復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法及濃縮液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法及濃 縮液。
【背景技術(shù)】
[0002] 對(duì)于人體組織損傷導(dǎo)致的功能障礙，傳統(tǒng)的修復(fù)方法是自體組織移植術(shù)，自體組 織移植術(shù)會(huì)犧牲自體健康組織，并且會(huì)導(dǎo)致很多并發(fā)癥及附加損傷。
[0003] 組織工程指在體外構(gòu)建人工組織器官，例如，通過(guò)對(duì)人源或者動(dòng)物源的細(xì)胞在組 織工程培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)并大量擴(kuò)增，構(gòu)建人工組織器官。對(duì)于人體組織損 傷，通過(guò)人工組織器官作為修復(fù)材料，可以達(dá)到較好的修復(fù)效果，并且避免了自體組織移植 術(shù)的各種缺點(diǎn)。
[0004] 體外構(gòu)建人工組織器官過(guò)程中，細(xì)胞可以自分泌和旁分泌氨基酸、多肽或蛋白質(zhì) 等多種生物活性因子到培養(yǎng)液中，形成組織工程皮膚條件培養(yǎng)液。常見(jiàn)的細(xì)胞分泌的生 物活性因子有hEGF(中文：人表皮生長(zhǎng)因子，英文：humanepidermalgrowthfactor), FGF(中文：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，英文：fibroblastgrowthfactor),VEGF(中文：血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子，英文：vascularendothelialgrowthfactor)等。
[0005] 包含多種生物活性因子的組合體可以稱為復(fù)合生物活性因子。復(fù)合生物活性因子 除了具備各種生物活性因子自身的功能外，各種生物因子之間還可以相互促進(jìn)，所以，復(fù)合 生物活性因子在醫(yī)療和化妝品等行業(yè)具有重要作用。
[0006] 組織工程皮膚條件培養(yǎng)液中除了包含有用的復(fù)合生物活性因子之外，還包含多種 雜質(zhì)，而且，復(fù)合生物活性因子的含量相對(duì)于雜質(zhì)的含量比較低，所以，為了有效利用復(fù)合 生物活性因子，對(duì)于復(fù)合生物活性因子的提純和濃縮就變得非常重要。
[0007] 但是，現(xiàn)有技術(shù)提供的提純和濃縮技術(shù)一般僅適用于單種生物活性因子，例如，陽(yáng) 離子交換層析方法，對(duì)種類繁多的復(fù)合生物活性因子進(jìn)行提純濃縮的效率和產(chǎn)率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的在于，提供一種復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法及濃縮液， 提高對(duì)復(fù)合生物活性因子提純濃縮的效率和產(chǎn)率，且工藝簡(jiǎn)單，方便實(shí)現(xiàn)。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] -方面，提供一種復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法，包括：
[0011] 提供包含所述復(fù)合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液；
[0012] 對(duì)所述組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行除雜處理，以除去所述組織工程皮膚條件培 養(yǎng)液中分子量大于30kD的物質(zhì)，獲得包含所述復(fù)合生物活性因子的中間液體；
[0013] 用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，截留所述中間液體中分子量大于3kD 的物質(zhì)，獲得包含所述復(fù)合生物活性因子的濃縮液。
[0014] 進(jìn)一步的，所述復(fù)合生物活性因子包括：hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、TGF-β2、 IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
[0015] 可選的，所述提供包含所述復(fù)合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液，具體 包括：
[0016] 收集組織工程皮膚條件培養(yǎng)液；
[0017] 將收集的組織工程皮膚培養(yǎng)液密封后凍存；
[0018] 取需要量的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行化凍，獲得包含所述復(fù)合生物活性因子 的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液。
[0019] 可選的，對(duì)所述組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行除雜處理，具體包括：
[0020] 將所述組織工程皮膚條件培養(yǎng)液在〇· 9-1. 8bar的壓力下，通過(guò)第一切向流超濾 濃縮組件，收集透過(guò)液，獲得所述中間液體。
[0021] 優(yōu)選的，在對(duì)組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行除雜處理之前，還包括：
[0022] 將所述組織工程皮膚條件培養(yǎng)液在4000rpm-8000rpm轉(zhuǎn)速下離心。
[0023] 優(yōu)選的，所述第一切向流超濾濃縮組件的規(guī)格為30kD或者50kD。
