專利名稱：神經(jīng)元再生的制作方法
專利說(shuō)明神經(jīng)元再生 本發(fā)明涉及神經(jīng)元存活和軸突再生，并且具體地涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)生長(zhǎng)的調(diào)控。本發(fā)明還提供組合物和使用所述組合物來(lái)提高神經(jīng)存活和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的方法。
在所有動(dòng)物物種的CNS和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的發(fā)育過(guò)程中，軸突和樹(shù)突充分地延長(zhǎng)。然而，在成年人中，CNS中軸突和樹(shù)突再生隨著進(jìn)化發(fā)展而日益喪失。在PNS中，在施加損傷后，所有脊椎動(dòng)物物種的軸突都能夠再生，至少在某種程度上再生。然而，在哺乳動(dòng)物的CNS中，損傷后的軸突再生限于軸突萌發(fā)。然而，神經(jīng)過(guò)程的再生在更低等脊椎動(dòng)物物種中是可能的。
神經(jīng)膠質(zhì)是控制軸突再生的決定性決定因素。在發(fā)育過(guò)程的CNS中和在成人PNS中，哺乳動(dòng)物的神經(jīng)膠質(zhì)允許軸突生長(zhǎng)。因此，當(dāng)施加損傷時(shí)，成年哺乳動(dòng)物PNS的神經(jīng)膠質(zhì)可以重新表達(dá)它們的早期軸突生長(zhǎng)-促進(jìn)潛力，并且促進(jìn)再生。某些低等脊椎動(dòng)物的CNS神經(jīng)膠質(zhì)在成年時(shí)期保持允許軸突的再生。相反，成年哺乳動(dòng)物的CNS神經(jīng)膠質(zhì)在損傷后不重新表達(dá)它們的發(fā)育生長(zhǎng)特性。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)存在于神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育過(guò)程中。在這樣的發(fā)育中，神經(jīng)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有限量的特異性NTFs，NTFs是投射到靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元存活、分化和生長(zhǎng)所必需的。NTFs促進(jìn)成熟神經(jīng)元的存活和/或維持，并且是CNS損傷后神經(jīng)再生的主要決定因素。此外，外周神經(jīng)膠質(zhì)(神經(jīng)膜細(xì)胞)產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)，推測(cè)所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子負(fù)責(zé)成人PNS損傷后的軸突再生。然而，長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)證明移植到CNS中的外周神經(jīng)移植物在超過(guò)損傷后30天(dpl)不再維持CNS軸突再生，并且到100dpl，大部分軸突降解了，大概是由于外周神經(jīng)移植物中的神經(jīng)膜細(xì)胞在移植后大約20天停止產(chǎn)生NTFs，這可能是由于缺少軸突接觸。
CNS髓磷脂是軸突生長(zhǎng)抑制劑的豐富來(lái)源，包括髓磷脂相關(guān)的糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)、Nogo和硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)，其通過(guò)結(jié)合Nogo受體(NgR)而阻滯軸突生長(zhǎng)。Nogo受體與LINGO-1(含有LRR和Ig結(jié)構(gòu)域的Nogo受體相互作用蛋白)和p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體(p75NTR)相關(guān)，其中p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體(p75NTR)是腫瘤壞死因子受體家族的一員。后者通過(guò)激活下游Rho-A而傳導(dǎo)抑制信號(hào)，這導(dǎo)致順序的ROCK/LIM激酶/肌動(dòng)蛋白絲切蛋白肌動(dòng)蛋白絲解聚以及生長(zhǎng)錐瓦解。因此，NgR、p75NTR和RhoA抑制分子一起形成軸突生長(zhǎng)抑制途徑的主要因素。應(yīng)該理解，許多其它分子，諸如ROCK/LIM、肌動(dòng)蛋白絲切蛋白和LINGO-1也參與所述途徑。
盡管許多年來(lái)進(jìn)行了無(wú)數(shù)的嘗試，但是，從來(lái)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)治療性的CNS中的神經(jīng)再生。例如，Logan等(Eur.J.Neurosci.199416(3)355-63)研究了損傷CNS中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)調(diào)控水平的作用，以觀察是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)元再生。在一些環(huán)境中，TGFβ1是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并且還是有力的纖維發(fā)生因子，刺激包括CSPG(一種軸突生長(zhǎng)抑制性配體)的基質(zhì)分子的產(chǎn)生，由此潛在地調(diào)控所述軸突生長(zhǎng)抑制途徑。他們證明TGFβ1參與瘢痕形成，其又限制瘢痕區(qū)域周圍損傷的CNS中軸突投射的生長(zhǎng)，這可能是通過(guò)如本文所含的CSPG的抑制性配體對(duì)活性軸突生長(zhǎng)的抑制。他們表明，阻滯TGFβ1活性不抑制瘢痕，但是存在很少或沒(méi)有相關(guān)的軸突生長(zhǎng)，這表明阻滯瘢痕形成和某些種類抑制分子的產(chǎn)生沒(méi)有引起增強(qiáng)的軸突再生。
因此，對(duì)于提供可以在CNS中促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的再生性治療存在顯而易見(jiàn)的需求。這樣的治療可以用來(lái)使得損傷或患病的神經(jīng)能夠在損傷之后存活、再生并且重新起作用。因此，本發(fā)明人決定將他們的研究集中在神經(jīng)元抑制途徑上，以觀察這一途徑的調(diào)控是否能夠增強(qiáng)-NTF刺激的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。
按照本發(fā)明的第一方面，提供一種適合下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達(dá)的基因沉默分子。
按照本發(fā)明的第二方面，提供一種用作藥物的適合下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達(dá)的基因沉默分子。
按照本發(fā)明的第三方面，提供適合下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的蛋白的基因的表達(dá)的基因沉默分子用于制備促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明人研究了許多生物化學(xué)途徑，以評(píng)估它們是否可以被調(diào)控以影響神經(jīng)元生長(zhǎng)。他們的研究確定Rho-A抑制途徑是一個(gè)令人驚訝的良好的調(diào)控靶點(diǎn)。通過(guò)表達(dá)“Rho-A抑制途徑”，我們意指軸突生長(zhǎng)抑制途徑，其中其包括NgR、p75NTR和RhoA抑制分子。
他們開(kāi)始檢測(cè)Rho-A途徑的各種調(diào)控子，以觀察是否可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，盡管沒(méi)有成功(例如，參見(jiàn)上文)。然而，令人驚訝地，按照本發(fā)明第一方面的基因沉默分子(例如siNA)的應(yīng)用證明是有效的，并且的確刺激神經(jīng)生長(zhǎng)。此外，令人驚訝地，本發(fā)明人已經(jīng)確定，按照本發(fā)明的基因沉默分子還有用于促進(jìn)神經(jīng)元存活(即，它們減少程序性細(xì)胞死亡對(duì)神經(jīng)元的清除)。因此，第一方面的分子具有按照第二方面的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并且更具體地，已經(jīng)表現(xiàn)出刺激按照第三方面的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。
優(yōu)選地，所述藥物用于促進(jìn)CNS中神經(jīng)元存活和軸突再生。CNS損傷可以由手術(shù)、外傷、加壓、挫傷、橫切、神經(jīng)毒性或其它物理?yè)p傷引起，由脈管系統(tǒng)藥理性或其它損傷包括出血或局部缺血損傷引起，或者由神經(jīng)退化或其它神經(jīng)疾病引起。特征在于消弱的或失敗的軸突生長(zhǎng)的疾病，其可以用所述藥物進(jìn)行治療，優(yōu)選地特征在于神經(jīng)損傷的疾病。例如，所述疾病可以是慢性的或急性的腦外傷、脊髓損傷、神經(jīng)毒性、中風(fēng)、青光眼、視神經(jīng)損傷、CNS出血、面神經(jīng)損傷，其由非急需施行的手術(shù)(electivesurgery)、神經(jīng)加壓、震蕩、局部缺血(ischaemia)、燒傷等引起。
本發(fā)明人更吃驚的是確定按照本發(fā)明的分子可以用于治療特征在于增加的細(xì)胞死亡的病癥。因此，他們已經(jīng)確定所述藥物還可以用來(lái)治療神經(jīng)元存活是顯著問(wèn)題的病況。例如，所述藥物可以用于治療神經(jīng)退化疾病，諸如癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、CJD等。
按照本發(fā)明的第四方面，提供適合下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的蛋白的基因的表達(dá)的基因沉默分子用于制備抑制細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
術(shù)語(yǔ)“基因沉默分子”，我們意指干擾討論基因表達(dá)的任何分子。這樣的分子可以是反義分子(反義DNA或反義RNA)或核酶分子。核酶和反義分子可以用于抑制編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的轉(zhuǎn)錄，或者抑制所述基因的mRNA的翻譯。反義分子是以序列特異性方式與核酸如DNA或RNA結(jié)合的寡核苷酸。當(dāng)與具有互補(bǔ)序列的mRNA結(jié)合時(shí)，反義RNA防止所述mRNA的翻譯。三聯(lián)體分子是指結(jié)合雙聯(lián)體DNA的單反義DNA鏈形成線性對(duì)應(yīng)的三聯(lián)體分子，因而防止轉(zhuǎn)錄。特別有用的反義核苷酸和三聯(lián)體分子是與編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的DNA有義鏈(或mRNA)互補(bǔ)或結(jié)合的那些分子。
能夠催化RNA底物的特異性裂解的酶促RNA分子的核酶的表達(dá)，還可以用于阻滯蛋白翻譯。核酶作用機(jī)制包括核酶分子與互補(bǔ)的靶點(diǎn)RNA的序列特異性雜交，然后是核酸內(nèi)切性裂解，例如錘頭狀基序核酶。
優(yōu)選地，所述基因沉默分子是短干擾核酸(siNA)。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的分子沉默NgR、p75NTR和/或RhoA抑制性分子的基因。
當(dāng)所述分子是siNA分子時(shí)，它可以是雙鏈的，并且因此包括有義和反義鏈。siNA分子可以包括siDNA分子或siRNA分子。然而，優(yōu)選所述siNA分子包括siRNA分子。因此，按照本發(fā)明的siNA分子優(yōu)選地通過(guò)RNA干擾(RNAi)而下調(diào)基因表達(dá)。
RNAi是動(dòng)物和植物中序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用。它使用小干擾RNA分子(siRNA)，所述siRNA是雙鏈的的，并且在序列上與沉默的(靶點(diǎn))基因同源。因此，siRNA分子與由靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNAs的序列特異性結(jié)合允許非常特異性的基因表達(dá)的靶點(diǎn)‘擊倒’。
作為一種實(shí)驗(yàn)方法，本發(fā)明人設(shè)計(jì)并且生產(chǎn)了許多siRNA分子，目的是檢測(cè)它們?cè)谡{(diào)控Rho-A抑制途徑中的效果。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用許多表現(xiàn)出針對(duì)參與Rho-A抑制途徑的各種蛋白的序列特異性的siRNA分子的確導(dǎo)致對(duì)所述途徑的抑制解除，并且導(dǎo)致提高的軸突生長(zhǎng)以及提高的神經(jīng)元存活。這使得他們相信按照本發(fā)明的分子的應(yīng)用可能是一種用于增強(qiáng)軸突長(zhǎng)出(outgrowth)的抑制解除的內(nèi)源機(jī)制以及提高的神經(jīng)元存活的有用技術(shù)。
