CST軸突再生進(jìn)入遠(yuǎn)端脊髓我們對雌性Sprague Dawley大鼠(體重190-250g)實(shí)施深度麻醉，在T6-7段脊髓處實(shí)施胸椎暴露術(shù)，暴露脊髓。我們切開脊髓背部一半，使用30號針和顯微剪刀將背部CSGT束分開，并用11號手術(shù)刀的鋒利的刀刃通過髓的背部一半(Grandpre et al.，2002，Nature，417，547-551)以確保損傷的深度(1.8mm)。滲透壓迷你泵((Abet2ML4，2ml容積，2.5μl/小時，28天遞送)中充滿含1.2mg大鼠IgG的PBS或者含1.2mg sNogoR310-Fc融合蛋白的PBS，將泵縫在動物背部皮膚下的肌肉中。與迷你的出口相連的導(dǎo)管，通過一個硬脊膜上的小洞，被插入到T7-8段脊髓的髓鞘內(nèi)空隙。灌輸Nogo受體-1拮抗劑蛋白在大鼠半切斷位置頭向誘導(dǎo)出大量出芽，但是更為關(guān)鍵的問題是出芽的CST纖維是否伸向遠(yuǎn)端脊髓且是否有助于運(yùn)動功能恢復(fù)。從載體處理大鼠獲取貫穿損傷部位的縱向切片，切片顯示在損傷水平處以下沒有任何可檢測的或者僅能檢測到極少數(shù)目的BDA標(biāo)記的腹側(cè)CST纖維(GrandPre et al.，2002；Weidner et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，3513-3518>。取自經(jīng)sNogoR310-Fc治療后的大鼠的類似切片顯示有許多BDA-標(biāo)記的纖維通過腹例和腹外側(cè)脊髓的橋梁組織繞過了橫切部位伸向脊髓的尾向。對星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP的免疫染色顯示，橫切到達(dá)的深度深過脊髓的中央管區(qū)。與突出的背部CST中頭向纖維的線形走勢不同，再生的CST纖維在遠(yuǎn)端脊髓中通常呈現(xiàn)高度分支的形式，灰質(zhì)區(qū)內(nèi)尤其如此。在脊髓的許多區(qū)域內(nèi)都檢測到了這些纖維，但是這些纖維在脊髓中央和背部那一半更容易看到。矢狀切片中的CST纖維計數(shù)顯示在每一只經(jīng)sNogoR310-Fc治療過的大鼠中，損傷部位后面1-2mm處有大約20個BDA-標(biāo)記的軸突；且在損傷部位遠(yuǎn)端7-8mm處有15個標(biāo)記軸突。通常，這些纖維的分支形式與NEP1-40肽局部處理過的動物中出現(xiàn)的分支形式相似，但是使用sNogoR310-Fc蛋白處理后的切片中可以看到每一個芽體中有更多側(cè)向分支。對從遠(yuǎn)端脊髓發(fā)出的芽進(jìn)行測量表明經(jīng)sNogoR310-Fc處理的動物中每一個芽的總側(cè)向長度是經(jīng)NEP 1-40處理的動物中的兩倍。脊髓尾向1-10mm內(nèi)芽體(長度≥200μm)的數(shù)目，在兩組Nogo受體-1拮抗劑處理的大鼠中都比對照組大20-40倍。與局部使用NEP1-40處理相比，經(jīng)sNogoR310-Fc處理的大鼠中可以看到更多的出芽(NEP1-40組中每只大鼠約25個出芽，sNogoR310-Fc組中每只大鼠約50個出芽)，但是這種區(qū)別在統(tǒng)計上不顯著(p＝0.1713，t檢驗(yàn))在接受sNogoR310-Fc治療的大鼠半切斷部位尾向11-15mm處的脊髓橫切切片中，可以見到正在再生的CST軸突。這些纖維在脊髓的灰質(zhì)和白質(zhì)中都可以檢測到，與白質(zhì)相比，在灰質(zhì)中檢測到的纖維通常具有更多的側(cè)向分支。與此相反，賦形劑處理組的橫切切片中，在腹側(cè)白質(zhì)區(qū)域中，只能偶爾看到BDA-標(biāo)記，這與未損傷組的腹側(cè)CST軸突一致。在遠(yuǎn)端脊髓的這一水平上，兩種Nogo受體-1拮抗劑(sNogoR310-Fc和NEP1-40)處理組中BDA-標(biāo)記的CST纖維的平均數(shù)目是載體處理大鼠的大約20倍。兩種Nogo受體拮抗劑sNogoR310-Fc蛋白和NEP1-40肽，都能使遠(yuǎn)端脊髓中出現(xiàn)明顯的CST軸突再生，但是前者誘導(dǎo)的出芽呈現(xiàn)出更高度的分支模式。
