一種骨組織工程多孔陶瓷支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)療器械技術(shù)領(lǐng)域，涉及骨組織工程支架的制備技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]骨作為人體骨骼系統(tǒng)的主要器官擔(dān)負(fù)著運(yùn)動(dòng)、支撐及承重等重要的功能。但因疾病、感染、外傷、老化、運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷等原因?qū)е鹿侨睋p已是臨床上亟待解決的難題之一。在臨床應(yīng)用上雖然有自體骨移植，異體骨移植或異種骨移植等治療手段，但存在來(lái)源不足及免疫排次排次等問(wèn)題。同時(shí)骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為這一難題的解決帶來(lái)新希望。
[0003]在組織工程中，多孔三維支架材料起著關(guān)鍵的作用，不僅為種子細(xì)胞提供黏附、增殖、分化的空間結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)模板，而且可以引導(dǎo)組織再生、控制再生組織的結(jié)構(gòu)。同時(shí)骨組織工程支架的結(jié)構(gòu)特性對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為和誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)有及其重要的作用，但是單純利用組織工程支架的結(jié)構(gòu)性能調(diào)制細(xì)胞行為和組織再生，原則上其生物學(xué)效果是有限的。為增強(qiáng)支架的誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)能力，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了許多嘗試，其重要的方向是探索生物材料與促進(jìn)骨生長(zhǎng)藥物或生長(zhǎng)因子的有效結(jié)合，最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)生物材料和生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用加強(qiáng)組織再生能力。在人工骨替代材料中加入外源性生長(zhǎng)因子和促進(jìn)細(xì)胞分化的藥物被認(rèn)為是提高人工骨替代材料骨形成能力的較有效方法。但單純的生長(zhǎng)因子或藥物在體內(nèi)溶解或降解太快，很難局部保持有效濃度，降低骨誘導(dǎo)作用。目前研究表明用高分子微球?yàn)樯L(zhǎng)因子或藥物的載體與多孔磷酸鈣基生物陶瓷支架組裝大大提高了誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)的能力。生物緩釋載體系統(tǒng)的研究是骨組織工程研究的一個(gè)新方向，它要求復(fù)合的生長(zhǎng)因子緩慢釋放，使局部長(zhǎng)時(shí)間保持生長(zhǎng)因子的有效濃度以持續(xù)有效的促進(jìn)組織生長(zhǎng)。殼聚糖是地球上僅次于纖維素的最豐富的天然聚合物，由于具有良好的生物相容性、生物降解性，和降解產(chǎn)物無(wú)毒性等特點(diǎn)，以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、殺菌、基因治療等許多重要領(lǐng)域。以殼聚糖微球?yàn)檩d體制備的給藥緩釋體系在骨組織缺損修復(fù)的領(lǐng)域也取得較大的進(jìn)展。但將殼聚糖載藥微球與具有良好骨誘導(dǎo)效應(yīng)的陶瓷材料(羥基磷灰石，磷酸三鈣，雙相磷灰石等)高效良好的結(jié)合仍比較困難。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201510224593.4公開(kāi)了采用糖球作為造孔劑可制備孔隙尺寸及貫通性可調(diào)多功能性的多孔陶瓷支架。目前構(gòu)建高分子微球與骨修復(fù)支架緩釋體系的方法主要有內(nèi)嵌及表面吸附兩種，但是內(nèi)嵌法只能局限于以高分子為基體材料的體系中，不能在降解速度緩慢的陶瓷基材料有效的內(nèi)嵌及釋放藥物，表面吸附法可以在陶瓷基材料上使用以構(gòu)建緩釋陶瓷支架體系，但存在微球與支架的結(jié)合效果不佳，并且不能確保微球在支架的表面上實(shí)現(xiàn)均勻的分布以保證藥物在支架的各部分均一的誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)。而且所使用的方法很難不影響支架本身表面的功能化如掩蓋陶瓷表面本身所具有的微納孔隙結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種骨組織工程多孔陶瓷支架的制備方法，它能有效地解決骨組織工程多孔陶瓷支架表面涂覆載藥殼聚糖微球的均勻分布問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種骨組織工程多孔陶瓷支架的制備方法，首先通過(guò)以下步驟制得支架:A、通過(guò)在含氯化鋰的二甲基乙酰胺溶劑加入甲殼素，再加入無(wú)機(jī)粉末配制成無(wú)機(jī)粉末/甲殼素漿料。B、將糖球顆粒堆積于支架模具中進(jìn)行熱處理，隨后冷卻至常溫;得到附著于支架模具內(nèi)表面的糖球堆積的支架模具。C、將A步的無(wú)機(jī)粉末/甲殼素漿料注入B步的支架模具中，待漿料自然凝膠化后，即得支架初胚;D、將C步制得的支架初胚在1000?1200°C下燒結(jié)2?3h，即制得多孔支架。