[0024] 進(jìn)一步的，所述對(duì)所述組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行除雜處理的步驟，在將所述 組織工程皮膚條件培養(yǎng)液在〇. 9-1. 8bar的壓力下，通過(guò)第一切向流超濾濃縮組件的過(guò)程 中，還包括：對(duì)未透過(guò)所述第一切向流超濾濃縮組件的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行洗濾， 其中，未透過(guò)第一切向流超濾濃縮組件的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液包括：被第一切向流超 濾濃縮組件截留的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液，以及尚未處理的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液。
[0025] 可選的，所述用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，具體包括：
[0026] 將所述中間液體在0. 9-1. 8bar的壓力下，通過(guò)第二切向流超濾濃縮組件進(jìn)行濃 縮，收集滯留液，在滯留液的體積為所述中間液體的1/10-1/20時(shí)，停止操作；所述滯留液 是指未透過(guò)超濾濃縮組件的液體。
[0027] 將所述收集的滯留液在0. 9-1. 8bar的壓力下，再次通過(guò)所述第二切向流超濾濃 縮組件，在滯留液的體積為所述中間液體的1/50-1/100時(shí)，停止操作，收集滯留液，得到包 含所述復(fù)合生物活性因子的濃縮液。
[0028] 優(yōu)選的，所述第二切向流超濾濃縮組件包含3-5塊串聯(lián)分布的超濾膜包，所述超 濾膜包的規(guī)格為3kD。
[0029] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種濃縮液，包括：hEGF、VEGF、FGF、TGF-β1、 TGF-β2、IGF-1、IGF-2、KGF和PDGF。
[0030] 本發(fā)明實(shí)施例提供的一種復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法，工藝簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)方 便，能夠?qū)Τ煞謴?fù)雜的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液中的多種生物活性因子同時(shí)提純和濃縮， 提高對(duì)種類繁多的復(fù)合生物活性因子提純濃縮的效率，且獲得的復(fù)合生物活性因子純度 高，包含的生物活性因子種類多。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例提供的濃縮液，包含9種生物活性因子，可以有效的與皮膚細(xì)胞發(fā) 生作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝，預(yù)防皮膚受到紫外線、自由基等侵害，還可以促使真皮 層膠原細(xì)胞的增生。因此對(duì)皮膚術(shù)后可以加速修復(fù)，并具有撫平細(xì)紋，延緩皮膚老化等功 能。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0033] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的一種超濾濃縮裝置的結(jié)構(gòu)圖；
[0034] 其中，1為原液桶，2為進(jìn)口端，3為蠕動(dòng)泵，4為調(diào)壓閥，5為進(jìn)口端壓力表，6為切 向流超濾濃縮組件，7為回流端壓力表，8為透過(guò)端，9為濾液桶，10為回流端。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 現(xiàn)將詳細(xì)地提供本發(fā)明實(shí)施方式的參考，其一個(gè)或多個(gè)實(shí)例描述于下文。提供每 一實(shí)例作為解釋而非限制本發(fā)明。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行多種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。例如，作為一個(gè)實(shí)施方式的部 分而說(shuō)明或描述的特征可以用于另一實(shí)施方式中，來(lái)產(chǎn)生更進(jìn)一步的實(shí)施方式。因此，基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0036] 本發(fā)明實(shí)施例所涉及的材料均可以通過(guò)商業(yè)途徑或通過(guò)申請(qǐng)人獲取。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種復(fù)合生物活性因子的提純濃縮方法，包括步驟：
[0038] 步驟1、提供包含復(fù)合生物活性因子的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液；
[0039] 步驟2、對(duì)該組織工程皮膚條件培養(yǎng)液進(jìn)行除雜處理，以除去所述組織工程皮膚條 件培養(yǎng)液中分子量大于30kD的物質(zhì)，獲得包含復(fù)合生物活性因子的中間液體；
[0040] 步驟3、用切向流超濾濃縮組件濃縮所述中間液體，截留所述中間液體中分子量大 于3kD的物質(zhì)，獲得包含復(fù)合生物活性因子的濃縮液。
[0041] 通過(guò)步驟1至步驟3,能夠?qū)Τ煞謴?fù)雜的組織工程皮膚條件培養(yǎng)液中的多種生物 活性因子同時(shí)提純和濃縮，提高對(duì)種類繁多的復(fù)合生物活性因子提純濃縮的效率，且獲得 的復(fù)合生物活性因子純度高，包含的生物活性因子種類多。
[0042] 下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的具體實(shí)現(xiàn)方式和優(yōu)選實(shí)現(xiàn)方式進(jìn)行說(shuō)明。
[0043] 組織工程皮膚為一種組織化工程組織。組織工程皮膚條件培養(yǎng)液是指在基本培養(yǎng) 基中添加其他輔助成分（例如，血清等），采用組織工程方法在體外構(gòu)建組織工程皮膚后， 包含除組織工