實(shí)施例21局部施用sNogoR310-Fc誘導(dǎo)受損大鼠脊髓中紅核脊髓和5-羥色胺能軸突出芽半切斷后14天，在后肢感覺運(yùn)動皮質(zhì)上方顱骨每一側(cè)鉆一個骨窗，以示蹤C(jī)ST纖維。在各側(cè)硬脊膜下深度為1.5mm的7個注射部位注射順向的神經(jīng)元示蹤物BDA(溶于PBS中，濃度為10％，每個皮質(zhì)3.5μl)(Grandpre，2002)。對于大鼠中紅核脊髓束的示蹤而言，將示蹤物BDA(分子量10,000，溶于PBS中，濃度為10％，1μl)注射入左側(cè)的紅核內(nèi)(前囪前5.8mm，距離顱骨表面外側(cè)0.7mm，腹側(cè)7.0mm)。BDA注射后兩周，依次使用PBS和4％多聚甲醛灌注動物，收集組織，用于組織學(xué)分析。脊髓損傷之后功能改善是由于受損紅核脊髓束(RST)纖維的修復(fù)(Liu et al.，1999，J.Neurosci.，19，4370-4387)。Nogo受體-1在CNS神經(jīng)元內(nèi)的廣泛分布使得下列事件成為可能Nogo受體-1被其拮抗劑抑制導(dǎo)致受損后RST軸突的再生。為了檢測sNogoR310-Fc對受損RST的作用，使用BDA注射入左側(cè)紅核，示蹤該途徑的完整性。在脊髓水平上，RST纖維一般位于脊髓的背外側(cè)白質(zhì)區(qū)，且被本研究中的背部半切斷橫切開。在對照組大鼠中，損傷部位頭向11-15mm處的橫切切片顯示，在突出的RST和背角灰質(zhì)之間可以看到少量的BDA-標(biāo)記的短纖維。在同一水平的sNogoR310-Fc處理的切片中，在RST主干和背角灰質(zhì)之間呈現(xiàn)有許多連接纖維。載體處理的大鼠中，距離SCI遠(yuǎn)端11-15mm處的橫切切片未見BDA-標(biāo)記的RST纖維。與此相反，接受sNogoR310-Fc處理的同一水平的切片中顯示，在示蹤物注射對側(cè)的灰質(zhì)和白質(zhì)中有大量的BDA-標(biāo)記的RST纖維，在與BDA注射同側(cè)的灰質(zhì)中可見一些具有分支模式的出芽。在經(jīng)sNogoR310-Fc處理的脊髓損傷大鼠中還檢查了紅核脊髓束纖維。免疫染色表明在載體處理組和sNogoR310-Fc處理組中，損傷部位頭向11-15mm處的5-羥色胺能纖維密度大致相同。在損傷部位下面11-15mm處的切片中，sNogoR310-Fc處理的大鼠的5-羥色胺纖維的數(shù)目是對照組的兩倍。這些結(jié)果表明sNogoR310-Fc蛋白對Nogo受體-1的抑制作用的反應(yīng)不止限于CST纖維，而且其它下行束，例如紅核脊髓束和5-羥色胺能軸突，也對Nogo受體-1拮抗作用有反應(yīng)。
實(shí)施例22局部施用sNogoR310-Fc促進(jìn)大鼠功能恢復(fù)髓鞘內(nèi)施用sNogoR310-Fc蛋白，能促進(jìn)外傷性脊髓損傷后許多下行途徑中軸突的再生。另外，我們還對該蛋白是否能促進(jìn)受損脊髓功能恢復(fù)進(jìn)行了測試。半切斷后兩周，賦形劑處理的大鼠的運(yùn)動功能BBB得分達(dá)到了穩(wěn)定的12分水平(圖14A)。在損傷后4周，大多數(shù)對照(7個中有6個)具有頻密-連續(xù)的負(fù)重跖肌步行以及頻密-連續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，但是它們在初次接觸測試表面時，優(yōu)勢爪位置有旋轉(zhuǎn)。與此相反，接受sNogoR310-Fc蛋白處理的大鼠中，運(yùn)動功能評分在損傷后2到4周內(nèi)持續(xù)升高。損傷后4周時，所有9只sNogoR310-Fc處理的動物都具有持續(xù)的前后肢協(xié)調(diào)，并且爪在首次接觸測試表面時是平行的。已有人使用格柵行走試驗(yàn)評價脊髓損傷后下行(descending)精細(xì)運(yùn)動控制中的缺陷(Metz et al.，2000)。格柵行走需要前后肢的協(xié)調(diào)和腹外側(cè)纖維、皮質(zhì)脊髓纖維和紅核脊髓束纖維介導(dǎo)的自主運(yùn)動控制。在損傷之前的訓(xùn)練中，所有的大鼠都能準(zhǔn)確地將它們的后肢放在格子的邊框上。損傷后2-4周，對照大鼠在每次行走中會出現(xiàn)8-9次錯誤，并且一段時間后僅有極小程度的改善。與此相反，使用sNogoR310-Fc處理后的大鼠在格柵行走時表現(xiàn)出進(jìn)行性改善，出現(xiàn)錯誤明顯減少(平均每次行走4-7次錯誤)。改善主要出現(xiàn)在損傷后的2-3周。對照組后爪腳印分析顯示與未受到損傷大鼠或者接受sNogoR310-Fc處理后的受損大鼠相比，對照組大鼠半切斷后4周時步幅的長度明顯減小且步幅寬度增加(圖14C)。因此，這些多項(xiàng)行為學(xué)測試表明局部注射拮抗劑蛋白對Nogo受體-1功能的阻斷，能夠促進(jìn)損傷后運(yùn)動功能的恢復(fù)。