[0006]E、載藥微球的制備:將質(zhì)量體積比為I?5 %的殼聚糖溶解在2 %的冰乙酸溶劑中，得到殼聚糖溶液，然后，按殼聚糖的質(zhì)量以2?8:1的比例將促骨生長(zhǎng)藥物加入殼聚糖溶液混合均勻，得到含促骨生長(zhǎng)藥物的殼聚糖混合液，將1ml含促骨生長(zhǎng)藥物的殼聚糖混合液緩慢滴加到含有2%司班80的油相中攪拌，再加入Iml?25ml濃度為I?25%交聯(lián)劑攪拌2?5小時(shí)，然后注入離心管，離心收集載藥殼聚糖混合物，分別依次用異丙醇，乙醇及去離子水或石油醚、異丙醇及去離子水對(duì)載藥殼聚糖混合物進(jìn)行清洗后，在零下10°C條件下冷凍干燥制得載藥微球。
[0007]F、涂覆海藻酸陶瓷支架制備:將海藻酸以質(zhì)量體積比為0.5?1.3%的比例溶解在去離子水中制得海藻酸溶液，將D步中的多孔支架浸入上述的海藻酸溶液中10分鐘后取出，在轉(zhuǎn)速為2000r/min條件下的離心處理，重復(fù)四次，再將多孔支架浸入26%氯化鈣溶液中I?3小時(shí)后取出，用去離子水反復(fù)沖洗后在轉(zhuǎn)速為1000?3000r/min條件下的離心處理，SP得到表面涂覆海藻酸的陶瓷支架；
[0008]G、載藥微球與陶瓷支架的結(jié)合:將E步制得的載藥微球均勻分散在裝有去離子水的離心管中，再將涂覆海藻酸的陶瓷支架浸入裝有載藥微球的離心管中，放置在37°C，轉(zhuǎn)速60?120r/min的恒溫震蕩箱中震蕩I?3小時(shí)，取出陶瓷支架用去離子水反復(fù)沖洗后，真空干燥即得載藥微球均勻分布在涂覆海藻酸的骨組織工程多孔陶瓷支架。
[0009]所述促骨生長(zhǎng)藥物是骨形態(tài)發(fā)生蛋白或丹酚酸B等。
[0010]所述油相是煤油、液體石蠟或植物油。
[0011]所述交聯(lián)劑為戊二醛、三聚磷酸鈉或京尼平。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0013]—、制備載藥殼聚糖微球均勻分布的涂覆海藻酸的骨組織工程多孔陶瓷支架表面上，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，每個(gè)微球獨(dú)立在吸附在多孔陶瓷支架表面上，保證藥物在多孔陶瓷支架的各部分均能均勻釋放以誘導(dǎo)組織生長(zhǎng)。
[0014]二、不同尺寸的殼聚糖微球均可均勻的分布在多孔陶瓷支架的表面，由于微球在多孔陶瓷支架表面均勻而規(guī)則的排布，在多孔陶瓷支架表面上可構(gòu)建了一層規(guī)則的尺寸可調(diào)的微納結(jié)構(gòu)與藥物協(xié)同調(diào)控細(xì)胞行為，促進(jìn)組織生長(zhǎng)。
[0015]三、涂覆層不會(huì)影響多孔陶瓷支架表面特殊的功能化，而且還可以模仿細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控細(xì)胞行為，促進(jìn)組織生長(zhǎng)
[0016]四、可在海藻酸涂覆層中包裹與殼聚糖不同的藥物以協(xié)同調(diào)控細(xì)胞行為，促進(jìn)組織生長(zhǎng)。
[0017]五、可再吸附與殼聚糖微球帶相反電荷的高分子微球，構(gòu)建分布均勾分布的多級(jí)控釋體系促進(jìn)組織生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明較大尺寸的殼聚糖微球均勻的分布在陶瓷支架表面的電鏡照片
[0019]圖2為本發(fā)明較小尺寸的殼聚糖微球均勻的分布在陶瓷支架表面的電鏡照片
[0020]圖3為本發(fā)明海藻酸涂覆層沒(méi)有堵塞陶瓷支架表面上微孔的電鏡照片實(shí)施例
[0021 ] 實(shí)施例一
[0022]A、載藥微球的制備:將0.25g的殼聚糖溶解在1ml 2%的冰乙酸溶液中，然后加入
0.125g丹酚酸B混合均勻，再將1ml丹酚酸B/殼聚糖混合液緩慢滴加到包含有2ml司班80的10ml油相中煤油體系中攪拌2h，再加入Iml 6%戊二醛攪拌2h后離心收集所制備的載藥殼聚糖微球，分別依次用異丙醇，乙醇及去離子水進(jìn)行清洗后，在零下_10°C冷凍后采用冷凍干燥方法制的載藥微球。
[0023]B、陶瓷支架的制備:將0.75g甲殼素通加入含5%氯化鋰的二甲基乙酰胺溶劑，再加入25g無(wú)機(jī)粉末配制成無(wú)機(jī)粉末/甲殼素漿料。再將糖球顆粒堆積于支架模具中，然后進(jìn)行溫度為60°C、時(shí)間為1min的熱處理，隨后冷卻至常溫；即得到附著于支架模具內(nèi)表面的糖球堆積模板;將已配制的無(wú)機(jī)粉末/甲殼素漿料注入支架模具中，待漿料自然凝膠化后，在支架模具中得到凝膠狀的模板支架，再用60°C的去離子水中浸泡洗滌模板支架中的糖球和氯化鋰;去離子水無(wú)色后常溫干燥，即得初胚;再將初胚在1200°C下燒結(jié)2h，即的骨組織工程多孔陶瓷支架
[0024]C、涂覆海藻酸支架制備:將Ig海藻酸溶解在10ml去離子水中制的海藻酸溶液，將B步中的多孔支架浸入上述的海藻酸溶液中1min后取出，在轉(zhuǎn)速為2000r/min下的離心處理。重復(fù)4次，浸入5%氯化I丐溶