編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因可以被視作靶點(diǎn)基因。優(yōu)選地，siNA分子基本上與靶點(diǎn)基因的編碼序列的至少一個(gè)區(qū)域相同，以能夠下調(diào)所述靶點(diǎn)基因。優(yōu)選地，siNA分子序列和靶點(diǎn)基因區(qū)域之間的同一性程度是至少60％的序列同一性，優(yōu)選地，至少75％的序列同一性，優(yōu)選地至少85％的同一性；至少90％的同一性；至少95％的同一性；至少97％的同一性；和最優(yōu)選地，至少99％的同一性。
不同氨基酸/多肽/核酸序列之間相似性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算可以進(jìn)行如下。首先通過(guò)ClustalX程序(成對(duì)參數(shù)缺口開(kāi)口10.0，缺口延伸0.1，蛋白基質(zhì)Gonnet 250，DNA基質(zhì)TUB；多重參數(shù)缺口開(kāi)口10.0，缺口延伸0.2，延遲分歧序列30％，DNA轉(zhuǎn)變重量0.5，陰性基質(zhì)off，蛋白基質(zhì)gonnet系列，DNA重量TUB；蛋白缺口參數(shù)，殘基特異性罰分on，親水性罰分on.親水殘基OPSNDQERR，缺口分離距離4，末端缺口分離off)產(chǎn)生多重比對(duì)。然后從所述多重比對(duì)計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)為(N/T)*100，其中N是兩種序列分享相同殘基的位置的數(shù)目，和T是進(jìn)行比較的位置總數(shù)。備選地，同一性百分?jǐn)?shù)可以作為(N/S)*100計(jì)算，其中S是進(jìn)行比較的較短的序列的長(zhǎng)度。氨基酸/多肽/核酸序列可以從頭合成，或者可以是天然氨基酸/多肽/核酸序列，或其衍生物。
一種基本上相似的核苷酸序列應(yīng)該由在嚴(yán)緊條件下與本文提及的任何核酸序列或它們的補(bǔ)體雜交的序列所編碼。對(duì)于嚴(yán)緊條件，我們意指核苷酸在45℃左右在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與過(guò)濾結(jié)合的DNA或RNA雜交，然后在5-65℃左右在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌至少1次。備選地，基本上相似的多肽可以在至少1個(gè)，但是少于5，10，20.50或100個(gè)氨基酸不同于按照本發(fā)明的肽序列。
由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，清楚地，任何核酸序列可以是不同的或改變的，而基本上不影響其所編碼的蛋白序列，以提供其功能變體。適宜的核苷酸變體是具有通過(guò)在所述序列內(nèi)編碼相同氨基酸的不同密碼子的取代(因此產(chǎn)生沉默改變)而改變的序列的那些核苷酸。其它適宜的變體是那些具有同源核苷酸序列但是包括通過(guò)取代編碼具有同它所取代的氨基酸相似的生物物理特性的側(cè)鏈的氨基酸(以產(chǎn)生保守改變)而改變的序列的全部或部分的核苷酸。例如，小的非極性、疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸；大的非極性、疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；中性極性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電荷(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
精確的蛋白或DNA序列比對(duì)是一種復(fù)雜的過(guò)程，其已經(jīng)由許多研究者詳細(xì)地研究過(guò)。特別重要的是序列的最佳匹配和為得到這樣的匹配引入缺口之間的平衡(trade-off)。在蛋白的情形中，匹配計(jì)分的方法也是重要的。盡管其它同等實(shí)用的矩陣是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，但是PAM矩陣(例如，Dayhoff，M.等，1978，Atlas of protein sequence and structure，Natl.Biomed.Res.Found.)和BLOSUM矩陣家族量化保守取代的性質(zhì)和可能性，并且用于多重比對(duì)運(yùn)算法則中。常用的多重比對(duì)程序ClustalW，以及其windows版本ClustalX(Thompson等.，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680；Thompson等，1997，Nucleic Acids Research，24，4876-4882)是產(chǎn)生蛋白和DNA多重比對(duì)的有效方法。
通常，自動(dòng)產(chǎn)生的比對(duì)需要人工比對(duì)，應(yīng)用專門訓(xùn)練的使用者關(guān)于要研究的蛋白家族的知識(shí)，例如，主要保守位點(diǎn)的生物知識(shí)。盡管其它的程序，諸如JalView或Cinema也是適用的，但是，一種這樣的比對(duì)編輯程序是Align(http://www.gwdg.de/～dhepper/download/；Hepperle，D.，2001Multicolor Sequence Alignment Editor.Institute of Freshwater Ecology andInland Fisheries，16775Steehlm，Germany)。
蛋白之間同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算發(fā)生在通過(guò)Clustal產(chǎn)生多重比對(duì)的過(guò)程中。然而，如果所述比對(duì)是人工改良的，或者為了兩種序列的謹(jǐn)慎比較，這些值需要重新計(jì)算。在比對(duì)中計(jì)算關(guān)于成對(duì)蛋白序列的這一值的程序包括PHYLIP系統(tǒng)發(fā)展包裝中的PROTDIST(Felsenstein；http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html)，其使用“相似性表格”選項(xiàng)作為氨基酸取代(P)的模型。對(duì)于DNA/RNA，在PHYLIP的DNADIST程序內(nèi)存在相同的選項(xiàng)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分子是siNA分子，并且包括大約5bp-50bp，更優(yōu)選地10bp-35bp，甚至更優(yōu)選地，15bp-30bp，并且還更優(yōu)選，18bp-25bp。優(yōu)選地，所述siNA分子為20bp-23bp，并且更優(yōu)選地，所述siNA分子包括21bp或22bp。最優(yōu)選地，所述siNA分子包括少于22bp。
適宜的siNA分子的設(shè)計(jì)是一種復(fù)雜的過(guò)程，并且包括非常認(rèn)真地分析靶點(diǎn)mRNA分子的序列。然后，使用相當(dāng)多的創(chuàng)造性努力，本發(fā)明人必須選擇具有確定的核苷酸堿基組成的確定的siNA序列，其將具有引起RNA干擾所需要的親和性以及穩(wěn)定性。
因此，為了可以確定適宜的siNA序列，靶點(diǎn)基因的編碼序列首先由本發(fā)明人仔細(xì)審閱，以定位其靶點(diǎn)區(qū)域，所述靶點(diǎn)區(qū)域編碼靶點(diǎn)mRNA。優(yōu)選地，所述靶點(diǎn)序列的靶點(diǎn)區(qū)域包括二腺嘌呤起始序列，和最大60％的GC含量。優(yōu)選地，所述分子包括低于50％的GC含量。使用在5’末端選擇的靶點(diǎn)基因的mRNA序列的DNA副本，設(shè)計(jì)siNA分子的反義鏈。
siNA分子可以從頭合成，或者通過(guò)微生物產(chǎn)生。例如，siNA分子可以由細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)產(chǎn)生，在這種情形中，優(yōu)選所述siNA分子的有義和反義鏈的3’末端可以包括一種8核苷酸序列5’-CCTGTCTC-3’。這與siNA分子有效轉(zhuǎn)錄所需要的T7啟動(dòng)子引物的互補(bǔ)序列相對(duì)應(yīng)。優(yōu)選地，這一8核苷酸序列在使用siNA分子之前被去除，以下調(diào)靶點(diǎn)基因。
適于下調(diào)編碼p75NTR受體的基因表達(dá)的特別優(yōu)選的siNA分子序列包括下列序列 p75NTR序列 序列1，5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’(SEQ ID No.1)； 序列2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’(SEQ ID No.2)； 序列3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’(SEQ ID No.3)； 序列4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’(SEQ ID No.4)；和 序列5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’(SEQ ID No.5)。
應(yīng)該理解，這樣的siNAs可以包括尿嘧啶(siRNA)或胸腺嘧啶(siDNA)。
本發(fā)明人通過(guò)在實(shí)施例1和實(shí)施例2中所述的方法檢測(cè)這5種siNA分子的每一種。
本發(fā)明的一個(gè)重要特征是按照本發(fā)明的基因沉默分子可以與刺激神經(jīng)突生長(zhǎng)的分子組合應(yīng)用，以對(duì)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活具有令人驚訝的協(xié)同作用。單獨(dú)使用，這些試劑具有中等或最小的作用，而組合應(yīng)用，這些試劑可以顯著地提高神經(jīng)再生。適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)刺激劑的實(shí)例可以包括任何NTF(TRK依賴型或TRK不依賴型)，例如，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)或成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)。應(yīng)該理解，CNTF是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)中神經(jīng)突的有效生長(zhǎng)刺激劑，和FGF2是背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突(DRGN)中神經(jīng)突的有效生長(zhǎng)刺激劑。可以與所述分子組合應(yīng)用的其它NTFs包括NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，F(xiàn)GF-1，F(xiàn)GF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，和VIP(Oppenheim.1996，Neuron 17195-197)。
實(shí)施例1描述將針對(duì)p75NTR mRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂的存在下用CNTF處理的培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)中的檢測(cè)范例。如在

圖1中所示，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在抑制性CNS髓磷脂的存在下，SEQ ID No.1-5確定的上述siNA分子中的每一種與CNTF組合，在RGCs中誘導(dǎo)神經(jīng)元存活和神經(jīng)突發(fā)生。由5種siNA分子中的4種(除SEQ ID No.2外的全部)引起的神經(jīng)突發(fā)生程度與在不存在髓磷脂和存在CNTF時(shí)誘導(dǎo)的程度相當(dāng)。每種序列表現(xiàn)出神經(jīng)長(zhǎng)出途徑的抑制解除作用(即，抵消抑制性髓磷脂的作用)，通過(guò)下調(diào)編碼p75NTR的基因的表達(dá)并且因而下調(diào)其下游信號(hào)成分而進(jìn)行。
甚至更令人驚訝的是下調(diào)p75NTR的具有SEQ ID No.2的siNA分子在下列各項(xiàng)中引起顯著的增加(a)具有神經(jīng)突的RGCs的數(shù)目，和(b)平均神經(jīng)突長(zhǎng)度，并且顯著地促進(jìn)(c)RGC存活。因此，不但SEQ ID No.2如同其它4種siNA’s一樣引起該途徑的抑制解除作用，它還能夠誘導(dǎo)比不存在髓磷脂時(shí)刺激的更多的神經(jīng)生長(zhǎng)。這是特別令人驚訝地，由于某種未知的機(jī)制，SEQ ID No.2能夠刺激超過(guò)在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂的解除抑制的抑制劑。
因此，特別優(yōu)選siNA分子包括SEQ ID No.2，并且特別優(yōu)選這一分子與NTF組合用于臨床應(yīng)用。