生物保藏將雜交瘤HB 7E11(ATCC保藏號PTA-4587)，HB 1H2(ATCC保藏號PTA4584)，HB 3G5(ATCC保藏號PTA-4586)，HB 5B10(ATCC保藏號PTA-4588)以及HB 2F7(ATCC保藏號PTA-4585)在2002年8月9日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)中，地址為10801Universityboulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)精神的前提下，可以對優(yōu)選實(shí)施方案作多方面的改動和調(diào)整。所有改動后的方案均在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種多肽，該多肽選自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ IDNO26)；LDLSDNAQLR(SEQ ID NO27)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO30)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO31)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO32)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO33)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO34)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO35)；DNAQLRWDPTT(SEQ ID NO36)；DNAQLR(SEQ ID NO37)；ADLSDNAQLRWDPTT(SEQ ID NO41)；LALSDNAQLRWDPTT(SEQ IDNO42)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO43)；LDLSDNAQLHWDPTT(SEQ ID NO44)；和LDLSDNAQLAWDPTT(SEQ ID NO45)。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述多肽的核酸。
3.權(quán)利要求2所述的核酸，其可操作地連接于表達(dá)調(diào)控序列。
4.一種載體，其中含有權(quán)利要求2或3所述的核酸。
5.一種宿主細(xì)胞，其中包含權(quán)利要求2或3所述的核酸或者包含權(quán)利要求4所述的載體。
6.一種制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，該方法包括下述步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞；以及(b)從該宿主細(xì)胞或者培養(yǎng)基中回收所述多肽。
7.一種制備抗體的方法，該方法包括下述步驟(a)用權(quán)利要求1所述多肽或權(quán)利要求5所述宿主細(xì)胞免疫宿主；以及(b)回收所述抗體。
8.一種用權(quán)利要求7所述方法制備的抗體或該抗體的抗原結(jié)合片段。
9.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其能與權(quán)利要求1所述多肽特異性結(jié)合。
10.權(quán)利要求8或9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述的抗體(a)能抑制神經(jīng)元的生長錐萎陷；(b)能夠降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長和出芽的抑制；以及(c)能抑制Nogo受體-1與配體間的結(jié)合。
11.權(quán)利要求10所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述的神經(jīng)突向外生長和出芽是軸突生長。
12.權(quán)利要求10所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述的神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
13.權(quán)利要求8或9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述的抗體是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求8或9所述的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述的抗體是小鼠抗體。
15.權(quán)利要求8或9所述的抗體，其中所述抗體選自人源化抗體、嵌合抗體和單鏈抗體。
16.一種用于抑制Nogo受體-1與配體間結(jié)合的方法，該方法包括下述步驟讓Nogo受體-1與權(quán)利要求10所述的抗體或抗原結(jié)合片段接觸。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的配體選自NogoA、NogoB、NogoC、MAG和OM-gp組成的組。
18.一種用于抑制神經(jīng)元內(nèi)生長錐萎陷的方法，該方法包括下述步驟讓所述神經(jīng)元與權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。
19.一種降低對神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)突向外生長或者出芽抑制的方法，該方法包括下述步驟讓所述神經(jīng)元與權(quán)利要求10所述的抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的神經(jīng)突向外生長或者出芽是軸突生長。
21.權(quán)利要求18或者19所述的方法，其中所述的神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元。
22.一種組合物，其中包括藥物學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求8或9所述的抗體或其抗原-結(jié)合片段。
23.權(quán)利要求22所述的組合物，該組合物進(jìn)一步還包括一種或多種其它治療劑。
24.一種用于促進(jìn)有死亡危險的神經(jīng)元存活的方法，該方法包含下述步驟讓神經(jīng)元與有效量的權(quán)利要求8或9所述的抗-Nogo受體-1抗體或抗原結(jié)合片段接觸。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的神經(jīng)元處于體外。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述的神經(jīng)元是哺乳動物的。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的哺乳動物表現(xiàn)出多發(fā)性硬化、ALS、亨丁頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森氏癥、糖尿病性神經(jīng)病、中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的體征或者癥狀。
28.一種用于促進(jìn)哺乳動物中的有死亡危險的神經(jīng)元存活的方法，該方法包括(a)提供表達(dá)權(quán)利要求8或9所述的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；以及(b)將所述宿主細(xì)胞導(dǎo)入該哺乳動物至所述神經(jīng)元所在位置或其附近。
29.一種用于促進(jìn)哺乳動物中的有死亡危險的神經(jīng)元存活的基因治療方法，該方法包括在神經(jīng)元或其附近位置施用病毒載體，該載體包含編碼權(quán)利要求8或9所述抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列，其中所述的抗-Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段由該核苷酸序列在哺乳動物中表達(dá)而成，其表達(dá)量足以促進(jìn)神經(jīng)元的存活。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有免疫原性的Nogo受體－1多肽、Nogo受體－1抗體及其抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體及其融合蛋白，以及編碼這些物質(zhì)的核酸。本發(fā)明還公開了組合物，其中包含所述Nogo受體抗體、其抗原結(jié)合片段、可溶性Nogo受體、其融合蛋白或編碼這些物質(zhì)的核酸，以及制備和使用這些多肽/蛋白質(zhì)和核酸的方法。
文檔編號A61K38/00GK1926147SQ200480029412
公開日2007年3月7日 申請日期2004年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者丹尼爾·H·S·李, R·布萊克·佩平斯基, 李維維, 西爾維亞·A·拉巴奇, 簡·K·雷爾頓, 戴恩·S·沃利, 斯蒂芬·M·斯特里特馬特, 迪納·Y·W·薩 申請人:比奧根艾迪克Ma公司, 耶魯大學(xué)