一種同時實現(xiàn)促進樹突細胞遷移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物科學領(lǐng)域，特別涉及一種促進樹突細胞迀移至淋巴組織，并能對該迀移過程進行多模式成像監(jiān)測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DC疫苗是通過采用病人自體的單核細胞在體外培養(yǎng)誘導生成DC，然后負載相應的腫瘤抗原并刺激成熟而獲得。若要高效地發(fā)揮其治療作用，成熟的DCXmature DC，mDC)必須迀移至病人的淋巴結(jié)組織并與幼稚T細胞相互作用。已有大量研究證據(jù)表明，DC所產(chǎn)生的體內(nèi)免疫反應與攜帶相關(guān)腫瘤抗原的成熟DC迀移至次級淋巴組織的效率成正相關(guān)。雖然近期的臨床預實驗顯示DC疫苗具有良好的治療效果，但是僅有不到2%的注射進入體內(nèi)的DC到達次級淋巴組織。因此，若要提升DC疫苗治療功效，其中關(guān)鍵的一步在于如何提高DC在體的迀移效率。目前的研究主要集中在通過探索DC在體迀移的分子機制來解決DC迀移效率低的問題。Fontecha等人發(fā)現(xiàn)采用腫瘤壞死因子(TNF)或白細胞介素(IL-la)等炎癥因子預免疫小鼠，可以增強其淋巴管內(nèi)皮細胞對于趨化因子CCL21的表達，從而引導DC細胞更高效地迀移。Weber等人于2013年1月在Science上發(fā)表文章，指出通過構(gòu)建模型證實了 DC在體迀移主要取決于淋巴管內(nèi)皮細胞表達的CCL21的濃度。闡明DC的迀移機制在一定程度上可以指導今后的DC疫苗設計，但是采用炎癥因子預刺激存在以下問題:1)DC迀移率仍較低(<3% );2)在DC接種量較高時(> 2 X 106)，預刺激基本不起作用；3)高劑量的炎癥因子在體給藥存在一定的不良反應;4)預刺激可以提高體內(nèi)CCL21的濃度梯度水平，但無法實現(xiàn)對DC迀移的直接控制。因此，迫切需要開發(fā)更加高效、安全和可控的技術(shù)手段來提高DC的活體迀移效率。
[0003]磁力牽引是借用磁體異極相吸的原理而產(chǎn)生的一種方法，目前在生物醫(yī)學領(lǐng)域已展現(xiàn)出良好的應用前景。Susan P.Foy合成了一種裝載氧化鐵的納米顆粒(magneticnanopart i c 1 e，麗P)經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后，利用外加磁場提高了 MNP在腫瘤組織中的蓄積。Alain Luciani將攝取MNP的Huh7肝癌細胞經(jīng)脾臟注射到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)利用磁力牽引可以顯著性地提高Huh7在肝臟外周血管周圍的數(shù)量。目前還未有報道利用磁力牽引來提高DC的活體迀移效率。目前的研究已表明磁力牽引具有特異性好、安全和可控等優(yōu)點，因此有望解決DC活體迀移效率低的難題。
[0004]另外，DC疫苗的優(yōu)化要求建立非創(chuàng)傷性的成像手段來動態(tài)地監(jiān)測DC迀移至淋巴組織的過程，從而實現(xiàn)在治療過程中快速評價DC疫苗的效果。將這些造影劑標記DC主要是通過納米運輸載體實現(xiàn)，包括量子點、磁性納米顆粒和聚合物納米材料等。其中，采用納米載體攜帶多種造影劑(尤其是近紅外和MRI探針)進行多模式成像可以兼顧成像檢測靈敏度和空間分辨率。為了滿足以上需求，納米顆粒的設計必須滿足以下要求:1)生物相容性好;2)能被DC高效地攝取;3)能同時包裹腫瘤抗原、近紅外和磁性MRI探針;4)在應用于腫瘤治療時，攜帶的腫瘤抗原能被優(yōu)先遞送到DC的胞漿中而不是內(nèi)體/溶酶體中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種促進樹突細胞迀移至淋巴組織，并能對該迀移過程進行多模式成像監(jiān)測的方法，利用該方法能有效提高DC的腫瘤防治功效。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種同時實現(xiàn)促進樹突細胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，所述方法由成熟樹突細胞(mDCs)攜帶磁性焚光納米顆粒在外加磁場下實現(xiàn)。
[0008]進一步地，所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-磁性氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機結(jié)合形成。
[0009]進一步地，所述的磷脂為DMPC和MHPC。
[0010]進一步地，所述的近紅外探針為ICG分子。
[0011]進一步地，所述的具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽是由α螺旋多肽、連接序列和抗原肽以共價鍵的形式串連而成。
[0012]進一步地，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述連接序列的氨基酸序列為GSG，所述抗原肽的氨基酸序列為KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、SIINFEKL或ISQAVHAAHAEINEAGR。
[0013]進一步地，所述外加磁場為磁鐵產(chǎn)生或者恒定外加磁場。
[0014]本發(fā)明提供的一種同時實現(xiàn)促進樹突細胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法，具有以下優(yōu)點:
[0015](1)生物相容性好:本發(fā)明方法中所選用的材料，磷脂、ICG、氧化鐵顆粒和抗原融合肽，這些原材料都已用于臨床或臨床試驗，具有良好的生物相容性。