應(yīng)該理解，SEQ ID No.2包括4個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶堿基。本發(fā)明人最初認(rèn)為這在RNAi方案中可能是有問(wèn)題的。這是由于他們認(rèn)為siNA分子中4個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶堿基可能模擬轉(zhuǎn)錄終止序列，因而引起RNA聚合酶從所述siNA模板上解離，而終止siNA的轉(zhuǎn)錄。幸運(yùn)地，這不是這種情形，并且優(yōu)選的siNA不但可以有效地在細(xì)菌中合成，而且十分有效地下調(diào)p75NTR。
因此，本發(fā)明人表明，siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒在RGCs中導(dǎo)致CNTF-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出的抑制解除作用。
本發(fā)明人對(duì)同樣的5種siNA分子進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。實(shí)施例2描述將同樣的5種針對(duì)p75NTR mRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂的存在下用FGF2處理的培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRGN)中。應(yīng)該理解，F(xiàn)GF2促進(jìn)DRGNs中的神經(jīng)突發(fā)生，并且因此在DRGNs中作用為神經(jīng)突的陽(yáng)性生長(zhǎng)刺激劑。如上所述，CNS髓磷脂作用抑制神經(jīng)突發(fā)生。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，每種siNA分子還在DRGNs中增加細(xì)胞的存活和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，最有效的是具有SEQ ID No.2的siNA分子。然而，SEQ ID No.2不但如其它4種siNAs一樣引起所述途徑的抑制解除作用，它還能夠誘導(dǎo)比在不存在髓磷脂時(shí)刺激的更多的神經(jīng)生長(zhǎng)。這是特別令人驚訝的，由于某種未知的機(jī)制，SEQ ID No.2能夠刺激超過(guò)在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂-相關(guān)分子的解除抑制的抑制劑。
因此，本發(fā)明人還證明siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒在DRGN中導(dǎo)致FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出的解除抑制作用。
適于下調(diào)編碼NgR的基因的表達(dá)的特別優(yōu)選的siNA分子序列包括下列序列- NgR序列- 序列1，5’-AATCTCACCATCCTGTGGCTG-3’(SEQ ID No.6)； 序列2，5’-AACCTCACGCATCTCTTTCTG-3’(SEQ ID No.7)； 序列3，5’-AATCAGCTCACTGATGAGGAG-3’(SEQ ID No.8)； 序列4，5’-AAATGCACTCAAGGGACGTGT-3’(SEQ ID No.9)；和 序列5，5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’(SEQ ID No.10)。
本發(fā)明人通過(guò)實(shí)施例2中所述的方法檢測(cè)了上述siNA分子的每一種。實(shí)施例2描述將上述5種針對(duì)NgR mRNA的siNA分子遞送到在抑制性CNS髓磷脂(生長(zhǎng)抑制劑)的存在下用叫作成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)的NGF處理的培養(yǎng)的DRGNs中。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，每種siNA分子在DRGNs中增加神經(jīng)突發(fā)生，最有效的是具有SEQ ID No.6的siNA分子。令人驚訝地，SEQID No.6在存在抑制性髓磷脂時(shí)比在不存在髓磷脂刺激更多的軸突生長(zhǎng)。
因此，特別優(yōu)選siNA分子包括SEQ ID No.6。
因此，本發(fā)明人還證明siRNA-介導(dǎo)的NgR擊倒在DRGN中導(dǎo)致FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出的抑制解除作用。
適于下調(diào)編碼Rho-A分子的基因的表達(dá)的特別優(yōu)選的siNA分子序列包括下列序列- Rho-A 序列- 序列1，5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’(SEQ ID No.11)； 序列2，5’～AAGGATCTTCGGAATGATGAG-3’(SEQ ID No.12)； 序列3，5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’(SEQ ID No.13)； 序列4，5’-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’(SEQ ID No.14)；和 序列5，5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-S’(SEQ ID No.15)。
本發(fā)明人通過(guò)實(shí)施例2所述的方法檢測(cè)了上述siNA分子的每一種。如上文，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，每種siNA分子在DRGNs增加神經(jīng)突發(fā)生，最有效的是具有SEQ ID No.12的siNA分子。本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)，每種siNA分子在DRGNs中增加細(xì)胞的存活和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，最有效的是具有SEQ IDNo.2的siNA分子。然而，SEQ ID No.12不但引起所述途徑的抑制解除作用(如其它siNAs一樣)，它還能夠誘導(dǎo)比在不存在髓磷脂時(shí)刺激的更多的神經(jīng)生長(zhǎng)。這是特別令人驚訝的，由于某種未知的機(jī)制，SEQ ID No.12還似乎能夠刺激超過(guò)在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的生長(zhǎng)的生長(zhǎng)。這可能是由于所述分子是不同于髓磷脂-相關(guān)分子的解除抑制的抑制劑。
因此，特別優(yōu)選所述siNA分子包括SEQ ID No.12。
因此，本發(fā)明人表明，使用按照本發(fā)明的分子的基因沉默可以用來(lái)提高神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述分子是調(diào)控NgR、p75NTR和/或Rho-A的擊倒的siRNA分子。最優(yōu)選地，按照本發(fā)明的分子與NTF(例如，F(xiàn)GF2)聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)是這種情形時(shí)，按照本發(fā)明的分子對(duì)于解除抑制NTF刺激的軸突生長(zhǎng)，以及令人驚訝的神經(jīng)元存活非常有效。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在CNS髓磷脂的存在下，F(xiàn)GF2-刺激的DRGN中p75NTR、NgR和Rho-A的擊倒分別促進(jìn)5倍、3.5倍和6.5倍增加的神經(jīng)突長(zhǎng)出。在siNA-介導(dǎo)的Rho-A擊倒后，神經(jīng)突比p75NTR和NgR擊倒后長(zhǎng)得更長(zhǎng)。這表明Rho-A沉默可能是在體內(nèi)促進(jìn)CNS軸突再生的特別有效的解除抑制的策略。因此，特別優(yōu)選按照本發(fā)明的siNA分子是SEQ ID No.12。不被任何假說(shuō)束縛，本發(fā)明人相信RhoA沉默導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)途徑上游成分的令人吃驚的沉默--能通過(guò)目前定義為反饋環(huán)的作用。
按照本發(fā)明的第五方面，提供適于下調(diào)編碼參與RhoA抑制途徑的肽的基因表達(dá)的基因沉默分子，其特征在于所述分子在存在神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子時(shí)比在不存在所述抑制劑分子時(shí)適于誘導(dǎo)更多的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。
表達(dá)“更多的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)”，我們意指，與不存在相同的神經(jīng)突抑制劑分子相比，當(dāng)存在神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子時(shí)，獲得更高的誘導(dǎo)水平。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明第五方面的分子可以與NTF(例如FGF2或CNTF)組合應(yīng)用，在神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子諸如先前命名為髓磷脂-相關(guān)的分子的存在下，所述NTF的活性受到抑制。按照本發(fā)明第五方面的分子，不但顛倒由神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子諸如指出的髓磷脂-相關(guān)分子所引起的NTF-刺激的軸突生長(zhǎng)的抑制，而且還令人吃驚地，刺激比在不存在抑制劑分子時(shí)觀察到的更大程度的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。例如，所述作用大于在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的作用，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，在不存在神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子(例如，除去髓磷脂的CNS神經(jīng)元)時(shí)用NTF刺激神經(jīng)突。
優(yōu)選地，按照第五方面的分子包括siNA分子，并且可以選自具有SEQID No.2，SEQ ID No.6或SEQ ID No.12確定的序列的siRNA分子的組。
按照本發(fā)明任一方面應(yīng)用的基因沉默分子優(yōu)選為核酸(例如，siRNA或反義或核酶)。這樣的分子可以(但不必要)是這樣的，即，其結(jié)合在要治療的受試者的細(xì)胞的DNA中。未分化的細(xì)胞可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述基因沉默分子，導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳修飾的子細(xì)胞(在這種情形中，在受試者中可能需要表達(dá)調(diào)控，例如，使用特異的轉(zhuǎn)錄因子或基因活化劑)。
基因沉默分子可以是從頭合成的，并且以足夠的量引入以在靶點(diǎn)細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默(例如，通過(guò)RNA干擾)。備選地，所述分子可以通過(guò)微生物如大腸桿菌產(chǎn)生，然后以足夠的量引入以在靶點(diǎn)細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默。
所述分子可以通過(guò)攜帶編碼基因沉默序列的核酸的載體而產(chǎn)生。所述載體可以包括能夠控制和/或增強(qiáng)核酸表達(dá)的元件。載體可以是重組載體。例如，所述載體可以包括質(zhì)粒、黏端質(zhì)粒、噬菌體或病毒DNA。除了使用或代替使用所述載體合成所述基因沉默分子，所述載體可以用作用所述基因沉默序列轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)細(xì)胞的遞送系統(tǒng)。
重組載體還可以包括其它功能元件。例如，重組載體可以設(shè)計(jì)成所述載體在靶點(diǎn)細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制。在這一情形中，在重組載體中可能需要誘導(dǎo)核酸復(fù)制的元件。備選地，所述重組載體可以設(shè)計(jì)成所述載體和重組核酸分子整合到靶點(diǎn)細(xì)胞的基因組中。在這一情形中，有利于靶點(diǎn)結(jié)合(例如，通過(guò)同源重組)的核酸序列是理想的。重組載體還可以具有編碼可以在克隆過(guò)程中用作選擇標(biāo)記的基因的DNA。
當(dāng)需要時(shí)，所述重組載體還可以包括控制核酸表達(dá)的啟動(dòng)子或調(diào)控子或增強(qiáng)子。組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件可以用來(lái)調(diào)控核酸在特異的細(xì)胞類型如CNS神經(jīng)元中的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。
備選地，所述基因沉默分子可以以結(jié)合在載體中或者不結(jié)合在載體中而施用給靶點(diǎn)細(xì)胞或受試者。例如，所述分子可以結(jié)合在脂質(zhì)體或病毒顆粒(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、痘病毒、痘苗病毒、腺病毒、慢病毒(lentovirus)等)內(nèi)。備選地，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缰苯拥陌涛斩鴮ⅰ奥恪眘iNA或反義分子插入到受試者細(xì)胞中。
可以通過(guò)轉(zhuǎn)染、感染、顯微注射、細(xì)胞融合、原生質(zhì)體融合或彈果轟擊(ballistic bombardment)而將所述基因沉默分子轉(zhuǎn)移到要治療的受試者的細(xì)胞中。例如，轉(zhuǎn)移可以通過(guò)使用包被的金顆粒的彈果轉(zhuǎn)染；含有siNA分子的脂質(zhì)體；包括基因沉默序列的病毒載體(例如，包括SEQ ID No.2，6或12的腺病毒)；或者通過(guò)直接應(yīng)用所述基因沉默分子而提供直接的核酸吸收(例如，內(nèi)吞)的方式進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，siNA分子可以遞送到靶點(diǎn)細(xì)胞(不管是在載體中還是“裸露的”)，并且然后可以依賴于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，并且因此達(dá)到治療有效的水平。當(dāng)是這種情形時(shí)，所述siNA優(yōu)選地結(jié)合在能夠使得siNA(例如，SEQ ID No.2，6或12)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒中，然后干擾編碼參與Rho-A途徑的蛋白的內(nèi)源mRNA的翻譯。
應(yīng)該理解，按照本發(fā)明的基因沉默分子可以用于單一治療(例如，使用按照本發(fā)明的siNA’s刺激神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng))。然而，優(yōu)選地，按照本發(fā)明的分子可以用作添加劑，或者與用于刺激軸突生長(zhǎng)的已知治療組合應(yīng)用。特別優(yōu)選地，所述組合治療包括基因沉默分子和NTF(例如，F(xiàn)GF2或CNGF)。
按照本發(fā)明的基因沉默分子可以與具有許多不同形式的組合物組合，特別取決于所述組合物使用的方式。因此，例如，所述組合物可以以膠囊、液體、軟膏劑、膏劑、凝膠、水凝膠、氣霧劑、噴霧劑、微膠粒、透皮貼片、脂質(zhì)體的形式，或可以施用給患有以消弱的軸突生長(zhǎng)為特征的疾病狀態(tài)的人或動(dòng)物的任何其它適當(dāng)形式。應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物的賦形劑應(yīng)該是對(duì)于它所給予的受試者良好耐受的賦形劑，并且優(yōu)選地能夠使得所述分子遞送到需要軸突生長(zhǎng)和/或提高神經(jīng)元存活的靶點(diǎn)位點(diǎn)。
包括按照本發(fā)明的siNA’s的組合物可以以許多方法應(yīng)用。例如，可以需要全身使用，在這種情形中，化合物可以包含在例如可以通過(guò)注射到血流而施用的組合物中。注射可以是靜脈內(nèi)(大丸劑或灌注)、皮下(大丸劑或灌注)、心室內(nèi)或蛛網(wǎng)膜下的。
所述化合物可以通過(guò)吸入(例如，鼻內(nèi)地)而施用。
基因沉默分子還可以結(jié)合在緩慢的或延緩釋放的裝置中。例如，這樣的裝置可以插入到CNS損傷的位點(diǎn)，并且所述分子可以幾周或幾個(gè)月的釋放。當(dāng)需要使用按照本發(fā)明的基因沉默分子進(jìn)行長(zhǎng)期治療時(shí)，以及通常需要頻繁的施用(例如，至少每日注射)的治療中，這樣的裝置可能是特別有利的。
應(yīng)該理解，需要的基因沉默分子的量由它的生物活性和生物利用度決定，并且其又依賴于施用的模式、應(yīng)用的分子的物理化學(xué)特性、以及它是用作單一治療還是與NTF組合治療。施用的頻率還將受到上文提及的因素以及特別是在治療的受試者內(nèi)分子半衰期的影響。
施用的最佳劑量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定，并且將隨著下列各項(xiàng)而不同使用的具體的基因沉默分子、制劑的強(qiáng)度、施用的模式、以及疾病病癥的晚期或嚴(yán)重性、和軸突生長(zhǎng)需要的緊急性。取決于要治療的具體受試者的其它因素將導(dǎo)致需要調(diào)整的劑量，所述因素包括受試者年齡、體重、性別、日常飲食和施用時(shí)間。
已知的方法，諸如藥物工業(yè)常規(guī)所用的那些方法(例如，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等)，可以用于建立按照本發(fā)明應(yīng)用的具體的制劑和精確的治療方案(諸如基因沉默分子的日常劑量和施用頻率)。
一般地，取決于所用的具體基因沉默分子，0.01μg/kg體重和0.5g/kg體重之間的按照本發(fā)明的基因沉默分子的日常劑量可以用于刺激軸突生長(zhǎng)(并且促進(jìn)神經(jīng)元存活)。更優(yōu)選地，日常劑量在0.01mg/kg體重和200mg/kg體重之間，并且更優(yōu)選地，在大約0.1mg/kg和100mg/kg之間，并且甚至更優(yōu)選地在大約1mg/kg和10mg/kg之間。
當(dāng)將所述分子(例如，siNA或反義的)遞送到細(xì)胞(并且在靶點(diǎn)細(xì)胞中不需要從頭合成)時(shí)，日常劑量可以作為單一施用(例如，單一的每日注射)而給出。典型地，治療有效劑量應(yīng)該每單一劑量提供約1ng-100μg/kg的基因沉默分子，并且優(yōu)選地每劑量2ng-50ng。
備選地，所述分子可以需要一天內(nèi)施用兩次或更多次。作為實(shí)例，按照本發(fā)明的siNA’s可以作為兩劑(或多劑，取決于病癥的嚴(yán)重性)0.1mg/kg和10mg/kg之間(即，假定體重70kg)的每日劑量進(jìn)行施用。接受治療的患者可以在醒來(lái)時(shí)服用第一劑，然后在傍晚服用第二劑(如果是兩劑方案)，或者在其后以3或4小時(shí)的時(shí)間間隔服用。備選地，可以應(yīng)用緩慢釋放的裝置為患者提供最佳劑量，而無(wú)需施用重復(fù)的劑量。
按照第六方面，提供包括治療有效量的按照本發(fā)明第一方面的基因沉默分子和藥用賦形劑的組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明第六方面的組合物可以包括大約0.01μg和0.5g的基因沉默分子。更優(yōu)選地，組合物的量是在0.01mg和200mg之間，并且更優(yōu)選地，在大約0.1mg和100mg之間，并且甚至更優(yōu)選地在大約1mg和10mg之間的基因沉默分子。最優(yōu)選地，所述組合物包括大約2mg和5mg之間的基因沉默分子。
優(yōu)選地，所述組合物包括大約0.1％(w/w)-90％(w/w)的基因沉默分子，并且更優(yōu)選地，1％(w/w)-10％(w/w)的基因沉默分子。其余的組合物可以包括賦形劑。
本發(fā)明提供制備藥物組合物的方法，所述方法包括將治療有效量按照本發(fā)明的基因沉默分子與藥用賦形劑組合在一起。
“治療有效量”是當(dāng)施用給受試者時(shí)，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活的按照本發(fā)明第一或第四方面的分子的任何量。
“受試者”可以是脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、家畜或人。
當(dāng)用于本文時(shí)，“藥用賦形劑”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于配制藥物組合物的任何生理學(xué)賦形劑。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物賦形劑是液體，并且所述藥物組合物是溶液的形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物賦形劑是凝膠，并且所述組合物是膏劑等的形式。
是無(wú)菌溶液或混懸液的液體藥物組合物可以通過(guò)，例如，肌內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)以及特別是皮下、大腦內(nèi)或大腦室內(nèi)的注射。SiNA分子可以制備成無(wú)菌固體組合物，其可以在施用時(shí)使用無(wú)菌水、鹽水或其它適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌注射介質(zhì)而溶解或混懸。賦形劑意欲包括必要的和惰性的粘合劑、混懸劑、潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑、甜味劑、防腐劑、染料以及包衣材料。
基因沉默分子和NTF的組合代表了本發(fā)明的重要特征。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這兩種活性成分的組合對(duì)于在受傷組織中誘導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞存活特別有利。
因此，按照本發(fā)明的第七方面，提供用于促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括適于下調(diào)基因的表達(dá)的基因沉默分子，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子，所述基因編碼參與Rho-A抑制途徑的肽。
按照第七方面的組合物可以用來(lái)治療患有CNS損傷的個(gè)體。
按照第八方面，提供在受試者中促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)的方法，所述方法包括給需要這樣的治療的受試者施用一種組合物，所述組合物包括適于下調(diào)基因的表達(dá)的基因沉默分子，以及NTF，所述基因編碼參與Rho-A抑制途徑的肽。
適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子的實(shí)例可以包括CNTF，F(xiàn)GF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，F(xiàn)GF-1，F(xiàn)GF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，以及VIP等(Oppenheim，1996，Neuron 17195-197)。
NTF的量可以在大約0.01μg/kg體重和0.5g/kg體重之間，更優(yōu)選地，大約0.1mg/kg和10mg/kg之間。
所述基因沉默分子可以包括反義分子或短干擾核酸(siNA)。
本文所述的所有特征(包括任何附屬的權(quán)利要求、摘要和附圖)，和/或所公開(kāi)的任何方法或過(guò)程的所有步驟可以以除其中至少某些這樣的特征和/或步驟是互斥的組合外的任何組合與上述方面組合。
為了更好地理解本發(fā)明，并且表現(xiàn)其實(shí)施方案可以怎樣實(shí)施，現(xiàn)在通過(guò)實(shí)例的方式參考附屬的簡(jiǎn)圖，其中 圖1顯示siRNA處理后，在解離的視網(wǎng)膜培養(yǎng)物中p75NTR和Rho-A的擊倒； 圖2顯示FGF2在DRGN培養(yǎng)物中促進(jìn)神經(jīng)突長(zhǎng)出； 圖3顯示CNS髓磷脂阻滯FGF2-促進(jìn)的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出； 圖4顯示在CNS髓磷脂的存在下，F(xiàn)GF2-刺激的DRGN的siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒； 圖5顯示在髓磷脂的存在下，在FGF2-刺激的DRGN中siRNA-介導(dǎo)的NgR的擊倒； 圖6顯示在髓磷脂的存在下，在FGF2-刺激的DRGN中siRNA-介導(dǎo)的Rho-A的擊倒； 圖7顯示在siRNA-介導(dǎo)的p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后，在CNS髓磷脂的存在下，在DRG培養(yǎng)物中作為與FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突生長(zhǎng)相關(guān)的βIII-微管蛋白的蛋白質(zhì)印跡和密度定量。
實(shí)施例1 材料和方法 成年視網(wǎng)膜培養(yǎng)物 將成年大鼠(6-8周齡)通過(guò)斷頸法處死，并且通過(guò)解剖移出視網(wǎng)膜，并且按照制造者的流程(Worthington Biochem，New Jersey，USA)使用目木瓜蛋白酶系統(tǒng)解離。在37℃在5％濕潤(rùn)的CO2氛圍下，在補(bǔ)充了Neurobasal-A(Invitrogen)的培養(yǎng)基中，將含有RGC的2×106個(gè)解離的視網(wǎng)膜細(xì)胞在4孔培養(yǎng)板(Nunc，UK)中用100μg/ml聚-D-賴氨酸(Sigma，Dorset，UK)和20μg/ml分區(qū)蛋白(Chemicon.Harrow.UK)預(yù)先包被的玻璃蓋玻片上培養(yǎng)4d。
siRNA制備和轉(zhuǎn)染 為了設(shè)計(jì)靶點(diǎn)-特異的siRNA雙聯(lián)體，我們應(yīng)用Elbashir和合作者提出的標(biāo)準(zhǔn)(Nature 411494-498)從大鼠p75NTR mRNA的開(kāi)放閱讀框(NCBI登記號(hào)NM012610)中選擇針對(duì)p75NTR的5種siRNA序列?；瘜W(xué)合成寡核苷酸模板和控制-合成(control-scrambled)的序列(Alta Biosciences，Universityof Birmingham，UK)，并且使用Silencer siRNA構(gòu)建試劑盒(Ambion.Texas，USA)構(gòu)建siRNA序列。
所用的siRNA序列為- p75NTR序列- 序列1.5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’； 序列2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’； 序列3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’； 序列4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’；和 序列5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’。
合成的序列為- 反義5’-AATCGCATGCGTTCCATTTCGCCTGTCTC-3’； 確義5’-AACGAAATGGAACGCATGCGACCTGTCTC-3’。
按照制造者的指導(dǎo)(Invitrogen)，使用Oligofectamine試劑(Invitrogen)，在4孔培養(yǎng)板(Nunc)中，用siRNA轉(zhuǎn)染RGC。轉(zhuǎn)染5h后，加入補(bǔ)充的Neurobasal-A，并且在細(xì)胞裂解和免疫組化之前，在存在/不存在CNS髓磷脂(來(lái)自N.Gregson的饋贈(zèng)，Kings College London，UK)下再培養(yǎng)72h。
抗體 單克隆β-III微管蛋白(1∶100)和多克隆抗-p75NTR(1∶500)都來(lái)自Sigma，Poole，UK。單克隆192-Ig(1∶100用于免疫組化，和1∶500用于蛋白質(zhì)印跡)購(gòu)自O(shè)ncogene Research Products，San Diego，USA。山羊抗人NgR(1∶100用于蛋白質(zhì)印跡)和單克隆抗人Rho-A(26C4)用于通過(guò)免疫組化(1∶200)和蛋白質(zhì)印跡(1∶200)(Santa Cruz，C.A.，USA)而定位Rho-A。
組織制備和免疫組化 將至少3只大鼠的組通過(guò)麻醉過(guò)量而處死，并且切離它們的視網(wǎng)膜和視神經(jīng)(ON)，包埋在OCT(Miles mc，CA，USA)中，并且在液氮中冷凍。在-20℃從ON和視網(wǎng)膜(Bright Instrument Co.Ltd.，Cambridgeshire，UK)上切下10μm厚的縱向低溫切片，收集到Vectabond包被的載玻片(VectorLaboratories，Cambridgeshire，UK)上，空氣干燥，并且按先前所述(Mol CellNeurosci 21301-311)處理進(jìn)行免疫組化。將培養(yǎng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞固定在4％低聚甲醛中，并且也按先前所述(Lorber等.，2002，Mol Cell Neurosci21301-311)進(jìn)行處理。
神經(jīng)突長(zhǎng)出檢測(cè) 通過(guò)使用Axiovision軟件(Zeiss，Hertifordshire，UK)追蹤每一神經(jīng)突，從捕獲的βIII-微管蛋白免疫染色的RGC圖片檢測(cè)神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且在每一蓋玻片上檢測(cè)50RGC的最長(zhǎng)的神經(jīng)突(n＝3，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。然后計(jì)算平均神經(jīng)突長(zhǎng)度。
蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡 在ON粉碎后第0，6，8和20d，將在每一處理組中的大鼠殺死，并且提取來(lái)自6個(gè)匯集的ON的蛋白，按先前所述(J Biol Chem 27732820-32829)進(jìn)行處理用于蛋白質(zhì)印跡分析。為了通過(guò)蛋白質(zhì)印跡確定siRNA處理的RGC培養(yǎng)物中p75NTR的水平，按先前所述(Winton等，2002，J Biol Chem.157565-570)，將6×106個(gè)細(xì)胞/siRNA裂解并點(diǎn)樣。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)算樣品平均數(shù)，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，Version 4.0，San Diego，USA)，通過(guò)單向變量分析(ANOVA)，然后用Dunnett’s方法進(jìn)行post-hoc檢測(cè)，而分析顯著性。
結(jié)果 在抑制性CNS髓磷脂的存在下，siRNA-介導(dǎo)的p75NTR擊倒下調(diào)Rho-A，并且增強(qiáng)CNTF-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出 本發(fā)明人使用解離的RGC的原代培養(yǎng)物建立CNS損傷的體外模型，并且發(fā)現(xiàn)100ng/ml的非Trk-依賴型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白CNTF促進(jìn)最理想的RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且這種CNTF-介導(dǎo)的長(zhǎng)出受到10μg/ml大鼠CNS髓磷脂的抑制(未顯示)。在存在髓磷脂而生長(zhǎng)的CNTF-刺激的RGC中，使用siRNAp75NTR而獲得p75NTR擊倒，并且結(jié)果在圖1中顯示，其中- (a)顯示使用SEQ ID No.2確定的p75NTR siRNA的完全擊倒，和使用p75NTR的其它siRNA序列的‘部分’擊倒，以及當(dāng)在存在髓磷脂用CNTF刺激RGC時(shí)對(duì)Rho-A活化的同時(shí)抑制。因此，所有的siRNA序列都表現(xiàn)出功效。(b)來(lái)自視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)物的第二蛋白質(zhì)印跡表明合成的序列對(duì)p75NTR和Rho-A沒(méi)有作用，這證明SEQ ID No.2作用的特異性。(c)體外擊倒，特別是用SEQ ID No.2，將神經(jīng)突長(zhǎng)出水平恢復(fù)到在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的水平，并且SEQ ID No.2顯著地刺激神經(jīng)突長(zhǎng)出，高于在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的水平。SEQ ID No.2還顯著地促進(jìn)RGC存活 (***P＜0.0001，在存在髓磷脂時(shí)，序列2相對(duì)于CNTF，ANOVA)。注意SEQ ID No.1-5都阻滯髓磷脂的抑制作用。(d)使用雙免疫組化，在存在CNTF下生長(zhǎng)的βIII-微管蛋白+RGC表現(xiàn)在somata和神經(jīng)突中的p75NTR免疫染色。然而，在SEQ ID No.2.-介導(dǎo)的p75NTR siRNA實(shí)驗(yàn)中，βIII微管蛋白+RGC表現(xiàn)出完全的(somata和神經(jīng)突)或部分的(只有神經(jīng)突)p75NTR擊倒?？潭葪l，50μm。
在所有的對(duì)照培養(yǎng)物(未處理的RGC，用CNTF處理的RGC，以及用CNTF和CNS髓磷脂處理的RGC)中，檢測(cè)到p75NTR和Rho-A的顯著水平(圖la)。在遞送5種p75NTR siRNA(SEQ ID Nos 1-5)后，SEQ ID Nos 1和3誘導(dǎo)顯著的p75NTR擊倒(70-80％，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡密度計(jì)量學(xué)而定量(未顯示))，而SEQ ID No.2引起100％的p75NTR擊倒和其處理形式(胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)p55和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)p25片段)(圖1a)。所有5種檢測(cè)的p75NTR siRNA序列還顯著地抑制Rho-A-GTP的水平，并且使用序列1-3完全阻滯了活化(圖1a)。SEQ ID No.2的對(duì)照合成序列沒(méi)有在p75NTR水平或在Rho-A活化中引起變化，如在單獨(dú)的蛋白質(zhì)印跡中所示(圖1b)。
與存在髓磷脂時(shí)只用CNTF觀察到的數(shù)目相比，在用SEQ ID No.2在培養(yǎng)的RGC中擊倒p75NTR/p55/p25以及因而抑制Rho-A活化后，在存在髓磷脂時(shí)用CNTF刺激生長(zhǎng)神經(jīng)突的RGC的數(shù)目發(fā)生5倍的增加(圖1c)，伴隨RGC神經(jīng)突長(zhǎng)度的5倍的延長(zhǎng)(圖1c)。此外，在培養(yǎng)4天后，下調(diào)p75NTR/p55/p25和抑制Rho-A活化與顯著增加的RGC存活相關(guān)(圖1c)。有趣地，在抑制性CNS髓磷脂的存在下，所有5種siRNA序列將CNTF-刺激的RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出恢復(fù)到在不存在髓磷脂時(shí)用CNTF觀察到的水平(圖1c)。然而，SEQ ID No.2令人驚訝地增強(qiáng)RGC神經(jīng)突的長(zhǎng)出，高出當(dāng)沒(méi)有CNS髓磷脂用CNTF刺激時(shí)觀察到的水平。與單獨(dú)的CNTF對(duì)照相比，存在CNTF和合成序列2而生長(zhǎng)的RGC在神經(jīng)突長(zhǎng)出中沒(méi)有表現(xiàn)出差異(圖1d)。
盡管本發(fā)明人不希望受到任何假說(shuō)的束縛，但是他們相信這些結(jié)果表明，通過(guò)siRNA-介導(dǎo)的p75NTR mRNA翻譯沉默而擊倒p75NTR阻滯Rho-AGDP向Rho-A GTP轉(zhuǎn)化，因而通過(guò)保持生長(zhǎng)錐完整性在抑制性環(huán)境中增強(qiáng)CNTF-誘導(dǎo)的RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且可能通過(guò)增強(qiáng)的肌動(dòng)蛋白多聚化作用而提高。
討論 檢測(cè)的5種siRNA分子的每一種表現(xiàn)出對(duì)RhoA抑制途徑的抑制解除作用。特別地，在存在抑制性髓磷脂時(shí)，比不存在所述抑制劑時(shí)，SEQ IDNo.2.令人驚訝地有效地刺激更多的生長(zhǎng)。在體外，siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒導(dǎo)致完全阻滯下游抑制性信號(hào)傳導(dǎo)分子Rho-A的活化，并且在CNS髓磷脂存在下，CNTF-刺激RGC存活和神經(jīng)突長(zhǎng)出顯著地增強(qiáng)。同時(shí)，部分消除p75NTR，除了SEQ ID No.2.之外的p75NTR siRNA序列還導(dǎo)致對(duì)Rho-A活化的顯著抑制，并且在存在CNS髓磷脂時(shí)，通過(guò)CNTF恢復(fù)RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出。在存在CNS髓磷脂時(shí)，SEQ ID No.2.引起所有p75NTR形式和Rho-A的完全擊倒，同時(shí)增強(qiáng)比在不存在髓磷脂時(shí)觀察到的生長(zhǎng)高2倍的神經(jīng)突長(zhǎng)出。這表明，即使不存在髓磷脂，CNTF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功效受到抑制性分子的控制。盡管我們不希望受到任何假說(shuō)的束縛，本發(fā)明人相信這些可能包括CSPG、肝配蛋白、腦信號(hào)蛋白等。
總之，本發(fā)明人結(jié)果表明，在NTF-刺激的再生RGC中，存在一種下調(diào)p75NTR介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐(cone)衰弱(collapse)的內(nèi)源機(jī)制，包括對(duì)下游Rho-A-介導(dǎo)的抑制信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。這種p75NTR的內(nèi)源下調(diào)作用可以通過(guò)應(yīng)用p75NTR-靶向的siRNA而有效地增加。因此，siRNA技術(shù)提供一種其它的治療策略，以幫助再生的軸突克服CNS的抑制環(huán)境。對(duì)于成功的CNS修復(fù)，神經(jīng)元死亡可能是比最初的想法更大的障礙，并且使用適當(dāng)?shù)腘TFs和按照本發(fā)明的分子增強(qiáng)神經(jīng)元存活以及軸突再生的組合治療策略，是在損傷后促進(jìn)CNS軸突再生、細(xì)胞存活和恢復(fù)功能的優(yōu)選的方法。
實(shí)施例2 材料和方法 成年DRGN培養(yǎng)物 將L4-L7DRG對(duì)從成年大鼠(6-8周齡)解剖下來(lái)，并且在37℃含有5％CO2的濕潤(rùn)氛圍中，使用含有0.1％膠原酶(Sigma，Poole，England)和200U/ml DnaseI(Worthington Biochem，New Jersey，USA)的Neurobasal-A(Invitrogen，Paisley，UK)溶液處理2hr，將其解離成單細(xì)胞，搗幾次，并且通過(guò)15％牛血清白蛋白梯度離心以去除碎片。將解離的細(xì)胞沉淀下來(lái)，然后重懸在含有B27補(bǔ)充物、L-谷氨酰胺和Gentimicin的Neurobasal-A(補(bǔ)充的Neurobasal-A，所有的都來(lái)自Invitrogen)中。在37℃含有5％CO2的濕潤(rùn)氛圍中，在存在和不存在大鼠CNS髓磷脂(來(lái)自Dr.Norman Gregson，King’sCollege London，UK)下，將1,500DRGN/孔在4孔組織培養(yǎng)板(Nunc.UK)中用100μg/ml聚-D-賴氨酸然后用20μg/ml層粘連蛋白-I(Sigma，Dorset，UK)預(yù)先包被的無(wú)菌玻璃蓋玻片上培養(yǎng)72hr。
siRNA制備和轉(zhuǎn)染 同實(shí)施例1，使用Elbashir和合作者提出的標(biāo)準(zhǔn)(Elbashir等.，2001，同前所述)，設(shè)計(jì)針對(duì)p75NTR、NgR和Rho-A的siRNA。仔細(xì)審看大鼠p75NTR、NgR和Rho-A的編碼序列，以確定具有二腺嘌呤起始序列并且包括低于50％GC含量的可能的區(qū)域。所用的siRNA序列為- p75NTR序列- SEQ ID No.1，5’-AACCTCATTCCTGTCTATTGC-3’； SEQ ID No.2，5’-AACGCTTGATGCCCTTTTAGC-3’； SEQ ID No.3，5’-AAGAGACCAGGAGCATTGTAC-3’； SEQ ID No.4，5’-AAGAACCAGAGCCATGCACTC-3’；和 SEQ ID No.5，5’-AAGCGGAGCGCTGACGCCGGA-3’。
NgR序列- SEQ ID No.6，5’-AATCTCACCATCCTGTGGCTG-3’； SEQ ID No.7，5’-AACCTCACGCATCTCTTTCTG-3’； SEQ ID No.8，5’-AATCAGCTCACTGATGAGGAG-3’； SEQ ID No.9，5’-AAATGCACTCAAGGGACGTGT-3’；和 SEQ ID No.10，5’-AATGACTCTCCATTTGGGACT-3’。
Rho-A序列- SEQ ID No.11，5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’； SEQ ID No.12，5’-AAGGATCTTCGGAATGATGAG-3’； SEQ ID No.13，5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’； SEQ ID No.14，5，-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’；和 SEQ ID No.15，5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-3’。
將所選的序列進(jìn)行BLAST搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)，以確保與其它基因沒(méi)有顯著的同源性。有義siRNA模板在5’端以AA二聚體起始，然后接著19個(gè)與靶點(diǎn)序列互補(bǔ)的核苷酸。有義和反義模板的3’端都包括8個(gè)核苷酸的序列5’-CCTGTCTC-3’，其與所述siRNA有效轉(zhuǎn)錄所需要的T7啟動(dòng)子引物的互補(bǔ)序列相對(duì)應(yīng)。去保護(hù)的和脫鹽的寡核苷酸模板和對(duì)照-合成的序列是化學(xué)合成的(Alta Biosciences，University of Birmingham，UK)。
SEQ ID No.16合成的p75NTR Seq 25’-AATCGCATGCGTTCCATTTCG-3’； SEQ ID No.17合成的NgR15’-AACTTCCACCATTTGGCGGTC-3’； SEQ ID No.18合成的Rho-A Seq 25’-AAGAGTTCATCTGAGTAGGAG-3’。
將Oligofectamine試劑(Invitrogen)用于4孔組織培養(yǎng)板(Nunc)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。在一個(gè)管中，將0.84μg siRNA/孔混合在50μl Opti-MEM(Invitrogen)中，同時(shí)第二個(gè)管含有3μl Oligofectamine(Invitrogen)和12μlOpti-MEM(Invitrogen)。將這些管在室溫下溫育5min，然后將這兩種溶液合并，并且允許在室溫下再溫育25min，以便形成復(fù)合物。然后，將整個(gè)混合物補(bǔ)充Opti-MEM(Invitrogen)達(dá)到需要的用量，以允許每孔DRGN加入150μl轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染5hr后，向轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入補(bǔ)充的Neurobasal-A，使得終濃度為500μl/孔，并且在進(jìn)行細(xì)胞裂解(用于蛋白質(zhì)印跡分析)或免疫組化之前，將DRGN再培養(yǎng)48hr。
抗體 單克隆β-III微管蛋白抗體(Sigma)以1∶100應(yīng)用以通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)標(biāo)記DRGN神經(jīng)突，并且在蛋白質(zhì)印跡中以1∶500應(yīng)用。多克隆抗-p75NTR Ab用于鑒定和定位p75NTR(Sigma，1∶500稀釋用于蛋白質(zhì)印跡和ICC)。單克隆192-Ig用于鑒定和定位25kDa加工的p75NTR細(xì)胞質(zhì)片段(Oncogene Research Products.San Diego，CA，USA，1∶200稀釋用于蛋白質(zhì)印跡)。Rho-A(單克隆和多克隆Abs，都以1∶200稀釋用于蛋白質(zhì)印跡和ICC)和多克隆抗-NgR Ab(1∶100稀釋用于蛋白質(zhì)印跡和ICC)購(gòu)自Santa CruzBiotechnology，CA，USA。
免疫細(xì)胞化學(xué) 在用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌3次之前，將DRG培養(yǎng)物在4％低聚甲醛上固定10min(TAAB Laboratories，Berkshire，UK)，在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)和1％Triton X-100(Sigma)的PBS中封閉，并且用1∶100稀釋在含有0.5％BSA和0.5％吐溫-20(Sigma)的PBS中的相應(yīng)的一級(jí)抗體在濕潤(rùn)的房間里在室溫下溫育1hr。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌3次，并且用1∶100稀釋在PBS-T-BSA中的Alexa Fluor 488(綠色)或Texas Red(紅色)(二者都來(lái)自Molecular Probes)在室溫下溫育1hr。在PBS中進(jìn)一步洗滌后，將蓋玻片包埋在FluorSave(Calbiochem，San Diego，USA)中，并且在熒光顯微鏡(Carl Zeiss，Welwyn-Garden City，UK)下觀察。
神經(jīng)突長(zhǎng)出的檢測(cè) 使用Axiovision軟件(Carl Zeiss)從用Axiovision檢測(cè)工具隨機(jī)選擇的30個(gè)DRGN/蓋玻片捕獲βIII-微管蛋白+免疫染色的DRGN神經(jīng)突的顯微照片。神經(jīng)突長(zhǎng)度表示為平均值±SD。由于神經(jīng)突長(zhǎng)出是廣泛的，所以所述軟件不能用于檢測(cè)siRNA擊倒實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)突。在這樣的情形中，將DRGN細(xì)胞裂解物用于βIII-微管蛋白的蛋白質(zhì)印跡，作為神經(jīng)突長(zhǎng)出的檢測(cè)。
蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡 為了確定siRNA處理的DRG培養(yǎng)物中的p75NTR、NgR和Rho-A的水平，將細(xì)胞用PBS洗滌2次，并且用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)在37℃溫育15min，然后搗碎，并且在1300rpm離心5min。將DRG細(xì)胞沉淀重懸在冰冷的含有20mM Tris-HCl(pH7.4)，1mM EDTA，0.5mM EGTA，l50mMNaCl，1％NP-40(Sigma)和蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的裂解緩沖液中，并且在冰上溫育30min。在4℃13,000rpm離心30min后，使用比色DC蛋白檢測(cè)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，將裂解物的蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化。在用于蛋白質(zhì)印跡分析之前將勻漿物和細(xì)胞裂解物保存在-70℃。
將每種樣品(40μg總蛋白)在90℃用2×Laemmeli上樣緩沖液溫育4min，并且在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore UK，Gloucestershire，UK)上，在室溫下在含有0.1％吐溫20和5％脫脂牛奶的Tris-緩沖鹽水中封閉1hr。將膜用相應(yīng)的抗體印跡過(guò)夜。對(duì)于檢測(cè)，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(Amersham，Buckinghamshire，UK)和HRP-綴合的二級(jí)抗體(1∶1,000，Amersham)。將每一印跡去除，并且然后用相關(guān)的抗體重新探測(cè)。
DRGN存活 siRNA-介導(dǎo)的擊倒后，在熒光顯微鏡下通過(guò)仔細(xì)審查每種siRNA 9個(gè)蓋玻片的全區(qū)域而計(jì)數(shù)βIII-微管蛋白+DRGN數(shù)目。按下文所述，計(jì)算DRGN/蓋玻片的平均數(shù)，并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
密度計(jì)量 在3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于每種siRNA的蛋白質(zhì)印跡和抗體評(píng)估進(jìn)行3次，并且在相關(guān)情形中，使用ScionImage軟件(Scion Corporation/NIH Image，USA)通過(guò)密度計(jì)量學(xué)而定量印跡。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)算樣品的平均值，并且使用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，Version 4.0，San Diego，USA)通過(guò)單向變量分析(ANOVA)，分析顯著性，然后通過(guò)Dunnett’s方法進(jìn)行post-hoc檢測(cè)以確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的組。
結(jié)果 FGF2促講DRGN神申經(jīng)突長(zhǎng)出 為了檢測(cè)所選的siRNA序列的功效，本發(fā)明人首先建立體外模型，其中將非Trk-依賴型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子FGF2用于刺激DRGN中神經(jīng)突的長(zhǎng)出，并且結(jié)果在圖2中顯示，其中- A，無(wú)FGF2；B，1ng/ml FGF2；C，10ng/ml FGF2；D，100ng/ml FGF2；E，200ng/ml FGF2在DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)度中引起劑量-依賴型增加；和F，通過(guò)圖像分析而定量βIII-微管蛋白+平均值±SD神經(jīng)突長(zhǎng)度，表明用10ng/mlFGF2獲得最理想的神經(jīng)突長(zhǎng)出，此后平均神經(jīng)突長(zhǎng)出下降。(***p＜0.0001，10ng/ml FGF2相對(duì)于0ng/ml)。
所述結(jié)果表明βIII-微管蛋白陽(yáng)性DRGN神經(jīng)突在單獨(dú)的Neurobasal-A上生長(zhǎng)，達(dá)到350±35μm的平均長(zhǎng)度(如在圖2A和F中所示)。然而，增加FGF2的濃度，達(dá)到10ng/ml，增加神經(jīng)突長(zhǎng)出(圖2B，C和F)。超過(guò)這一最佳濃度，DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出下降(圖2D-F)。這些結(jié)果證明FGF2可以以濃度-依賴型方式有效地促進(jìn)DRGN中神經(jīng)突的長(zhǎng)出。
在CNS髓磷脂中抑制FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出 通過(guò)在存在一定范圍的CNS髓磷脂濃度下培養(yǎng)DRGN，而確定CNS髓磷脂對(duì)FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出的抑制作用，并且結(jié)果顯示在圖3中，其中- A，無(wú)CNS髓磷脂；B，100μg/ml CNS髓磷脂；C，10μg/ml CNS髓磷脂；D，100μg/ml CNS髓磷脂；E，200μg/ml CNS髓磷脂在DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)度上引起劑量-依賴型減少；和F，通過(guò)圖像分析定量平均值±SD神經(jīng)突長(zhǎng)度，表明抑制DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出的最理想濃度是200μg/ml CNS髓磷脂，更高濃度的CNS髓磷脂(500μg/ml)對(duì)于DRGN是有毒的。***p＜0.0001，200μg/ml相對(duì)于0μg/ml髓磷脂。
通過(guò)在存在100μg/ml CNS髓磷脂下生長(zhǎng)DRGN(圖3B)，顯著地減少了由10ng/ml FGF2刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出(如圖3A所示)，而200μg/ml CNS髓磷脂幾乎完全抑制了FGF2-介導(dǎo)的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出(圖3C)。將CNS髓磷脂的濃度增加到250μg/ml(圖3D)和500μg/ml(圖3E)完全抑制了神經(jīng)突長(zhǎng)出。然而，由于所用的最高CNS髓磷脂濃度導(dǎo)致增加的細(xì)胞死亡和改變的DRGN形態(tài)，我們選擇200μg/ml髓磷脂為我們后續(xù)的siRNA實(shí)驗(yàn)提供最佳抑制。通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)突長(zhǎng)度量化神經(jīng)突長(zhǎng)出而證實(shí)這些觀察(圖3F)，并且證明FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出被CNS髓磷脂有效地阻滯。
p75NTR siRNA擊倒p75NTR及其片段，并且還在DRGN中下調(diào)Rho-A 本發(fā)明人已經(jīng)在實(shí)施例1中證明，在5種所選的針對(duì)p75NTR mRNA的siRNA序列中，SEQ ID No.2在RGC中完全擊倒p75NTR及其處理的片段，以及下游Rho-A(參見(jiàn)實(shí)施例1)。來(lái)自只在FGF2存在下生長(zhǎng)的DRG培養(yǎng)物細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析沒(méi)有表現(xiàn)出p75NTR和Rho-A蛋白水平的任何變化。然而，p75NTR蛋白水平在存在FGF2和CNS髓磷脂時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞裂解物中保持不受影響，而Rho-A水平增強(qiáng)，這表明對(duì)抑制途徑的誘導(dǎo)(如圖4A所示)。
圖4中A，在siRNA-介導(dǎo)的基因沉默作用后細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡表現(xiàn)出p75NTR蛋白的70％的擊倒，下調(diào)所有p75NTR片段，并且隨后抑制Rho-A活化；B，使用βIII-微管蛋白和p75NTR抗體的雙免疫細(xì)胞化學(xué)表明在不存在CNS髓磷脂時(shí)使用FGF2的神經(jīng)突長(zhǎng)出，而p75NTR免疫染色定位在DRGN somata和它們的神經(jīng)突；C，盡管CNS髓磷脂抑制神經(jīng)突長(zhǎng)出，但是它對(duì)p75NTR免疫反應(yīng)性沒(méi)有影響；D，用p75NTR序列2轉(zhuǎn)染DRGN引起與顯著的(P＜0.0001，相對(duì)于p75NTR合成的序列2)神經(jīng)突長(zhǎng)出相關(guān)的對(duì)p75NTR免疫反應(yīng)性的顯著減少；E，在存在針對(duì)p75NTR序列2的合成序列時(shí)，p75NTR的免疫反應(yīng)性保持，而沒(méi)有任何明顯的神經(jīng)突長(zhǎng)出。
如同用于RGC那樣(參見(jiàn)實(shí)施例1)，當(dāng)將DRGN用相同的5種針對(duì)p75NTRmRNA的siRNA序列轉(zhuǎn)染時(shí)，序列2又引起最大的p75NTR及其處理片段p55和p25的擊倒，具有70％的效率(P＜0.0001相對(duì)合成的2)(圖4A)。由于序列2的合成譯本對(duì)于p75NTR擊倒沒(méi)有作用，所以使用SEQ ID No.2觀察到的擊倒是特異的。當(dāng)將印跡去除，并且用Rho-A重新探測(cè)時(shí)，使用p75NTR siRNA SEQ ID No.2還獲得幾乎完全的Rho-A擊倒。在存在FGF2而沒(méi)有CNS髓磷脂時(shí)，在βIII-微管蛋白+DRGN中存在p75NTR免疫反應(yīng)性以及中等神經(jīng)突長(zhǎng)出(圖4B)。DRGN somata和神經(jīng)突的p75NTR免疫反應(yīng)性不受CNS髓磷脂和FGF2組合存在的影響，但是神經(jīng)突長(zhǎng)出顯著減小(圖4C)。
然而，在存在p75NTR siRNA SEQ ID No.2與CNS髓磷脂和FGF2時(shí)生長(zhǎng)的DRGN中，存在p75NTR免疫反應(yīng)性的顯著減少，并且神經(jīng)突長(zhǎng)出增強(qiáng)(圖4D)。在存在FGF2和CN髓磷脂時(shí)，合成的對(duì)照序列2在p75NTR免疫反應(yīng)性中沒(méi)有表現(xiàn)出變化，并且沒(méi)有神經(jīng)突長(zhǎng)出(圖4E)，這證實(shí)p75NTR siRNASEQ ID No.2-介導(dǎo)的擊倒生物反應(yīng)是特異的siRNA反應(yīng)，其還引起下游抑制信號(hào)傳導(dǎo)分子Rho-A的有效擊倒。
NgR siRNA顯著擊倒DRGN中的NgR 本發(fā)明人檢測(cè)了5種針對(duì)NgR mRNA的siRNA序列(SEQ ID No.6-10)用于擊倒DRGN中的NgR，并且結(jié)果顯示在圖5中，其中- A，使用siRNASEQ ID No.6，7和10，在siRNA-介導(dǎo)的基因沉默作用后細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分別表現(xiàn)出100％，55％和18％的NgR蛋白擊倒；B，用NgR siRNA SEQ ID No.6轉(zhuǎn)染DRGN引起免疫反應(yīng)性的顯著減少，同時(shí)促進(jìn)顯著的神經(jīng)突長(zhǎng)出；和C，然而，在用合成序列1轉(zhuǎn)染的DRGN中，使用βIII-微管蛋白和NgR抗體的雙免疫細(xì)胞化學(xué)沒(méi)有揭示神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且在NgR免疫反應(yīng)性中沒(méi)有變化。
本發(fā)明人表明，在存在FGF2和CNS髓磷脂時(shí)，SEQ ID No.6完全擊倒NgR(100％擊倒，P＜0.0001相對(duì)于合成的1)，如圖5A所示。siRNA NgRSEQ ID No.6的合成譯本對(duì)于NgR水平?jīng)]有影響，這證明SEQ ID No.6siRNA的特異性。在NgR擊倒后，在p75NTR及其片段中沒(méi)有調(diào)控，然而，在獲得顯著的擊倒的樣品中，活性Rho-A水平減小(圖5A)。在用NgRsiRNA SEQ ID No.6轉(zhuǎn)染的DRGN中，NgR免疫反應(yīng)性顯著減小，而在存在CNS髓磷脂時(shí)，用FGF2刺激后，βIII-微管蛋白+神經(jīng)突的生長(zhǎng)增強(qiáng)(圖5B)。在存在FGF2和CNS髓磷脂時(shí)，合成的NgR SEQ ID No.6對(duì)NgR免疫反應(yīng)性和DRGN的神經(jīng)突長(zhǎng)出沒(méi)有作用(圖5C)。
Rho-A siRNA顯著地?fù)舻笵RGN中的Rho-A 其次，本發(fā)明人構(gòu)建了5種針對(duì)下游抑制性信號(hào)傳導(dǎo)分子Rho-A的siRNA(SEQ ID No.11-15)，并且檢測(cè)它們擊倒DRGN中Rho-A的能力，并且結(jié)果在圖6中顯示，其中- A，使用Rho-A siRNA SEQ ID No.s 11，12，13和15，在siRNA-介導(dǎo)的基因沉默作用后細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分別表現(xiàn)出80％，100％，10％和70％的Rho-A蛋白擊倒。全長(zhǎng)和p75NTR處理形式的同時(shí)減少也是顯而易見(jiàn)的；B，用SEQ ID No.12轉(zhuǎn)染的DRGN具有減少的Rho-A免疫反應(yīng)性，和旺盛的神經(jīng)突長(zhǎng)出；和C，然而，在用合成SEQ ID No.12轉(zhuǎn)染的DRGN中，使用βIII-微管蛋白和NgR抗體的雙免疫細(xì)胞化學(xué)沒(méi)有表現(xiàn)出神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且在Rho-A免疫反應(yīng)性中沒(méi)有變化。
在存在CNS髓磷脂時(shí)，在用FGF2刺激的DRGN中，SEQ ID No.12完全擊倒Rho-A(100％擊倒，P＜0.0001相對(duì)于合成的序列12)蛋白，而合成的譯本沒(méi)有影響(圖6A)。siRNA-介導(dǎo)的Rho-A擊倒與p75NTR及其片段p55和p25的顯著擊倒相關(guān)(圖6A)。在βIII-微管蛋白+DRGN中，Rho-A siRNASEQ ID No.12幾乎完全消除了Rho-A的免疫反應(yīng)性，并且在存在CNS髓磷脂時(shí)，比檢測(cè)的任何其它的siRNA序列導(dǎo)致更多的FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出(圖6B)。合成的Rho-A SEQ ID No.2對(duì)Rho-A免疫反應(yīng)性和DRGN的神經(jīng)突長(zhǎng)出沒(méi)有影響(圖6C)。
從βIII-微管蛋白的蛋白質(zhì)印跡量化DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出 由于許多DRGN生長(zhǎng)多于一個(gè)神經(jīng)突，并且這些由來(lái)自相鄰DRGN的神經(jīng)突點(diǎn)綴，所以，很難使用Axiovision軟件檢測(cè)用siRNA-介導(dǎo)的p75NTR、NgR和Rho-A擊倒觀察到的神經(jīng)突長(zhǎng)度。因此，βIII-微管蛋白的蛋白質(zhì)印跡的密度計(jì)量學(xué)分析用來(lái)估計(jì)神經(jīng)突長(zhǎng)出，并且結(jié)果顯示在圖7中，其中 A和B，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉(zhuǎn)染的DRGN相比，在用p75NTR siRNA SEQ ID No.2轉(zhuǎn)染的DRGN中，檢測(cè)到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和CNS髓磷脂時(shí)生長(zhǎng)的DRGN相比，這表現(xiàn)出5倍的增加；C和D，使用針對(duì)NgR的siRNA，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉(zhuǎn)染的DRGN相比，在用SEQ ID No.6轉(zhuǎn)染的DRGN中，檢測(cè)到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和髓磷脂時(shí)生長(zhǎng)的DRGN相比，這表現(xiàn)出3倍的增加；E和F，使用針對(duì)Rho-A的siRNA，與用合成的或任何其它的siRNA序列轉(zhuǎn)染的DRGN相比，在用Rho-A SEQ ID No.12轉(zhuǎn)染的DRGN中，檢測(cè)到顯著更高的βIII-微管蛋白量(P＜0.0001，ANOVA)，與只存在FGF2和髓磷脂時(shí)生長(zhǎng)的DRGN相比，這表現(xiàn)出6.5倍的增加。最大的βIII-微管蛋白量(反映最旺盛的神經(jīng)突長(zhǎng)出)在用Rho-A SEQ ID No.12轉(zhuǎn)染的DRGN中檢測(cè)到；和G，在siRNA-介導(dǎo)的p75NTR、NgR或Rho-A擊倒后，計(jì)數(shù)βIII-微管蛋白+DRGN的數(shù)目，作為細(xì)胞存活的檢測(cè)，沒(méi)有揭示出任何顯著變化。***P＜0.0001相對(duì)于使用FGF2和髓磷脂的對(duì)照DRGN。
當(dāng)使用siRNA SEQ ID No.2擊倒p75NTR時(shí)，存在CNS髓磷脂時(shí)，F(xiàn)GF2-介導(dǎo)的神經(jīng)突長(zhǎng)出增強(qiáng)5倍(圖7A和B)，當(dāng)使用siRNA SEQ ID No.6擊倒NgR時(shí)增強(qiáng)3.5倍(圖7C和D)，以及當(dāng)使用siRNA SEQ ID No.12擊倒Rho-A時(shí)增強(qiáng)6.5倍(圖6E和F)。在Rho-A擊倒后，F(xiàn)GF2-刺激的βIII-微管蛋白水平比在p75NTR擊倒后觀察到的水平進(jìn)一步增加。這些結(jié)果表明，阻滯Rho-A最理想地解除CNS髓磷脂存在時(shí)對(duì)FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出的抑制。
p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后的DRGN存活 在p75NTR、NgR和Rho-A擊倒后，培養(yǎng)物中存在的在髓磷脂存在時(shí)用FGF2刺激的βIII-微管蛋白+DRGN的數(shù)目保持不受影響(圖7G)。這表明，存在CNS髓磷脂時(shí)，p75NTR、NgR或Rho-A的擊倒對(duì)于FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出沒(méi)有不利影響。
討論 本發(fā)明人的軸突生長(zhǎng)解除抑制策略使用siRNA靶向抑制性信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，而不是抑制性配體。在FGF2-刺激的DRGN中p75NTR、NgR和Rho-A的擊倒都導(dǎo)致解除CNS抑制性髓磷脂存在時(shí)對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)出抑制，Rho-A的擊倒引起最明顯的作用。最有效的siRNA，Rho-A SEQ ID No.12，促進(jìn)比存在CNS髓磷脂時(shí)用FGF2觀察到的高6.5倍的FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出，和比用siRNA p75NTRSEQ ID No.2觀察到的高1.5倍的FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出。有趣地，siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒還引起Rho-A的完全擊倒，而siRNA-介導(dǎo)的全部Rho-A的擊倒相反在DRGN中引起中等的但是顯著的p75NTR的擊倒。NgR的擊倒增強(qiáng)神經(jīng)突長(zhǎng)出最小，當(dāng)與存在CNS髓磷脂時(shí)生長(zhǎng)的DRGN相比較時(shí)，其使FGF2-刺激的神經(jīng)突長(zhǎng)出增加3.5倍。
siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的擊倒 本發(fā)明人已經(jīng)證明siRNA-介導(dǎo)的p75NTR的基因沉默作用解除了CNS髓磷脂存在對(duì)RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出的抑制(實(shí)施例1)。本發(fā)明人還表明，p75NTR的擊倒導(dǎo)致對(duì)Rho-A活化的抑制，由此表明對(duì)抑制性信號(hào)傳導(dǎo)的抑制(實(shí)施例2)。這里，本發(fā)明人使用相同的siRNA序列來(lái)在體外DRGN中研究p75NTR基因沉默的作用。存在髓磷脂時(shí)，p75NTR及其片段的擊倒以及隨后抑制Rho-A活化增強(qiáng)了FGF2-刺激的DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出，這一觀察支持下述假說(shuō)抑制性配體結(jié)合分子NgR需要p75NTR以在多種神經(jīng)元細(xì)胞類型中轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號(hào)。
總之，結(jié)果證明p75NTR的擊倒在存在推定的抑制性環(huán)境(髓磷脂)時(shí)對(duì)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-刺激的(CNTF)RGC神經(jīng)突長(zhǎng)出具有顯著有利的影響。此外，NgR、p75NTR和Rho-A的擊倒在存在推定的抑制性環(huán)境時(shí)對(duì)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-刺激的(FGF2)DRGN神經(jīng)突長(zhǎng)出具有顯著有利的影響。這暗示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-刺激的機(jī)制對(duì)神經(jīng)突長(zhǎng)出抑制的解除作用可能是一種普遍現(xiàn)象，并且siRNA可以增強(qiáng)這一作用。結(jié)果對(duì)于抑制解除策略是有希望的，并且表明針對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)分子的RNAi在促進(jìn)最理想的CNS軸突再生中是最有利的。
序列表
<110>諾伊熱尼有限公司
<120>神經(jīng)元再生
<130>72441PPC
<160>18
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>1
aacctcattc ctgtctattg c21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>2
aacgcttgat gcccttttag c21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>3
aagagaccag gagcattgta c21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>4
aagaaccaga gccatgcact c21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>5
aagcggagcg ctgacgccgg a21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>6
aatctcacca tcctgtggct g21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>7
aacctcacgc atctctttct g21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>8
aatcagctca ctgatgagga g21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>9
aaatgcactc aagggacgtg t21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>10
aatgactctc catttgggac t21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>11
aagattatga ccgtctgagg c21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>12
aaggatcttc ggaatgatga g21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>13
aaggcgggag ttagccaaaa t21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>14
aatgaagcag gagccggtaa a21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>15
aaagaccaaa gacggagtga g21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>16
aatcgcatgc gttccatttc g21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>17
aacttccacc atttggcggt c21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人
<400>18
aagagttcat ctgagtagga g2權(quán)利要求
1.一種基因沉默分子，其適于下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達(dá)，其中所述基因沉默分子是短干擾核酸(siNA)，所述短干擾核酸包含適于下調(diào)編碼Rho-A分子的基因表達(dá)的序列。
2.按照權(quán)利要求1的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括siRNA分子。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括大約5bp-50bp。
4.按照權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括小于50％的GC含量。
5.按照權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其中所述siNA分子包括
5’-AAGATTATGACCGTCTGAGGC-3’(SEQ ID No.11)；
5’-AAGGATCTTCGGAATGATGAG-3’(SEQ ID No.12)；
5’-AAGGCGGGAGTTAGCCAAAAT-3’(SEQ ID No.13)；
5’-AATGAAGCAGGAGCCGGTAAA-3’(SEQ ID No.14)；或
5’-AAAGACCAAAGACGGAGTGAG-3’(SEQ ID No.15)。
6.按照權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其中所述基因沉默分子包括SEQ ID No.12確定的序列。
7.按照權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其中所述基因沉默分子與刺激神經(jīng)突生長(zhǎng)的分子組合應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求7的基因沉默分子，其中所述刺激神經(jīng)突生長(zhǎng)的分子包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTF)。
9.按照權(quán)利要求8的基因沉默分子，其中所述NTF獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組CNTF，F(xiàn)GF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，F(xiàn)GF-1，F(xiàn)GF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，以及VIP等。
10.按照權(quán)利要求9的基因沉默分子，其中所述NTF是睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)或成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)。
11.按照權(quán)利要求1-2，8-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其用作藥物。
12.按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子用于制備促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
13.按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子用于制備抑制細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的藥物中的應(yīng)用。
14.按照權(quán)利要求1-2，8-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子，其特征在于所述分子適于在存在神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑分子時(shí)比不存在所述抑制劑分子時(shí)誘導(dǎo)更多的神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)。
15.一種組合物，其包括治療有效量的按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子，和藥用賦形劑。
16.用于促進(jìn)神經(jīng)元存活和軸突生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括按照權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的基因沉默分子，和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子。
17.按照權(quán)利要求16的組合物，其中所述NTF獨(dú)立地選自由下列各項(xiàng)組成的組CNTF，F(xiàn)GF2，NGF，NT-3，NT-4，BDNF，GDNF，F(xiàn)GF-1，F(xiàn)GF-5，CT-1，CDF，胰島素，IGF-1，IGF-2，IL-6，LIF，NPF，PDGF，PN-1，S-100，TGF-β，和VIP等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基因沉默分子，其適于下調(diào)編碼參與Rho-A抑制途徑的肽的基因的表達(dá)。所述基因沉默分子用于促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)元存活和軸突再生。本發(fā)明還提供組合物以及應(yīng)用所述組合物提高神經(jīng)存活和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的方法。
文檔編號(hào)A61P25/14GK101818150SQ20101011571
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者祖貝爾·艾哈邁德, 馬丁·貝里, 安·洛根 申請(qǐng)人:諾伊熱尼有限公司