[0016](2)操作工藝簡單，有望應用于臨床。
[0017](3)能大幅提尚DC的活體遷移效率。
[0018](4)能同時進行DC的活體多模示蹤和腫瘤免疫治療:mDCs攝取磁性熒光納米顆粒后，其活體分布可以采用近紅外光學成像和磁共振成像進行示蹤；由于磁性熒光納米顆粒含有抗原融合肽，因此可以用于腫瘤的預防和治療。
[0019](5)采用磁力牽引能顯著增強mDCs的抗癌功效。
[0020](6)功能可擴展:該系統(tǒng)除了直接應用于DC疫苗外，還可以在其表面裝載免疫佐劑直接作為納米疫苗，同時實現(xiàn)在體免疫細胞的激活、抗原高效遞送、磁力牽引和多模成像。
【附圖說明】
[0021]圖1為所述磁性熒光納米顆粒的透射電子顯微鏡成像圖像和動態(tài)激光光散射(DLS)圖。
[0022]圖2為磁性熒光納米顆粒的磁共振信號和熒光信號成像圖。
[0023]圖3為mDCs攝取磁性熒光納米顆粒的流式細胞圖。
[0024]圖4為攝取磁性熒光納米顆粒對DC生存率的影響。
[0025]圖5為攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs的熒光成像圖。
[0026]圖6為攝取磁性熒光納米顆粒的mDCs的普魯士藍染色圖。
[0027]圖7為磁力牽引對DC迀移能力的影響研究。
[0028]圖8為小鼠足墊回輸mDCs在24后的多模式成像(近紅外和磁共振)圖。
[0029]圖9為mDCs后的近紅外熒光成像圖以及磁力牽引實施24小時后的熒光成像圖。
[0030]圖10為實施磁力牽引前后小鼠腿彎淋巴結(jié)熒光成像對比圖。
[0031]圖11為流式檢測含磁性熒光納米顆粒的DC在促進特異性淋巴細胞增值方面的能力。
[0032]圖12為在有無磁場作用下DC抗腫瘤疫苗功效的對比研究。
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明實施例提供一種同時實現(xiàn)促進樹突細胞迀移至淋巴結(jié)和多模式成像的方法。具體步驟如下:
[0034]l)mDCs的制備:DC的制備來源性骨髓提取分離，mDCs的制備采用常規(guī)培養(yǎng)方法獲得，可以攜帶腫瘤抗原，也可以不含腫瘤抗原。DC可以是來源于骨髓提取，也可以是DC2.4細胞系。
[0035]2)mDCs攜帶多肽抗原和磁性物質(zhì):mDCs與一種磁性熒光納米顆粒在37°C下孵育6小時即可完成。
[0036]所述磁性熒光納米顆粒是由油酸酯-氧化鐵顆粒、兩種磷脂、近紅外探針和一種具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽通過自組裝有機結(jié)合形成。
[0037]所述油酸酯-氧化鐵顆粒是油酸修飾氧化鐵后的納米顆粒，該物質(zhì)已經(jīng)投入商業(yè)化生產(chǎn)(見http: //www.nanoeast.net/cxnmklfzxs.html，油酸修飾的四氧化三鐵磁性納米顆粒(0A@Fe304，共沉淀法或高溫熱解法)
[0038]【產(chǎn)品名稱】
[0039]油酸修飾的四氧化三鐵磁性納米顆粒
[0040]【英文名稱】
[0041 ] 0A coated Fe304nanopartic 1 es
[0042]【成分】
[0043]油酸修飾的Fe304磁性納米顆粒
[0044]【特點】
[0045]油溶性，可分散在環(huán)己烷、氯仿、四氫呋喃等溶劑中.
[0046]【用途】
[0047 ]用于摻雜水包油納米乳、修飾納米脂質(zhì)體、構(gòu)建磁性納米藥物等。
[0048]【技術(shù)參數(shù)】
[0049]TEM 尺寸:約 10nm
[0050]飽和磁化強度:約75emu/g Fe。
[0051 ]優(yōu)選地，所述磷脂為DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero_3-phosphocholine)和MHPC(lipidsl-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine)。
[0052]優(yōu)選地，所述近紅外探針為ICG分子(吲哚氰綠/心臟綠)。
[0053]所述具有脂質(zhì)結(jié)合能力的抗原融合肽，是由α螺旋多肽、連接序列和抗原肽以共價鍵的形式串連而成，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為FAEKFKEAVKDYFAKFWD，所述連接序列的氨基酸序列為GSG，所述抗原肽的氨基酸序列為KVPRNQDWL、KTWGQYWQV、ISQAVHAAHAEINEAGR或其它抗原多肽序列。
[0054]3)磁場作用下促進DCs活體迀移至淋巴組織:本發(fā)明使用圓形的磁鐵N35(40X10mm；Gauss,11.7-12.1k)用來引導含磁性焚光納米顆粒的mDCs的迀移，但不局限于磁鐵發(fā)出的磁場，恒定的磁場也可以用于上述應用。
[0055]下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明做進一步詳細的說明。
[0056]實施例1
[0057]組成磁性熒光納米顆粒的抗原融合多肽，該肽是由α螺旋多肽(R4F)、連接序列和抗原肽(ΑΡ )以共價鍵的形式串連而成。其中α螺旋多肽的氨基酸序列為:FAEKFKEAVKDYFAKFWD，連接序列的氨基酸序列為GSG，抗原肽的氨基酸序列為:KVPRNQDWL。該多肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.1所述。
[0058]制備磁性熒光納米顆粒，其步驟為:
[0059]磁性熒光納米顆粒的制備:稱取DMPC和羥丙基甲基纖維素醚(MHPC)各5mg分別置于EP管中，然后在EP管中加入200μ1的三氯甲烷進行溶解，將溶解好的DPMC和MHPC轉(zhuǎn)移至體積為約為400μ1含氧化鐵的氯仿溶液中(10mg/mL)，再按氯仿: